Agronomía Tropical

7/17/2019 Agronomía Tropical

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Agronomía Tropical. 39(4-6): 249-268.1989

PROPAGACION CLONAL DE PLANTAS DE CAFÉ (Coffea arabica L. 'Catimor') APARTIR DE MICROES!E"ES C!LTI#ADOS IN #ITRO

Eva G. de Garcia ! "argari#a $a%ael

&niver'idad en#ral de ene*+ela ,ac+l#ad de iencia'. en#ro de o#nicaTropical. Apdo. 4/114. araca' 1041. ene*+ela.

$E: %erero 225 1989.

RES!MEN

El ca%e#o a#imor (o%%ea araica var. a#+rra 7 írido de Timor ) con'#i#+!e +nc+l#ivar de par#ic+lar in#er' por la al#o re'i'#encia +e pre'en#a %ren#e a la ro!aanaran;ada (emilia va'#a#ri7 er< ! r.)5 cominada con impor#an#e' carac#erí'#ica'agron=mica' como 'on +ena calidad en #a*a5 al#o rendimien#o ! a;o por#e. En e'#e#raa;o 'e e'#+di= '+ micropropagaci=n5 #omando en c+en#a la in%l+encia den+#rimen#o' ! el e%ec#o de la' condicione' de crecimien#o de la plan#a donadora5 'oreel e'#alecimien#o ! prod+cci=n de ro#e' a par#ir de microe'+e;e' ai'lado' del ca%e#oa#imor c+l#ivado' in vi#ro. >o' e7plan#e' proceden#e' de plan#a' crecida' in vivapre'en#aron prolema' de o7idaci=n +e %+eron con#rolado' al colocar la' plan#a'donan#e' a +na a;a in#en'idad l+minica5 pre#ra#ando lo' e7plan#e' con +na me*claan#io7idan#e (300 mg?1 de cido a'c=rico @ 100 mg?1 de cido cí#rico5 previo a '+c+l#ivo en medio lí+ido con ci'#eína (60 mg?l). En lo' microe'+e;e' ai'lado' de

plan#a' in vi#ro 'e de#ermin= +e a+ello' con'#i#+ido' por el n+do apical pre'en#an+na ma!or capacidad de ro#aci=n in vi#ro +e lo' n+do' '+!acen#e'. &na al#oconcen#raci=n de A5 en#re 12 ! 16 mg?l5 permi#i= romper la la#encia de la' !ema'5incremen#ndo'e el porcen#a;e de e7plan#e' con ro#e' 'in A de B5=C a 62C.E'#+dio' mor%oana#=mico' compara#ivo' reali*ado' en plan#a' in vi#ro5 a lo' #re' me'a'de crecimien#o5 revelaron la pre'ervaci=n de carac#erí'#ica' ;+venile'. >o' clc+lo'reali*ado' a'ado' en lo' re'+l#ado' o#enido' perrni#en a%irmar +e el rendimien#opo#encial de la me#odología empleada en e'#e #raa;o (B /93 a 10 98B v'#ago' en +naDo)5 para la propagaci=n vege#a#iva del a#imor5 e' '+perior al repor#ado para lo'm#odo' or#ícola' convencionale' (100 a 200 v'#ago' en do' aDo').

P.C.: Coffea arabica, cultivo de tejidos, microesquejes, regeneración.

INTROD!CCION

E1 ca%e#o a#imor (o%%ea araica cv. a#+rra $o;o 7 írido de Timor) e' +nc+l#ivar de par#ic+lar impor#ancia5 !a +e comine +na al#o re'i'#encia a #oda' o ca'i#oda' la' ra*a' conocida' de la ro!a anaran;ada (emileia va'#a#ri7) con carac#erí'#ica'agron=mica' de'eale' como: a;o por#e5 rendimien#o5 vigor5 a'í como calidad de laeida idn#ica a la' Farica'F #radicionale' (2).



e e'#ima +e la propagaci=n a gran e'cala de geno#ipo' de ca% me;orado' medion#em#odo' or#ícola' convencionale' #omaría m' de 30 aDo'5 #iempo +e re'+l#adema'iado largo en vi'#a de la amena*a inminen#e de la ro!a. &na po'ile 'ol+ci=n alprolema e' la propagaci=n vege#a#iva in vi#ro de a+ello' geno#ipo' me;orado'5

re'al#an#e' de lo' programa' de iridi*aci=n ! 'elecci=n5 lo c+al aceleraría el proce'o! permi#iría acer +na 'elecci=n m' preco*5 !a +e el c+l#ivo in vi#ro cond+ce a +ncoe%icien#e de m+l#iplicaci=n maco ma!or +e la reprod+cci=n vege#a#iva por víaor#ícola5 por permi#ir la r+p#+ra de la la#encia de la' !ema' ! +n rpido crecimien#o dela' mi'ma'5 lo +e da l+gar a +n verdadero Fro#e en ca'cadaF.

la m+l#iplicaci=n por medio de microe'+e;e' e' +na de la' %orma' m' prc#ica' de+#ili*aci=n de e'#e m#odo in vi#ro5 ! a re'+l#ado de primordial impor#ancia para lacon'ervaci=n ! reprod+cci=n a gran e'cala de geno#ipo' e7cepcionale'.

En la pre'en#e inve'#igaci=n 'e anali*an lo' re+erimien#o' n+#ricionale' ! amien#ale'nece'ario' para lograr +na m+l#iplicaci=n clonal e%icien#e del ca%e#o a#imor5 medion#eel +'o de microe'+e;e'. e anali*a5 adem'5 la in%l+encia de la edad ! condicione' de

crecimien#o de la plan#a donadora 'ore el e'#alecimien#o ! prod+cci=n de ro#e' apar#ir de dico' microe'+e;e'.

RE#ISION DE LITERAT!RA

e denomina propagaci=n por microe'+e;e' al m#odo +e 'e a'a en el c+l#ivo de+na 'ecci=n (e7plan#e) provenien#e del v'#ago de la plan#a (n+do o en#ren+do)5 con el%in de o#ener n+evo' v'#ago' medion#e el de'arrollo de !ema' pree7i'#en#e' oneo%ormada'5 la' c+ale' podrn5 a '+ ve*5 proporcionar n+evo' e'+e;e'5 o 'erenrai*ado'5 o#enindo'e a'í mHl#iple' plan#i#a'5 idn#ica'5 en principio5 a la plan#amadre (13).

