Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
AŞI SUŞU OLARAK KULLANILACAK ŞAP VİRUSU PLAK
MORFOLOJİSİNDEKİ FARKLILIKLARIN
GENETİK OLARAK İNCELENMESİ
Müge FIRAT SARAÇ
VİROLOJİ ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Yılmaz AKÇA
2011- ANKARA
TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
AŞI SUŞU OLARAK KULLANILACAK ŞAP VİRUSU PLAK
MORFOLOJİSİNDEKİ FARKLILIKLARIN
GENETİK OLARAK İNCELENMESİ
Müge FIRAT SARAÇ
VİROLOJİ ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Yılmaz AKÇA
Bu tez, Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü tarafından TAGEM/HS/11/14/01/195 proje
numarası ile desteklenmiştir.
2011 – ANKARA
iii
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay ii
İçindekiler iii
Önsöz vi
Simgeler ve Kısaltmalar vii
Şekiller ix
Çizelgeler x
1. GİRİŞ 1
1.1. Genel Bilgiler 1
1.2. Etiyoloji 2
1.2.1. Şap Virusunun Genel Özellikleri 2
1.2.2. Şap Virusu Genomunun Özellikleri 3
1.3. Epidemiyoloji 6
1.3.1. Şap Virusunun Tipleri ve Moleküler Epidemiyolojisi 7
1.4. Patogenez ve Patoloji 9
1.5. Klinik Belirtiler 10
1.6. Şap Viruslarının Teşhisi ve Tiplendirilmesi 11
1.7. Kontrol ve Mücadele 13
1.8. Türkiye’de Şap Hastalığının Durumu 14
1.9. Plak Morfolojisi ve Mutasyonlar 16
1.10. Tezin Amacı 18
2. GEREÇ VE YÖNTEM 19
2.1. GEREÇ 19
2.1.1. Hücre Kültürü 19
2.1.2. Araştırmada Kullanılan Viruslar 19
2.1.2.1. Aday Viruslar 19
2.1.2.2. Kontrol Viruslar 20
iv
2.1.3. Primerler 21
2.2. YÖNTEM 23
2.2.1. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması 24
2.2.2. Epitelden Virus Süspansiyonunun Hazırlanması 25
2.2.3. Virus İzolasyonu 25
2.2.4. İndirekt Sandviç ELISA 26
2.2.5. Plak Test 27
2.2.6. RNA Ekstraksiyonu 28
2.2.7. Viral RNA’nın Ters Transkripsiyonu 29
2.2.8. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) 30
2.2.9. PCR Ürününün Agaroz Jel Elektroforezi 31
2.2.10. PCR Ürününün Agaroz Jelden Purifiye Edilmesi 32
2.2.11. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu ve Elde Edilen Nükleotid
Dizilerin Değerlendirilmesi
33
3. BULGULAR 34
3.1. Virus İzolasyonu 34
3.2. İndirekt Sandviç ELISA 34
3.3. Plak Test 35
3.3.1. Aday Virus 1 (A tipi 1) 35
3.3.2. Aday Virus 2 (A tipi 2) 36
3.3.3. Aday Virus 3 (A tipi 3) 36
3.3.4. Aday Virus 4 (A tipi 4) 36
3.3.5. Aday Virus 5 (A tipi 5) 36
3.3.6. Aday Virus 6 (O tipi 1) 37
3.3.7. Aday Virus 7 (O tipi 2) 37
3.3.8. Aday Virus 8 (O tipi 3) 37
3.3.9. Aday Virus 9 (O tipi 4) 37
3.3.10. Aday Virus 10 (O tipi 5) 38
3.3.11. A22 Irak Kontrol Virusu 38
3.3.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu 38
3.3.13. O1 Manisa Kontrol Virusu 38
v
3.4. PCR 58
3.5. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu 58
3.5.1. Aday Virus 1 (A tipi 1) 59
3.5.2. Aday Virus 2 (A tipi 2) 59
3.5.3. Aday Virus 3 (A tipi 3) 59
3.5.4. Aday Virus 4 (A tipi 4) 60
3.5.5. Aday Virus 5 (A tipi 5) 60
3.5.6. Aday Virus 6 (O tipi 1) 60
3.5.7. Aday Virus 7 (O tipi 2) 60
3.5.8. Aday Virus 8 (O tipi 3) 61
3.5.9. Aday Virus 9 (O tipi 4) 61
3.5.10. Aday Virus 10 (O tipi 5) 61
3.5.11. A22 Irak Kontrol Virusu 61
3.5.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu 62
3.5.13. O1 Manisa Kontrol Virusu 62
4. TARTIŞMA 64
5. SONUÇ VE ÖNERİLER 76
ÖZET 79
SUMMARY 80
KAYNAKLAR 81
EKLER 93
Ek - 1 Standart genetik kodlar 93
Ek - 2 Amino asitler ve sembolleri 93
Ek - 3 VP1 genine ait diziler 94
Ek - 4 3A genine ait diziler 109
Ek - 5 cre genine ait diziler 114
Ek - 6 VP4 genine ait diziler 115
Ek - 7 VP2 genine ait diziler 118
Ek - 8 VP3 genine ait diziler 127
ÖZGEÇMİŞ 135
vi
ÖNSÖZ
Şap hastalığı, çift tırnaklı hayvanların akut ve çok bulaşıcı viral bir hastalığıdır. Hastalığın etkeni olan şap virusunun yedi farklı serotipi (O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 ve SAT3) vardır. Bir tiple geçirilen hastalık sonucu diğer tiplere karşı koruyucu antikor oluşmaması, şap virusunun rüzgarla bulaşma dahil çeşitli yayılma modelleri ile bir ülkenin kendi içinde ve sınırları geçerek hastalığın görülmediği bölgelerde hastalığın oluşabilmesi, ülkemiz için kaçak hayvan hareketlerinin kontrolünün zorluğu ve RNA’lı olan virusun tür benzeri yapısında olması hastalıkla mücadeleyi güçleştiren sebeplerdendir. Diğer RNA’lı viruslarda olduğu gibi yüksek mutasyon oranı ve hızlı replike olabilme yeteneğinin beraberinde getirdiği tür benzeri yapı sebebi ile şap virusu populasyonları genetik ve antijenik olarak heterojendir, varyantların karışımından oluşur ve bu nedenle mevcut aşı suşlarının koruma oluşturmadığı yeni alttip ve varyantların oluşumu sık olarak şekillenmektedir. Hastalığın endemik olduğu bölgelerde kontrol uygulaması olarak hayvanlar yılda en az iki kere aşılanmaktadır. Şap aşılarının hazırlanmasında aşının formülasyonuna katılan suşun sahada seyreden salgının etkeni olan suşa karşı koruma oluşturması gerekmektedir. Aşıların hazırlanmasında önemli konulardan bir tanesi de büyük hacimli hücre kültürlerinde plak morfolojisi yönünden orijin virusla aynı özelliklerde virus üretilmesidir. Şap viruslarının monolayer ve süspanse hücre kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotiplerinin genetik düzeyde incelenmesi için söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonların sorgulanması, şap virusu ve şap aşısı üretimine yönelik çalışmalara katkı sağlayabilir. Bu tez çalışması Tarımsal Araştırmalar Genel Müdürlüğü (TAGEM) tarafından TAGEM/HS/11/14/01/195 proje numarası ile desteklenmiştir. Tez çalışmamda yardımlarını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr.İbrahim BURGU’ya, Danışman Hocam Prof.Dr.Yılmaz AKÇA’ya, çalışmamın her aşamasında yardım ve desteklerini gördüğüm Prof.Dr.Aykut ÖZKUL ve Prof.Dr.Feray ALKAN’a, değerli katkılarından dolayı Tez İzleme Komitesi Üyelerine ve Viroloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerine, çalışmalarımın yürütülmesini sağlayan Şap Enstitüsü Müdürlüğü’ne, yardım ve katkılarını eksik etmeyen Moleküler Epidemiyoloji Laboratuvarı’nda görevli Dr.Ünal PARLAK ve Uzm.Vet.Hek.Fuat ÖZYÖRÜK’e, Kontrol Bölüm Başkanı Uzm.Vet.Hek.Hidayet BOZOĞLU ve Kontrol Bölümü’nde görevli laborant arkadaşlarım Banu BAYRİ ÖZBİLGE ile Ömer ŞİŞMAN’a, Tip Tayini, Hücre Bankası ve Süspanse Hücre Kültürü Laboratuvarları personeline, sonsuz manevi destekleri ile her zaman yanımda olan Nilüfer’e, Babam’a ve Eşim Erkin’e ve teşekkürün yetersiz kalacağı Annem’e teşekkürlerimi sunarım.
vii
SİMGE ve KISALTMALAR
aa Amino asit
An30-31 Ankara30-31
A/C/G/T Adenine/Cytosine/Guanine/Thymine
BHK Baby Hamster Kidney
bp base pair
°C degree Celsius
cDNA complementary Deoxyribose Nucleic Acid
CHO Chinese Hamster Ovary
Cl-13 BS31 Clone-13 Brescia31
cm2 Santimetrekare
CO2 Karbondioksit
CPE Cytopathological Effect
cre cis-acting replication element
DNA Deoksiribonükleik Asit
DNaz Deoksiribonükleaz
dNTP Deoksi-Nükleotid Trifosfat
DTT Dithiothreitol
EDTA Etilen Daimin Tetra Asetik Asit
EITB Enzyme Linked Immuno Electrotransfer Blot
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FMDV Foot-and-Mouth Disease Virus
GMEM Glasgow Minimum Essential Medium
HSPG Heparan Sülfat Proteoglikan
IBRS Swine Kidney Cell Line
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses
Ig Immunglobulin
viii
IRES Internal Ribozomal Entry Site
L Litre
Log Logaritma
MgCl2 Magnezyum klorür
mg Miligram
µg Mikrogram
ml Mililitre
µl Mikrolitre
µm Mikrometre
mM Milimolar
mRNA messenger RNA
MMLV Moloney Murine Leukemia Virus
MOI Multiplicity of Infection
NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
nt Nükleotid
O.D. Optical Density
OIE Office International des Epizootica (Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü)
ORF Open Reading Frame
PFU Plaque Forming Unit
RNA Ribonucleic Acid
RNaz Ribonükleaz
RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
SAT South African Territories
SP Sığır Pasajı
TPB Tryptose Phosphate Broth
TUR TÜRKİYE
UTR Untranslated Region
VIAA Virus-Infection Associated Antigen
VP1-4 Viral Protein1-4
VPg Virus genome-linked protein
WRL World Reference Laboratory
ix
ŞEKİLLER
Şekil 1.1. Şap virusunun 5’UTR’sinde yer alan yapılar 4
Şekil 1.2. Şap virusunun genomu ve translasyon ürünleri 5
Şekil 1.3. VP1 geni nükleotid dizilerine göre tanımlanmış şap virusu O (a) ve A
(b) topotipleri
9
Şekil 2.1.1. BHK-21 An31 (a) ve BHK-21 An30 (b) monolayer hücre kültürlerinin
mikroskop altındaki görüntüleri
19
Şekil 3.1. Virus 1’e ait P1 (a), P11 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 39
Şekil 3.2. Virus 2’ye ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 39
Şekil 3.3. Virus 3’e ait P1 (a), P2 (b), P7 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri 39
Şekil 3.4. Virus 4’e ait P1 (a), P18 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 40
Şekil 3.5. Virus 5 e ait P1 (a), P11 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 40
Şekil 3.6. Virus 6’ya ait P4 (a), P16 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 40
Şekil 3.7. Virus 7’ye ait P1 (a), P6 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 41
Şekil 3.8. Virus 8’e ait P1 (a), P6 (b), P10 (c), P11 (d) ve P15 (e) plak görüntüleri 41
Şekil 3.9. Virus 9’a ait P1 (a), P9 (b), P11 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri 42
Şekil 3.10. Virus 10’a ait P1 (a), P10 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 42
Şekil 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 43
Şekil 3.12. A Tur 04-06’ ya ait P1 (a), P7 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri 43
Şekil 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait P1 (a), P9 (b) ve P23 (c) plak
görüntüleri
43
x
ÇİZELGELER
Çizelge 2.1.1. Çalışmada kullanılan aday viruslara ait bilgiler 20
Çizelge 2.1.2. Çalışmada kullanılan aşı suşu niteliğindeki kontrol viruslara ait
bilgiler
20
Çizelge 2.1.3. Çalışmada kullanılan primerler 22
Çizelge 2.2.1. Çalışmada kullanılan referans nükleotid dizilere ait bilgiler 33
Çizelge 3.1. Virus 1’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 44
Çizelge 3.2. Virus 2’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 45
Çizelge 3.3. Virus 3’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 46
Çizelge 3.4. Virus 4’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 47
Çizelge 3.5. Virus 5’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 48
Çizelge 3.6. Virus 6’ya ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 49
Çizelge 3.7. Virus 7’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 50
Çizelge 3.8. Virus 8’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 51
Çizelge 3.9. Virus 9’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 52
Çizelge 3.10. Virus 10’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri 53
Çizelge 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve
plak test bilgileri
54
Çizelge 3.12. A Tur 04-06 kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve
plak test bilgileri
55
Çizelge 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve
plak test bilgileri
56
Çizelge 3.14. Çalışılan virusların cre, VP4, VP2, VP3, VP1 ve 3A gen
bölgelerinde tespit edilen aminoasit değişimleri
63
1
1. GİRİŞ
1.1. Genel Bilgiler
Şap hastalığı ülkeler arası canlı hayvan ve hayvansal ürün ticaretini olumsuz yönde
etkileyen, büyük ekonomik kayıplara neden olan, çift tırnaklı hayvanların akut ve
çok bulaşıcı viral bir hastalığıdır (Bachrach, 1968; Pereira, 1981; Gebauer ve ark.,
1988). Hastalığın ilk yazılı tanımlaması Fracastorius tarafından İtalya’da 1546
yılında yapılmıştır. 1897 yılında ise Loeffler ve Frosch şap hastalığına filtre edilebilir
ve bakterilerden daha küçük özellikte bir ajanın sebep olduğunu bularak, hayvanlarda
hastalığa neden olan bir virusun ilk olarak tanımlamasını yapmışlardır (Bachrach,
1968; Samuel ve Knowles, 2001; Sobrino ve ark., 2001). Hayvan ve hayvansal
ürünlerin ulusal ticaretinde en önemli sınırlama olarak bilinen şap hastalığı Dünya
Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE)’nün hastalıktan ari ülkeler ve bölgeler için resmi bir
liste oluşturduğu ilk hastalıktır (Archetti ve ark., 1994; Leforban, 1999; Sobrino ve
ark., 2001; Alexandersen ve ark., 2003).
Şap virusu diğer tek iplikçikli RNA viruslarında olduğu gibi doğal şartlarda
yüksek mutasyon oranına sahiptir ve antijenik olarak birbirinden farklı yedi serotipi,
çok sayıda alttipi ve varyantı vardır (Sobrino ve ark., 1986; Steinhauer ve Holland,
1987). Bu çeşitlilik, hastalıkla mücadelede aşı kullanımını güçleştiren bir etmendir.
Hastalığın endemik olduğu ülkelerde uygun serotipte inaktif aşılarla yapılan
koruyucu aşılamalar ile hastalığın insidensinin düşürülmesine yönelik önlemler
alınmaktadır (Doel, 2003). Mevcut aşıların koruma oluşturamadığı sahadaki yeni
antijenik varyantların varlığı şap aşısı üretiminde önemli bir problemdir. Bir serotip
içindeki antijenik varyasyon uygun aşının etkisiz olmasına yol açabilir. Belli bir
salgın için uygun aşı suşunun ve yeterli antijenik kütleyi üretebilmek için hücre
kültüründe yüksek ürün vererek üreyen virusların seçilmesi önemlidir. Bunun için aşı
üretiminde kullanılmak üzere, sahada salgına neden olan virusun hücre kültüründe
pek çok ardışık pasajının yapılması gerekir (Piatti ve ark., 1995).
2
1.2. Etiyoloji 1.2.1. Şap Virusunun Genel Özellikleri
Şap virusu Picornavirales takımı, Picornaviridae ailesi, Apthovirus cinsi içerisinde
yer alır. Picornaviridae ailesi Ağustos 2009’da Uluslararası Virus Taksonomi
Komitesi (ICTV) tarafından resmi olarak tanınan 12 cinsten oluşur (Enterovirus,
Cardiovirus, Apthovirus, Hepatovirus, Parechovirus, Erbovirus, Kobuvirus,
Teschovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Tremovirus ve Avihepatovirus) (Knowles,
2009; ICTV Picornaviridae Study Group, 2009).
Şap virusu, pH 7-9 değerleri arasında stabil olmakla beraber virusun en
dayanıklı olduğu pH değerleri pH 7,2-7,6 arasındadır. Şap virusu, çeşitli kimyasal
maddeler ile asit (asetik, formik, fosforik, sitrik, sülfürik asitler) ve alkali (sodyum
karbonat, sodyum metasilikat, sodyum hidroksit) pH değerlerinde inaktive olur. Şap
virusunun saha şartlarında inaktivasyonu için yüzde dörtlük sodyum karbonat ve
yüzde birlik sodyum hidroksit kullanılabilir (Shafyi, 1968; Olechnowitz ve Engler,
1970). Virus asit şartlara (<pH 6,0) (Randrup, 1954), 50°C’nin üzerindeki
sıcaklıklara ve morötesi ışığa karşı hassas olmakla beraber kontamine yemde ve
uygun iklime sahip çevre koşullarında bir aya kadar, kemik iliği ve lenf bezlerinde
ise uzun süre persiste kalabilir (Wild ve ark., 1969).
Şap virusunun in vivo izolasyonunda, süt emen fareler ve kobayların deney
hayvanı olarak kullanılabileceği belirtilmiştir (Rowlands, 2008). Şap virusunun geniş
çaplı üretimi için in vitro metotların geliştirilmesinin gerekli olduğu anlaşıldıktan
sonra, sığır dil epitel hücrelerinin virusun geniş çaplı üretiminde kullanılabileceği
gösterilmiştir. Şap virusunun üretiminde monolayer ve süspanse hücre hatlarının
avantajları fark edildikten sonra ise, virusun çoğaltılmasında domuz böbrek (PK) ve
bebek hamster böbrek (BHK) hücre kültürleri kullanılmaya başlanmıştır (Brown,
2003). Şap virusunun in vitro olarak üretildiği diğer hücre kültürleri; dana tiroid,
dana testis, dana böbrek, kuzu böbrek, domuz böbrek ve sığır dil epiteli gibi primer
3
ve Mengeling-Vaughn domuz böbrek hücre hattı (MVPK-1), sığır böbrek hücre hattı
olan LF-BK, domuz böbrek hücre hattı olan IBRS ve hamster akciğer hücre hattı
olan HmLu gibi devamlı hücre kültürleridir (Aktaş, 1998).
