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AEB2011 1Marc Bonneu ESTBB 2008
Les approches protéomiques
Plan
1-Séparation des protéines par électrophorèse
2-Identification des protéines par spectrométrie de masseCarte peptidiqueSéquençage peptidique 3-Quantification des protéinesComparaison gel 2DMarquage isotopiqueLabel Free
4-Caractérisation des protéinesInteractions protéine-protéineModifications post-traductionnelles
SDS-PAGE
1-Séparation des protéines par électrophorèse
Avantage : • toutes les protéines y compris les
protéines membranaires
Inconvénient :• Plusieurs protéines dans la même
bande• Les petites protéines migrent toutes
ensemble au niveau du front de migration
Petites protéines emprisonnées dans des micelles de SDS
Remplacement de la glycine par un tripeptide de glycine (Tricine)
Tris-Tricine
1-Séparation des protéines par électrophorèse
pI
taille
Avantages :Excellente résolution
Les limites :
Protéines majeuresProtéines solubles4 < pI <1115 000 Da < PM < 150 000 Da
IPG/SDS-PAGE
1-Séparation des protéines par électrophorèse
16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride)
Détergent cationique16-BAC
SD
S
16-BAC/SDS-PAGE
1-Séparation des protéines par électrophorèse
Avantages :Séparation des protéines hydrophobes possible
Les limites :Résolution réduite
SyproRuby
1 2 3 4 5 6 7
Bleu Colloïdal
1 2 3 4 5 6 7
ProQ diamond
1 2 3 4 5 6 7
Nitrate d’argent
1 2 3 4 5 6 7
Coomassie R250
1 2 3 4 5 6 7
Ruthenium 16µl/L
1 2 3 4 5 6 7
1: 1000 ng/ protéine2: 500 ng/ protéine3: 250 ng/ protéine4: 125 ng/ protéine5: 62.5 ng/ protéine6: 31.25 ng/ protéine7: 15.6 ng/ protéine
La détection des protéines sur gel
1-Séparation des protéines par électrophorèse
Limite de détection
Gamme dynamique
Coloration au bleu de Coomassie 500 ng 1 ordre
Coloration au bleu de Coomassie colloïdal classique 100 ng 2 à 3 ordres
Coloration au bleu de Coomassie colloïdal rapide 20 ng 2 à 3 ordres
Coloration au nitrate d’argent 10 ng 1 ordre + prot spécifique
Coloration au nitrate d’argent non compatible avec la masse 1 ng 1 ordre + prot
spécifique
SyproRuby®, DeepPurple®, Ruthénium 1 ng 3 ordres
Marquage radioactif 0.000 2 ng excellente
1-Séparation des protéines par électrophorèse
La détection des protéines sur gel
La gamme dynamique est définie comme le rapport du signal maximal mesurable sur le signal minimal mesurable
Spectromètre de masse : mesure précise du rapport m/z d’un ion
peptideou
protéineion m/z
m : masse de l’ionz : valence de l’ion
unité : Thompson
Ionisation Analyseen m/z
H+ Spectromètre de Masse
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
protéine gène
Pourquoi le spectromètre de masse mesure le rapport m/z ?
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
+
++
+
+ Champ électrostatique
m = 1000 Da
m = 1000 Da
m = 2000 Da
m/z =
m/z =
m/z =
1000 + 1
1000 + 2
2000 + 1
1
2
1
= 1001
= 501
= 2001
H+ = 1 Da
Vide suffisant
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
m/z =
m/z =
m/z =
1000 + 1
1000 + 2
2000 + 1
1
2
1
= 1001
= 501
= 2001
H+ = 1 Da
501
1001
2001
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
m/z =
m/z =
m/z =
1000 + 1
1000 + 2
2000 + 1
1
2
1
= 1001
= 501
= 2001
H+ = 1 Da
501
1001
2001
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
m/z =
m/z =
m/z =
1000 + 1
1000 + 2
2000 + 1
1
2
1
= 1001
= 501
= 2001
H+ = 1 Da
501
1001
2001
Le massif isotopique
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Le massif isotopique
x 12C(x-1) 12C + 1 13C
(x-2) 12C + 2 13C
La différence de masse entre deux pics
successifs d’un massif isotopique est égale à
1Da
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
x 12C(x-1) 12C + 1 13C
(x-2) 12C + 2 13C
La différence de masse entre deux pics
successifs d’un massif isotopique est égale à
1Da
a Th a Th
Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ?
