AFLATOXINAS

Un poco de Historia.

o Las aflatoxinas cobraron importancia a partir de la muerte repentina en Escocia (1960), de cien mil pavos alimentados con maní infectado con una especie fúngica: Aspergilus flavus proveniente del Brasil. Los micelios de ésta y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de colonizar semillas de maní, girasol, algodón, soya, avellanas, almendras y cereales y sus derivados dispuestos en sacos o silos.

o En 1961-1962 comenzaron a aparecer publicaciones en las que se ponía en manifiesto la presencia de una sustancia tóxica, más tarde llamada aflatoxina, en la harina de cacahuate procedente de África, Brasil y otras zonas.Tiempo después los investigadores británicos demostraron que se trataba del metabolito de un hongo Aspergillus flavus.

o La AOAC creó un grupo de trabajo encargado de establecer la metodología más idónea para la determinación de aflatoxinas, este grupo emitió varios reportes que culminaron en la adopción de un método oficial en 1966.

¿Qué son?

Las aflatoxinas, al igual que otras micotoxinas son metabolitos secundarios generalmente tóxicos producidos por algunas especies fúngicas. Las aflatoxinas son producidas principalmente por algunas especies de aspergilus tales como: A. flavus, A. parasiticus y A. nominus

Las más tóxicas son la AFLATOXINA M1 (AFM1) (derivado metabólico de la AFLATOXINA B1 y que se forma dentro del organismo animal), la AFLATOXINA B1 (AFB1) y la AFLATOXINA G1 (AFG1). Las notaciones B y G se refieren al hecho de que estos compuestos presentan fluorescencia azul (blue) y verde (green), respectivamente, cuando se exponen a la radiación UV.

¿Dónde se pueden encontrar?

Las aflatoxinas se pueden encontrar en cereales y sus subproductos, ensilados, piensos, carne y pescado secos, forrajes, frutos secos, especias, leche y derivados y otros alimentos para humanos. Los hongos que producen las aflatoxinas son capaces de desarrollarse en gran variedad de sustratos, pudiendo contaminar los alimentos cuando éstos son cultivados, procesados, transformados o almacenados en condiciones adecuadas que favorezcan su desarrollo. De forma interesante, se habla de que casi la mitad de los cacahuates recién recolectados contienen esporas de Penicillium y/o Aspergillus.

Factores de Riesgo

El crecimiento y la producción de toxinas dependen de muchos factores como el alimento en cuestión, su grado de acidez, la temperatura o humedad ambientales y la presencia de microflora competidora.

Los alimentos con cierta humedad (superior al 15%), almacenados en condiciones de alta temperatura (más de 25ºC) y alta humedad ambiental (más del 85%), son un sustrato ideal

para el desarrollo de estos hongos productores de micotoxinas; el riesgo es mayor cuando existe una elevada proporción de granos dañados ó partidos, cuando el alimento está molido, y cuando el tiempo de almacenamiento es prolongado. No obstante, se debe tener presente que no todos los hongos producen micotoxinas; y a su vez, puede haber micotoxinas y ya no hongos.

¿Qué daños causan a la salud?

Son cancerigenas, teratogenicas y mutagenicas, hepatotoxicas e inmunosupresivas.

Teratogénicas: que puede originar alteraciones en el feto durante su desarrollo intrauterino originándole malformaciones.Mutagénicos: que pueden producir alteraciones en el material genético de las células (mutaciones).Hepatotoxico: que causa daño a las células del hígadoInmunosupresor: Que suspende la respuesta inmunitaria del organismo ante determinados tratamientos médicos

La acción carcinogénica de las aflatoxinas ha sido demostrada en ratas, truchas y hurones. Usando alimento con aflatoxinas se demostró que 0,5 ppm. en la dieta inducen en un 100% carcinoma hepático en ratas. Hay mayores evidencias en aquellas áreas del mundo donde se ha incrementado la incidencia de carcinoma hepático en la población expuesta a las aflatoxinas donde la nutrición proteica es deficiente.