1.2.2. Şap Virusu Genomunun Özellikleri Şap virusu partikülü küresel, yaklaşık 30 nanometre çapında ve zarfsızdır. Tek
iplikçikli, pozitif polariteli ve enfeksiyöz genomik RNA’nın tekli bir kopyası ile
birlikte virus tarafından kodlanan ve ikozahedral bir kapsit oluşturan dört değişik
kapsit proteininin; VP1 (1D), VP2 (1B), VP3 (1C) ve VP4 (1A) 60 kopyasından
oluşur.
Şap virusu genomu yaklaşık 8 500 nükleotidden oluşur (Clarke ve ark., 1987).
Viral genom tek bir açık okuma alanı (ORF) içerir ve iki ayrı çevrilmeyen bölgeye
(5’UTR ve 3’UTR) ayrılır (Sobrino ve ark., 2001). 1 300 nükleotid uzunluğunda olan
şap virusu 5’UTR’si, diğer picornaviruslara göre oldukça uzundur (Rowlands, 2008).
5’UTR’de bulunan gen bölgelerinden; S-parçasının (Belsham, 2005), uzunluğu farklı
izolatlara göre 80-450 nükleotid arasında değişen poli (C) bölgesinin (Harris ve
Brown, 1977; Escarmis ve ark., 1992) ve birbiri ardından tekrar edilen çoklu (2-4)
pseudo düğümlerin genomdaki rolleri henüz bilinmemektedir. RNA replikasyonuna
katılan bir ilmek yapısı olan cis-aracılı replikasyon elemanı (cre), diğer
picornaviruslarda genomun değişik yerlerinde bulunmakla beraber sadece şap virusu
genomunda kodlayıcı bölgenin dışında ve 5’UTR’de yer almaktadır. Bu bölge RNA
sentezinin başlaması için gerekli korunmuş bir motif olan AAACA dizisine sahiptir
(Belsham, 2005). Cre’den sonra yaklaşık 450 nükleotid uzunluğunda olup
translasyonun internal başlangıcına katılan internal ribozomal giriş bölgesi (IRES) yer
alır. Translasyon, IRES’de bulunan ve 84 nükleotidden oluşan 2 AUG kodonu ile
başlar (Sobrino ve ark., 2001; Mason ve ark., 2003).
4
Şekil 1.1. Şap virusunun 5’UTR’sinde yer alan yapılar (Rowlands, 2008)
Enfekte hücrelerdeki şap virusu RNA’sı; VPg (3B) proteininin, genomik
RNA’nın 5’UTR’sine bağlanmasından sonra şapka yapısını kaybederek serbest bir
5’UTR’sine sahip olur. VPg hücresel bir enzim tarafından bölündükten sonra, IRES
yönetiminde bir poliprotein üretilir. Bu poliproteinin viral proteazlar tarafından
bölünmesi sonucu, genom replikasyonuna destek veren ve yeni bir enfeksiyon
siklusu başlatacak yeni virus partiküllerinin üretimi için gerekli olan çeşitli yapısal ve
yapısal olmayan proteinler şekillenir (Mason ve ark., 1994; Racaniello, 2007).
Poliproteinin ilk bileşeni L proteindir (Mason ve ark., 2003; Belsham, 2005). Daha
sonra kapsit protein öncüsü P1 gelir.
P1 viral proteazlar tarafından parçalanarak VP0, VP1 ve VP3 protomerlerine
ayrılır. Beş protomer birleşerek bir pentameri ve oniki pentamer de birleşerek boş
kapsiti oluşturur. Kapsit, yeni sentezlenmiş bir RNA molekülü ile birlikte provirionu
oluşturur. Son olgunlaşma basamağı ise VP0’ın VP4 ve VP2’ye parçalanması ile
virionun salınmasını kapsar (Fox ve ark., 1987; Mason ve ark., 1994; Verdaguer ve
ark., 1994). Yapısal proteinlerin virion içinde üç boyutlu düzenlenmeleri, aşılama ve
enfeksiyona karşı yanıta neden olan antijenik bölgeleri sağlar. Bu yapılar ayrıca;
hücre reseptörlerine bağlanma, genomun hücrelere girişi ve kapsitin çevresel
faktörlere karşı dayanıklılığını belirlemeye aracılık eder (Hernandez ve ark., 1996;
Mason ve ark., 2003). VP1, VP2 ve VP3 kapsit yüzeyinde bulunurken, VP4 RNA ile
temas eden içsel bir proteindir (Grubman ve Baxt, 2004; Belsham, 2005; Fry ve ark.,
2005). Diğer picornaviruslara göre şap virusunun protein tabakası genellikle daha
5
ince ve dış yüzeyi daha pürüzsüz olup (Rowlands, 2008), konakçı hücre reseptörü ile
etkileşimde rol oynayan ve geçici bir çıkıntı olan kanyona sahip değildir (Hogle ve
ark., 1985). Dış yüzeydeki genel pürüzsüz yapı için VP1’in yüzeyinde bir çıkıntı
oluşturan, 140-160 aminoasit dizisinde yer alan ve immunodominant antijenik
bölgeyi kapsayan G-H kıvrımı bir istisnadır (Acharya ve ark., 1989).
Şekil 1.2. Şap virusunun genomu ve translasyon ürünleri (Racaniello, 2007)
P2 ve P3 öncüleri yapısal olmayan proteinleri (2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D)
kodlar. 2A proteininin viral replikasyonda rolü olduğu düşünülmektedir. 2B ve 2C
proteinleri endoplazmik retikulumdan golgi aparatına doğru olan transportu bloke
ederek salgısal yolu inhibe ederler (Moffat ve ark., 2007). Ayrıca RNA replikasyonu,
yapısal proteinlerin katlanması ve virus kaynaklı sitopatik etkilerde görev alırlar. 3A
ve 3B proteinleri hücresel membranlar ile çok yakından ilişkili kritik RNA
replikasyonu faktörleridir (Mason ve ark., 2003). 3A’nın hücresel membranlar ile
etkileşiminin sitopatik bir etkiye neden olduğu gösterilmiştir (Beard ve Mason, 2000).
2B ve 3C proteinlerinin serotipler arasında en çok korunan bölgeler oldukları
belirtilmiştir (Carrillo ve ark., 2005). 3’UTR ise, heterojen dizilimli yaklaşık 100
nükleotid uzunluğunda bir bölge ve poli (A) bölgesi olmak üzere iki bileşenden oluşur
(Belsham, 2005).
6
Şap virusu hücre içine alındığında, replikasyonun ilk basamağı olan viral
RNA’nın translasyonu şekillenir. RNA, replikasyonda mRNA işlevi görür (Mason ve
ark., 2003). Genomun replikasyonu, 3D proteini (virus tarafından kodlanan RNA
polimeraz) tarafından cre’nin yardımı ile gerçekleştirilir (Goodfellow ve ark., 2003;
Bedard ve Semler, 2004). Viral RNA’nın tek bir molekülü enfeksiyonu başlatmak için
yeterlidir. Şap virusunun RNA bağımlı polimerazının düşük doğruluğa sahip olduğu
ve kopyalanan 103-105 nükleotidde bir mutasyon oranı ile mutant soyların devamını
arttırdığı öngörülmektedir (Holland ve ark., 1982; Sobrino ve ark., 1983). Şap virusu
populasyonları genetik ve antijenik olarak heterojendir, varyantların karışımından
oluşur ve diğer RNA virusları gibi tür benzeri (quasispecies) yapısındadır (Martinez
ve ark., 1992; Sa-Carvalho ve ark., 1997; Domingo, 2002).
1.3. Epidemiyoloji Şap hastalığı Afrika, Asya ve Güney Amerika’nın büyük bölümünde endemiktir.
Ayrıca uluslararası sınırları geçerek daha önceden hastalıktan ari olan bölgelerde
epidemilere neden olduğu 2000 yılında Japonya ve Güney Kore, 2001 yılında ise
İngiltere ve Avrupa’daki salgınlarda gösterilmiştir (Knowles ve ark., 2001). OIE’nin
haftalık hastalık bilgilerine göre 2010 yılında Japonya ve Güney Kore’de, 2011
yılında ise Bulgaristan’da hastalık tekrar teşhis edilmiştir (OIE, Hayvan Sağlığı
Bilgileri, Haftalık Hastalık Bilgisi-WAHID Interface, 2010-2011). Şap virusunun
geniş bir konakçı aralığına sahip olması, enfekte hayvanlar tarafından yüksek
konstantrasyonda salınması, duyarlı hayvanlarda küçük dozlarla bile enfeksiyon
oluşturabilmesi, hızlı bir replikasyon sürecine sahip olması ve rüzgarla yayılım dahil
çoklu bulaşma modelleri ile yayılabilmesi gibi özelliklerinden dolayı şap hastalığı
kontrol ve eradikasyonu zor ve pahalı olan bir hastalıktır (Donaldson ve ark., 1982).
Artiodactyla takımı içinde bulunan hayvanlar, birkaç istisna dışında şap
hastalığına duyarlıdır. Hastalığın epidemiyolojisinde büyük öneme sahip olan sığır,
domuz, koyun ve keçi, özellikle Asya ve Güney Amerika’da su bufaloları, Afrika
bufaloları, kudu ve impalalar hastalığın doğal epidemiyolojisinde rol oynayan
7
gruptur. Geyik, deve, lama, Hindistan filleri ise belli şartlar altında epidemiyolojik
risk oluşturabilecek hayvanlardır (Alexandersen ve Mowat, 2005). Şap virusu genel
olarak enfekte hayvan hareketleri ile, daha az sıklıkta ise kontamine hayvan ürünleri
ile yayılır (Alexandersen ve ark., 2002). Duyarlı hayvanlar şap virusu ile enfekte
diğer hayvanlar veya enfekte bir çevre ile aracısız veya aracılı temas sonucunda
enfekte olabilirler (Alexandersen ve ark., 2003). Uzun menzilli hava yolu ile bulaşma
nadir görülmesine rağmen, uygun iklim ve meteoroloji koşullarında virusun rüzgarla
yayılabilmesi de önemli bir bulaşma şeklidir (Alexandersen ve ark., 2002;
Alexandersen ve ark., 2003; Alexandersen ve Mowat, 2005).
1.3.1. Şap Virusunun Tipleri ve Moleküler Epidemiyolojisi Şap virusunun genetik heterojenite ve çeşitliliği sonucu, özellikle virusun antijenik
özelliklerini önemli ölçüde etkileyen kapsit proteinlerinin yüzey kıvrımlarında oluşan
aminoasit değişimlerine göre serolojik olarak yedi serotipi (O, A, C, Asia1, SAT1,
SAT2 ve SAT3) tanımlanmıştır (Bachrach, 1968; Pereira, 1981). Serotipler;
epidemiyolojik olarak çeşitlilik gösterir, aralarında çapraz bağışıklık yoktur ve her
serotip kendi içinde alttiplere ayrılmaktadır. Bu çeşitliliğin yüksek mutasyon oranı,
tür benzeri populasyon dinamikleri (Domingo ve ark., 2005) ve rekombinasyon
(Carrillo ve ark., 2005; Jackson ve ark., 2007) sonucu olduğu düşünülmektedir. Bu
nedenle şap virusunun bir serotipi ile geçirilen hastalık veya bir serotipe karşı yapılan
aşılama, diğer serotiplere ve bazen aynı serotip içinde bulunan diğer alttiplere karşı
çapraz koruma oluşturmaz (Brooksby, 1982; Mattion ve ark., 2004). Şap virusu
serotiplerinin dünya üzerindeki dağılımı eşit değildir. A ve O serotipleri yayılımı en
fazla görülen serotiplerdir ve Afrika’nın pek çok bölgesinde, Asya’nın çeşitli
bölgelerinde, Uzak Doğu’da (A serotipi bu bölgede görülmez) ve Güney Amerika’da
görülür. SAT serotipleri sadece Afrika kıtasında görülür. C serotipi Hint Alt
Kıtası’nda ve Asia1 serotipi ise genelde Güney Asya’da görülür. Şap virusunun yedi
serotipi nükleotid ve aminoasit dizileri gruplandırıldığında tip spesifik dallara,
coğrafik dağılımlarına göre ise topotip (genotip) olarak adlandırılan genetik gruplara
8
ayrılır. Yüzde seksenbeşten fazla nükleotid benzerliği olan izolatlar aynı grup veya
topotip içerisine alınır (Knowles ve Samuel, 2003).
O serotipi şap virusları, VP1 geni nükleotid dizileri karşılaştırıldığında genetik
ve coğrafik olarak birbirlerinden farklı evrimsel soylar olan on adet topotipe ayrılır.
Bu topotipler; Avrupa-Güney Amerika (Euro-SA), Orta Doğu-Güney Asya (ME-
SA), Güneydoğu Asya (SEA), Katay (CHY), Batı Afrika (WA), Doğu Afrika-1 (EA-
1), Doğu Afrika-2 (EA-2), Doğu Afrika-3 (EA-3), Endonezya-1 (ISA-1) ve
Endonezya-2 (ISA-2) olarak adlandırılır. Endonezya topotipleri 1983’den beri tespit
edilememiştir ve kayboldukları düşünülmektedir (Knowles ve ark., 2005). 1999
yılında Tayvan’da farklı bir O alttipi tespit edilmiştir. O PanAsia olarak
isimlendirilen bu alttip Asya’dan Türkiye’ye ve 2001 yılında İngiltere’ye kadar
ulaşmıştır (Mahy, 2005). Filogenetik karşılaştırmalar sonucunda ME-SA
topotipindeki şap viruslarının, 2001 yılından itibaren Orta Doğu ve Güney Asya’dan
izole edilen O serotipi viruslar arasında baskın duruma geçtiği belirlenmiştir. Orijinal
PanAsia suşunun değişime uğraması ile birçok virus dalı ortaya çıkmıştır ve
bunlardan bir tanesi olan O PanAsia-2 pandemik suşu Hindistan’dan batıya doğru
yayılarak 2008 ve 2009’da Orta Doğu’da yeni salgınlarla devam etmiştir. O PanAsia-
2, 2005 yılından beri Pakistan’ın batısındaki bölgede diğer bütün O serotipi
suşlarının yerini almıştır (Knowles ve ark., yayınlanmamış veri).
Yedi serotip içerisinde en fazla yeni alttip oluşumunun görüldüğü ve bu
sebeple aşılama ile kontrolde zorluklara sebep olan serotip A’dır (Kitching, 2005). A
serotipinin epidemiyolojisinde alt dalların çok sık görülmesi ve bu serotip içinde çok
fazla antijenik çeşitlilik oluşmasının sebebinin, az gözlemlenen bölgeler ve türler
içerisinde virusun uzun süreli sirkülasyonu esnasında düzenli olarak şekillenen
rekombinasyonlar olabileceği bildirilmiştir (Kitching, 2005; Li ve ark., 2007).
Bununla birlikte birçok yeni A serotipi suşunun düzenli olarak ortaya çıkıp daha
sonra neden kaybolduğu hala bilinmemektedir (Kitching, 2005). Knowles ve Samuel
(2003) tarafından üçyüz tane tam ve kısmi VP1 nükleotid dizisinin karşılaştırılması
sonucu; Avrupa-Güney Amerika (Euro-SA), Asya ve Afrika olmak üzere üç tane A
topotipi bildirilmiştir. Dünya Referans Laboratuvarı (WRL)’nın verilerine göre 2005
9
yılında İran’da A serotipinin yeni bir suşu tespit edilmiştir. A/IRN/2005 olarak
olarak isimlendirilen bu suş hızla İran dışına yayılmıştır. Bu suşun yapısal genom
bölgeleri evrimsel başlangıç noktalarını A22 suşundan almaktadır. A/IRN/2005
suşunun çok yüksek virulense sahip olduğu ve bütün yaş gruplarındaki sığırlarda
şiddetli hastalık belirtilerine sebep olduğu tespit edilmiştir (Klein ve ark., 2007).
(a) (b)
Şekil 1.3. VP1 geni nükleotid dizilerine göre tanımlanmış şap virusu O (a) ve A (b) topotipleri (Knowles ve Samuel, 2003)
Asia1 serotipi antijenik olarak diğer serotiplere göre daha az düzeyde değişiklik
göstermektedir ve tek bir genotip içerisinde iki ayrı gruba ayrıldığı bildirilmiştir
(Muthuchelvan ve ark., 2001). Başka bir çalışmada ise Asia1’in genotip I-IV olarak
bilinen dört farklı genotipe ayrıldığı bildirilmiştir (Gurumurthy ve ark., 2002).
1.4. Patogenez ve Patoloji Şap virusu vücuda giriş bölgesinde (üst solunum yolunun mukoza ve lenfoid
dokusunda veya deri bütünlüğünün bozulduğu bölgelerde dermal ve subdermal
dokuda) replike olmakla beraber (Kitching, 2002a), çoğunlukla farengeyal bölgedeki
boynuzlaşmamış hücreler primer enfeksiyon bölgesidir (McVicar ve Sutmoller,
1976). Virus daha sonra serbest olarak veya mononükleer hücreler ile ilişkili şekilde
10
kan dolaşımına geçer ve vücuda yayılarak sekonder replikasyonun şekillendiği
glanduler doku, deri ve ağızda bulunan boynuzlaşmış stratum spinosum tabakasında
affinite gösterdiği alanlara gider. Buradaki hücrelerde veziküller şekillenir.
Veziküllerin birleşmesi ile hastalığın karakteristik özelliğini oluşturan aft ve bullalar
oluşur. Bunlar genellikle kabuklaşır ve kabuklar yirmidört saat sonra düşer.