E1 primer in%orme 'ore microe'+e;e en ca% %+ el reali*ado por A$ e# al. (14) enel +e 'e o#+vo la %ormaci=n de ro#e' ! raíce' a par#ir de e7plan#e' ca+linare'or#=#ropo' ! plagi=#ropo' de . araica cv. "+ndo I+evo ! cv. o+ron Amarillo.

e gran impor#ancia an 'ido la' inve'#igacione' reali*ada' en e'#a rea por &lI(45 B5 6) con el írido Ara+'#a. En '#a' 'e a logrado el de de'arrollo de v'#ago'+e po'#eriormen#e %+eron enrai*ado' a par#ir de !ema' pre%ormada' o neo%ormada'5de n+do' o en#ren+do'5 re'pec#ivamen#e. a'ndo'e en '+' inve'#igacione'5 &lI(B5 6) concl+!e +e la e'#ra#egia de e'+e;e in vi#ro para Ara+'#a comprende la' %a'e''ig+ien#e' a) o#enci=n ! m+l#iplicaci=n de lo' microe'+e;e'5 ) enrai*amien#o ! c)#ra'pa'o a condicione' ordinaria' de c+l#ivo. or o#ra par#e5 el a+#or e'#ima +e +n 'olomicroe'+e;e podría proporcionar5 en +n aDo5 20 000 pln#+la' apro7imadamen#e5 lo

+e 'igni%ica +n al#í'imo rendimien#o5 el c+al +nido a la garan#ía de con%ormidadgeno#ípica +e o%rece e'#a #cnica5 lo convier#e en +na m+! +ena al#erna#iva para lapropagaci=n ma'iva de geno#ipo' in#ere'an#e'.

#ro' inve'#igadore' +e #amin an aplicado e7i#o'amen#e la' #cnica' demicroe'+e;e' 'on IAJA"&$A ! IAl (11)5 +iene' #raa;aron con n+do' derama' or#=#ropa' de . araica cv. "+ndo Iovo5 o#eniendo el de'arrollo del 4BC dela' !ema' pre%ormada'5 con +na e%iciencia de /5B pln#+la' por n+do c+l#ivado en '=lo



'ei' me'e'.

En ene*+ela5 $A,AE> (13) o#+vo la regeneraci=n de plan#a' comple#a' de a#imor5 apar#ir de microe'+e;e' proceden#e' #an#o de plan#a' crecida' in viva como in vi#ro por

emriogne'i' 'om#ica. E1 medio +#ili*ado el de "&$AGE ! JG (") (10)5'+plemen#ado con di'#in#a' concen#racione' de encilaminop+rina (A) ! AcidoIa%#alenac#ico (AIA). En e'#e #raa;o 'e 'eDala la '+perioridad en rendimien#o de lame#odología empleada c+ando 'e compare con lo' m#odo' or#ícola' convencionale'.KALA (16) #amin a in%ormado 'ore la o#enci=n de ro#e' in vi#ro a par#ir demicroe'+e;e' de a#imor.

#ro a'pec#o impor#an#e en la micropropagaci=n in vi#ro de ca% e' la ind+cci=n deemriogne'i' 'om#ica. Al re'pec#o 'e p+ede mencionar el #raa;o de GA$A !"EIEIEK (/)5 en el c+al 'e logr= la %ormaci=n a'#a de /B emrioide' por e7plan#e%oliar de a#imor5 +#ili*ando primero +n medio para la ind+cci=n del callo emriognicoM"?25 8 mg? A ! 1 mg?1 de Acido 254-dicloro%ene7iac#ico (254)N5 !po'#eriormen#e o#ro medio para la di%erenciaci=n de lo' emrioide' ("?2 ! 10C de

ag+a de coca). En la mi'ma línea de la emriogne'i'5 AAI (1) in%orma 'ore la%ormaci=n indirec#a de a+ndan#e' emrioide' aploide'5 en an#era' de . araica var.Garnica5 la' c+ale' aían 'ido pre#ra#ada' con a;a' #empera#+ra' (BO5 por 24 ) !c+l#ivada' en medio " con 2 i'open#eniladenina (2i)5 enciladenina (A) ! AIA endi%eren#e' concen#racione'.

MATERIALES $ METODOS

Materia% &eeta%

e e7#ra;eron microe'+e;e' de plan#a' de a#imor o#enida'5 #an#o in vi#ro como invivo. E1 ma#erial in vi#ro %+ o#enido por "EIEIEK (9) por emriogne'i' 'om#ica5

! crecido d+ran#e +n #iempo de 'ei' a die* me'e' en el medio de c+l#ivo "-15 en +nacmara de crecimien#o ,orma cien#i%ic5 con il+minaci=n con#in+a de 2600 l+7 a 2/ @1O. >a' pln#+la' 'e man#+vieron en e'#a' condicione' a'#a alcan*ar +na al#+ra de 2a B cm5 con +n nHmero de pare' de o;a' en#re 3 ! 12. E1 ma#erial in viva e'#aacon'#i#+ido por plan#a' de a#imor ;=vene' (3 a 10 me'a') ! ad+l#a' (3 a 35B aDo')corre'pondien#e' a la ,65 de'cendien#e' de progenie , 960 (,B) ! per#enecien#e' alo' gr+po' %i'iol=gico' de re'i'#encia A ! 1. E'#a' plan#a' crecieron a;o la' condicione'amien#e' 'ig+ien#e': en +n 'al=n con l+* con#in+a de a;a in#en'idad (300 l+7)5 a#empera#+ra amien#e (26 @ 2O)P regada' coda #re' día' ! #ra#ada' peri=dicamen#econ %er#ili*an#e (a!%olan 953C)5 in'ec#icida (I+drín B mg?1) ! %+ngicida' (enom!l5 1a 10 g?15 +pravi#5 35B g?1 o $idomil5 10 g?1).