Se produce la aflatoxicosis aguda cuando se consumen niveles medios a altos de aflatoxinas. Los efectos de esta intoxicación pueden incluir hemorragia, daño agudo del hígado, el edema, la alteración en la digestión, la absorción y/o el metabolismo de alimentos, y posiblemente la muerte.

La aflatoxicosis crónica resulta del consumo de niveles bajos a moderados de aflatoxinas. Los efectos son generalmente subclínicos y difíciles de reconocer. Algunos de los síntomas comunes son una difícil y deteriorada absorción de los alimentos e índices de crecimiento más lento.Para que un animal (o ser humano) haya muerto por causa de aflatoxinas debió ser suministrado con grandes dosis de las mismas -y 'posiblemente' durante largo tiempo-, esto pone en duda la cadena entera de control de calidad sobre la que el gobierno nacional (además de la empresa) tiene una gran cuota de responsabilidad.

Los principales órganos afectados son hígado, riñón y cerebro.

¿Cómo se determina su presencia?

En la elección de un método para la determinación de aflatoxinas se debe considerar el nivel de instrumentación y la experiencia requeridos, el costo del ensayo, el número de muestras que se necesitan, la sensibilidad requerida, la precisión, la exactitud y la especificidad.

Preparación de la muestra

En cualquier determinación analítica de alimentos, los resultados del método más sofisticado significan poco si no se ha obtenido una muestra representativa de todo el producto.

Puesto que las micotoxinas no están distribuidas homogéneamente en el grano o en los piensos, la toma de muestra de pienso o grano que proporcione una idea correcta en un análisis de micotoxinas es difícil. Tomas individuales generalmente proporcionan bajas estimaciones del contenido en micotoxinas. De hecho, casi el 90% del error asociado a los análisis de micotoxinas puede ser atribuido a como se tomó la muestra original.Esto se debe a que aproximadamente un 3% de las semillas en un lote contaminado contienen micotoxinas, y que estas semillas contaminadas no están generalmente igual distribuidas en el lote de granos.

En el anexo 1 de la Directiva 98/53/CE (Comunidad Europea) de la Comisión de 16 de Julio de 1998, se establecen las disposiciones (nº muestras elementales, peso de la muestra elemental, condicionamiento y conservación de las muestras, etc.) para el control oficial del contenido de aflatoxinas en determinados productos alimenticios, entre ellos cacahuetes, frutos de cáscara, frutos desecados y cereales.En México la NOM-188-SSA-1-2002 Productos y Servicios. Control de aflatoxinas en cereales para consumo humano y animal. Especificaciones sanitarias. Establece las condiciones en las que se debe llevar a cabo el muestreo.

Con este patrón de contaminación, es absolutamente necesario realizar metodologías sistemáticas en el muestreo, la preparación de la muestra y el análisis para poder determinar de aflatoxinas del orden de las ppb.

El procedimiento general de muestreo es el siguiente:

1. Reducción del tamaño de partícula

Moler toda la muestra junta hasta reducir el tamaño de partícula hasta el mínimo que sea práctico y manejable.

2. Homogenización

Se debe mezclar la muestra perfectamente para garantizar la distribución de las posibles porciones contaminadas. De esta forma, la porción de muestra a la que se va a realizar la prueba analítica tiene la misma concentración de aflatoxina que la muestra original.

Extracción y purificación de la muestra

La detección de minúsculas cantidades de aflatoxinas en los alimentos hace necesario que las toxinas se separen de compuestos presentes en la muestra que puedan interferir en la determinación. Se realiza una extracción inicial para remover la toxina de la matriz del alimento, pero se extraen a la vez otros compuestos. Estos compuestos pueden interferir en la determinación analítica, por lo que una etapa de purificación es necesaria.