Kabukların ayrılmasından sonra kırmızı renkte ülserler açığa çıkar. Birkaç gün sonra
lezyonların üzerinde nekrotik epitel parçaları meydana gelir. Özellikle ağız
bölgesinde ve dil üzerinde hastalığa özgü granülasyon dokusu oluşur. Rumen,
retikulum ve omasum epitelinde makroskopik lezyonlar gelişebilir. Virus genç
hayvanlarda miyokardium hücrelerine saldırır ve özellikle sol ventrikül duvarında
çizgili bir görünüm şeklinde makroskopik gri alanlar gözlemlenebilir. İskelet kası
hücrelerinde hiyalin dejenerasyonu şekillenebilir (Kitching, 2002a; Alexandersen ve
ark., 2003).
1.5. Klinik Belirtiler Şap hastalığında inkübasyon süresi; alınan virus miktarına, virus suşuna ve konakçının
bireysel faktörlerine bağlı olarak sığırlarda iki-ondört gün (Kitching, 2002a), koyun ve
keçilerde ise üç-sekiz gün (Kitching ve Mackay, 1994) arasında değişir. Bir-iki gün
süren yüksek ateşten (40°C) sonra dil, sert damak, dudaklar, diş etleri, merme, koroner
bant ve interdigital boşlukta çeşitli sayıda veziküller gelişir. Özellikle laktasyondaki
sığırlarda memelerde de veziküller gelişebilir. Genç hayvanlarda virus yeni gelişen
kalp hücrelerine saldırarak hasara neden olduğu için veziküller şekillenmeden önce
ölüm görülebilir (Kitching, 2002a).
Akut enfekte sığırlarda yoğun miktarda salivasyon görülür ve önce mukoid
sonra mukoprulent hale gelen burun akıntısı tüm mermeyi kaplar. Dildeki veziküller
çoğunlukla birleşir ve dorsal epitelin büyük kısmı yer değiştirebilir. Ağızdaki
veziküller genellikle yirmidört saat içinde koparak yüzeysel erozyonlar oluşur. Ağız
lezyonları hızla iyileşir, erozyonlar fibrin tabakası ile dolar ve pembe fibröz doku
oluşur. Ayak lezyonlarının iyileşmesi daha uzun zaman alır ve lezyonlar sekonder
11
bakteriyel enfeksiyona yatkındır. Laktasyondaki sığırlardaki meme lezyonları süt
sağımını zorlaştırır ve veziküllerin parçalanması sonucu çoğunlukla sekonder mastitis
gelişir. Hastalıktan etkilenen hayvanlar kolaylıkla kondisyon kaybına uğrar. Süt
verimindeki düşüş kalan laktasyon süresince düzelmez. Bir yaşından küçük hayvanlar
tiroid gibi glanduler dokulardaki hasara bağlı olarak gelişimlerini gerektiği ölçüde
tamamlayamazlar (Kitching, 2002a). Koyun ve keçilerde ise hastalığın klinik
belirtilerinin belirlenmesi daha zordur, hastalığın ilk belirtisi topallıktır ve çoğu zaman
ağızda veziküller görülmeyebilir (Hughes ve ark., 2002). Sekonder enfeksiyon
görülmeyen yetişkin hayvanlar hızla iyileşir (Kitching ve Hughes, 2002).
1.6. Şap Viruslarının Teşhisi ve Tiplendirilmesi Şap hastalığının teşhisi hastalığın klinik bulgularına, enfeksiyonun erken döneminde
şap virusunun identifikasyonuna ve iki haftadan sonraki dönemde ise hastalığın
serolojisine dayanır. Persiste enfekte veya taşıyıcı hayvanların teşhisi ise
özofarengeyal sekretlerden virus izolasyonu ile yapılır (Thomson, 1994). Akut
vakalarda vezikül epiteli ve vezikül sıvısı yüksek konsantrasyonlarda şap virusu
içerdiği için tanı materyali olarak kullanılır (Oliver ve ark., 1988). Epitel örneklerinin
uygun olmadığı durumlarda kan ve akut vakalarda yüksek miktarda virus içeren
tükrük tanı materyali olarak kullanılabilir (Thomson, 1994).
Şap virusu pek çok hücre kültüründe çabuk üreyerek hızlı bir şekilde
sitopatolojik etki (CPE) oluşturur. Şap virusu izolasyonu için en sık kullanılan hücre
kültürleri primer veya sekonder buzağı tiroid hücreleri, IBRS-2 veya BHK-21 hücre
hatlarıdır (House ve Yedloutschnig, 1982). Şap hastalığının tanısı ve saha suşlarının
tiplendirilmesinde önceleri kullanılan komplement fikzasyon testi yerini daha hassas,
daha spesifik ve daha çok numune ile çalışma olanağı veren ELISA sistemlerine
bırakmıştır. Virus izolasyonu için hücre kültürü pasajları, ELISA ile birlikte
doğrulayıcı test olarak kullanılmaktadır (Hamblin ve ark., 1984; Roeder ve Le Blanc
Smith, 1987; Ferris ve Dawson, 1988). Son yıllarda şap hastalığının tanısı için RT-
PCR geliştirilmiş ve bu amaçla çeşitli prosedürler bildirilmiştir (House ve Meyer,
12
1993; Reid ve ark., 1998; Moss ve Haas, 1999). Gerçek zamanlı PCR (Reid ve ark.,
2001), nükleik asit dizi analizi temelli amplifikasyon (NASBA) (Collins ve ark.,
2002) ve mikroçip testi (McGall ve Christians, 2002) üzerinde çalışılan diğer
tekniklerdir.
Serumda şap virusuna karşı oluşan antikorların tespiti için mikro virus
nötralizasyon testi (VNT) veya ELISA kullanılmaktadır. VNT, serumda antikor tespiti
için OIE tarafından “altın standart” olarak önerilmektedir (Alexandersen ve ark.,
2003). Şap virusunun aşı ve saha suşlarının eşleştirme testleri de temel olarak VNT ve
ELISA gibi in vitro metodlara dayanır ve eşleştirme yapılacak her bir aşı suşuna karşı
hazırlanmış antiserum havuzları kullanılarak “r” değerinin (relationship value)
hesaplanması ile bulunabilir (Rweyemamu ve ark., 1978; Rweyemamu, 1984; Paton
ve ark., 2005). Ayrıca, monoklonal antikor panelleri ve viral kapsid genlerinin
nükleotid dizi analizleri de bu serolojik testleri tamamlayıcı olarak kullanılabilirler
(Paton ve ark., 2005).
Şap hastalığında, yapısal olmayan proteinlere karşı oluşan antikorların tespiti ile
aşılı hayvanlar ve hastalığı atlatan hayvanların ayrımı için ELISA, EITB ve saf yapısal
olmayan protein antijenlerinin eksprese edildiği viral (baculovirus) veya plasmid
(Escherichia coli) ekspresyon sistemleri geliştirilmiştir. Ayrıca viral polimerazı
kodlayan 3D genine karşı oluşan antikorlar, viral enfeksiyon ilişkili antijen (VIAA)
testi ile tespit edilebilir (Kitching, 2002b).
Plak test; çoğalma özellikleri ve sitopatolojileri birbirinden farklı olan virus
varyantlarının enfektivitesinin ölçülerek kantitatif olarak test edilmesine ek olarak,
virusun ısı ve ilaç uygulaması gibi sadece belli şartlar altında plak oluşturabilen veya
değişik ölçü ve şekillerde plak oluşturabilen genetik olarak farklı varyantlarının
klonlanmasında da kullanılmaktadır (Condit, 2007).
13
1.7. Kontrol ve Mücadele Şap hastalığı ile mücadelede etkin olan kurallar OIE’nin Hayvan Sağlığı Kodu’nda
belirtilmiştir. Bu kurallara göre ülkenin bir bölgesi, ülke geneli veya birkaç bölge
birlikte değerlendirilebilir. Hastalık mücadelesinde uygulanan stratejiye göre
bölgeler; aşılamanın olmadığı hastalıktan ari bölge, gözetim altındaki bölge, aşılama
ile hastalıktan arındırılmış bölge, tampon bölge ve enfekte bölge şeklinde
tanımlanmaktadır (Şap Enstitüsü Müdürlüğü, 2010b). Şap hastalığının kontrolü,
ülkenin hastalık kontrol politikaları ve epidemiyolojik durumuna bağlıdır.
Hastalıktan ari ülkelerde kontrol, hastalığın varolduğu ülkelerden hayvan ve
hayvansal ürünlere uygulanan katı sınırlamalar ile virusun ülkeye girişinin
önlenmesine yöneliktir. Bu ülkelerde karantina ve salgın görülmesi durumunda
zorunlu kesim uygulanır. Hastalığın endemik olduğu ülkelerde ise uygun serotipte
inaktif aşılarla yapılan koruyucu aşılamalar ve sanitasyon uygulamaları kombine
edilerek hastalığın insidensinin düşürülmesine yönelik önlemler alınmaktadır (Doel,
2003). Aşılamayı takiben oluşan koruyucu bağışıklık, enfeksiyonu takiben oluşandan
daha kısa sürelidir. Bu nedenle yılda iki veya daha fazla aşılamaya ihtiyaç vardır
(Sutmoller ve ark., 2003).
Belirli bir virus suşundan hazırlanmış olan şap aşısı tarafından, antijenik olarak
ilişkili fakat identik olmayan saha virusuna karşı oluşturulan çapraz korumanın
başarısında aşı ile ilişkili en önemli iki kriter; aşının güçlü bir bağışıklığı ne kadar iyi
uyarabildiği (potens) ve saha virusu ile ne kadar yakın ilişkili olduğudur (antijenik
uyum). Aşının potensini etkileyen faktörler; antijenin miktarı ve kalitesi, kullanılan
adjuvant ve aşının formülasyonudur. Kontrol programlarında kullanılacak ve aşı
antijen rezervlerinde saklanacak aşı suşlarının şap virusunun en uygun suşları
arasından seçimi, salgınlardan toplanan temsili saha izolatlarının uygun aşı suşları ile
eşleştirilmesi temeline dayanır (Rweyemamu ve ark., 1978; Rweyemamu, 1984;
Paton ve ark., 2005). Eğer yeni bir salgının virusuna karşı aşı hazırlamak
gerekiyorsa; aşı suşu olarak seçilen aday varyant, uygun doku kültürü hücrelerine
adapte edilerek gerekli testleri tamamlandıktan sonra süspanse hücre kültürlerinde
büyük miktarlarda üretilir (Piatti ve ark., 1995). Daha sonra binari etilenimin (BEI)
14
gibi bir aziridin ile iki basamaklı inaktivasyona tabi tutulur, konsantre ve purifiye
edilir. Purifikasyon aşamasından sonra inaktive viral materyal, antijen bankası için
sıvı azot içerisinde dondurularak yıllarca saklanabilir veya adjuvantlar ile formüle
edilerek aşı şişelerine doldurulur. Kalite kontrolleri tamamlanan aşı kullanıma hazır
hale gelir (Doel, 2003; Lombard ve ark., 2003; Paton, 2005; Lombard ve Fussel,
2007).
1.8. Türkiye’de Şap Hastalığının Durumu Şap hastalığı ülkemizde eskiden beri bilinmekte olup, hastalığın seyri ve sonuçlarına
ait ilk bilgiler 1914 yılında Ziraat İstatistiği’nde yayınlanmıştır (Sütçü ve ark., 1978).
Şap hastalığı sığırcılık sektörü açısından Türkiye’nin en önemli hastalığıdır (Parlak ve
ark., 2007). Şap virusu suşları Türkiye’ye doğu ve güneydoğu sınırından hayvan
hareketleri ile giriş yapar ve bu bölgelerde hastalık endemik olup yıl boyunca rapor
edilir (Rweyemamu ve ark., 2008). Türkiye’de şap hastalığı mihraklarında yapılan
incelemelerde hastalığın en yaygın bulaşma yolunun aracısız bulaşma olduğu
bildirilmiştir (Aktaş, 1998). 1990’dan itibaren şap virusunun ülke içinde kısa mesafeli
yayılmasından çok, yerel üretimin karşılayamadığı artan et ihtiyacına bağlı olarak
uzun mesafeli kontrolsüz hayvan hareketlerinin baskın risk faktörü olduğu
belirtilmekte (Gilbert ve ark., 2005) ve hayvan pazarlarının önemli rolü olduğu
düşünülmektedir (Aktaş, 1998). Yapılan genetik analizler sonucunda Afganistan,
Pakistan, Suudi Arabistan, İran ve Türkiye’deki virus suşlarının birbiri ile ilişkili
oldukları gösterilmiştir. Bunun sebebi muhtemelen şap virusunun Güney-Orta
Asya’dan batıya doğru yayılmasıdır (Rweyemamu ve ark., 2008).
Ülkemizde 1914 yılından beri değişik tarihlerde A, O, SAT-1 ve Asia1 tipleri
teşhis edilmiştir. SAT-1 tipi 1963 yılında saptanmıştır. Asia1 tipi ilk defa 1973
yılında saptanmış olup, 1984-1999 yılları arasında sadece belli illerde sınırlı
sürelerde (3 yıldan az) dolaşımda kalmıştır ve 2002 yılından bu yana
görülmemektedir. A ve O serotipleri 1952 yılından beri endemik olarak
gözlenmektedir (Aktaş, 1998; Tufan, 2006). Yılda iki kez yapılan aşılama ve sıkı
15
kontrol uygulamalarına rağmen A ve O serotipleri halen rapor edilmektedir (Parlak
ve ark., 2007). İlk görülme yerleri doğu illeri olduğu için A ve O serotiplerinin
ülkemize sınırdan giriş yaptığı düşünülmektedir ve VP1 nükleotid dizileri temel
alındığında komşularımızda persiste olarak sirküle olan suşlar ile evrimsel olarak bir
bütünlük sergiledikleri gösterilmiştir (Aktaş, 1998; Parlak ve ark., 2007).
Ülkemizde halen seyretmekte olan A serotipi suşu ilk olarak 2005 yılı Ağustos
ayında tespit edilmiş olan A/IRN/2005’tir ve özellikle 2006 ilkbaharında büyük
problemlere sebep olmuştur (Klein ve ark., 2007). Ülkemizde halen seyretmekte olan
O serotipi suşu ise, Hindistan’dan batıya doğru Orta Doğu’ya kadar gelerek 2006
yılından beri ülkemizde sığır, koyun ve keçilerde görülmekte olan ve 2007 yılı Şubat,
Nisan ve Eylül aylarında Trakya’ya kadar ulaşan O PanAsia-2 pandemik suşudur
(Knowles ve ark., yayınlanmamış veri).
Tarım ve Köyişleri Bakanlığı tarafından, 2008 İlkbahar Şap Aşısı Kampanyası
ile Avrupa Birliği destekli ve üç yıl süreli “Türkiye’de Şap Hastalığı’nın Kontrolü
Projesi” başlatılmıştır. Bu proje kapsamında; Türkiye genelinde sığır varlığının yılda
iki kez, koyun varlığının ise yılda bir kez olmak üzere üç yıl süre ile yoğun
aşılanması, hastalığın surveylansının yapılması ile hastalık mihraklarının takibi ve
dezenfeksiyonu planlanmıştır. Büyükbaş hayvanlarda Trakya’da ve Anadolu’da
(Ağrı, Ardahan, Artvin, Gaziantep, Hakkari, Hatay, Iğdır, Kars, Kilis, Mardin,
Şanlıurfa, Şırnak, Van illeri) trivalan şap aşısı, diğer illerde ise bivalan şap aşısı
kullanılması kararlaştırılmıştır. Hastalık çıkması durumunda sıkı karantina
yöntemleri uygulanarak bu bölgelerden canlı hayvan ve risk taşıyan ürünlerin
çıkışına izin verilmemesi, Trakya Bölgesi’nde mihraklarda hasta ve hastalıktan
şüpheli hayvanlara kesim metodu uygulanması kararlaştırılmıştır (Tarım ve Köyişleri
Bakanlığı Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü, 2009). Trakya’da 2007 yılı Kasım
ayından bu yana şap hastalığı görülmediği için Trakya kesiminin "Aşılı Arilik"
statüsü için OIE’ye başvuru yapılmıştır. Başvuru 24-28 Mayıs 2010 tarihleri arasında
Paris, Fransa’da düzenlenen OIE Genel Kurulu’nda değerlendirilerek, Trakya “Şap
Hastalığından Aşılı Arilik” statüsü kazanmıştır (Şap Enstitüsü Müdürlüğü, 2010a).
16
1.9. Plak Morfolojisi ve Mutasyonlar Şap aşılarının sahada uygulandığı hayvanlarda yüksek bir bağışıklık meydana
getirebilmesi için iyi bir aşı suşunun; üretildiği sisteme kolay adapte olması,
adaptasyonu takiben iyi bir antijenite ve enfektivite vererek üremesi, üreme sırasında
orijin virusla serolojik, immunolojik ve plak morfolojisi yönünden homolog bir
yapıda olması, immunojen partikülün inaktivan maddelere karşı dayanıklı ve aşı
durumuna geldiğinde uzun süreli ve sahada mevcut aynı alttipin çeşitli varyantlarına
karşı dominant özellikleri olması, aşının saklanması esnasında 146S partiküllerinin
stabil kalması gerekir (Okay ve ark., 1979; Öztürkmen, 1982). Homolog virusların
aşıdaki koruma güçleri heterolog viruslara göre daha fazladır. Bu bakımdan güçlü bir
aşı üretmek için, özellikle süspanse kültürde plak morfolojisi yönünden orijin virusla
aynı karakterde virus üretmek ve mümkün olduğu kadar ilk pasajlara yakın tohum
virus kullanmak zorunluluğu ortaya çıkmaktadır. İleri pasajlarda virusların meydana
getirdikleri plak morfolojilerindeki değişim virusun homolog olmaktan uzaklaştığını
göstermektedir (Okay ve ark., 1979). Suşların plak varyantlarının ve antijenik
farklılıklarının üretim metodlarından mı yoksa pasajlar sonucu mu meydana
geldiğinin saptanması gerekmektedir (Okay ve ark., 1979; Öztürkmen, 1982).