Ai'lamien#o de e7plan#e' a par#ir de plan#a' o#enida' in vi#ro. a;o la campana de%l+;o laminar5 en condicione' de a'ep'ia5 'e cor#aron con i'#+rí5 'ore placa' de e#ri5#ro*o' de v'#ago' de la' pln#+la' o#enida' in vi#ro. >o' #ro*o' comprendían el Hl#imopor de o;a'5 con la !ema apical.! vario' pare' de o;a' m' de'arrollada'. E1 #allode'%oliado 'e dividi= en microe'+e;e'5 #omndo'e en c+en#a el nivel del v'#agocorre'pondien#e a coda +no5 para a'ignarle el Io. 1 al n+do apical5 el Io. 2 al'ig+ien#e5 ! a'í '+ce'ivamen#e a'#a llegar al n+do m' vie;o. E'#o' e7plan#e' %+eron'emrado' inmedio#amen#e en #+o' de 25B 7 20 cm5 con#en#ivo' de c+l#ivo5 lo' c+ale''e man#+vieron en +na cmara de crecimien#o ,orma cien#i%ic a 2/ @ 1O ! con +n



%o#operíodo de 16 a 2 600 l+7.

Ai'lamien#o de e7plan#e' a par#ir de plan#a' o#enida' in vivo. >a' porcione' ai'lada' !de'%oliada' de rama' or#r=#opa' o plagi=#ropa'5 de la' plan#a' crecida' in vivo5

%ormada' por el n+do apical5 +n en#ren+do ! el n+do 'ec+ndario '+!acen#e5 %+eron'ome#ida' al proce'o de de'in%ecci=n 'ig+ien#e:

a) lavado en ag+a corrien#e con ;a=n iodadoP

) inmer'i=n en ipoclori#o de calcio al 35BC5 vacío parcial (-21 l) ! %río d+ran#e 20min+#o'P

c) #re' en;+ag+e' con ag+a de'#ilada e'#rilP

d) inmer'i=n en me*cla %ría ! e'#erili*ada de enom!l (B00 mg?1) ! Gen#amicina (B00mg?1)5 d+ran#e 30 min+#o'5 en vacío parcial (-21 >)P

e) cor#e de lo' microe'+e;e' en me*cla e'#erili*ada ! %ría de cido a'c=rico (300mg?1) ! cido cí#rico (100 mg?1)5 en la +e 'e de;an por 10 min+#o'5 para con#rolar lao7idaci=nP

%) pa'o por alcool i'opropílico (90C)5 d+ran#e c+a#ro 'eg+ndo' an#e' de 'emrar.

e'p+' de la de'in%ecci=n 'e e7#ra;eron ! 'emraron lo' microe'+e;e' de la mi'rna%orma +e 'e i*o con el ma#erial de in vi#ro5 ! 'e colocaron en +na cmara con%o#operíodo de 16 ora' a 2 600 l+75 ! 2/ Q 1O.

Meio e c*%ti&o.

Todo' lo' medio' de c+l#ivo empleado' en e'#e #raa;o %+eron preparado' con la' 'ale'minerale' del medio a'al de "&$AGE ! JG (10)5 comple#a' o dil+ida' a lami#ad ("?2)5 'egHn 'e re+iriera. >a con'#i#+ci=n de la porci=n orgnica de dico'medio' vari= dependiendo del o;e#ivo dcada e7periencia ! 'e a;+'#= el p a B5/ conIa o 1 1 I. e prepararon #an#o medio' lí+ido' como '=lido'5 +#ili*ndo'e parae'#o' Hl#imo' Gelri#e (2 g?1). e a+#oclavaron a 121O ! 152 <g?cm2 d+ran#e 1Bmin+#o'.

Meio +ara e% crecimie,to e embrio,e om-tico (Meio MSI).

E'#e medio %+ preparado en e'#ado '=lido5 con la' 'ale' " dil+ida' a la mi#ad5 mio-ino'i#ol (100 mg?1)5 #iamina (10 mg?1)5 idroli*ado de ca'eína (100 mg?1)5 ci'#eína(3B mg?1)5 'acaro'a (30 g?1)5 '+plemen#ado' con A (B mg?1) ! 2i (1 mg?1).

Meio +ara microe/*e0e e +%a,ta obte,ia i, &itro.

Todo' lo' medio' de c+l#ivo preparado' para e'#e #ipo de e7plan#e' con#ienen la' 'ale'



de " comple#e'5 #iamina (1 mg?1)5 mio-ino'i#ol (100 mg?1)5 cido nico#ínico (05Bmg?1)5 pirido7ina (05B mg?1)5 glicina (2 mg?1) ! 'acaro'a (40 g?1)5 di%erencindo'een#re 'i en la concen#raci=n de A ! AIA +e po'een (+adro 1 ! en el e'#ado %í'icodel medio.

Meio +ara microe/*e0e e +%a,ta crecia i, &i&o.

Todo' lo' medio' preparado' para el c+l#ivo de e7plan#e' de plan#a' crecida' in vivacon#ienen la' 'ale' comple#e' de "5 mio-ino'i#ol (100 mg?1)5 #iamina (1 mg?1)5 cidonico#ínico (05B mg?1)5 pirido7ina (05B mg?1)5 glicina (2 mg?1) ! 'acaro'a (40 g?1). Alo' mi'mo' 'e le' aDadi= 80 = 100 mg?1 de Gen#amicina para coma#ir lacon#aminaci=n ac#erial ! B00 mg?1 de enom!l para con#rolar la con#aminaci=n%+ngal.

Meio +ara e% a,-%ii e% efecto e% 1AP e i,teracci2, 1AP3ANA e, e%crecimie,to e %o microe/*e0e.

ara e'#+diar el e%ec#o de la concen#raci=n de A ! de la cominaci=n A?AIA5 'e'emraron lo' microe'+e;e' en medio' en lo' +e 'e en'a!aron la' concen#racione'de A 'ig+ien#e': 4 mg?15 8 mg?15 10 mg?15 12 mg?1 ! 16 mg?1 (medio' "-145 "-165 "-185 "R20 ! "S215 re'pec#ivamen#e5 +adro 1).

C!ADRO 4. Meio +ara microe/*e0e e +%a,ta crecia i, &itro.

1AP ANA Cit. Ge%rite

Meio m3% m3% m3% m3%

"-12 - - 40 0562

"-13 2 - 60 0562

"-14 4 - 60 0562

"-1B 4 05B 60 0562

"-16 8 - 60 0562



"-1/ 8 05B 60 0562

"-18 10 - 60 0562

"-19 10 05B 60 0562

"-20 12 - 60 -

"-21 16 - 60 -

"-22 - - 40 -

"-23 1 - 40 -

"-24 1 1 40 -

"-2B 2 1 40 -

"-26 4 1 40 -

ITA: #odo' lo' medio' con#ienen la' 'ale' de " comple#e'5 #iamina (1 mg? 1)5 mio-ino'i#ol (100mg?1)5 cido nico#inico (05B mg?1)5 pirido7ina (05B mg?1)5 glicina (2 mg?1) ! 'acaro'a (40 g?1).