PRIMERA PARTE: La extracción

o La muestra homogénea y finamente dividida se somete a agitación a alta velocidad en la presencia del sistema de disolventes para la extracción

o Los disolventes más utilizados son: acetona-agua (85:15) y cloroformo-agua (91:9). Los disolventes orgánicos se combinan con pequeñas cantidades de agua para incrementar la penetración del sistema en el tejido hidrofílico del alimento.

o La fase acuosa puede ser una solución ácida que rompa las interacciones entre las toxinas y los constituyentes del alimento (como las proteínas), aumentando la eficiencia de la extracción

o Después de la extracción la solución se filtra para separar los residuos sólidos, y entonces queda lista para los procedimientos de purificación

SEGUNDA PARTE: La purificación

o En muestras con gran cantidad de lípidos, éstos pueden extraerse después de la extracción utilizando disolventes no polares como el hexano

o Es esencial la eliminación de compuestos fluorescentes, pues la propiedad de las toxinas que se usa en la determinación es precisamente su fluorescencia

o Se usan columnas cromatográficas para purificar los extractos de aflatoxina. Esas columnas pueden ser empacadas en el laboratorio o comprarse ya listas para su uso

o El extracto se hace pasar a través de la columna de sílica-gel usando un disolvente no polar. Las toxinas se quedan atrapadas en la matriz, mientras que el disolvente no polar arrastra todos los compuestos de interferencia (como los lípidos). Las toxinas se recuperan de la columna eluyendo con un disolvente más polar

o Además del sílica-gel, se usan como adsorbentes Florisil R, Sephadex R, óxido de aluminio, celulosa y poliamida

o Las columnas que se venden preempacadas tienen la ventaja de un empacado más uniforme, menor cantidad de tiempo y de disolventes, pero son menos versátiles, pues no pueden adaptarse a los requerimientos de cada muestra

o Una vez que el extracto se ha purificado es necesario concentrarlo. Esto se logra usando un evaporador rotatorio bajo presión reducida, de forma que sean suficientes pequeños incrementos de temperatura para concentrar la muestra a sequedad

o Después de la concentración de la muestra a sequedad, puede redisolverse en un pequeño volumen de disolvente compatible con el sistema de determinación

Técnicas para la cuantificación de aflatoxinas

Métodos cromatográficos

La cromatografía es un proceso en el cual los componentes de una mezcla pueden ser físicamente separados para su identificación y cuantificación. Generalmente la mezcla en una fase móvil se hace pasar por una fase estacionaria (llamada matriz), y los diferentes componentes de la mezcla se separan de acuerdo con una propiedad particular.

Métodos de minicolumnas

o Es un método barato y rápido

o Permite monitorear un gran número de muestras usando personal sin entrenamiento científico

o El método fue primero descrito por Romer (1975) y adaptado por Stanley y colaboradores (1979)

o Una minicolumna de 6 x 190mm es empacada con una capa de fibra de vidrio en el extremo inferior, seguida por una capa de sulfato de calcio, Florisil como adsorbente, aluminia y otra capa de sulfato de calcio

o El extracto de la muestra en cloroformo es colocado en la minicolumna y se deja migrar hacia abajo

o Se adiciona como disolvente de elución cloroformo-acetona (9:1)

o El sulfato de calcio sirve para secar la muestra, mientras que la alumina atrapa muchos de los compuestos de interferencia

o Las aflatoxinas quedan atrapadas en una banda en la parte superior de la capa de Florisil, y son examinadas bajo luz UV

o Se puede estimar la concentración de aflatoxinas en la muestra comparando la intensidad de la fluorescencia de la minicolumna de la muestra con una columna a la que se adicionó una cantidad conocida de aflatoxinas estándar

o La sensitividad del método no es muy grande (5-15 g/kg)

o Se usa sólo como método preliminar para la aplicación de otros métodos más sofisticados en caso de un resultado positivo