RNA viruslarının hızlı replikasyonu, yüksek mutasyon oranları ve geniş
populasyon ölçüleri viral tür benzerleri olarak adlandırılan genetik olarak yüksek
ölçüde heterojen virus populasyonlarının oluşumuna yol açar. Viral tür benzerleri,
populasyonun bireysel genomlarında var olan bazı çoklu mutasyonların sabitlenmesi
ile değişik koşullara hızlı bir şekilde adapte olabilir (Domingo ve ark., 1985; Domingo
ve ark., 2001; Domingo, 2006). Diğer RNA virusları gibi tür benzeri yapısında olan
şap virusu populasyonları da genetik ve antijenik olarak heterojen olup varyantların
karışımından oluşur (Martinez ve ark., 1992; Sa-Carvalho ve ark., 1997; Domingo,
2002) ve bu nedenle aynı populasyondaki şap virusları, genotipik ve fenotipik olarak
farklı özellikler gösterirler (Mateu ve ark., 1989). Virus populasyonu içindeki genom
çeşitliliği, in vivo veya in vitro immun baskı veya yeni bir konağa giriş gibi çevresel
değişiklere uyumlu varyantların hızlı seleksiyonuna izin verir. Bu seleksiyon
17
hayvanların persiste enfeksiyonu süresince veya hücre kültüründe yayılma süresince
oluşabilir (Sa-Carvalho ve ark., 1997).
Mutant viruslar hakkında yapılan fenotipik çalışmalardan birisi de plak ölçüsü
ve morfolojisinin araştırılmasıdır (Bridgen ve Elliott, 2000). Virus karışımları bazen
tek bir partikül tarafından üretilebilen aynı plak morfolojisine sahip değişik parenteral
genomlardan projeni üreten toplu partiküller içerebilirler. Ayrı plaklardan virusların
karşılaştırılması ve tek bir enfeksiyöz partikülden çoğalan viral populasyonların
evrimi ile ilgili çalışmalar tür benzeri kavramının gelişiminde yararlı olmuştur.
Ayrıca, virusların biyolojik klonlarının kullanımı ile viral tür benzerlerinin dinamik
davranışı hakkında önemli kavramlar tespit edilmiştir. Tek bir plaktan köken alan bir
virus soyu en güç genetik darboğaz olan viral populasyonun geçici olarak tek bir
enfeksiyöz genoma indirgenmesine sebep olur. Populasyonun bileşimi katlanarak
değişir ve büyüme sabitlerindeki çok küçük değişiklikler, zaman içinde bileşimde
büyük değişiklikleri ifade eder. Çeşitli varyantlar içeren küçük populasyonlar
büyüdüğünde, yavaş varyantlar çoğunlukla gözden kaçar. Plak gelişimi sırasında
ortaya çıkmaya başlayan her hangi nötral olmayan bir mutasyon, plağın gelişimi
sırasında yayılacak olan baskın genomlar tarafından sarılır. Bir mutasyon kesinlikle
nötral bile olsa, plaktan örneklenen genomların dizilenmesinde bir mutasyon olarak
kabul edilebilmesi için plak gelişimi sırasında çok erken dönemde oluşması gereklidir.
Daha genel terimlerle her replikasyonda mutant partiküller oluşma olasılığı söz
konusu olduğundan, doğru mutasyon oranı her zaman tespit edilemeyebilir. Tek bir
plak bile heterojen genom populasyonu tarafından oluşturulabilir ve bu populasyonun
optimizasyonunun derecesi virusun girdiği replikasyon siklusu sayısına bağlıdır.
Genel olarak, bir plağın gelişimi sırasında negatif seleksiyon gelişmesi için yeterli
zaman bulunamaz ve daha sağlam genomlarla yarışabilecek mutantlar populasyonda
kalarak bir sonraki transfer için seçilme şansına sahip olurlar (Domingo ve ark.,
2001).
18
1.10. Tezin Amacı
Güçlü bir aşı üretmek için, özellikle büyük hacimli süspanse kültürde plak
morfolojisi yönünden orijin virusla aynı karakterde virus üretilmesi çok önemlidir.
Türkiye’de şap aşısı ile ilgili çalışmaların yapıldığı Şap Enstitüsü’nde yapılan aşı
üretim çalışmaları sırasında ve geçmişte yapılmış olan çalışmalarda yaşanan önemli
bir istenmeyen durum olarak; ilerleyen pasajlarda plak morfolojisi yönünden ana
(orijin) virusa göre değişiklik gösteren bazı virusların oluştuğu ve bu viruslar
kullanılarak hazırlanan aşılarda ana virusa göre aşı üretim miktarı ve kalitesini
etkileyen düzeyde, enfektif titre ve 146S gibi değerlerde önemli düşüşler
gözlenmiştir. Bu durum, aşının kalitesinde olumsuzluklar yaratarak ekonomik olarak
kayıplara neden olabilecek önemli bir faktördür. Bir aşı suşundan bir üretim döngüsü
sonucunda elde edilecek aşı miktarı ve kalitesi ekonomik olarak önemli olduğu için,
bu çalışma sonucu elde edilecek bulgular daha az maliyetle daha kaliteli şap aşısı
üretmek için yapılan çalışmalara bilgi sağlayabilir. Bu çalışmada; aşı suşu adayı
olarak seçilen A/IRN/05 ve O PanAsia-2 suşlarına dahil saha suşlarının ve güncel
bazı aşı suşlarının (O1 Manisa, A22 Irak, A Tur 04-06) monolayer ve süspanse hücre
kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotiplerinin VP1,
VP2, VP3, VP4, 3A ve cre genleri düzeyinde incelenmesi için bu genlerde söz
konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonların sorgulanması
amaçlanmıştır.
19
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. GEREÇ
2.1.1. Hücre Kültürü
Çalışmada orijini İtalya Brescia Enstitüsü olan BHK-21 Cl-13 BS31 hücre kültürü
hattının, Şap Enstitüsü şartlarında endüstriyel üretime adapte edilmiş monolayer
üreme özelliği gösteren BHK-21 An31 ve BHK-21 An30 ile süspanse üreme özelliği
gösteren BHK-21 An30 hücre kültürü hatları kullanıldı.
(a) (b)
Şekil 2.1.1. BHK-21 An31 (a) ve BHK-21 An30 (b) monolayer hücre kültürlerinin mikroskop altındaki görüntüleri
2.1.2. Araştırmada Kullanılan Viruslar 2.1.2.1. Aday Viruslar
Bu çalışmada; 2007 yılında Türkiye’nin çeşitli illerindeki şap hastalığı şüpheli
sığırlardan alınarak tanı amacı ile Şap Enstitüsü’ne gönderilmiş olan 10 adet dil
epiteli, Tip Tayini Laboratuvarı’nda elde edilmiş olan ELISA sonuçları (pasaj 0-P0
olan orijinal virus süspansiyonun tipi ve optik dansitesi-O.D.) ve dil epitel arşivindeki
20
stok durumları incelenerek aday virus olarak seçildi ve çalışmada kullanıldı (Çizelge
2.1.1.).
Çizelge 2.1.1. Çalışmada kullanılan aday viruslara ait bilgiler
Virus Kodu Tipi ve O.D.’si (P0 için)
İli Hastalık Çıkış Tarihi
Laboratuvara Geliş Tarihi
1 A-1,3 Isparta 23.02.2007 28.02.2007
2 A-1,1 Isparta 23.02.2007 28.02.2007
3 A-2,0 Ankara 28.09.2007 01.10.2007
4 A-1,4 Iğdır 30.10.2007 05.11.2007
5 A-1,8 Bolu 01.12.2007 04.12.2007
6 O-2,1 Rize 13.01.2007 18.01.2007
7 O-2,0 Denizli 22.01.2007 30.01.2007
8 O-1,7 Kırklareli 25.02.2007 02.03.2007
9 O-2,4 Balıkesir 13.09.2007 18.09.2007
10 O-1,9 Nevşehir 19.09.2007 26.09.2007
2.1.2.2. Kontrol Viruslar
Çalışmada kullanılan aşı suşu niteliğindeki kontrol viruslara ait geçmiş tarihlerde
yapılan sığır pasajlarından elde edilmiş dil epitelleri Şap Enstitüsü’nden temin edildi
(Çizelge 2.1.2.).
Çizelge 2.1.2. Çalışmada kullanılan aşı suşu niteliğindeki kontrol viruslara ait bilgiler
Kontrol Virus Coğrafik Orijin ve İzolasyonTarihi
Çalışmada Kullanılan Sığır Pasajı (SP) Numarası ve Tarihi
O1/Manisa/TUR/69 Türkiye-1969 SP5-07.08.2000
A22/IRAK/24/64 Irak-1964 SP2-22.12.2006
A/TUR/04/06 Türkiye-2006 SP2-26.01.2009
21
2.1.3. Primerler Çalışmada kullanılan primerlerden; NK61 ve NK72 (Knowles ve Samuel, 1998),
3135F, 535F, 1025R, 5265F ve 5450R (Christensen ve ark., 2006) ile CMAL1
(Uzman Veteriner Hekim Fuat ÖZYÖRÜK, Moleküler Epidemiyoloji Laboratuvarı,
Şap Enstitüsü) Şap Enstitüsü Moleküler Epidemiyoloji Laboratuvarı’nda rutinde
kullanılan primerlerden seçilerek kullanıldı. A-1296F, A-1575F, A-2041F, A-2289R,
A-2492F, A-2683R, A-2993R, A-3321R, O4F, O5F, O5R, O6F, O6R2, O7F, O7R
ve O8R; “Batı Avrasya’da Şap Virusunun Yüksek Çözünürlüklü Moleküler
Epidemiyolojisi için Uygulama Teknikleri” isimli proje kapsamında WRL Pirbright-
İngiltere’de tasarlanmış olan primerlerden seçildi ve bu çalışma için de özel bir
firmaya1 sentezlettirilerek kullanıldı. OVP3F, OVP3R, AVP4/2F-Mg, AVP4/2R-Mg,
AVP3F-Mg ve AVP3R-Mg bu çalışma için tasarlandı ve özel bir firmaya1
sentezlettirilerek kullanıldı. Çalışmada kullanılan primerlerin listesi Çizelge 2.1.3.’de
verildi.
1 Metabion International, Almanya.
22
Çizelge 2.1.3. Çalışmada kullanılan primerler
Primer
Nükleotid Dizisi (5’-3’)
Gen
Tip
Ürün Büyüklüğü (bp)
Kullanım Amacı
3135F NK61
ACAAACGTACAGGGGTGGGT GACATGTCCTCCTGCATCTG
VP1
A
896
PCR
CMAL1 NK61
CCACAAATGTACAGGGATGGG GACATGTCCTCCTGCATCTG
VP1
O
896
PCR
NK72
GAAGGGCCCAGGGTTGGACTC
VP1
A O
823 825
Nükleotid dizi reaksiyonu
535F 1025R
GAGAAAYGGGACGTCTGCGC GTCRCCTATTCAGGCATAGAAG
cre
A O
491
PCR Nükleotid dizi reaksiyonu (R primerler ile)
5265F 5450R
TATGTTCAAGCCTCAACCACC CACTTTCAAACCGACAGGTT
3A
A O
755
A-1296F A-2289R A-1575F A-2683R A-2041F A-2993R A-2492F A-3321R
GAGCCTTTCTTC GACTGGGTC WCACCTCCACGTCCCAGC GGGTGGTARGCGATCGACG GCTGTTTTRGGGTCTGTTGTCACC AYTCGAGTGTGGGAGTCACS GTAC GCCACCATGTASCGG CTGGACYCTGGTRGTGATGG TGGTGGTGACAGGGTCTGC
VP4 VP2 VP3
A
994 1109 953 830
O4F O5R O5F O6R2 O6F O7R O7F O8R
GTGGACCACCCGCTCTC TCTGGCACCATGGCCAC CAGAACCARTCAGGCAACACTG GCCTCAGCCACATCAAGG CTGACCACAAAGGTGTCTAYGG GTCAGACGC GGTGTACGC CACGTYGCGGGTGAGTTCC CGGGACCCAGGTRAGGTTYC
VP4 VP2 VP3
O
953 1026 921 961
OVP3F OVP3R
GGTACACAAACCTTGGACCCTCG YGAGACRTCCGTGTGYTGGC
VP3
O
898
AVP4/2F-Mg AVP4/2R-Mg
TAYGCGATCGACGACGAGG AATGCTGCTGGTGGTCAGTGG
VP4 VP2
A 957
AVP3F-Mg AVP3R-Mg
CATGACAGCCCACATCACGG CGYTGAGCCTGTGTCTCWCC
VP3
A 936
Uluslararası Biyokimya Birliği (IUB) Kodları nükleotid simgeleri (R: A veya G; S: C veya G; W: A veya T; Y: C veya T)
23
2.2. YÖNTEM Araştırmanın yöntemsel algoritması aşağıda sunulduğu şekilde gerçekleştirildi:
5 adet A tipi - 5 adet O tipi - 3 adet kontrol virus
BULGULARIN KARŞILAŞTIRILMASI
Epitel arşivinden tipi ve O.D. si belli olan epitellerin seçilmesi
2.2.2. Epitelden virus süspansiyonunun hazırlanması
2.2.1. Hücre kültürlerinin hazırlanması
2.2.3. Virus izolasyonu
2.2.4. ELISA
BHK-21 An31 monolayer hücre kültürüne adaptasyon
BHK-21 An30 monolayer hücre kültürüne adaptasyon
BHK-21 An30 süspanse hücre kültürüne adaptasyon
Serotipik identifikasyon
2.2.5. Plak test
Enfektif titre ve fenotipik değerlendirme Moleküler viroloji
(2.2.6.-2.2.11.)
6 gene ait nükleotid diziler
24
2.2.1. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması Çalışmada kullanılan virusların izolasyonları, çoğaltılmaları ve plak testlerinde
önceden duyarlılık ve sterilite kontrolleri yapılmış monolayer hücre kültürü hatları
olan BHK-21 An31 ve BHK-21 An30 hücre yapısının çalışma boyunca aynı kalması
amacı ile gerekli miktarlarda çoğaltılarak -196°C’de stoklandı ve kullanılacağı zaman
çözdürüldü. Monolayer hücre kültürlerinin çoğaltılması amacı ile 150 cm2’lik1, virus
ekimleri için ise 25 cm2’lik2 hücre kültürü şişeleri ve hücre üretme vasatı olarak %10
ticari sığır serumu3 ile %90 Glasgow minimum temel vasatı (GMEM)4 kullanıldı.
Monolayer hücre pasajı bilinen yöntemle yapıldı. Hazırlanan hücre kültürleri, virus
ekimine kadar CO2’li etüvde 37°C’de inkübasyona bırakıldı. Süspanse hücre kültürü
ise çalışma esnasında Şap Enstitüsü’nde hücre üretme tanklarında çoğaltılan ve aşı
üretiminde kullanılan süspanse BHK-21 An30 süspanse hücre kültürü hattından alındı.
Burker Hemositometre5 kullanılarak ve %10 tripan mavisi solüsyonu ile boyandıktan
sonra süspanse hücrenin ml’deki sayısı mikroskopta bulundu. %10 sığır serumu ve
%90 6M vasatı (Şap Enstitüsü’nün kendi oluşturduğu formülasyon) içeren süspanse
hücre üretme vasatını ortamdan uzaklaştırmak amacı ile süspanse hücre 800 rpm’de
santrifüj edildi. Süpernatant atıldı ve pelet ml’sinde 2,0x106 hücre olacak şekilde virus
üretme vasatı ile sulandırıldı. Virus üretme vasatı olarak %10 oranında triptoz fosfat
brot (TPB)6, %1 sodyum bikarbonat ve %1 antibiyotik (gentamisin) eklenerek
kullanıma hazır hale getirilen GMEM7 kullanıldı. Hücre toplam miktarı 50 ml olacak
şekilde 70 ml kapasiteli manyetik karıştırıcılı mini cam fermentörlere taksim edildi ve
fermentörler manyetik karıştırıcı aleti üzerine alınarak 37°C’de inkübasyona bırakıldı.
1 NUNC, Kat. No: 159920. 2 Greiner Bio-One, Kat. No: 690170. 3 PAA Adult Bovine Serum, Kat. No: B 15-313. 4 AppliChem GMEM BHK 21, Kat. No: A 1321-1/5. 5 Burker-Superior, Almanya. 6 Invitrogen, GIBCO, Kat. No: 18050. 7 Invitrogen, GIBCO GMEM BHK 21 1X, Kat. No: 21710.
25
2.2.2. Epitelden Virus Süspansiyonunun Hazırlanması Sahadan gelen dil epitelleri ve referans olarak seçilen viruslara ait dil epitellerinden
virus süspansiyonlarının hazırlanması daha önceden bildirilen (Ferris ve Dawson,
1987) yönteme göre yapıldı. Bu amaçla, 1g dil epiteli steril bir havan içerisinde
steril kum ile ezilerek 9 ml PBS ile homojenize edildi, +4°C’de ve 3 000 rpm’de 30
dakika santrifüj edildi. Üstteki süpernatant alınarak 0,45 µm1 ve 0,20 µm’lik2
filtrelerden geçirildi ve etiketlendirilerek bir sonraki işleme kadar -80°C’de
saklandı.
2.2.3. Virus İzolasyonu Çalışmada kullanılan virusların hücre kültürlerine adapte olmaları amacı ile Şap
Enstitüsü Protokolü’ne göre öncelikle BHK-21 An31, daha sonra da BHK-21 An30
hücre kültürü hatlarında virus pasajları yapıldı. Bu amaçla virus süspansiyonları 25
cm2’lik hücre kültürü şişelerinde hazırlanan ve monolayer üreme özelliği gösteren
BHK-21 An31 ve BHK-21 An30 hücre kültürlerine adsorbsiyonlu ekim yöntemi ile
ekildi. Hücre kültürlerinin yüzeyleri virus ekiminden önce serum kalıntısını
uzaklaştırmak amacı ile 2 defa virus üretme vasatı ile yıkandı. Virusların enfektif
titrelerine göre 0,05 enfeksiyon dozunda (MOI) olacak şekilde (1 virus partikülü/20
hücre) 1 ml virus ekimi yapılarak CO2’li etüvde 1 saat 37°C’de inkübasyona
bırakıldı. Bu süre sonunda ekimi yapılan virus ortamdan uzaklaştırıldı. Hücre
kültürlerinin yüzeyi virus üretme vasatı ile tekrar yıkandı. Daha sonra 5 ml virus
üretme vasatı ilave edilerek CO2’li etüvde 37°C’de inkübasyona bırakıldı.
İnkübasyon süresince CPE ve pH değişiklikleri yönünden kontrol edildi. Virus
kültüründe %75-80 CPE görüldüğü zaman -20°C’ye kaldırıldı. Dondurulan virus
kültürü bir sonraki virus pasajında kullanılacağı zaman hızlıca çözdürülerek
+4°C’de ve 3 000 rpm’de 30 dakika santrifüj edildi. Süpernatant alınarak bir kısmı
tekrar hücre kültürüne ekildi, bir kısmı testlerde kullanılmak üzere porsiyonlandı.