#ro' medio' %+eron '+plemen#ado' con A ! AIA en la' proporcione' 'ig+ien#e': 4mg?1 A?05B mg?1 AIAP 8 mg?1 A?05B mg?1 AIA ! 10 mg?1 A?05B mg?1 AIA(medio' "-1BP "-1/P "-l95 re'pec#ivamen#e5 +adro 1).

Meio e e,rai5amie,to e &-tao obte,io.

Alg+no' de lo' v'#ago' prod+cido' in vi#ro5 con +n nHmero de pare' de o;a' en#re#re' ! eco5 ! +na longi#+d de 058 a 2 cm5 %+eron a'p#icamen#e 'eparado' dele7plan#e original ! 'emrado' en medio' para el enrai*amien#o. >o' medio' con#eníanla' 'ale' de "&$AGE ! JG dil+ida' a la mi#ad ! lo' comp+e'#o' orgnico'corre'pondien#e'5 ci'#eína (40 mg?1)5 'acaro'a (10 g?1) ! a+7ina': AIA o A (+adro2).



E&a%*aci2, e% crecimie,to e %o microe/*e0e.

la eval+aci=n 'e reali*= 'ernanalnen#e medion#e la o'ervaci=n del ma#erial 'emrado5con la a!+da de +n micro'copio e'#ereo'c=pico a+'c and

C!ADRO 6. Meio +ara e% e,rai5amie,to e %o &-tao +ro*cio i, &itro.

Cit. 1AP ANA AI1 SAC Ge%rite

Meio MS m3% m3% m3% m3% 3% m3%

"-2/ 1?1 40 - - 2 30 -

"-28 1?1 40 051 2 - 30 -

"-29 1?1 40 - 15B 05B 30 -

"-30 1?1 60 - - 2 30 2

"-31 1?1 60 -

RB 30 2

"-32 1?2 60 - - 2 30 2

"-33 1?2 60 - - B 30 2

"-34 1?2 60 - 10 - 10 2

"-3B 1?2 60 - - 10 10 2

"-36 1?2 60 - - - 10 2

ITA: #odo' lo' medio' con#ienen #iamina (051 mg?1)5 mio-ino'i#ol (100 mg? 1)5 cido nico#ínico(05B mg?1)5 pirido7ina (05B mg?1) ! glicina (2 mg?1).



>om. e #om= en c+en#a el nHmero de e7plan#e' +e prod+;eron ro#e'5 el nHmero dero#e' por e7plan#e' ! l nHmero de pare' de o;a' por ro#e.

A lo' #re' me'e' de c+l#ivo 'e e'#im= el nHmero de +evo' microe'+e;e' +e 'epodrían o#ener a par#ir de coda e7plan#e inicial (rendimien#o)5 para lo c+al 'econ'ider= +e coda ro#e prod+cido p+ede proporcionar #an#o' microe'+e;e' comon+do' #enga.

e #a+laron lo' valore' a'ndo'e en el promedio del #o#al de replica' (10)5'emrada' en coda condici=n ! 'e gra%icaron para '+ comparaci=n.

ara e'#alecer 'i la' di%erencia' +e 'e pre'en#aron en#re lo' da#e' de +n #ipo dee7plan#e de#erminado5 a di'#in#a' concen#racione' ormonale' (A5 o A?AIA)5 eran

e'#adí'#icamen#e 'igni%ica#iva' 'e reali*= la pr+ea de J$&JAl-All (1B). >o' da#e'corre'pondien#e' a e7plan#e' di%eren#e' %+eron con%ron#ado' medion#e la pr+ea deJl"G$-"$I5 para de#erminar '+ grado de 'igni%icaci=n.

Et*io morfoa,at2mico.

ara de#erminar la e7i'#encia de di%erencia' mor%ol=gica' !?o ana#=mica'5 en#repln#+la' o#enida' in vi#ro a par#ir de microe'+e;e'5 ! la' plan#a' donan#e' (ad+l#a'! ;=vene') crecida' in vivo5 'e reali*aron o'ervacione' compara#iva' del #allo5 o;a' !raí* de amo' #ipo' de plan#a'. >a' o'ervacione' de =rgano' ! #e;ido' 'e icieron enma#erial vege#al %re'co o pre'ervado en e#anol /0C.

ara lo' e'#+dio' ana#=mico' 'e cor#= el ma#erial a mano '+el#a ! 'e #iD= con a*+l de#olo+idina. on e'#o' cor#= 'e prepararon lmina' 'emipermanen#e' (glicerina B0C).>a' preparacione' 'e o'ervaron en +n micro'copio lei#* ! 'e icieron regi'#ro'%o#ogr%ico' con +na cmara incorporada a +n micro'copio ild-eerr+gg.

Re*%tao

Crecimie,to e microe/*e0e ai%ao e +%a,ta obte,ia i, &itro.

En general5 'e o'erv= +e lo' n+do' apicale' pre'en#aron ma!or porcen#a;e dee7plan#e' +e prod+cían ro#e' (93506C) en relaci=n al con;+n#o de lo' n+do' noapicale' (44501C)P la mi'ma #endencia 'e pre'en#= con re'pec#o al nHmero de ro#e'

prod+cido' por e7plan#e. Adem'5 lo' n+do' corre'pondien#e' a di'#in#o' nivele' delv'#ago pre'en#aron di%erencia' en el porcen#a;e de e7plan#e' con ro#e'5 ordenndo'ede la manera 'ig+ien#e:

I+do apical (93506C) eg+ndo n+do (4651BC)



e7#o n+do (83530C) cimo n+do (33533C)

U+in#o n+do (B652BC) Tercer n+do (2C)

p#imo n+do (B0508C) c#avo n+do (2BC)

+ar#o n+do (48C) Ioveno n+do (2BC)

E1 100C de lo' n+do' apicale' prod+cen ro#e' con c+al+iera de la' concen#racione'de A en'a!ada' (en#re 3 ! 16 mg?1) (,ig+re 1)P en lo' n+do' '+!acen#e''olamen#e 'e logra la ro#aci=n en +n m7imo de 625BC ! lo acen a +na al#oconcen#raci=n de A de 12 mg?1 (+adro 3). Adem'5 mien#ra' lo' n+do' apicale'alcan*an +n promedio m7imo de c+a#ro ro#e' por e7plan#e' con 45 10 = 12 mg?1 deA5 al cao de #re' me'e' de c+l#ivo5 lo' n+do' '+!acen#e' 'olo alcan*an +npromedio m7imo de 25B ro#e' por e7plan#e a concen#racione' de A en#re 10 ! 16mg?1.