Cromatografía en capa fina. TLC (Thin-Layer Chromatography))

o Es otra técnica analítica barata que puede ser ejecutada usando equipo básico de laboratorio

o Es un método de multidetección por el que pueden determinarse la mayoría de las micotoxinas de interés.

o Es un procedimiento semicuantitativo que frecuentemente está limitado por tener una baja precisión y una baja eficiencia cromatográfica

o Se realiza en una capa delgada de material adsorbente soportada por vidrio inerte o una charola plástica

o El adsorbente es generalmente sílica-gel

o La fase móvil es el sistema de disolventes que se coloca en un recipiente junto con el plato (el plato debe traer aplicado el extracto con la muestra, y el nivel del disolvente no debe llegar a la altura de la muestra)

o El disolvente se deja migrar hacia arriba por el adsorbente, arrastrando la mezcla de componentes en diferentes grados de acuerdo con su afinidad por las fases móvil y estacionaria

o Se calcula el valor del Rf después de revelar la placa con luz UV:

o

o El valor del Rf de la muestra se compara con el valor del Rf para estándares de aflatoxina colocados en la misma placa. De esta forma es posible identificar las aflatoxinas

o Los sistemas de disolventes más usados son los que se muestran a continuación:

Sistema de Disolventes

1ª Dirección 2ª Dirección

Cloroformo-Acetona 90:10

Éter-Metanol-Agua 96:3:1 Cloroformo-Acetona 9:1

o La cromatografía en una sola dirección se usa para muestras que han sido altamente purificadas

o La presencia de altas concentraciones de compuestos de interferencia puede ser compensada empleando cromatografía en dos direcciones

o Se corre la cromatografía en una dirección y se deja secar la placa. La mezcla de disolventes Éter-Metanol-Agua sirve para arrastrar los componentes lipídicos que no fueron removidos en la purificación

o La placa se rota 90° y se realiza la segunda cromatografía usando cloroformo-acetona

o Los estándares deben colocarse en forma diagonal para que no interfieran con la migración de la muestra

o Como en la cromatografía unidireccional, la placa se revela con UV, se calculan los valores de Rf y se compara la muestra con los estándares

o Las concentraciones aproximadas de aflatoxina se determinan comparando las intensidades de color con los estándares de concentración conocida

Cromatografía líquida de alta resolución HPLC

En este caso se emplea una columna de fase inversa (C18), seguida la separación de una reacción de derivatización para proveer a la aflatoxina de la fluorescencia necesaria para poder cuantificarse. Previamente a la separación por HPLC se puede aislar selectivamente una micotoxina enconcreto, mediante una columna de inmunoafinidad conteniendo anticuerpos específicos de la micotoxina en cuestión.

o La fase móvil es colocada a alta presión y es forzada a través de una columna que contiene la fase estacionaria

o Es un método más eficiente y preciso que el TLC

o Puede estar adaptado a una computadora, con lo que la determinación se vuelve completamente automatizada

o Requiere un tiempo largo de análisis para una muestra sencilla, los instrumentos son caros y requiere un alto nivel de experiencia para operar y mantener el equipo

o Las muestras que se van a analizar por HPLC requieren mucho más pureza

o HPLC de fase normal: las columnas son de sílica gel y se usa cloroformo-cloruro de metileno. Los detectores están equipados con detectores de fluorescencia. El problema es que la fluorescencia de B1 y B2 es muy débil en los disolventes no polares utilizados

o HPLC de fase reversa: la fase estacionaria es de octadecilsílca no polar y se usan disolventes polares (agua-acetonitrilo-metanol). B1 y G1 casi no presentan fluorescencia en disolventes polares, pero pueden convertirse a sus hemiacetales fluorescentes haciendo reaccionar el extracto de la muestra con ácido TFA. Un método alternativo es hacer reaccionar las toxinas con yodo/agua después de la HPLC, lo que incrementa su fluorescencia

Métodos biológicos

En los bioensayos se usa una gran variedad de sistemas biológicos para probar la presencia de aflatoxinas. El único bioensayo aceptado por la AOAC es en embriones de pollo.