1 Millex, Kat. No: SLHV033RS. 2 Millex, Kat. No: SLGPO33RS.
26
Hücre kontrol olarak hazırlanan hücre kültürü şişeleri için aynı işlemler sadece
vasat kullanılarak yapıldı. Virus ekimleri hücre kontrol ile mikroskobik olarak
karşılaştırıldı. Tüm viruslar 24 saat içerisinde %90-100 CPE oluşturarak BHK-21
An31 monolayer hücre kültürüne adapte olduktan sonra, aynı işlemler tekrarlanarak
süspanse hücre kültürüne adaptasyon için geçiş hücresi olan BHK-21 An30
monolayer hücre kültüründe adaptasyon çalışmaları yapıldı.
Monolayer hücre hatlarında adaptasyonları tamamlanan virusların süspanse
hücre kültüründe pasajları yapıldı. Bu amaçla, başlangıç hücre konsantrasyonu
2,0x106 hücre/ml olarak hazırlanan manyetik karıştırıcılı mini cam fermentörlere 0,05
MOI dozunda virus ekimi yapıldı. Fermentörler manyetik karıştırıcı aleti üzerine
alınarak 37°C’de inkübasyona bırakıldı. Fermentörlerden belli aralıklarla numune
alınarak mikroskopta CPE yönünden kontrol edildi. %90 ve üzeri CPE şekillendiği
zaman +4°C’de ve 3 000 rpm’de 30 dakika santrifüj edildi. Süpernatant alınarak bir
kısmı tekrar hücre kültürüne ekildi, bir kısmı testlerde kullanılmak üzere
porsiyonlandı ve geri kalanı -80°C’de saklandı. Hücre kontrol olarak hazırlanan
fermentöre virus ekilmedi, virus ekimleri ile aynı şartlarda inkübasyona bırakıldı,
mikroskopta hücre morfolojisi ve sayısı incelendi. Hücre kontrol 800 rpm’de 10
dakika santrifüj edilerek süpernatantı alındı ve testlerde kullanılmak üzere
porsiyonlandı.
2.2.4. İndirekt Sandviç ELISA
Çalışma için seçilen aday ve kontrol virusların hücre kültüründe yapılan her virus
pasajı sonrasında indirekt sandviç ELISA ile tip tayinleri yapıldı. Her virus
pasajında kullanılan hücre kontrol de teste alındı. Test, Roeder ve Le Blanc Smith
(1987) tarafından bildirilen yönteme göre yapıldı. Bu amaçla, WRL’ndan temin
edilen tip (A, O, Asia1) spesifik tavşan hiperimmun serumları ile bir gece
öncesinden kaplanan tek kullanımlık ELISA tableti1 PBS ile yıkandı ve kurutuldu.
1 NUNC, Kat. No: 442404.
27
Araştırmada kullanılan viruslar, her bir tip için spesifik antikor ile kaplı üçer
göze olacak şekilde tabletin uygun gözlerine konuldu. 37°C’de 1 saat inkübasyonu
takiben, WRL’ndan temin edilen şap virusu spesifik poliklonal kobay hiperimmun
serumu tüm gözlere konularak tabletler tekrar 37°C’de 1 saat inkübasyona bırakıldı.
Daha sonra tüm gözlere horse-radish peroksidaz (HRPO) ile işaretli konjugat1 (anti-
kobay IgG) titresi oranında sulandırılarak ilave edildi. 37°C’de 1 saat inkübasyonu
takiben hidrojen peroksit ile aktive edilen substrat2 (orthophenilaminediamine-OPD)
ilave edildi ve 15 dakika oda ısısında inkübasyona bırakıldı. Reaksiyonun
durdurulması için 1,25 M. sülfürik asit durdurucu solüsyonu kullanıldı. Sonuçlar
492 nm dalga boyunda spektrofotometrede okutuldu. Elde edilen üç göz O.D.
değerlerinin ortalaması 0,1 ve üzeri olanlar tip spesifik şap virusu olarak
değerlendirildi.
2.2.5. Plak Test Virusların enfektivite titrelerini hesaplamak ve plak morfolojilerini incelemek amacı
ile Şap Enstitüsü Protokolü’ne göre plak test yapıldı. Bu amaçla; enfektivite titresi
ölçülecek virusların, virus üretme vasatı ile 10-1’den 10-6’ya kadar dilusyonları
yapıldı. Her virus pasajında kullanılan hücre kontrol de teste alındı. 48 saat
öncesinde hazırlanmış, %100 kaplı monolayer hücre ihtiva eden 6 gözlü tek
kullanımlık hücre kültürü tabletlerine3 her dilüsyondan 0,1 ml olacak şekilde ekim
yapıldı ve CO2’li etüvde 37°C’de 1 saat adsorbsiyona bırakıldı. Bu süre sonunda her
göze 3 ml örtme vasatı (%50 gum4 + %50 2X GMEM karışımı) konularak tabletler
48 saat CO2’li etüvde 37°C’de inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon süresi sonunda
vasatları dökülerek her göze 2 ml %20 formol ve %2,5 kristal viyole ile hazırlanan
boyama solüsyonu ilave edildi. 2 saat oda ısısında bekletildikten sonra boya
dökülerek tabletler çeşme suyu ile dikkatlice yıkandı ve kurumaya bırakıldı.
1 DAKO, P0141. 2 Amresco, J348-50J. 3 Orange Scientific, Kat. No: 2030500. 4 SIGMA-ALDRICH, Gum Tragacanth, Kat. No: 9000-65-1.
28
Tabletler kuruduktan sonra değerlendirmeye alındı. Değerlendirmede
sayılabilen plakların bulunduğu son göz okunarak plak sayısının ortalaması alındı.
Daha sonra aşağıda yazılı olan formülde yerine konularak enfektivite titresi PFU/ml
olarak bulundu.
Plakların sayıldığı dilüsyon x Ortalama plak sayısının logaritması
Enfektivite titresi =
(PFU/ml) İnokulasyon hacmi
Ayrıca yapılan plak testlerden sonra plak morfolojileri incelendi ve plakların
çapları ölçüldü. Bazı virusların plak klonları seçildi. Plak klonlarının elde edilmesi
amacı ile belirlenen tek bir plağın sınırları içinden 5 µl örtme vasatı alınarak 45 µl
vasatla karıştırılarak bir sonraki inokulasyona kadar -20°C’de saklandı. Seçilen her
plak klonu 2 defa daha plak teste alınarak, toplamda 3 kez plak purifikasyonu
gerçekleştirildi.
2.2.6. RNA Ekstraksiyonu Viral RNA’nın ters transkripsiyonu için gerekli olan şap virusu genomik RNA’sının
virus süspansiyonlarından elde edilmesi amacı ile spin kolon teknolojisi ile
hazırlanmış ticari kitin protokolüne1 göre RNA ekstraksiyonu yapıldı. Bu amaçla 2
ml’lik nükleazlardan ari toplama tüpüne 250 µl virus süpansiyonu konuldu. Üzerine
hücrenin lize olmasını sağlayan TMR1 solüsyonundan 500 µl eklenerek 1-2 dakika
vortekslendi. Üzerine yine hücrenin lize olmasını sağlayan TMR2 solüsyonundan
500 µl ve TMR3 solüsyonundan 250 µl eklenerek tüpler 5 defa ters yüz edilerek
karıştırıldı. Karışım buz üzerinde 5 dakika inkübasyona bırakıldı. +4°C ve 10 000
rpm’de 10 dakika santrifüj edildi. Bu karışımdan 1 000 µl süpernatant pelete zarar
vermeden yeni bir 2 ml’lik toplama tüpüne alındı. Üzerine RNA’nın yıkanması için
kullanılan TMR4 solüsyonundan 800 µl eklendi ve pipetasyon yapılarak karıştırıldı.
1 Mobio-Ultra Clean Tissue RNA Isolation Kit, Kat. No: 15000-50.
29
Bu karışımdan 650 µl alınarak 2 ml’lik toplama tüpüne yerleştirilen ve RNA’yı
bağlama özelliğindeki silis membranlı spin filtreye yüklendi ve 10 000 rpm’de 30
saniye santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. Kalan süpernatant ve
TMR4 karışımı bitene kadar aynı işlem uygulandı. Spin filtreye RNA’nın yıkanması
için kullanılan TMR5 solüsyonundan 500 µl eklendi ve 10 000 rpm’de 30 saniye
santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. TMR5 kalıntısı kalmaması
amacı ile 13 000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Filtre 2 ml’lik temiz bir toplama
tüpüne alındı. RNA’nın sulandırılması amacı ile beyaz filtre membranının ortasına
gelecek şekilde içinde RNaz içermeyen su bulunan TMR6 solüsyonundan 50 µl
eklendi. 10 000 rpm’de 30 saniye santrifüj edildi. Filtre atıldı. Elde edilen RNA
örnekleri etiketlenerek kullanılacağı zamana kadar -80°C’de saklandı.
2.2.7. Viral RNA’nın Ters Transkripsiyonu Viral RNA’nın ters transkripsiyonunun yapılarak cDNA elde edilmesi amacı ile
Knowles ve Samuel (1998) tarafından daha önceden bildirilen yöntem temel alındı.
Bu amaçla öncelikle 0,7 µl 25 pmol/µl konsantrasyonundaki random hekzamer
primeri1 ve 7 µl RNA, nükleazlardan ari toplama tüpüne konularak kısa süreli
santrifüj edildi. Isısal döngü cihazına2 yerleştirilerek 90°C’de 1 dakika ve 70°C’de 1
dakika inkübe edildi.
1 Ella Biotech, Almanya. 2 Eppendorf, Mastercycler Personal, Almanya.
30
Bu esnada aşağıda bildirilen RT reaksiyonu karışımı hazırlandı:
Bileşen Miktar (µl)
10 mM dNTP karışımı1 1,25
5X RT buffer2 2,5
RNazin3 (3,0 U/µl) 0,5
Nükleazlardan ari su4 0,5
DDT5 0,5
MMLV Ters transkriptaz6 (200U/µl) 0,25
Toplam 5,5
Isısal döngü cihazından alınan tüpler kısa süreli santrifüj edildi ve üzerine
hazırlanan RT karışımından 5,5 µl ilave edilerek tekrar kısa süreli santrifüj edildi.
Isısal döngü cihazına konularak 42°C’de 60 dakika ve 94°C’de 10 dakika inkübe
edildi. Cihazdan alınan tüpler kısa süreli santrifüj edildi. Elde edilen cDNA hemen
kullanılmayacak ise bir sonraki işleme kadar -20°C’de saklandı.
2.2.8. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Çalışmada nükleotid dizileri elde edilmesi istenen gen bölgelerinin amplifikasyonu
için yapılan PCR; içinde magnezyum klorür (MgCl2), 10X PCR buffer ve Platinum
Taq DNA Polimeraz bulunan ticari kitin7 protokolüne göre yapıldı.
1 Fermentas, Kat. No: R0192. 2 Fermentas, Kat. No: EP0442. 3 Fermentas, Kat. No: E00381. 4 Fermentas, Kat. No: R0582. 5 Fermentas, Kat. No: R0861. 6 Fermentas, Kat. No: EP044.
7 Invitrogen, Platinum Taq DNA Polymerase, Kat. No: 10966-030.
31
Bu amaçla 0,5 ml’lik nükleazlardan ari toplama tüpü içerisinde aşağıda bildirilen
PCR karışımı hazırlandı:
Bileşen Konsantrasyon Miktar (µl)
MgCl2 50 mM 1,50
10X PCR buffer 1X 5,00
10 mM dNTP karışımı Her biri 0,2 mM 1,00
Primer 1 10 µM 1,00
Primer 2 10 µM 1,00
Platinum Taq DNA polimeraz (5 U/µl) 1,0 U 0,20
Nükleazlardan ari su 35,30
cDNA 5,00
Toplam 50,00
Hazırlanan karışım kısa süreli santrifüj edildi. Isısal döngü cihazında 94°C’de 4
dakika, 94°C’de 1 dakika - 55°C’de 1 dakika - 72°C’de 1 dakika 35 döngü ve 72°C’de
5 dakika inkübe edildi. İnkübasyonu takiben PCR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi
yapılarak bant oluşumu incelendi ve ürünler hemen kullanılmayacak ise bir sonraki
işleme kadar -20°C’ de saklandı.
2.2.9. PCR Ürününün Agaroz Jel Elektroforezi PCR ürünlerinin görüntülenmesi amacı ile % 1,5’luk agaroz jel hazırlandı. Bu
amaçla; 0,45 g agaroz1, 1X tris-borat-EDTA tampon çözeltisi (TBE)2 ile 30 ml’ye
tamamlanarak ısı ile eritildi. Erimiş olan agaroz jel soğutulmaya bırakıldı ve 5 mg/µl
konsantrasyonundaki stok etidyum bromidden3 her 10 ml için 1 µl ilave edilerek,
final konsantrasyonu 0,5 µg/ml olacak şekilde agaroz jel hazırlandı.
1 Scharlau, Kat. No: 9012-36-6. 2 Fermentas, Kat. No: B52. 3 SIGMA-ALDRICH, Kat. No: E8751.
32
Elektroforez tankına tarak yerleştirildikten sonra agaroz jel döküldü. Yüzeyin
düzgün şekil alması ve jelin donması için 15 dakika beklendi. Bu işlem sonunda jel
üzerine 1X TBE eklenerek tarak jelden alındı. Her bir örnek için 1 µl 6X yükleme
tamponu1 üzerine 5 µl PZR ürünü ilave edilerek pipetasyonla karıştırıldı ve jel
üzerindeki gözlere 5 µl aktarıldı. Daha sonra 1 µl moleküler ağırlık merdiveni2, 1 µl
yükleme tamponu ve 4 µl su ile karıştırılarak jelin uygun gözüne aktarıldı. 20
dakika-100 volt koşullarında gerçekleştirilen elektroforez sonrasında, örneklere ait
bant oluşumu görüntüleme cihazı3 ile kontrol edildi.
2.2.10. PCR Ürününün Agaroz Jelden Purifiye Edilmesi PCR ürününün agaroz jelden purifiye edilerek nükleotid dizileme reaksiyonuna
hazırlanması, spin kolon teknolojisi ile hazırlanmış ticari kitin4 protokolüne göre
yapıldı. Bu amaçla ilk olarak, PCR ürünlerinin elde edileceği % 1,5’luk agaroz jel
hazırlandı. Jel donduktan sonra, 50 µl PCR ürün örneği ve 10 µl 6X yükleme
tamponu 0,2 ml’lik toplama tüpü içerisinde karıştırılarak otomatik pipet yardımı ile
jel üzerindeki gözlere yüklendi. Daha sonra 1 µl moleküler ağırlık merdiveni, 1 µl
yükleme tamponu ve 4 µl su ile karıştırılarak jelin uygun gözüne aktarıldı.
Elektroforez, 20 dakika-100 volt koşullarında gerçekleştirildi. PCR ürünleri
morötesi ışık kaynağı kullanılarak steril bistüri ile jelden kesildi. PCR ürününü
içeren jel parçası 1,5 ml’lik toplama tüpüne alındı. Jel parçasının ağırlığı tartıldı ve
her 10 mg jel parçası için 60 µl GS1 (jeli çözdürücü tampon) eklendi. En az 15
dakika olacak şekilde, jel parçası eriyene kadar 50°C’de inkübasyona bırakıldı. Her
3 dakikada bir karıştırıldı. Jel parçası eridikten sonra 5 dakika daha inkübasyonda
tutuldu. Jel ekstraksiyon kolonu 2 ml’lik yıkama tüpüne yerleştirildi ve GS1
içerisinde erimiş olan jel kolona yüklendi. Oda ısısında 10 000 rpm’de 1 dakika
santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. Kolona 500 µl GS1 eklendi
1 Fermentas, Kat. No: RO611. 2 Invitrogen, Kat. No: 10488-058. 3 Kodak Gel Logic 1500, Amerika Birleşik Devletleri. 4 Invitrogen-Quick Gel Extraction Kit, Kat. No: K 2100-12.
33
ve oda ısısında 1 dakika inkübasyona bırakıldı. 10 000 rpm’de 1 dakika santrifüj
edildi. Tüpe geçen sıvı ortamdan uzaklaştırıldı. Kolona içerisinde etanol bulunan
W9 yıkama solüsyonundan 700 µl eklendi ve oda ısısında 5 dakika inkübasyona
bırakıldıktan sonra 10 000 rpm’de 1 dakika santrifüj edildi. Tüpe geçen sıvı
ortamdan uzaklaştırıldı. W9 kalıntısı kalmaması amacı ile tekrar 10 000 rpm’de 1
dakika santrifüj edildi. Kolon 1,5 ml’lik yeni bir tüpe alındı. Kolon membranının
ortasına gelecek şekilde TE solüsyonu (nükleazlardan ari su) eklendi. Oda ısısında 1
dakika inkübasyona bırakıldı. 10 000 rpm’de 2 dakika santrifüj edildi. Kolon atıldı.
Tüp üzerine gerekli bilgiler yazıldıktan sonra elde edilen purifiye DNA, 2.2.9.’da
anlatıldığı şekilde % 1,5’luk agaroz jelde yürütülerek nükleotid dizileme analizi için
yeterli kalitede olup olmadığı kontrol edildi. Daha sonra kullanılacağı zamana kadar
-20°C’de saklandı.
2.2.11. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu ve Elde Edilen Nükleotid Dizilerin
Değerlendirilmesi
Nükleotid dizileme reaksiyonu özel bir firmaya1 yaptırıldı. Nükleotid diziler,
ClustalX (Thompson ve ark., 1997) ve GeneDoc (Nicholas ve ark., 1997) yazılımları
kullanılarak GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) numaraları Çizelge
2.2.1.’de verilen referans nükleotid diziler ile hizalandı ve MEGA4 (Tamura ve ark.,
2007) yazılım paketi kullanılarak FASTA formatına çevrildi. Verilerin
dökümantasyonunda ise BioEdit Version 7.0.1 yazılım paketi (Hall, 1999) kullanıldı.