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
x 12C(x-1) 12C + 1 13C
(x-2) 12C + 2 13C
La différence de masse entre deux pics
successifs d’un massif isotopique est égale à
1Da
a Th a Th
a = 1 z = 1a = 0.5 z = 2
a = 0.33 z = 3
Protéine àidentifier
Peptides générés par protéolyse
Spectre MS expérimental
YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD
LKLLIHGFDSQASDRFGNHGGTKTRFDFEEKYILMNPRTHSEIK
Séquences des protéines
Peptides générés in silico
Spectres MS théoriques
Comparaison
m/z
I
m/z
I
KK
K
K
R
R
Carte peptidique
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Protéine Peptides générés par protéolyse
Spectre MS expérimental
YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD
LKLLIHGFDSQASDRFGNHGGTKTRFDFEEKYILMNPRTHSEIK
Séquences des protéines
Peptides générés in silico
Spectres MS2
théoriques
Co
mp
arai
sonm/z
I
m/z
I
KK
K
K
R
R
m/z
I
Spectre MS2 expérimental
Séquençage peptidique
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
découpage
Digestion in-gel
Identification par spectrométrie de masse
LC/MS/MS
Compilation et élimination de la
redondance
Identification des protéines dans un mélange complexe
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
trypsine
Protéines
dénaturation
Peptides
pH 3.5 pH 10
24 cm
32 morceaux
électrophorèse
Identification par spectrométrie de masse
LC/MS/MS
Compilation et élimination de la
redondance
Strip IPG
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
Digestion in-gel
Carte peptidique séquence peptidique
Identification par MS
RapidePeu coûteux
Attention à l’overlapping
Identification systématique des protéines d’un protéome
2-Identification des protéines par spectrométrie de masse
3-Quantification des protéines
Quantification relative par électrophorèseQuantification relative spectrométrie de masse
Marquage isotopiqueSILACICATiTRAQ
Label FreeQuantification absolue par spectrométrie de masse
Comparaison de l’abondance des protéines entre des états physiologiques différents
synthèse dégradationabondance
modificationmodification
synthèse abondance dégradation
F1 F2
Identification par MSCarte peptidiqueSéquence peptidique
Quantification relative par électrophorèse bidimensionnelle
3-Quantification des protéines
La spectrométrie de masse n’est pas quantitative
I
m/z
MS
1 Protéine Digestion Peptides
équimolaires
p
3-Quantification des protéines
La spectrométrie de masse n’est pas quantitative et pourtant …
I
m/z
MS
1 Protéine Digestion Peptides
équimolaires
I
m/z
MS
Peptide p 14N
Peptide p 15N
p
I
m/z
MSI
m/z
MS
1:11:2
1:10
3-Quantification des protéines
SILAC
ICAT
iTRAQ
Digestiontrypsique
échantillon
protéine
peptide
Spectrométrie de masse
La comparaison par marquage isotopique et analyse MS
Marquage isotopique
3-Quantification des protéines
iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification
reporter balance
114 31+ 145115 30+ 145116 29+ 145117 28+ 145
Groupementréactif
H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…
R1 R2
H3CN
NN
OO
O
O
3-Quantification des protéines
Mélange
MarquageiTRAQ 114
protéine
protéolyse
t0 T0+20 min
MarquageiTRAQ 115
protéine
protéolyse
T0+40 min
MarquageiTRAQ 116
protéine
protéolyse
T0+60 min
MarquageiTRAQ 117
protéine
protéolyse
3-Quantification des protéines
iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification
114 31
115 30
116 29
117 28in
ten
sit
é
m/z
MS
inte
nsit
é
m/z
MS/MS
inte
nsit
é
m/z
11
41
15
11
61
17
peptidebalancereporter
peptidebalancereporter
peptidebalancereporter
peptidebalancereporter
3-Quantification des protéines
iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification
quanti
té
temps de rétention
Label Free
LC/MS/MS
inte
nsi
té
m/z m/z m/z m/z
MS MS MS MS
C18
3-Quantification des protéines
Label Free
inte
nsi
té
m/z m/z m/z m/z
MS MS MS MS
inte
nsi
té
Même temps de rétention
3-Quantification des protéines
Label Free
inte
nsi
té
Même temps de rétention
inte
nsi
té
