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Adriana Maggi
METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI
GENERAZIONE DI ANIMALI REPORTER Ingegneria Animale
animali mutati geneticamente ad esprimere un gene reporter
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD)
Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)
TRANSGENESI STANDARD
GENE TARGETING
Microiniezionedel DNA clonato
zigote
Embrionestadio 2 cellule
Impianto nellafemmina pseudogravida
10-20% dei nascituricontiene il transgene
Trasfezione del DNA clonatoin cellule ES
Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti
Impianto della blastocisti in femmina pseudogravida
Topo chimerico
Ibrido F1
25-75% della progenieportano il transgene
Preparazione oociti fecondati
Preparazione ‘pseudo pregnant’
Screening della progenie
Preparazione costrutti
microiniezione
Preparazione oociti fecondati
Cocktail ormonale
Incrocio
Recupero uova fecondate
Preparazione del costrutto
Purificazione del transgene
propagazione del transgene
transgene Vettore di clonaggio
Impianto degli oociti microiniettati
Preparazione delle ‘pseudo pregnant’
FemminaMaschio vasectomizzato
Incrocio
Prelievo delle uova fecondate
MicroiniezioneTrasferimento delle uova
fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di
femmina pseudogravida
Microiniezione e reimpiantodegli oociti microiniettati
Screening della progenie
Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per :
Southern blot
PCR
GENE TARGETING - procedura -
• generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES)
• preparazione del vettore
• trasfezione delle cellule ES con il vettore
• iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti
• generazione di topi mosaico
• incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale
Generazione di cellule staminali ES
Femmine dopo 3-4 giornidal concepimento
Blastocisti
Espianto e messa in coltura
Crescita in terreno selettivo per le ES
Disaggregazione
1 passaggio
Linea pura
Trasfezione del vettore (elettroporazione)
Cellule ES
Selezione dellecellule knock out
Trasfezione delle ES
Strategia di selezione delle ES knock outDestino del DNA
Integrazione random
Integrazione sito specifica
Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000
Iniezione delle cellule ES nella blastocisti
- generazione di animali mosaico -
Incroci per l’omozigosi
F2Omozigoti 1:4Eterozigoti 1:2Wild type 1:4
Founder/wild type
F1/F1
REPORTER SYSTEMSTO STUDY DRUGS ACTIVE
THROUGH INTRACELLULARRECEPTORS
GFP
POL II, TF, co-regulators
ERERER
ER ER
ReporterERE
transcription
Reporter: easily detectable protein REPORTER MOUSE
INSULATOR( MAR )
INSULATOR
( MAR )
lightluciferin + ATP = oxyluciferin + AMP +
TKERE 2x
firefly luciferase
+/- +/-
ERE-Luc reporter mouse
The ERE-Luc reporter mouse: a model to study of ER transcriptional activity
Ciana et al., 2001
ERE
kinase-dependent activation
i.p. of D-luciferin
20 min.
Evaluation of ER transcriptional activity
5 min. after the acquisition
18.516.514.513.5 15.5
ERE-Luc mouse
ER is transcriptionally active at day 14.5 pc
dpc (day post conception)
ERE-Luc mouse
P118.516.514.513.512.5
dpc (day post conception) post-natal day 1
endoderm mesoderm ectodermimaging IHC
A B C D
E
F
G
H
C – intestine 20xD – bone 40xE – heart 40xF – forebrain 10xG – moustache 40x H – skin 20x
16.5 dpc 16.5 dpc
GP Rando, 2007
ERE-Luc mouse bone
0
2
4
6
thymus
0
1
2
3
4
brain
0
5
10
15
20
P E M D2
intestine
0
4
8
12
16
bone
0
2
4
6
thymus
0
1
2
3
4
brain
0
5
10
15
20
LU
CIF
ER
AS
E A
CT
IVIT
Y (
RL
U)
P E D
intestine
0
4
8
12
16liver
0
10
20
P E M D2
ovaries
0
2
4
uterus
1
3
5
7
9
0
6
12
liver
0
10
20
P E D2P E D
ovaries
0
2
4
uterus
1
3
5
7
9
0
6
12hypothalamus
M D P E
Est
rad
iol
(pg/m
l)
1020
30
40
50
day 1 day 2 day3 day 4
SESTRUS
E2
(p
g/m
l)
1020304050
M D P E
Luciferase activity in adult, cycling females
Ciana et al, Nature Ned., 2003
Suckling Mice
Pregnancy &
EmbryoDevelopment
13.5
14.5
15.5
16.5
17.5
18.5
19.5
12.5
DAY 18.5
DAY 16.5
DAY 13.5
DAY 14.5
DAY 15.5
DAY 1
DAY 10
Immature Mice
Adult Mice
LIFE
CYCLE
ERE-Luc mice to understand ER involvement in mammals physiopathology
MOLECULAR IMAGING IN LIVING SMALL ANIMALS
Functional Magnetic Nuclear Resonance
Optical imagingBioluminescence
Ultrasound
MicroPETPositron emission tomography
Nuclear imaging
Micro SPECTsingle-photon emission
computerized tomography
2/06
Fluorescence
PARTICULARLY, IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH!
ONE PICTURE IS WORTH TEN THOUSAND WORDS(Frederic Barnhard 1927)
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