Çizelge 2.2.1. Çalışmada kullanılan referans nükleotid dizilere ait bilgiler
Referans Nükleotid Dizi Genbank Numarası Referans
A24/Cruzeiro/BRA/55 Kapsit genleri AJ251476 (Knowles ve ark., 1999)
A/PAK/3/2006 3A geni EF117837 (Klein ve ark., 2006)
O1/Manisa/TUR/69 Kapsit genleri AJ251477 (Aktaş ve Samuel, 2000)
O/NY00 cre geni AY333431 (Zheng ve ark., 2004)
O/KEN/1/91 3A geni AF335006 (Heath ve ark., 2001)
1 RefGen, ODTÜ Teknokent, Ankara.
34
3. BULGULAR
3.1. Virus İzolasyonu Bu çalışma için BHK-21 hücre kültürü hatlarında virus izolasyon çalışmasına alınan
13 adet virusun; BHK-21 An31 monolayer hücre kültüründe 1.-6. (O1 Manisa
kontrol virusu için 1.-13.), BHK-21 An30 monolayer hücre kültüründe 7.-12. (O1
Manisa kontrol virusu için 14.-20.) ve BHK-21 An30 süspanse hücre kültüründe
13.-15. (O1 Manisa kontrol virusu için 21.-23.) pasajları tamamlanarak hücre
kültürü adaptasyon çalışmaları yapıldı. O1 Manisa kontrol virusunun adaptasyonu
diğer viruslara göre daha fazla pasaj yapılarak tamamlanabildi. BHK-21 An31 ve
BHK-21 An30 monolayer hücre kültürü hatlarında yapılan son pasajlarda bütün
viruslar 24 saatten daha kısa sürede %90-100 CPE oluşturdu. BHK-21 An30
süspanse hücre kültüründe yapılan son pasajlarda ise Virus 5 ve A Tur 04-06
kontrol virusu hariç bütün viruslar 24 saatten daha kısa sürede % 90-100 CPE
oluşturarak adaptasyonlarını tamamladı. Virus 5 ve A Tur 04-06 kontrol virusu ise
BHK-21 An30 süspanse hücre kültüründe yapılan pasajlarda CPE oluşumu
göstermedi ve bu hücre kültürüne adapte olmadı. Bütün virus pasajları için hücre
kontrol olarak hazırlanan ve virus ekilmeyen hücre kültürlerinde CPE oluşumu
görülmedi.
3.2. İndirekt Sandviç ELISA Bütün virus pasajlarından elde edilen pasaj sıvıları indirekt sandviç ELISA testinde
çalışılarak virusların tip tayinleri yapıldı. İndirekt sandviç ELISA testinde çalışılan
viruslardan Virus 1, Virus 2, Virus 3, Virus 4, Virus 5, A22 Irak ve A Tur 04-06
kontrol virusları A serotipi; Virus 6, Virus 7, Virus 8, Virus 9, Virus 10 ve O1 Manisa
kontrol virusu O serotipi olarak tiplendirildi. Virus 5’in BHK-21 An30 süspanse
hücre kültüründe yapılan 1. ve 3. pasajında (P13 ve P15), Virus 10’un BHK-21 An31
hücre kültüründe yapılan 1. pasajında (P1) ve A Tur 04-06 kontrol virusunun BHK-
35
21 An30 süspanse hücre kültüründe yapılan 2. ve 3. pasajında (P14 ve P15) menfi
(negatif) sonuç alındı. Hücre kontrol olarak hazırlanan ve virus ekilmeyen hücre
kültürleri de menfi sonuç verdi. Aday viruslar ve kontrol viruslara ait indirekt
sandviç ELISA sonuçları; Çizelge 3.1.-3.13.’de verildi.
3.3. Plak Test Çalışılan virusların bütün virus pasajlarından elde edilen pasaj sıvıları, plak teste
alınarak enfektivite titreleri hesaplandı ve plak morfolojileri incelendi. Hücre
kontrol olarak hazırlanan ve virus ekilmeyen hücre kültürleri plak oluşturmadı.
BHK-21 An30 süspanse hücre kültüründeki son pasajların pasaj sıvısından yapılan
plak testte; Virus 2 için büyük ve küçük plak, Virus 3 için büyük ve küçük plak,
Virus 6 için küçük plak ve Virus 8 için orta boy plak fenotipi gösteren farklı plak
klonları seçildi. Bu klonlar iki defa daha plak teste alınarak plak pasajı yapıldı ve
nükleotid dizilerinde bir farklılık olup olmadığı araştırıldı. Bunlardan büyük klonlar
PK1, küçük klonlar PK2, diğerleri ise PK olarak adlandırıldı. Aday viruslar ve
kontrol viruslara ait plak test bilgileri Çizelge 3.1.-3.13.’de ve plak
morfolojilerindeki değişimleri gösteren fotoğraflar Şekil 3.1.-3.13.’de verildi.
3.3.1. Aday Virus 1 (A tipi 1) Aday Virus 1’in (A tipi 1) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2
ve P10’da plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen diğer pasajlarda
küçüldüğü, P6’dan itibaren 1,0 mm ve daha küçük çapta küçük plakların oluştuğu
ve küçük plakların sayısının süspanse hücre pasajlarında çok arttığı tespit edildi.
36
3.3.2. Aday Virus 2 (A tipi 2) Aday Virus 2’nin (A tipi 2) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu;
ilerleyen pasajlarda P1’e göre plak çapı ortalamasının küçüldüğü, P9’dan itibaren
1,0 mm ve daha küçük çapta küçük plakların sayısının arttığı tespit edildi.
3.3.3. Aday Virus 3 (A tipi 3) Aday Virus 3’ün (A tipi 3) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2,
P3, P4, P5, P6, P7 ve P13’de plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen
diğer pasajlarda küçüldüğü, P2 ve P5 hariç bütün pasajlarda 1,0 mm ve daha küçük
çapta küçük plakların oluştuğu tespit edildi.
3.3.4. Aday Virus 4 (A tipi 4) Aday Virus 4’ün (A tipi 4) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P8,
P9, P10 ve P11’de plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen diğer
pasajlarda küçüldüğü, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında küçük plakların
oluştuğu ve küçük plakların sayısının son süspanse hücre pasajında çok arttığı tespit
edildi. P14’de test ikinci defa tekrarlanmasına rağmen plak oluşumu şekillenmedi.
3.3.5. Aday Virus 5 (A tipi 5) Aday Virus 5’in (A tipi 5) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P3,
P8 ve P9’da plak çapı ortalamasının P1’e göre artmasına rağmen diğer pasajlarda
küçüldüğü, P10’dan itibaren 1,0 mm’den daha küçük çapta plakların oluştuğu tespit
edildi. P14’de test ikinci defa tekrarlanmasına rağmen plak oluşumu şekillenmedi.
37
3.3.6. Aday Virus 6 (O tipi 1) Aday Virus 6’nın (O tipi 1) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında birbirine yakın
olduğu; P2, P3, P4 ve P5’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar artmasına
rağmen diğer pasajlarda daha küçük olduğu, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında
küçük plakların oluştuğu ve ilk pasajlarda bulanık olan plak görüntülerinin daha
sonra netleşerek belirgin hale geldiği tespit edildi.
3.3.7. Aday Virus 7 (O tipi 2) Aday Virus 7’nin (O tipi 2) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında birbirine yakın
olduğu; P2, P3, P4 ve P5’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar artmasına
rağmen diğer pasajlarda daha küçük olduğu, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında
küçük plakların oluştuğu ve ilk pasajlarda bulanık olan plak görüntülerinin daha
sonra netleşerek belirgin hale geldiği tespit edildi.
3.3.8. Aday Virus 8 (O tipi 3) Aday Virus 8’in (O tipi 3) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu ve
bir artıp bir azaldığı, daha sonra tekrar artıp azaldığı tespit edildi. 1 mm çapındaki
küçük plakların P3, P4, P5 ve P7 hariç bütün pasajlarda oluştuğu ve ilk pasajlarda
bulanık olan plak görüntülerinin daha sonra netleşerek belirgin hale geldiği görüldü.
3.3.9. Aday Virus 9 (O tipi 4) Aday Virus 9’un (O tipi 4) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu ve
bir artıp bir azaldığı, daha sonra tekrar artıp azaldığı, P9 ve P15 hariç bütün
pasajlarda plak çapı ortalamasının P1’e göre arttığı tespit edildi. 1 mm çapındaki
küçük plakların P6, P11 ve P12 hariç bütün pasajlarda oluştuğu görüldü.
38
3.3.10. Aday Virus 10 (O tipi 5) Aday Virus 10’un (O tipi 5) plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2
ve P4’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar arttığı, P6’da eşit olduğu ve
diğer pasajlarda azaldığı, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında küçük plakların
oluştuğu tespit edildi.
3.3.11. A22 Irak Kontrol Virusu A22 Irak kontrol virusunun plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu; P2,
P3 ve P4’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar artmasına rağmen diğer
pasajlarda azaldığı, ilk pasajdan itibaren P2, P3 ve P4 hariç 1,0 mm çapında küçük
plakların oluştuğu tespit edildi.
3.3.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu A Tur 04-06 kontrol virusunun plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu;
P3’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar arttığı, P12’da eşit olduğu ve
diğer pasajlarda azaldığı, ilk pasajdan itibaren 1,0 mm çapında küçük plakların
oluştuğu tespit edildi. P14’de test ikinci defa tekrarlanmasına rağmen plak oluşumu
şekillenmedi.
3.3.13. O1 Manisa Kontrol Virusu O1 Manisa kontrol virusunun plak çapı ölçülerinin pasajlar arasında farklı olduğu;
P9, P10, P11, P12, P14 ve P15’de plak çapı ortalamasının P1’e göre bir miktar
artmasına rağmen diğer pasajlarda azaldığı, P1 ve P9 hariç 1,0 mm çapında küçük
plakların bütün pasajlarda oluştuğu tespit edildi.
39
(a) (b) (c) Şekil 3.1. Virus 1’e ait P1 (a), P11 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
(a) (b) (c) Şekil 3.2. Virus 2’ye ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
(a) (b) (c)
(d) Şekil 3.3. Virus 3’e ait P1 (a), P2 (b), P7 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri
40
(a) (b) (c) Şekil 3.4. Virus 4’e ait P1 (a), P8 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
(a) (b) (c) Şekil 3.5. Virus 5’e ait P1 (a), P11 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
(a) (b) (c) Şekil 3.6. Virus 6’ya ait P4 (a), P6 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
41
(a) (b) (c) Şekil 3.7. Virus 7’ye ait P1 (a), P6 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
(a) (b) (c)
(d) (e) Şekil 3.8. Virus 8’e ait P1 (a), P6 (b), P10 (c), P11 (d) ve P15 (e) plak görüntüleri
42
(a) (b) (c)
(d) Şekil 3.9. Virus 9’a ait P1 (a), P9 (b), P11 (c) ve P15 (d) plak görüntüleri
(a) (b) (c) Şekil 3.10. Virus 10’a ait P1 (a), P10 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
43
(a) (b) (c) Şekil 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait P1 (a), P12 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
(a) (b) (c) Şekil 3.12. A Tur 04-06 kontrol virusuna ait P1 (a), P7 (b) ve P15 (c) plak görüntüleri
(a) (b) (c) Şekil 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait P1 (a), P9 (b) ve P23 (c) plak görüntüleri
44
Çizelge 3.1. Virus 1’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 30 3,9-A 7,7 19 4,0-6,0 5,8
P2 20 0,8-A 7,6 5 6,0-8,0 7,2
P3 18 0,6-A 7,2 20 3,0-6,0 5,6
P4 17 1,4-A 7,4 26 3,0-7,0 5,2
P5 16,5 0,5-A 7,7 46 2,0-6,0 3,6
P6 16 1,2-A 8,3 22 1,0-7,0 4,2
Monolayer BHK-21 An30
P7 31 2,7-A 7,3 25 1,0-7,0 3,6
P8 24 3,9-A 7,0 11 1,0-5,0 3,7
P9 18 2,5-A 7,2 21 1,0-6,0 3,1
P10 17 1,9-A 7,0 12 5,0-8,0 6,5
P11 17 3,6-A 7,0 38 1,0-7,0 3,6
P12 15,5 2,8-A 7,5 27 1,0-4,0 1,8
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 1,7-A 7,6 96 0,5-2,0 0,8
P14 17 2,5-A 6,6 136 0,5-4,0 1,0
P15 16 2,2-A 6,7 50 0,5-3,0 1,2
45
Çizelge 3.2. Virus 2’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 27 1,5-A 7,2 24 3,0-7,0 5,1
P2 20 1,4-A 7,3 16 3,0-6,0 4,2
P3 19 0,7-A 7,4 29 3,0-6,0 4,6
P4 18 3,9-A 7,4 32 3,0-6,0 4,3
P5 17 3,7-A 7,5 15 3,0-6,0 4,8
P6 16 0,5-A 8,2 19 3,0-6,0 3,7
Monolayer BHK-21 An30
P7 47 3,9-A 6,3 21 2,0-6,0 3,8
P8 17 2,7-A 8,0 30 2,0-6,0 3,1
P9 17 2,6-A 4,6 53 0,5-4,0 1,3
P10 17 1,9-A 5,2 44 1,0-6,0 2,5
P11 17 2,7-A 6,4 121 0,5-2,0 1,0
P12 16,5 2,2-A 7,1 74 1,0-4,0 1,3
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 1,3-A 6,5 113 0,5-3,0 0,6
P14 17 2,0-A 6,0 129 0,5-4,0 0,9
P15 16 2,3-A 6,3 110 0,5-3,0 0,8
46
Çizelge 3.3. Virus 3’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 25 1,7-A 7,8 65 1,0-4,0 1,8
P2 19 2,0-A 7,2 28 3,0-6,0 4,5
P3 20 2,1-A 7,4 28 1,0-6,0 3,7
P4 23 2,0-A 7,4 25 1,0-5,0 3,9
P5 22 1,6-A 6,5 29 2,0-5,0 3,4
P6 18,5 1,2-A 6,4 23 0,5-4,0 3,0
Monolayer BHK-21 An30
P7 24 2,0-A 5,6 34 1,0-5,0 2,9
P8 21 2,8-A 5,2 16 0,5-3,0 1,3
P9 20 1,3-A 5,4 33 1,0-4,0 1,8
P10 20 1,5-A 5,1 62 1,0-4,0 1,8
P11 19 1,9-A 5,3 31 0,5-3,0 1,1
P12 19 1,1-A 4,9 42 0,5-3,0 1,5
Süspanse BHK-21 An30
P13 24 0,2- A 3,6 44 0,5-4,0 2,0
P14 24 0,3- A 3,5 35 0,5-3,0 1,1
P15 24 0,2- A 5,4 85 0,5-1,0 0,7
47
Çizelge 3.4. Virus 4’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 39 1,5-A 8,4 64 1,0-4,0 2,4
P2 19 2,1-A 7,4 80 1,0-3,0 2,0
P3 20 2,0-A 7,7 49 1,0-3,0 2,0
P4 19,5 1,9-A 7,5 33 1,0-4,0 1,4
P5 23 0,9-A 7,3 69 1,0-3,0 2,0
P6 19 1,1-A 7,8 54 1,0-3,0 2,1
Monolayer BHK-21 An30
P7 22 0,9-A 8,4 17 1,5-4,0 2,3
P8 21 2,1-A 7,5 28 2,0-6,0 3,4
P9 20 1,2-A 5,8 31 2,0-5,0 3,3
P10 21 1,3-A 5,0 10 2,0-7,0 4,2
P11 19 1,3-A 2,9 10 1,0-4,0 2,6
P12 19 0,8-A 4,1 23 1,0-3,0 1,8
Süspanse BHK-21 An30
P13 40 0,3-A 2,6 7 0,5-2,0 0,7
P14 40 0,3-A Plak yok Plak yok Plak yok Plak yok
P15 24 0,2-A 5,7 73 0,5-1,5 0,7
48
Çizelge 3.5. Virus 5’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 27 1,9-A 8,6 37 2,0-7,0 4,4
P2 18 2,6-A 7,2 17 3,0-5,0 3,9
P3 17 1,0-A 7,3 18 2,0-6,0 4,7
P4 18 0,5-A 7,5 30 2,0-5,0 3,7
P5 21 0,6-A 7,6 28 2,0-6,0 4,1
P6 17 0,3-A 7,2 18 2,0-6,0 3,7
Monolayer BHK-21 An30
P7 23 1,4-A 7,1 15 2,0-6,0 4,0
P8 21 2,5-A 6,3 19 4,0-6,0 5,5
P9 20 1,2-A 6,1 11 1,5-6,0 4,6
P10 20 1,3-A 6,4 23 0,5-6,0 4,0
P11 19 1,3-A 6,1 55 0,5-6,0 1,8
P12 19 0,7-A 5,6 45 0,5-6,0 1,2
Süspanse BHK-21 An30
P13 40 Menfi 3,8 47 0,5-6,0 1,9
P14 40 0,3-A Plak yok Plak yok Plak yok Plak yok
P15 40 Menfi 4,4 38 0,5-1,5 0,5
49
Çizelge 3.6. Virus 6’ya ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 49 Menfi 2,7 7 1,0-2,0 1,1
P2 45 0,3-O 7,2 16 1,0-3,0 2,1
P3 43 0,3-O 6,5 23 1,0-3,0 1,9
P4 45 1,1-O 6,2 49 1,0-5,0 2,6
P5 23 0,2-O 6,3 30 0,5-3,0 1,6
P6 18 0,2-O 5,4 140 0,5-4,0 0,7
Monolayer BHK-21 An30
P7 18 0,2-O 5,8 87 0,5-1,0 0,5
P8 16 0,2-O 3,3 80 0,5 0,5
P9 17 0,2-O 3,6 113 0,5-2,0 0,5
P10 17 0,3-O 6,5 35 0,5 0,5
P11 16 0,1-O 6,6 75 0,5-1,0 0,7
P12 15 0,1-O 7,5 89 0,5-1,0 0,9
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 0,5-O 6,8 57 0,5 0,5
P14 18 0,3-O 6,8 117 0,5-4,0 0,7
P15 18 0,8-O 7,0 62 0,5-1,0 0,6
50
Çizelge 3.7. Virus 7’ye ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 49 Menfi 4,3 20 1,0-2,0 1,3
P2 45 0,2-O 6,2 65 1,0-2,0 1,6
P3 43 0,6-O 7,3 54 1,0-3,0 1,5
P4 45 1,4-O 5,6 35 1,0-3,0 1,8
P5 40 1,7-O 7,7 23 1,0-3,0 1,7
P6 18 0,5-O 5,3 110 0,5-3,0 0,6
Monolayer BHK-21 An30
P7 31 0,2-O 5,5 135 0,5 0,5
P8 16 0,2-O 3,3 168 0,5-4,0 0,5
P9 17 0,2-O 5,5 120 0,5 0,5
P10 17 0,2-O 6,6 44 0,5 0,5
P11 16 0,4-O 6,9 90 0,5-1,0 0,7
P12 15 0,4-O 7,6 47 0,5-1,0 0,8
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 0,4-O 6,7 45 0,5-1,0 0,6
P14 18 1,0-O 6,7 101 0,5-5,0 0,8
P15 18 1,1-O 6,9 124 0,5-2,0 0,8
51