En c+an#o al nHmero de e7plan#e' o#enido' a par#ir del microe'+e;e inicial(rendimien#o)5 en %+nci=n de la concen#raci=n de A5 'e o'ervaron lo' ma!ore'valore' en lo' n+do' apicale'5 llegando a 1/52 e7plan#e' por microe'+e;e inicial con 4mg?1 de AP mien#ra' +e lo' n+do' no apicale' alcan*aron +n promedio de 1050e7pl.?e7pl. inicial ! e'#o con 16 mg?1 de A. >a adici=n de AIA (05B mg?1) a lo'medio' con 45 8 ! 10 mg?1 de A re'+l#= en +n incremen#o del porcen#a;e dee7plan#e' con ro#e' (+adro 35 %ig. 2)

En el con;+n#o general de microe'+e;e'5 n+do' apicale' ! '+!acen#e'5 proceden#e'de v'#ago' prod+cido' in vi#ro5 'e o'erv= +e el porcen#a;e de Fe7plan#e' conde'arrollo de ro#e'F5 incremen#aa a medida +e la concen#raci=n de A en el medio

de c+l#ivo era grad+almen#e a+men#ada de 0 a 12 mg?15 o'ervndo'e +na ligeradeclinaci=n con 16 mg?1 (+adro 4). &na #endencia parecida 'e o'erv= en elpromedio de Fro#e' prod+cido' por e7plan#eF (+adro 4). >a pr+ea de J&JAl-All(1B) aplicada a e'#o' da#e' indic= +e la' di%erencia' en el porcen#a;e de Fe7plan#e'con ro#e'F ! en el promedio de Fro#e' por e7plan#e'F5 encon#rado' en#re la' di'#in#a'concen#racione' de A en'a!ada'5 'on e'#adí'#icamen#e 'igni%ica#iva' (con V 050B)



Fi. 4. N*o a+ica% +rocee,te e+%a,ta e i, &itro earro%%-,oee, meio *+%eme,tao co, 7 m34e 1AP. Pree,ta iete brote co,*, m-8imo e ci,co +are e 9o0a(tre mea e c*%ti&o.

Fi 6. Microe/*e0e +rocee,te e&-tao obte,io i, &itro e, meio*+%eme,tao co, 7 m34 e 1AO : ;<=m34 e ANA< earro%%-,oe a9ora e,meio co, 4; m34 e 1AP. Pree,tam>%ti+%e brote (e, * +arte *+erior) :ei ra?ce (e, * +arte *+erior) (tremee e c*%ti&o).

C!ADRO @. E&a%*aci2, e% efecto e %a co,ce,traci2, e 1AP : ANA obre e% earro%%oe microe/*e0e e +%a,ta crecia i, &itro.



1AP ANA e8+%a,te +ore8+%.

PDB e8+%a,te co,brote

Re,imie,to

m3% m3% NA NS NA NS NA NS NA NS

- - 05/8 0506 156 2 //58 B56 152 051

2 - 251 0518 353 1 100 10 659 0518

4 - 4 154 453 154 100 36 1/52 159

4 05B 15B 059/ 256 25B 915/ 4856 359 452

8 - 25/ 0562 353 15B 100 3058 859 0593

8 05B 353 1540 3 251 100 615B 959 2594

10 - 4 251 4 2 100 B/51 16 452

10 05B 352 1 356 0591 100 6858 115B 0591

12 - 4 159 4 158 100 625B 16 3542

16 - 3 25B 353 4 100 4B5B 959 10

IA: I+do apical I: I+do '+!acen#e : are' de o;a'

En relaci=n al e'#ado %í'ico del medio5 'e encon#raron5 al cao de do' me'a' de c+l#ivo5ma!ore' porcen#a;e' de o7idaci=n en#re a+ello' e7plan#e' 'emrado' en medio '=lido(B059C) +e en#re lo' 'emrado' en medio li+ido (3154C). >a' pln#+la' +na ve*enrai*ada' %+eron pa'ada' a #ierra ! man#enida' en +n amien#e Hmedo5 dondecon#in+arían de'arrollndo'e (,ig+re 3).

Crecimie,to e microe/*e0e ai%ao e +%a,ta obte,ia i, &itro.



>o' e7plan#e' provenien#e' de plan#a' crecida' in viva a;o condicione' con#rolada'pre'en#aron poco prolema' de o7idaci=n ! con#aminaci=n. on re'pec#o al#ra#amien#o de de'in%ecci=n ! an#io7idaci=n aplicado' a e'#o' e7plan#e'5 'e o'erv=+e el m#odo 'eg+ido permi#ía di'min+ir en gran porcen#a;e la o7idaci=n ! lacon#aminaci=n %+ngal ! ac#erial.

C!ADRO 7. E&a%*aci2, e% efecto e 9 co,ce,traci2, e 1AP obre e% earro%%o(,*o a+ica%e ,*o *b:ace,te) +rocee,te e +%-,t*%a : &-taoobte,io i, &itro.

1AP e8+%. co, brote brote3e8+%.

m3% Ti+o I Ti+o II Ti+o I Ti+o 44

0 2956 - 053 -

2 2954 - 056 -

4 4259 2B 15/ 05B

8 4358 60 1 156

10 6B54 625B 254 151

12 /0 /0 253 15B

16 B/52 40 256 1

Tipo 1: e7plan#e' proceden#e' de pln#+la' o#enida' in vi#ro por emriogne'i' 'om#ica.

Tipo : e7plan#e' proceden#e' de v'#ago' prod+cido' in vi#ro a par#ir de microe'+e;e' deplan#a' de in vivo.



Fi. @. #-tao +ro*cio :

e,rai5ao i, &itro< co,ti,*a,o* earro%%o e, tierra<e+* e *, me e%tra,+%a,te.