o Extractos crudos de micotoxinas o de estándares son inyectados en la bolsa de aire de embriones de pollo antes de la incubación

o Se construye una curva de dosis respuesta con las concentraciones de estándar

o En la curva anterior se interpola el valor de respuesta obtenido para la muestra

Métodos inmunológicos

El análisis de aflatoxinas usando inmunoensayos se basa en el hecho de que los animales que están expuestos a macromoléculas extrañas sintetizan proteínas reactivas llamadas anticuerpos, que son específicos para esos antígenos. Las aflatoxinas son demasiado pequeñas y por sí mismas no causan una respuesta inmunológica. Pero si se inyectan a los animales acopladas con macromoléculas antigénicas, los anticuerpos resultantes pueden ser utilizados para fines analíticos.

A. Radioinmunoensayo RIA

o Su principio es la competición entre las aflatoxinas de una muestra y aflatoxinas estándar marcadas radiactivamente, por un limitado número de sitios en los correspondientes anticuerpos

o El extracto de la muestra es incubado con el correspondiente anticuerpo y la toxina marcada

o La toxina libre y la unida son separadas y el nivel de inhibición ejercido por la muestra en la unión de la toxina marcada y el anticuerpo puede ser determinado. Este valor es comparado con una curva estándar obtenida incubando concentraciones variables del estándar de toxina en las mismas condiciones

o La sensibilidad del ensayo es proporcional a la pureza del extracto

o Procedimiento

o El extracto purificado o el estándar de aflatoxina se disuelven en buffer de fosfato y se incuban con la toxina marcada radiactivamente y con una dilución apropiada del anticuerpo

o Se separa la toxina libre de la unida precipitando el complejo toxina-anticuerpo con una solución saturada de sulfato de amonio, centrifugando y decantando

o La cantidad de toxina libre marcada radiactivamente es determinada midiendo el nivel de radiactividad emitido por el sobrenadante

o La cantidad de toxina unida marcada radiactivamente es determinada midiendo la radiactividad del precipitado

B. ELISA

o Es similar al RIA, pero de mayor sensitividad y menor variabilidad. También está basado en la unión competitiva entre las toxinas libres de la muestra y toxinas marcadas con sitios en un anticuerpo

o Usa un conjugado enzima-toxina como el marcador

o Después de incubar con la muestra, la cantidad de complejo enzima-toxina unida al anticuerpo es determinada adicionando un sustrato para la enzima

o El producto de la reacción catalizada por la enzima puede ser cuantificado espectrofotométricamente, midiendo la cantidad de complejo enzima-toxina unida al anticuerpo, y con ella la cantidad de toxina en la muestra

o No involucra compuestos radiactivos, por lo que puede considerarse más seguro

o Requiere menos tiempo

o Pueden determinarse varias muestras a la vez

Procedimiento del ELISA

o Una fase sólida (placas o tubos de poliestireno) es pretratada con albúmina sérica bovina y glutaraldehído

o Se adicionan los anticuerpos diluidos en buffer

o La placa se deja secar al aire y puede ser guardada hasta 3 meses en desecador sin perder su reactividad

o Se mezcla el extracto de la muestra o el estándar de aflatoxinas con el conjugado enzima-toxina

o Se adiciona la mezcla anterior a la placa con anticuerpos y se incuba durante 1 hora a 37°C

o Se lava la placa repetidamente con una mezcla Tween-buffer para remover la toxina o el conjugado enzima-toxina que no se unieron

o Se determina la cantidad de conjugado enzima-toxina unido a los anticuerpos adicionando a la placa el sustrato de la enzima, que es convertido a cromóforo para leer su absorbancia

C Kits comerciales

o Basados en la técnica enzimo-inmuno análisis competitivo. El principio básico de estos kits es la afinidad de las aflatoxinas por anticuerpos específicos fijados a un soporte.

o La reacción de competición entre la aflatoxina y un producto enzima/conjugado (coloreado) que contiene el kit indica la ausencia de aflatoxina cuando el resultado de la prueba es una señal coloreada, y presencia de las mismas en caso de ausencia de color.

o Estas técnicas permiten el control de las aflatoxinas in situ, de un modo rápido, fiable y sencillo.