Çizelge 3.8. Virus 8’e ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 47 0,3-O 6,4 84 1,0-3,0 1,8
P2 39 0,3-O 7,5 28 1,0-5,0 2,4
P3 22 0,4-O 7,3 19 2,0-5,0 3,1
P4 21 1,2-O 6,6 40 2,0-5,0 3,8
P5 23 1,4-O 7,1 42 2,0-5,0 4,5
P6 22 0,5-O 7,2 57 1,0-4,0 2,7
Monolayer BHK-21 An30
P7 47 0,3-O 6,5 35 2,0-3,0 2,1
P8 25 0,2-O 6,6 63 0,5-2,0 0,8
P9 17 0,3-O 5,0 84 0,5-2,0 0,7
P10 17 0,3-O 7,0 104 0,5-2,0 1,2
P11 16 0,5-O 7,5 20 1,0-3,0 1,9
P12 15 0,5-O 7,9 41 1,0-4,0 2,8
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 0,7-O 7,2 51 1,0-5,0 3,0
P14 17 0,9-O 7,0 49 1,0-4,0 2,4
P15 17 1,1-O 7,0 32 1,0-4,0 2,4
52
Çizelge 3.9. Virus 9’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 46 0,3-O 6,2 18 1,0-3,0 1,6
P2 37 0,2-O 7,5 33 1,0-3,0 2,4
P3 22 0,1-O 7,0 50 1,0-3,0 2,2
P4 30 0,3-O 6,3 37 1,0-4,0 2,2
P5 25 0,5-O 6,5 34 1,0-5,0 2,4
P6 18 0,9-O 7,6 17 2,0-5,0 3,4
Monolayer BHK-21 An30
P7 47 0,5-O 6,3 15 1,0-5,0 3,0
P8 45 0,5-O 6,6 24 1,0-3,0 2,2
P9 25 0,6-O 6,7 154 1,0-3,0 1,2
P10 24 0,2-O 7,1 47 1,0-3,0 1,9
P11 21 0,9-O 7,3 23 2,0-4,0 3,0
P12 16 0,7-O 7,4 24 3,0-5,0 4,0
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 1,2-O 5,6 42 0,5-5,0 1,8
P14 17 0,7-O 4,7 36 0,5-5,0 2,7
P15 17 0,7-O 5,6 65 0,5-4,0 1,2
53
Çizelge 3.10. Virus 10’a ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre (PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 48 Menfi 6,3 33 1,0-5,0 2,8
P2 21 0,3-O 7,0 36 1,0-5,0 3,2
P3 46 0,4-O 7,0 39 1,0-4,0 2,1
P4 48 0,6-O 6,4 22 1,0-4,0 3,0
P5 30 0,4-O 6,6 45 1,0-4,0 2,6
P6 24 1,8-O 6,3 15 1,0-4,0 2,8
Monolayer BHK-21 An30
P7 48 1,0-O 4,3 44 1,0-4,0 1,8
P8 40 1,2-O 5,4 18 0,5-4,0 2,0
P9 34 0,8-O 5,5 23 0,5-4,0 1,8
P10 28 0,2-O 4,1 70 0,5-3,0 1,3
P11 24 1,5-O 3,0 14 1,0-4,0 1,9
P12 20 1,7-O 3,6 29 1,0-4,0 1,7
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 1,6-O 4,5 33 0,5-4,0 1,1
P14 17 0,8-O 5,6 77 0,5-4,0 1,1
P15 16 1,8-O 5,6 75 0,5-4,0 0,9
54
Çizelge 3.11. A22 Irak kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre(PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 25 1,8-A 8,1 38 1,0-4,0 2,8
P2 20 2,9-A 7,2 17 3,0-7,0 4,7
P3 18 4,0-A 7,6 38 2,0-5,0 3,4
P4 21 3,1-A 8,0 43 2,0-5,0 3,4
P5 17 2,8-A 6,8 80 1,0-4,0 1,6
P6 17 2,3-A 7,5 100 1,0-3,0 1,6
Monolayer BHK-21 An30
P7 31 3,9-A 7,1 74 1,0-5,0 2,0
P8 16 3,3-A 6,5 41 0,5-7,0 2,0
P9 16,5 3,0-A 5,4 30 0,5-5,0 1,5
P10 17 2,9-A 6,5 95 0,5-7,0 1,4
P11 16 3,3-A 7,1 65 0,5-5,0 1,5
P12 15 3,0-A 6,2 105 0,5-4,0 0,8
Süspanse BHK-21 An30
P13 18 1,8-A 5,9 90 0,5-5,0 1,1
P14 17 2,4-A 5,8 51 0,5-3,0 1,4
P15 16 2,7-A 6,0 62 0,5-4,0 1,4
55
Çizelge 3.12. A Tur 04-06 kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre(PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 37 1,1-A 6,9 36 1,0-5,0 3,8
P2 24 0,9-A 6,5 30 0,5-4,0 3,1
P3 24 1,0-A 7,3 20 1,0-6,0 5,7
P4 24 0,3-A 7,4 27 1,0-4,0 2,4
P5 22 0,5-A 7,2 77 0,5-3,0 1,6
P6 21 0,4-A 7,5 31 0,5-5,0 2,0
Monolayer BHK-21 An30
P7 32 0,4-A 7,1 66 0,5-3,0 1,8
P8 29 0,4-A 7,6 35 0,5-4,0 2,2
P9 24 0,8-A 6,7 45 1,0-4,0 2,7
P10 19 0,4-A 7,1 45 1,0-4,0 2,3
P11 19 0,4-A 6,2 14 0,5-5,0 3
P12 18,5 0,5-A 5,3 19 1,0-7,0 3,8
Süspanse BHK-21 An30
P13 40 0,1-A 3,5 27 1,0-5,0 2,9
P14 40 Menfi Plak yok Plak yok Plak yok Plak yok
P15 40 Menfi 3,6 52 0,5-4,0 1,3
56
Çizelge 3.13. O1 Manisa kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj
No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre(PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An31
P1 30 0,9-O 5,3 32 2,0 2,0
P2 48 1,0-O 6,4 51 1,0-2,0 1,4
P3 21 1,4-O 6,2 45 1,0-2,0 0,9
P4 27 0,5-O 5,5 23 1,0-3,0 1,3
P5 31 0,8-O 6,6 22 1,0-2,0 1,8
P6 35 1,2-O 6,6 26 1,0-2,0 1,6
P7 26 0,7-O 6,6 40 1,0-3,0 1,8
P8 24 0,8-O 6,6 84 1,0-4,0 1,4
P9 44 0,7-O 5,1 12 2,0-5,0 3,0
P10 33 1,7-O 6,6 24 1,0-5,0 2,6
P11 19 1,4-O 6,5 28 1,0-5,0 2,3
P12 19,5 1,4-O 7,1 47 1,0-5,0 2,6
P13 19 0,9-O 7,5 30 1,0-5,0 1,7
57
Çizelge 3.13. Devam O1 Manisa kontrol virusuna ait pasaj, indirekt sandviç ELISA ve plak test bilgileri
Pasaj Yapılan Hücre
Pasaj
No
Toplandığı
Saat
ELISA
O.D.si ve Tipi
Enfektif Titre(PFU)
Log10/1,0 ml
Sayılabilen Plakların
Sayısı
Sayılabilen Plakların Çapı (mm)
Dağılımı Ortalaması
Monolayer BHK-21 An30
P14 35 1,5-O 7,3 22 1,0-4,0 2,2
P15 46 1,0-O 7,0 44 1,0-4,0 2,1
P16 51 1,4-O 6,6 33 1,0-3,0 1,6
P17 46 1,3-O 7,1 48 1,0-5,0 1,9
P18 42 0,4-O 6,9 37 1,0-3,0 1,6
P19 27 0,5-O 5,7 43 1,0-3,0 1,5
P20 18,5 0,5-O 4,2 16 1,0-2,0 1,4
Süspanse BHK-21 An30
P21 24 0,2-O 5,3 149 0,5-4,0 0,9
P22 19 0,2-O 5,6 95 0,5 0,5
P23 18 0,1-O 5,3 100 0,5 0,5
58
3.4. PCR Çalışılan virusların orijinal virus süspansiyonları (P0), BHK-21 An31 monolayer
hücre kültüründeki ileri pasaj olan 6. pasajları (P6), BHK-21 An30 monolayer hücre
kültüründeki ileri pasaj olan 5. pasajları (P11) ve BHK-21 An30 süspanse hücre
kültüründeki son pasajlarının (P15) pasaj sıvıları VP1, 3A ve cre gen bölgelerinin
eldesi için PCR ile çalışıldı. Aynı amaçla; O1 Manisa kontrol virusu için P0, P13,
P20 ve P23 pasaj sıvıları kullanıldı. Virusların P0 ve P15 (O1 Manisa kontrol virusu
için P0 ve P23) pasaj sıvıları VP4, VP2 ve VP3 gen bölgelerinin eldesi için PCR ile
çalışıldı. Virus 2, Virus 3, Virus 6 ve Virus 8’e ait plak klonları VP1, 3A ve cre gen
bölgelerinin eldesi için PCR ile çalışıldı. Virus 3’e ait plak klonundan cre gen
bölgesi, bütün plak klonları ve Virus 5’den ise VP4, VP2 ve VP3 gen bölgeleri PCR
ile elde edilemedi.
3.5. Nükleotid Dizileme Reaksiyonu Çalışılan virusların P0, P6, P11 ve P15 için (O1 Manisa için P0, P13, P20 ve P23)
639 nükleotid uzunluğunda olan VP1, 459 nükleotid uzunluğunda olan 3A ve 54
nükleotid uzunluğunda olan cre gen bölgeleri nükleotid dizileri elde edildi. Ayrıca
P0 ve P15 (O1 Manisa aşı suşu için P0 ve P23) için 255 nükleotid uzunluğunda olan
VP4, 654 nükleotid uzunluğunda olan VP2 ve 663 nükleotid uzunluğunda olan VP3
gen bölgeleri de elde edilerek, çalışılan tüm gen bölgelerinin referans nükleotid
diziler ile hizalamaları gerçekleştirildi. Virus 2, Virus 3, Virus 6 ve Virus 8’e ait
plak klonlarının VP1, 3A ve cre gen bölgeleri de hizalandı. Hizalama yapıldıktan
sonra referans nükleotid diziler çıkarılarak her virusa ait pasajlar arasındaki
nükleotid dizi farklılıkları tespit edildi. Pasajlar arasında nükleotid değişimi görülen
nükleotid diziler, aminoasit dizilerine çevrilerek aminoasit düzeyinde meydana
gelen anlamlı farklılıklar tespit edildi. Virus 3’e ait plak klonundan cre gen bölgesi,
bütün plak klonları ve Virus 5’den ise VP4, VP2 ve VP3 gen bölgeleri PCR ile elde
edilemediği için bu gen bölgelerinin nükleotid dizileri elde edilemedi. Virus 10’a ait
P15 VP4 gen dizisinin ilk 18 nükleotidi eksik olarak elde edildi. Araştırma
59
kapsamında test edilen tüm viruslara ait ilgili gen bölgeleri itibarıyla elde edilen
nükleotid dizilerinin ve pasajlar arasında nükleotid değişimi görülen dizilerden
anlamlı aminoasit değişimi gösteren aminoasit dizilerinin hizalanmalarına ilişkin
bulgular tablolar halinde EKLER bölümünde sunuldu (değişim görülmeyen diziler
için konsensus nükleotid dizileri verildi).
3.5.1. Aday Virus 1 (A tipi 1) Virus 1’in VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında T48K ve Q110K olarak 2
aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında T178G olarak 1 aminoasitte değişim
tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 1’in 3A, cre, VP4 ve VP2 genlerinde pasajlar
arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.2. Aday Virus 2 (A tipi 2) Virus 2’nin VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15, PK1, PK2 arasında D199G olarak 1
aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15 arasında E131K olarak 1 aminoasitte değişim
tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 2’nin 3A, cre, VP4 ve VP3 genlerinde pasajlar
arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.3. Aday Virus 3 (A tipi 3) Virus 3’ün VP2 geninde; P0 ile P15 arasında W129C, E131K, L134R ve T201A
olarak 4 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 3’ün VP1, 3A, cre,
VP4 ve VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
60
3.5.4. Aday Virus 4 (A tipi 4) Virus 4’ün VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında H57R ve Q110R olarak 2
aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 4’ün 3A, cre, VP4, VP2 ve
VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.5. Aday Virus 5 (A tipi 5) Virus 5’in VP1 geninde; P0, P6, P15 ile P11 arasında H57R, P0, P6, P11 ile P15
arasında H108R ve P0, P6 ile P11, P15 arasında Q110R olarak 3 aminoasitte
değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 5’in 3A ve cre genlerinde pasajlar
arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.6. Aday Virus 6 (O tipi 1) Virus 6’nın VP1 geninde; P0 ile P6, P11, P15, PK arasında E198K olarak 1
aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında H56R ve D60G olarak 2 aminoasitte
değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 6’nın 3A, cre, VP4 ve VP2 genlerinde
pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.7. Aday Virus 7 (O tipi 2) Virus 7’nin VP1 geninde; P0 ile P6, P11, P15 arasında T13A, S30T ve E198K
olarak 3 aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında H56R ve D60G olarak 2
aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 7’nin 3A, cre, VP4 ve VP2
genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
61
3.5.8. Aday Virus 8 (O tipi 3)
Virus 8’in VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15, PK arasında E83K ve R172W olarak 2
aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 8’in 3A, cre, VP4, VP2 ve
VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.9. Aday Virus 9 (O tipi 4) Virus 9’un VP1 geninde; P0, P6, P11 ile P15 arasında T96K, P0, P6 ile P11, P15
arasında E138K ve E198K olarak 3 aminoasitte, 3A geninde; P0, P6, P11 ile P15
arasında T119A, N139D ve V143A olarak 3 aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15
arasında L137R olarak 1 aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15 arasında C34R olarak
1 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 9’un cre ve VP4
genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.10. Aday Virus 10 (O tipi 5) Virus 10’un VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında E138K ve E198K olarak 2
aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15 arasında L137R olarak 1 aminoasitte değişim
tespit edildi (Çizelge 3.-14.). Virus 10’un 3A, cre, VP4 ve VP3 genlerinde pasajlar
arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
3.5.11. A22 Irak Kontrol Virusu A22 Irak kontrol virusunun 3A geninde; P0 ile P6, P11, P15 arasında L129P olarak 1
aminoasitte, VP2 geninde; P0 ile P15 arasında E131K olarak 1 aminoasitte değişim
tespit edildi (Çizelge 3.-14.). A22 Irak kontrol virusunun VP1, cre, VP4 ve VP3
genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir değişim tespit edilmedi.
62
3.5.12. A Tur 04-06 Kontrol Virusu A Tur 04-06 kontrol virusunun VP1 geninde; P0, P6 ile P11, P15 arasında Q110K,
P0, P6, P11 ve P15 arasında E174A olarak 2 aminoasitte, VP3 geninde; P0 ile P15
arasında D174G olarak 1 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). A Tur
04-06 kontrol virusunun 3A, cre, VP4 ve VP2 genlerinde pasajlar arasında anlamlı
bir değişim tespit edilmedi.
3.5.13. O1 Manisa Kontrol Virusu O1 Manisa kontrol virusunun VP1 geninde; P0, P13 ile P20, P23 arasında H108R
olarak 1 aminoasitte değişim tespit edildi (Çizelge 3.-14.). O1 Manisa kontrol
virusunun 3A, cre, VP4, VP2 ve VP3 genlerinde pasajlar arasında anlamlı bir
değişim tespit edilmedi.
63
Çizelge 3.14. Çalışılan virusların cre, VP4, VP2, VP3, VP1 ve 3A gen bölgelerinde tespit edilen aminoasit değişimleri
Virus adı
cre VP4 VP2 VP3 VP1 3A
Virus 1
- - - T178G (P15)* T48K, Q110K (P11)* -
Virus 2
- - E131K (P15)* - D199G (P11)* -
Virus 3 - - W129C, E131K, L134R, T201A (P15)*
- - -
Virus 4
- - - - H57R, Q110R (P11)* -
Virus 5
- - - - H57R (P11)*, R57H (P15)*, H108R (P15)*, Q110R (P11)*
-
Virus 6
- - - H56R, D60G (P15)*
E198K (P6)* -
Virus 7
- - - H56R, D60G (P15)*
T13A, S30T, E198K (P6)* -
Virus 8
- - - E83K, R172W (P11)* -
Virus 9 - - L137R (P15)* C34R (P15)* T96K (P15)*, E138K (P11)*, E198K (P11)*
T119A, N139D, V143A (P15)*
Virus 10
- - L137R (P15)* - E138K, E198K (P11)* -
A22 Irak
- - E131K (P15)* - - L129P (P6)*
A Tur 04-06
- - - D174G (P15)* Q110K (P11)*, E174 A (P15)* -
O1 Manisa
- - - - H108R (P20)* -
* Parantezlerin içindeki rakamlar değişikliğin saptandığı pasajın sayısıdır
64
4. TARTIŞMA
Aşılarda kullanılan virusların, monolayer hücrelerde yapılan plak testlerden elde
edilen plak ölçüleri yönünden çoğu zaman heterojen oldukları bilinmektedir. Plak
varyantlarının sabit kaldığı durumlar ise, virus populasyonunda oluşan attenüasyon
(Kanda ve Melnick, 1959; Rapp, 1964) ve antijenik değişim (Hare ve Morgan,
1962; Takemoto ve Habel, 1959) gibi diğer değişikliklere bağlanmıştır. Şap aşısı
üretiminde doğru serolojik suş seçilse bile kullanılan laboratuvar üretim
sistemlerinin ve metodolojinin virusun biyolojik karakterlerinde büyük
değişikliklere sebep olduğu ve aynı alttipte viruslarda plak varyantlarının meydana
gelebildiği, sonuç olarak üretilen aşının değeri üzerinde büyük değişiklikler
oluşabildiği geçmişte yapılan çalışmalarda belirtilmiştir (Cowan, 1966; Cowan,
1970; Erol ve ark., 1979; Gürhan ve Dakılır, 1994). Bu değişikliklerin immuniteyi
de etkileyebileceği saptanmış ve plak varyantlar gösteren şap viruslarının antijenik
olarak birbirinden farklı olabileceği görülmüştür (Cowan, 1968; Martinsen, 1971;
Erol ve ark., 1979). Preston ve arkadaşlarının (1981) yaptığı bir çalışmada ise,
SAT1Nig10/75 şap virusunun küçük ve büyük plak varyantları arasında antijenik
benzerlik olduğu belirtilmiştir. Şap virusunun plak varyantları ile ilgili olan pek çok
araştırmada, büyük plak varyantının hayvanlarda doğal hastalığı oluşturan vahşi tip
virus olduğu düşünülmüştür (Erol ve ark., 1975). Sahada hastalık yapan O1 tipinin
ise küçük plak morfolojisinde olduğu, monolayer pasajlarda plak morfolojisini
değiştirmemesine rağmen süspanse pasajlarda çok küçük plaklar oluşturduğu
bildirilmiştir (İlerle ve Tan, 1987).