Efecto e% etao f?ico e% meio e c*%ti&o.

"a!ore' porcen#a;e' de con#aminaci=n ! o7idaci=n 'e pre'en#aron en#re lo' e7plan#e''emrado' en medio '=lido +e en#re lo' del medio li+ido. e #al %orma +e a la'emana de 'emrado' 'e o'erv= +n 853C de o7idaci=n ! +n B2C de con#aminaci=nac#eriana en#re lo' e7plan#e' +e 'e encon#raan en el medio '=lido5 mien#ra' +e

en#re lo' 'emrado' en medio lí+ido aHn no 'e pre'en#aa ningHn e7plan#e a%ec#ado.

E&a%*aci2, e% crecimie,to e %o microe/*e0e.

ndependien#emen#e del origen del microe'+e;e (plan#a' de in vi#ro o de in viva)5 !del '+plemen#o ormonal empleado5 el porcen#a;e de e7plan#e' con ro#e' %+ 'iempre'+perior5 c+ando el mi'mo e'#aa con'#i#+ido por n+do' apicale' +e c+ando e'#aacon'#i#+ido por n+do' 'ec+ndario'.

lo' n+do' apicale' (ad+l#o' ! ;=vene') no mo'#raron marcada' variacione' en elporcen#a;e de e7plan#e' con ro#e'5 ni en el promedio de Fro#e' por e7plan#eF en%+nci=n de la concen#raci=n de A (en#re 4 ! 16 mg?1). >o mi'mo 'e o'erv= con

re'pec#o a lo' n+do' 'ec+ndario' (+adro B).

En c+an#o al rendimien#o o nHmero de n+evo' e7plan#e' +e 'e p+eden o#ener apar#ir de cada e7plan#e original en #re' me'e' de c+l#ivo5 el c+al depende #an#o delnHmero de ro#e' prod+cido'5 como del nHmero de pare' de o;a' de dico' ro#e'5 'eo'erv= +e a+ello' proceden#e' de plan#a' ad+l#a' re'+l#aron en general m'prod+c#ivo' +e lo' de plan#a' ;=vene'. A'í5 mien#ra' el m7imo valor alcan*ado porn+do' apicale' de plan#a' ad+l#a' era de 1352 e7plan#e'?e7plan#e original (con 4 mg?1de A)5 lo' de plan#a' ;=vene' '=lo llegaron a 159 e7pl.?e7pl. orig. (con 8 mg?1 de



A).

C!ADRO =. E&a%*aci2, e% efecto e %a co,ce,traci2, e 1AP : ANA obre e% earro%%oe microe/*e0e e +%a,ta a*%ta : 02&e,e crecia i, &itro.

brote +or e8+%a,te +or e 9o0a3brote Re,imie,to

1AP ANA NAA NA" NAA NS" NAA NA" NSA NS" NAA NA" NSA NS"

m3% m3%

4 - 12 1 153 059 151 1 158 15/ 1352 150 253 15B

4 05B 05/ 1 15B - 1 15/ 2 - 05/ 15/ 350 -

8 - 059 153 053 05B 254 15B 2 153 252 159 056 05/

8 05B 153 1 153 153 153 153 2 1 15/ 153 256 153

10 - 158 058 152 - 156 1 253 - 259 058 258 -

10 05B 05B 1 4 - 1 25B 2 - 05B 25B 850 -

12 - 152 1 151 053 350 058 2 058 356 058 252 052

16 - 15B 059 2 - 2 1 352 - 350 059 654 -

ITA:

IAA V I+do apical deplan#a' ad+l#a'

I31 V I+do 'ec+ndario de plan#a ;oven



IA V I+do 'ec+ndario deplan#a ad+l#a

$endimien#o V IHmero de n+evo'e7pian#e' +e 'e p+eden

IAW V I+do apical de plan#a

;oven

o#ener a par#ir de +n e7plan#e inicial

Fi. 7. #-tao +ro*cio i,&itro a +artir e *, ,*oec*,ario e +%a,ta a*%to ei, &i&a c*%ti&ao e, meio co,4 m3% e 1AP. Pree,ta *,ta%%o &ere< b%a,o< ea+ro8imaame,te ;<4= cm ei-metro : 6 cm e a%to< co,ci,co +are e 9o0a (c*atromee e c*%ti&o)

.

>o' n+do' 'ec+ndario' de plan#a' ad+l#a' prod+;eron a'#a 654 e7pl.? e7pl. orig.5 con16 mg?1 de A (,ig. 4)5 mien#ra' +e a+ello' proceden#e' de plan#a' ;=vene' '=loalcan*aron el valor de 15B (con 4 mg?1 de A) (+adro B). >o' microe'+e;e' dema!or rendimien#o %+eron lo' o#enido' de plan#a' crecida' in vi#ro5 con +n m7imo de1/5/ e7pl.?e7pl. orig.

Al comparar el promedio de Fro#e' prod+cido' por e7plan#eF de lo' microe'+e;e' deplan#a' o#enida' in vi#ro (+adro 4) con lo' de lo' microe'+e;e' de plan#a'prod+cida' in viva (+adro 6)5 'e o'erve +e para #oda' la' concen#racione' de A5



lo' primero' re'+l#aron m' prod+c#ivo' +e lo' 'eg+ndo'. >a pr+ea deJl"G$-"$I (1B)5 aplicada' a e'#o' da#e' indica +e la' di%erencia'

encon#rada' en#re amo' #ipo' de e7plan#e' 'on e'#adí'#icamen#e 'igni%ica#iva' (050B).

C!ADRO . E&a%*aci2, e% efecto e %a co,ce,traci2, e 1AP : ANA e, e% earro%%o e,*o a+ica%e ,*o ec*,ario e +%a,ta a*%ta : 02&e,e e i, &i&a.

. e e8+. co, br*ta brote3e8+%

1AP ANA A*%ta "2&e,e A*%ta "2&e,e

4 - /65B 60 152 059

4 05B /B 60 059 056

8 - 3/5B BB56 05/ 059

8 05B B0 665/ 153 152

10 - 6453 1858 154 053

10 05B 665/ 40 15/ 054

12 - 615B 4252 152 054

16 - /659 3859 158 054

A'pec#o' mor%oana#=mico' de lo' =rgano' originado' in vi#ro.