Un ejemplo de estos Kits comerciales, es el Aflatest, el cual es aceptado, tanto por la normatividad mexicana, como por la AOAC

AflaTest de VICAM es el único análisis de aflatoxina que da resultados numéricos precisos. Usando la cromatografía de afinidad monoclonal, AflaTest puede aislar aflatoxinas B1, B₂, G1, y G2 de alimento para consumo animal y humano y granos, a niveles tan bajos como 0.1 ppb y tan altos como 300 ppb. Puede ser ejecutado en menos de 10 minutos y no requiere habilidades especiales. Los resultados pueden ser registrados utilizando una

lectura de fluorómetro digital con dispositivo automático de impresión. AflaTest es también ideal como el paso de limpieza total para cualquier análisis de HPLC.

Limite permitido de AflatoxinasDe acuerdo con la Norma oficial mexicana NOM-188-SSA-1-2002 granos y cereales para consumo animal y humano, la contaminación no debe exceder de 20 µg/kg de aflatoxinas totales en granos y cereales para consumo humano. En granos y cereales para consumo animal se aceptan concentraciones de 21-300 µg/kg.

Bibliografía

o AOAC Official Methods of Analysis. 16ª ed. 1995.

o Kirk, R.S. et.al. Análisis químico de alimentos de Pearson

o Fung, Daniel et.al. Instrumental Methods for Quality Assurance in Foods. EUA, ASQC Quality Press, 1991.

o Food science and technology, a series of monographs. HPLC in food analysis. EUA, academic press limited. 1988.

o http://www.adiveter.com/ftp/articles/articulo578.pdf?PHPSESSID=ccce4496d48378e78c40cc0c471d7e4a

o http://es.msnusers.com/Alimentosanalisis/Documentos/Archivos%2DAlumnos/ASOCIADOS%20A%20CEREALES%20%2D%20ALUMNOS%2EDOC

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICOFacultad de química

Análisis de alimentos.

Aflatoxinas

Profra: M.C Fca. Aida Iturbe Chiñas

Alumnas:Cova Pérez CeciliaPérez Hernández Alejandra

Mayo 2007

Cromatografía líquida de alta resolución HPLC

En este caso se emplea una columna de fase inversa (C18), seguida la separación de una reacción de derivatización para proveer a la aflatoxina de la fluorescencia necesaria para poder cuantificarse. Previamente a la separación por HPLC se puede aislar selectivamente una micotoxina enconcreto, mediante una columna de inmunoafinidad conteniendo anticuerpos específicos de la micotoxina en cuestión.

o La fase móvil es colocada a alta presión y es forzada a través de una columna que contiene la fase estacionaria

o Es un método más eficiente y preciso que el TLC

o Puede estar adaptado a una computadora, con lo que la determinación se vuelve completamente automatizada

o Requiere un tiempo largo de análisis para una muestra sencilla, los instrumentos son caros y requiere un alto nivel de experiencia para operar y mantener el equipo

o Las muestras que se van a analizar por HPLC requieren mucho más pureza

o HPLC de fase normal: las columnas son de sílica gel y se usa cloroformo-cloruro de metileno. Los detectores están equipados con detectores de fluorescencia. El problema es que la fluorescencia de B1 y B2 es muy débil en los disolventes no polares utilizados

o HPLC de fase reversa: la fase estacionaria es de octadecilsílca no polar y se usan disolventes polares (agua-acetonitrilo-metanol). B1 y G1 casi no presentan fluorescencia en disolventes polares, pero pueden convertirse a sus hemiacetales fluorescentes haciendo reaccionar el extracto de la muestra con ácido TFA. Un método alternativo es hacer reaccionar las toxinas con yodo/agua después de la HPLC, lo que incrementa su fluorescencia

Métodos biológicosEn los bioensayos se usa una gran variedad de sistemas biológicos para probar la presencia de aflatoxinas. El único bioensayo aceptado por la AOAC es en embriones de pollo.