Même temps de rétention
Échantillon 1
Échantillon 2
3-Quantification des protéines
Protéines dont protéine P à doser
protéolyse
Peptides dont peptide p de la protéine p
Peptide p marqué par un isotope stable(quantité connue)
Analyse par LC/MS/MS
La quantification absolue : AQUA®
3-Quantification des protéines
m/z
MS
Peptide p Peptide p AQUA®
3-Caractérisation des protéines
Complexe protéique AgglomératsModification
post-traductionnelle
Complexe protéique
Le système double hybrideBlue Native / SDS-PAGECo-immunoprécipitationFar WesternPurification :
-Pull down-Purification des interactants par chromatographie d’affinité-Co-purification : TAP-tagPuce à protéinePhage displayComplémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC)Transfert d’énergie de fluorescence par résonanceRésonance plasmonique des surfaces
3-Caractérisation des protéines
promoteur reporteur
Gal4p
TA
DB
TA
DB
signal
Gal4p active la transcription de GAL1 et GAL10
Le système double hybride
3-Caractérisation des protéines
XY
promoteur reporteur
X
Y
TA
DB
+
signal
Le système double hybride
3-Caractérisation des protéines
Principe BN/SDS-PAGE
BN-PAGE
SD
S-P
AG
E
BN
-PA
GE
1ère dimensionBleu de Coomassie
Gradient
2ème dimensionÉquilibrationSDS
Mercaptant
dessalage
Détergent neutre
Complexes membranaires
Complexes cytosoliques
pH
3-Caractérisation des protéines
4% 18% 7% 12 %
complexes hétéromultimériques cytosoliques
3-Caractérisation des protéines
La co-immunoprécipitation
Extrait
Anticorps spécifique
de
+Protéine A sépharose
Identification par
spectrométrie de masse
SDS-PAGE
3-Caractérisation des protéines
Le Pull Down
lysat
+GST
GST GST
GST
Glutathion sépharose
GST
GST
GST
Identification par
spectrométrie de masse
SDS-PAGE
Glutathion sépharose
GST
GST
GST
GST
Variantes :-fixation préalable de la protéine de fusion sur la colonne de Glutathion séparose-autres étiquettes : 6His, Streptavidine, HaloTag, …
3-Caractérisation des protéines
NHS activated sepharose™
lysat
Identification par
spectrométrie de masse
SDS-PAGE
La purification des interactants par chromatographie d’affinité
3-Caractérisation des protéines
La co-purification : TAP-Tag
Protéine appât
Calmoduline Binding Peptide
Site de clivage de la protéase du TEV
Fragment ZZ de la protéine A
IgG Sepharose
CalmodulineSepharose
1
2
3
3-Caractérisation des protéines
Le phage display
Banque de phageM13 avec PIII rec
ou PVIII rec
Sélection Lavage Elution
Amplification et re-sélection
3-Caractérisation des protéines
Le Far Western
Transfert sur membrane
Renaturation Incubation avec la protéine
appât
Incubation avec l’anticorps dirigé
contre la protéine appât
Révélation avec un anticorps secondaire
Découpage de la zone
Identification par spectrométrie de
masse
3-Caractérisation des protéines
Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC)
Protéine A Linker NYFP
1 154
Protéine B Linker CYFP155 233
3-Caractérisation des protéines
Transfert d’énergie de fluorescence par résonance
Y YX
FRET
X
3-Caractérisation des protéines
Résonance plasmonique des surfaces
Source de lumière
Unité de détection optique
Prisme
Puce avec film d’or
Canal
Lumière polarisée Lumière réfléchie
Angle
Inte
nsité
3-Caractérisation des protéines
Puce à protéine
3-Caractérisation des protéines
Agglomérats
Problème récurrent en bioproduction
Mise au point du process de production
Mesure de la masse du produit purifié
3-Caractérisation des protéines
Modificationpost-
traductionnelle
Mesure de masse exacte de la protéine
Exemple : Masse mesurée = 65 864,338 DaMasse calculée = 65 928,435 Da
+58 Carboxymethyl (on Cysteine)+60 sodium + potassium+64 Selenocysteine (from Serine)+67 Asp transamidation with piperidine+68 3,5-Dichlorination (of Tyrosine with 35Cl)
D masse = + 64,097
3-Caractérisation des protéines
Modificationpost-
traductionnelle
MS
fragmentation
protéolyse
MS2
MS3MS4
3-Caractérisation des protéines
Merci de votre attention