>o' v'#ago' enrai*ado' in vi#ro no pre'en#an +na raí* a7ono%orma5 'ino varia' raíce'adven#icia' principale' (#re' o c+a#ro)5 de la' +e 'e originan o#ra' 'ec+ndaria'. E'#a'raíce'5 a di%erencia de la' o#enida' in viva5 pre'en#an poco engro'amien#o en la'



parede' del 7ilema5 el c+al %orma 'olo c+a#ro ra!o' en l+gar de 'ei'. En lo' cor#e'reali*ado' en la a'e de lo' v'#ago' enrai*ado' 'e o'erv= +e la' raíce' adven#icia''e originaan del cilindro va'c+lar del #allo5 ! no del callo %ormado en dica *ona.

>o' v'#ago' o#enido' in vi#ro5 al cao de #re' me'e' de %ormado'5 pre'en#an #allo'verde'5 lando' ! de poco' milime#ro' de dime#ro (1-2 mm). Ana#=micamen#e 'ep+do o'ervar +e carecen de anillo e'cleren+im#ico alrededor del cilindro va'c+lar5a'í como de crecimien#o 'ec+ndario: corco5 7ilema ! %loema 'ec+ndario'. X

la' o;a' de lo' v'#ago' prod+cido' in vi#ro con'ervan la mi'ma %ilo#a7i' dec+'ada !generalmen#e la mi'ma %orma ! carac#erí'#ica' de la' o;a' de plan#a' crecida' in viva.in emargo5 oca'ionalmen#e 'e p+do o'ervar la aparici=n de o;a' acic+lada'5irreg+lare'5 amarillen#a' !?o con la lamina %oliar an=mala (,ig. B). >a' di%erencia'pre'en#ada' de'de el p+n#o de vi'#a ana#=mico 'on la' 'ig+ien#e': c+#íc+la m'delgada5 cl+la' del parn+ima de empali*ada m' cor#aP parn+ima e'pon;o'o con'=lo c+a#ro o cinco cape'5 'in llegar n+nca a 'ei' cape' como en la' plan#a' de in vivoPcilindro va'c+lar del nervio cen#ral aier#o5 7ilema ! %loema m' e'ca'o'5 poco

engro'amien#o en la' parede' del 7ilema5 a+'encia del anillo e'cleren+im#icoalrededor del cilindro va'c+lar del nervio cen#ral5 carencia de cilindro' acce'orio'.Adem'5 en vi'#a '+per%icial5 la' cl+la' de la epidermi' in%erior pre'en#aan parede'rec#a'5 en con#ra'#e con la' parede' ond+lada' de la' o;a' de in viva ! 'on %rec+en#e'lo' e'#oma' en di'#in#o' e'#ado' de de'arrollo ! con %orma' an=mala': a+'encia de +nao ama' cl+la' ocl+'iva' o acompaDan#e'5 a'í como de'ig+aldad de %orma ! #amaDoen#re '#a' (,ig. 6).

Fi. =. #-tao +ro*cio i, &itro a +artire ,*o a+ica% e +%a,ta a*%ta<motra,o forma a,2ma%a e %a 9o0a.



Fi. . #ita *+erficia% e %a e+iermiaba8ia% e *,a 9o0a e &-tao +ro*cioi, &itro< motra,o %a +aree ce%*%arerecta : %a forma a,2ma%a e %o etoma(a*me,to 7;;).

DISC!SION

Anli'i' del e%ec#o del nivel del n+do5 origen ! edad de la plan#a donan#e5 ! alanceormonal del medio de c+l#ivo5 'ore el de'arrollo del e7plan#e in vi#ro.

El eco de +e el ma!or porcen#a;e de e7plan#e' +e logran prod+cir r+#a' in vi#ro'e pre'en#a en#re lo' n+do' apicale'5 independien#emen#e del origen del ma#erialdonan#e5 e' po'ile e7plicarlo como +na con'ec+encia del %en=meno de la dominancia

apical5 la c+al 'e a o'ervado en gran nHmero de e'pecie' vege#ale'.

iver'a' inve'#igacione' an revelado el papal primordial +e ;+ega el alanceend=geno a+7ina?ci#ocinina en la reg+laci=n de la ro#aci=n de la' !ema' la#erale'. E'generalmen#e acep#ado +e la' a+7ina' 'in#e#i*ada' en la' o;a' ;=vene' de la !emaapical 'on #ran'por#ada' a'ip#alamen#e acia la' !ema' la#erale'5 ! con'#i#+!en laprincipal 'eDal correla#iva +e reg+la la 'ín#e'i' de ci#ocinina'5 '+ di'#ri+ci=n o '++#ili*aci=n en e'#a' !ema'. e e'#a manera5 la iniici=n del crecimien#o de la' !ema'la#erale' e' +na con'ec+encia del d%ici# de ci#o+inina'5 lo +e impide alcan*ar elalance adec+ado a+7ina?ci#ocinina para la ind+cci=n del crecimien#o del ro#e (35 8512).

En el ca'o de lo' e7plan#e' proceden#e' de pln#+la' crecida' in vi#ro a par#ir deemrione' 'om#ico'5 'e o'erv= +e el e%ec#o reg+lador del pice 'e mani%ie'#a conma!or in#en'idad en lo' n+do' +e oc+pan el 'eg+ndo ! #ercer nivel5 di'min+!endoe'#a iniici=n a par#ir del +in#o n+do5 lo +e ace pen'ar +e de n+evo el alanceend=geno a+7ina?ci#ocinina e' adec+ado5 a'#a el p+n#o de permi#ir +n al#oporcen#a;e' (8353C) de ro#aci=n en lo' n+do' del 'e7#o nivel. En e'#e 'en#ido ! con elprop='i#o de eliminar lo' e%ec#o' de la dominancia apical5 +e como 'e ve5 'e man#ieneaHn en el ma#erial c+l#ivado in vi#ro5 'e podría rec+rrir a 'eparar la !ema apical cier#o#iempo an#e' de la e7#racci=n de lo' dem' n+do'5 'egHn lo '+gieren $EAI e# al.



(3).