Métodos inmunológicos

El análisis de aflatoxinas usando inmunoensayos se basa en el hecho de que los animales que están expuestos a macromoléculas extrañas sintetizan proteínas reactivas llamadas anticuerpos, que son específicos para esos antígenos. Las aflatoxinas son demasiado pequeñas y por sí mismas no causan una respuesta inmunológica. Pero si se inyectan a los animales acopladas con macromoléculas antigénicas, los anticuerpos resultantes pueden ser utilizados para fines analíticos.

Radioinmunoensayo RIA

o Su principio es la competición entre las aflatoxinas de una muestra y aflatoxinas estándar marcadas radiactivamente, por un limitado número de sitios en los correspondientes anticuerpos

o

o Procedimiento

o El extracto purificado o el estándar de aflatoxina se disuelven en buffer de fosfato y se incuban con la toxina marcada radiactivamente y con una dilución apropiada del anticuerpo

o Se separa la toxina libre de la unida precipitando el complejo toxina-anticuerpo con una solución saturada de sulfato de amonio, centrifugando y decantando

o La cantidad de toxina libre marcada radiactivamente es determinada midiendo el nivel de radiactividad emitido por el sobrenadante

o La cantidad de toxina unida marcada radiactivamente es determinada midiendo la radiactividad del precipitado

ELISA

o Es similar al RIA, pero de mayor sensitividad y menor variabilidad. También está basado en la unión competitiva entre las toxinas libres de la muestra y toxinas marcadas con sitios en un anticuerpo

o Usa un conjugado enzima-toxina como el marcador

o No involucra compuestos radiactivos, por lo que puede considerarse más seguro

o Requiere menos tiempo

o Pueden determinarse varias muestras a la vez

Procedimiento del ELISA

o Una fase sólida (placas o tubos de poliestireno) es pretratada con albúmina sérica bovina y glutaraldehído

o Se adicionan los anticuerpos diluidos en buffer

o La placa se deja secar al aire y puede ser guardada hasta 3 meses en desecador sin perder su reactividad

o Se mezcla el extracto de la muestra o el estándar de aflatoxinas con el conjugado enzima-toxina

o Se adiciona la mezcla anterior a la placa con anticuerpos y se incuba durante 1 hora a 37°C

o Se lava la placa repetidamente con una mezcla Tween-buffer para remover la toxina o el conjugado enzima-toxina que no se unieron

o Se determina la cantidad de conjugado enzima-toxina unido a los anticuerpos adicionando a la placa el sustrato de la enzima, que es convertido a cromóforo para leer su absorbancia

Kits comerciales

o Basados en la técnica enzimo-inmuno análisis competitivo. El principio básico de estos kits es la afinidad de las aflatoxinas por anticuerpos específicos fijados a un soporte.

o La reacción de competición entre la aflatoxina y un producto enzima/conjugado (coloreado) que contiene el kit indica la ausencia de aflatoxina cuando el resultado de la prueba es una señal coloreada, y presencia de las mismas en caso de ausencia de color.

o Estas técnicas permiten el control de las aflatoxinas in situ, de un modo rápido, fiable y sencillo.

AflaTest de VICAM puede aislar aflatoxinas B1, B₂, G1, y G2 de alimento para consumo animal y humano y granos, a niveles tan bajos como 0.1 ppb y tan altos como 300 ppb.

Limite permitido de AflatoxinasNOM-188-SSA-1-2002 granos y cereales para consumo animal y humano, la contaminación no debe exceder de 20 µg/kg de aflatoxinas consumo humano. 21-300 µg/kg. Consumo anima