>a #endencia a +na ma!or prod+cci=n de ro#e' por e7plan#e' en a+ello' proceden#e'de plan#a' in vi#ro (+adro 4)5 +e en lo' proceden#e' de plan#a' crecida' in viva

(+adro 6)5 re%le;a la e7i'#encia de di%erencia' en el con#enido ormonal end=geno deamo' #ipo' de e7plan#e'5 ! con'ec+en#emen#e de la capacidad mor%ogen#ica del#e;ido5 de#erminada' por el grado de mad+re* del ma#erial donan#e. e 'ae5 ! lo'e'#+dio' ana#=mico' reali*ado' en e'#e #raa;o a'í lo dem+e'#ran5 +e la' plan#a'man#enida' in vi#ro con'ervan carac#erí'#ica' ;+venile' +e in viva 'e pierden a medida+e la plan#a alcan*a '+ mad+re*.

>o' clc+lo' reali*ado' a'ado' en lo' re'+l#ado' o#enido' en e'#e #raa;o5 indican+e el nHmero m7imo de v'#ago' +e con la me#odología de'cri#a e' po'ile o#eneren +n aDo5 a par#ir del n+do apical ! +n n+do 'ec+ndario de +na pln#+la o#enida invi#ro5 por emriogne'i' 'om#ica5 e' ca'i el dole (10 98B v'#ago') del +e podríao#ener'e par#iendo de lo' mi'mo' e7plan#e' e7#raído' de +na plan#a de in viva (B /39v'#ago').

in emargo5 a! +e #omar en c+en#a lo +e 'eDala &lI (4) acerca del ma!orrie'go de al#eracione' gen=mica' +e pre'en#an la' plan#a' o#enida' poremriogne'i' 'om#ica5 por o'ervar'e d+ran#e e'#e proce'o +na %a'e de calloindi%erenciado. e e'#a manera5 'e p+ede con'iderar +e lo' e7plan#e' o#enido'direc#amen#e de la' plan#a' in viva o%recen ma!ore' garan#ía' de con%ormídadgen#ica5 lo c+al e' m+! impor#an#e 'ore #odo c+ando 'e de 'ea propagar plan#a' +ean 'ido 'eleccionada' por po'eer +n geno#ipo o de par#ic+lar in#er'5 como e' el ca'edel c+l#ivar a#imor.

Re,imie,to e% c*%ti&o e microe/*e0e e Catimor.

>a' ven#a;a' del c+l#ivo de microe'+e;e' 'e evidencian al comparar el po#encialreprod+c#ivo de e'#e m#odo (de B /93 a 10 98B v'#ago' en +n aDo)5 con el o#enidoen condicione' or#ícola' convencionale' (100 a 200 v'#ago' en do' aDo') (B5 6).

A+n+e aHn +eda maco +e inve'#igar para '+perar lo' prolema' +e acarrea elc+l#ivo in vi#ro del ca%5 ! lograr e'#alecer +na me#odología +e permi#a el m7imorendimien#o5 'e p+ede decir +e la propagaci=n vege#a#iva in vi#ro a par#ir de e7paln#e'ca+linare' e' +na al#erna#iva prome#edora.

En general5 e' po'ile o#ener plan#a' comple#e' a par#ir de lo' v'#ago' prod+cido' invi#ro5 enrai*ando '#o' en +n medio con la' 'ale' " dil+ida' a la mi#ad5 +na a;aconcen#raci=n de 'acaro'a (10 g?1) ! A (10 mg?1).

la #cnica de c+l#ivo in vi#ro de e7plan#e' ca+linare' e' +n m#odo +e deeincorporar'e a lo' programa' de propagaci=n ma'iva de c+l#ivare' de ca%'eleccionado'5 como el a#imor5 deido al al#o coe%icien#e de m+l#iplicaci=n +e po'eedica #cnica5 en comparaci=n con lo' m#odo' or#ícola' convencionale'.

S!MMAR$



o%eea araica cv. a#imor i' re'i'#an# #o a Yide range o% race' o% #e r+'# %+ng+'5 i#al'o a' de'irale agronomic carac#eri'#ic' and prod+ce' good +ali#! co%%ee. a'e on#e'e prominen# %ea#+re'5 #e ma''ive vege#a#ive propaga#ion o% #i' c+l#ivar 'e'm' #oe promi'ing in co+n#rie' Yi# r+'# prolem' #o prod+ce r+'# %ree co%%ee. n #i' paper

Ye anal!*ed #e n+#ri#ional and environmen#al re+iremen#' #o micropropaga#e o%%eaaraica cv. a#irnor. ropaga#ion Ye' acieved ! c+l#+ring microc+##ing o% or#o#ropicand plag!o#ropic 'oo#'5 o#ained %rom #e %ield and %rom plan#le#' greY in #elaora#or! ! in vi#ro c+l#+re. Al'o i# Ya' '#+died #e in%l+ence o% groY# condi#ion' o%#e donor plan#'5 and #e e%%ec# o% #e original po'i#ion o% #e c+##ing in #e donor'oo#5 on #e groY# o% #e microc+##ing. n #e e7plan#' (microc+##ing i'ola#ed %rom'oo#' o#ained %rom #e %ield5 'erio+' o7ida#ion Ya' o'erved5 Yic Ya' con#roled:a) ! placing #e donor plan#' +nder loY lig# in#en'i#!5 ) ! #rea#ing #e e7plan#' Yi#a'coric acid (300 mg?1) and c) ! groYing #e'e e7plan#' in li+id medio Yi# ci'#ein(60 mg?1). e %o+nd #a# microc+##ing Yi# apical node5 i'ola#ed %rom plan#le#' groYnin vi#ro ad e##er capaci#! #o develop +d' #an #e microc+##ing Yi# 'econdar!node'. ig A concen#ra#ion' (12 #o 16 mg?1) are nece''ar! #o ind+ce #e +dgroY#. Te microc+##ing' Yi# +d' increa'e' %rom B.6C in medio Yi#o+# A5 #o

62C in medio Yi# ig A concen#ra#ion. "orpoana#omic anal!'i' o% #ree mon#'old plan#'5 'oYed #a# #e! pre'erve carac#eri'#ic' o% ;+venili#! in compari'on Yi#plan#' o% 'ame age o#ained %rom 'eed'. o#en#ial! Yi# #i' me#od Ye can prod+cee#Rveen B5/93 #o 10598B 'oo#' in one !ear5 in compari'on Yi# 100 #o 20 'oo#'#a# can e o#ained ! or#ic+l#+ral me#od'.

H. Coffaa arabica< ti*e c*%t*re< microc*tti,.

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