Bu araştırmada, şap aşılarının hazırlanmasında aşı suşu adayı olarak seçilen şap
virusu saha suşlarının ve güncel bazı aşı suşlarının, monolayer ve süspanse hücre
kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotipleri genetik
düzeyde incelenerek, söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek
mutasyonlar sorgulanmıştır. Bu amaçla VP1, VP2, VP3, VP4, 3A ve cre gen
bölgeleri incelenmiştir.
65
Araştırma kapsamında çalışılan virusların hepsinde VP1 geni RGD motifinin
pasajlar arasında korunduğu tespit edilmiştir. VP1 geni yüzeyinde bir çıkıntı
oluşturan 140-160 aminoasit dizisinde yer alan G-H kıvrımı, immunodominant
antijenik bölge olan RGD (arjinin-glisin-aspartik asit) motifini kapsar (Acharya ve
ark., 1989). Şap virusunun saha suşlarının RGD motifi tarafından aracılık edilen
etkileşim ile RGD-bağımlı integrinleri kullandıkları belirtilmiştir (Jackson ve ark.,
1996; Fry ve ark., 1999; Jackson ve ark., 2000; Jackson ve ark., 2003). İntegrinler
ECHO virus (Bergelson ve ark., 1992) ve coxsackievirus tip A9 (Roivainen ve ark.,
1991) olmak üzere iki picornavirus için daha reseptör olarak tanımlanmıştır. RGD
aracılı şap virusunun ayrıca integrin aracılı yolu kullanmadan özellikle virus-antikor
kompleksinde olduğu gibi Fc reseptörü ile de hücrelere girebildiği belirtilmiştir
(Mason ve ark., 1993; Baxt ve Mason, 1995). A12 tipi şap virusunun RGD dizisinin,
hücreye bağlanma ve enfektivite için gerekli olduğu ve bu dizide mutasyon (Mason
ve ark., 1994) veya delesyon (McKenna ve ark., 1995) gösteren virusların hücre
kültürlerinde enfeksiyon oluşturmadıkları belirtilmiştir. Virusun hücreye
tutunmasında önemli bir rol oynayan VP1 geninde bulunan 193. rezidünün hücre
kültürlerinde yeterli enfeksiyonu oluşturmak için heparan sülfatın tanınmasında
etkili olduğu gösterilmiştir (Fry ve ark., 1999; Jackson ve ark., 1996). VP1’in G-H
kıvrımı dışında 41.-60. ve 190.-213. rezidüleri, antijenik varyasyonun görüldüğü
diğer en önemli bölgeler olarak bildirilmiştir (Brown, 1988).
Mbayed ve arkadaşları (1997) tarafından A/81/Castellanos/Arg/87 virusunun
sığır böbrek hücrelerinde yapılan 25 pasajından sonra seçilen viral
populasyonlarının bazı biyolojik ve biyokimyasal özelliklerinin çalışılması ile bu
virusun in vitro evrimi hakkında bilgiler elde edilmiştir. Aynı araştırmacılar, VP1
geni RGD motifine yakın olup antijenik bölge 1’de bulunan 149. aminoasitin
modifikasyonunun immun baskı altında gereken dayanıklılıktan sorumlu olduğunu
önermişlerdir. VP1 geni 149. aminoasit pozisyonunda serinin proline değiştiği hem
laboratuvar varyantlarında (Bolwell ve ark., 1989b), hem de A tipi şap viruslarının
saha izolatlarında (Weddell ve ark., 1985) görülmüştür. Mbayed ve arkadaşları
(1997) tarafından açıklanan VP1 geninde görülen diğer mutasyonlar; S47P, N85H/S
66
ve T110K değişimleridir. Bunlardan 110. pozisyondaki değişimin plak çapının
kazanılmış fenotipi ile ilişkili olabileceği, bu değişimin görüldüğü viruslarda hem
küçük plak hem de normal ölçüdeki plakların oluştuğu fakat bu değişimin
görülmediği viruslarda vahşi tip plak yapısının korunduğu belirtilmiştir. Mbayed ve
arkadaşları (1997) tarafından A tipi viruslar için plak çapının kazanılmış fenotipi ile
ilişkili olabileceği belirtilmiş olan VP1 geni 110. pozisyonunda, araştırmadaki A tipi
viruslardan Virus 1 için Q110K, Virus 4 için Q110R, Virus 5 için Q110R ve A Tur
04-06 kontrol virusu için Q110K mutasyonları tespit edilmiştir. Bu virusların birinci
pasajlarından itibaren çok homojen bir vahşi tip plak yapısı göstermedikleri, fakat
ilerleyen pasajlarda çok küçük plak oluşumu şekillendiği gözlenmiştir. Bu
araştırmada VP1 geni 110. pozisyonda mutasyon görülmeyen diğer viruslar için de
karışık plak yapısı izlendiği için, bu pozisyonun plak morfolojisi için önemi olup
olmadığı anlaşılamamıştır. O tipi virusların hiçbirinde bu pozisyonda mutasyon
şekillenmemiştir.
VP1 geninde Virus 1 için tespit edilen T48K ile Virus 4 ve Virus 5 için tespit
edilen H57R mutasyonlarının antijenik varyasyonun görüldüğü önemli bölgelerden
olan 41.-60. rezidüler arasında olmalarından dolayı antijenik olarak önemli ve plak
morfolojisi ile ilişkili olabilecekleri düşünülmüştür. Virus 2’de tespit edilen D199G
ile Virus 6, Virus 7, Virus 9 ve Virus 10’da tespit edilen E198K mutasyonlarının
antijenik varyasyonun görüldüğü önemli bölgelerden olan 190.-213. rezidüler
arasında olmalarından dolayı antijenik olarak önemli ve plak morfolojisi ile ilişkili
olabilecekleri düşünülmüştür. Virus 9 ve Virus 10’da tespit edilen E138K
mutasyonunun, çalışılan O tipi viruslarda G-H kıvrımı başlangıcının ikinci
pozisyonunda yer almasından dolayı antijenik olarak önemli ve plak morfolojisi ile
ilişkili olabileceği düşünülmüştür.
Şap virusu VP3 geni 56. rezidü için pek çok yapısal ve antijenik bilgi vardır.
Örneğin bu pozisyon VP2’nin E-F kıvrımı (131.-134. rezidüleri), VP2’nin B-C
kıvrımı (70.-80. rezidüleri), VP3’ün 58.-61. rezidüleri ve VP1’in 193.-197.
rezidüleri dahil olmak üzere üç dışsal kapsit proteininin kısımlarından oluşan
67
antijenik bölge D’ye dahildir. Bu reseptörün plak morfolojisi ve konakçı aralığını
değiştirdiği görülmekle beraber, heparine bağlanan virusların hala integrine de
bağlanabildikleri belirtilmiştir. BHK hücrelerinde yapılan seri pasajlarla birlikte
şekillenen adaptasyonun daha yavaş şekillendiği ve heparine bağlanma
yeteneklerinin bir sonucu olarak hücre kültüründe daha etkili rekabet edebilen
virusların seçimi ile sonuçlandığı görülmüştür. Heparine bağlanan virusların
sığırlarda önemli ölçüde attenüe olmasının; virus tarafından yeni bir reseptöre
bağlanma özelliğinin elde edilerek, virus replikasyonu için uygun olmayan
bölgelerden virusun ayrılması ile hastalığın ortadan kaldırılabildiğinin göstergesi
olduğu belirtilmiştir (Sa-Carvalho ve ark., 1997).
Sa-Carvalho ve arkadaşları (1997) ile Morioka ve arkadaşları (2008) tarafından
O tipi viruslar için belirtilen VP3 geni 56. ve 60. rezidülerdeki mutasyonlar, bu
araştırmada sadece O tipi viruslar olan Virus 6 ve Virus 7’de tespit edilmiştir. Bu iki
virusun VP3 geni nükleotid dizileri incelendiğinde, P0 ile P15 arasında H56R
mutasyonu ile orijinal virus için histidin olan aminoasitin hücre pasajlarından sonra
arjinine ve D60G mutasyonu ile aspartik asitin glisine dönüştüğü tespit edilmiştir.
Ayrıca Virus 1 için T178G, Virus 9 için C34R ve A Tur 04-06 kontrol virusu için
D174G mutasyonu VP3 geninde tespit edilen diğer mutasyonlardır. D174G ve
T178G mutasyonlarının, XingWen ve arkadaşları tarafından (2010) bildirildiği üzere
VP3 için heparin bağlanma alanı olan 173. rezidüye yakın olmalarından dolayı plak
morfolojisini etkiliyor olabilecekleri düşünülmüştür.
Sa-Carvalho ve arkadaşları (1997) tarafından O1 serotipindeki şap viruslarının
plak fenotipi, hücre kültüründe virusun konakçıda yayılımı ve heparine
bağlanmasını etkileyen kapsit rezidüleri tespit edilmiştir. İn vitro kültürde heparine
bağlanan virusların seçildiği ve bu heparine bağlanan virusların sığırlarda attenüe
olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, heparine bağlanan virus yüksek dozda inokule
edildiği sığırlardan geri elde edildiğinde kapsitte heparine bağlanma yeteneğini yok
eden değişiklikler olduğu saptanmıştır. Şap virusu izolatına bağlı olarak
enfeksiyonun başlamasına aracılık eden iki hücresel reseptör ailesi; heparan sülfat
68
proteoglikanlar (HSPG) ve integrinlerdir. Hücre kültürü hatlarına adapte olmuş pek
çok virus heparan sülfata yüksek eğilim kazanır ve hem hücreye tutunmada hem de
bunu izleyen dönemde HSPG’ı reseptör olarak kullanır. Heparan sülfat için
bağlanma bölgesi üç ana kapsit proteini olan VP1, VP2 ve VP3’ün lokalize olduğu
virion yüzeyindeki sığ çöküntüdür (Sa-Carvalho ve ark., 1997; Fry ve ark., 1999;
Jackson ve ark., 2000; Jackson ve ark., 2003). Sa-Carvalho ve arkadaşları (1997),
inceledikleri iki O1 Campos izolatının BHK hücre kültüründe farklı plak
morfolojileri gösteren iki varyant içerdiğini tespit etmişlerdir. Bu varyantlardan bir
tanesinin BHK ve CHO hücrelerinde replike olup küçük ve belirgin plak
oluşturduğunu, diğerinin ise sadece BHK hücrelerinde gelişip büyük ve düzensiz
plak oluşturduğunu belirtmişlerdir. Bu iki varyantın kapsidlerini kodlayan cDNA
kullanılarak, orijinal varyantların fenotiplerini gösteren kimerik viruslar
üretmişlerdir. Bu virusların ve bunlara ait kapsit genlerinin kısımları değiştirilerek
oluşturulan hibridlerin analizleri sonucunda, VP3 geninde bulunan 56. kodon hücre
tropizmi ve plak fenotipi için kritik belirleyici olarak identifiye edilmiştir. Belirli bir
biçimde CHO’da gelişen belirgin plak fenotipi VP3 geni 56. kodondaki rezidüde
bulunan yüksek yüklü arjinin varlığına bağlanmıştır. Virusun saha suşlarında bu
aminoasitin histidin olduğu, hücre kültürüne adaptasyonda ise bu pozisyonda
heparan sülfata yüksek afinite oluşturan arjinine sahip olan virusların seçildiği
belirtilmiştir. Genetik olarak tasarlanmış Arg 3056 virusu sığırlarda yüksek ölçüde
attenüe olurken, yüksek dozda bu virustan inokule edilen hayvanlardan virus tekrar
alındığında virusun CHO hücrelerinde üreme yeteneğini kaybettiği belirtilmiştir. Bu
virusun, VP3 geni 56. pozisyonda yüklenmemiş bir rezidü veya VP2 geni 134.
pozisyonda uzamsal ve antijenik olarak ilişkili pozisyonda lizin ile yerdeğiştirmiş
negatif yüklü glutamik asit içerdiği tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre hem VP2
geni 134. pozisyonda hem de VP3 geni 56. pozisyonda heparine bağlanmak için
pozitif yüklü rezüdülere ihtiyaç olduğu belirtilmiştir. Sonuçlar beraber ele
alındığında, O tipi şap viruslarının in vitro kültüründe heparine bağlanan virusların
seçildiği ve heparine bağlanan virus fenotipine sahip virusların doğal konakta
attenüe olduğu belirtilmiştir. Yine bu araştırmacılar tarafından VP3’ün β B-
çıkıntısında (56./60. rezidüler) bulunan aminoasitlerin hem plak fenotipi hem de
CHO hücrelerinde yayılma yeteneği sağladığı gösterilmiştir. Özellikle, bu bölgede
69
yüksek pozitif yüklü olan virusların (arjinin/alanine karşı histidin/aspartik asit) CHO
hücrelerinde geliştiğini ve BHK hücrelerinde küçük net plaklar oluşturduğunu
belirtmişlerdir. Aynı araştırmacılar tarafından, VP1 geni 134. rezidüsü ile
moleküller arası disülfid bağı oluşturabilen VP2 geni 130. rezidüsündeki sistein
varlığı veya yokluğunun veya VP1 geni 133. rezidüsünde oluşan valinin glutamik
asite değişiminin plak morfolojisi veya CHO hücrelerinde yayılmada hiçbir etkisinin
olmadığı belirtilmiştir. O1 küçük net plak fenotipi rekabet avantajının kapsit
dizilerindeki değişikliklerden kaynaklandığı ve diğer viral genlerden bağımsız
olduğu açıklanmıştır. BHK hücre kültürlerinde yayılma süresince ise VP2 geni 130.
rezidüsündeki sistein ve VP3 geni 56. rezidüsündeki arjinin genotipinin rekabet
avantajı olduğu önerilmiştir. CHO hücrelerine adaptasyonun daha hızlı şekillendiği,
VP3 geni 60. rezidü ve VP1 geni 133. rezidünün BHK plak fenotipi ve CHO
hücrelerinde gelişmede önemli belirteçler olmadıkları açıklanmıştır. Bu son
değişimin kapsit VP2 geni 134. rezidü/VP3 geni 56. rezidü bölgesindeki net pozitif
yükü azalttığı ve negatif yüklü heparine veya heparan sülfat moleküllerine
bağlanmayı azaltabileceği belirtilmiştir.
Morioka ve arkadaşları (2008) tarafından O/JPN/2000 suşunun izolasyonu
sırasında küçük ve büyük plak fenotipi gösteren iki biyotipin kapsit nükleotid dizileri
karşılaştırıldığında VP2 geni 133. aminoasitinde N133D mutasyonu ile asparjinin
aspartik asite ve VP3 geni 56. aminoasitinde R56H mutasyonu ile arjininin histidine
dönüştüğü belirtilmiştir.
XingWen ve arkadaşları tarafından (2010) domuzdan izole edilmiş
O/Fujian/CHA/5/99 suşunun biyolojik özelliklerini araştırmak amacı ile yapılmış olan
plak test, süt emen farelerde patojenite ve şap virusu genomunun tüm uzunluğunca
dizi analizi sonuçları bildirilmiştir. Üç günlük süt emen farelerde yapılan patojenite
çalışmaları sonucunda; domuzdan izole edilmiş O/Fujian/CHA/5/99 suşunun, sığırdan
izole edilmiş O/Tibet/CHA/1/99 suşuna göre daha yüksek virulense sahip olduğu
açıklanmıştır. Bu iki suşun plak fenotipleri yönünden birbirinden farklı oldukları,
O/Fujian/CHA/5/99 suşu büyük plak oluştururken O/Tibet/CHA/1/99 suşunun küçük
70
plak oluşturduğu tespit edilmiştir. O/Fujian/CHA/5/99 suşunun kapsit genlerinde
tespit edilen 14 aminoasit değişiminden çoğunun VP2 geninde bulunup antijenik
bölge 2’yi oluşturan B-C ve E-F kıvrımlarına ve VP1 geninde antijenik bölge 1’i
oluşturan G-H kıvrımına yakın olduğu açıklanmıştır. Bunlardan, heparin bağlanma
alanlarına (VP2 için 134. ve 135. rezidüleri, VP3 için 173. rezidüsü) yakın değişimler
olan VP2 genindeki E136G ve VP3 genindeki A174 S ile VP1 geni antijenik bölge
1’deki T142A, A152T ve Q153P aminoasit değişimlerinin plak çapını ve süt emen
farelerde patojeniteyi etkileyebileceği belirtilmiştir.
Bu araştırmada VP2 geninde Virus 2 için E131K, Virus 3 için W129C,
E131K, L134R ve T201A, Virus 9 için L137R, Virus 10 için L137R ve A22 Irak
kontrol virusu için E131K mutasyonları tespit edilmiştir. Daha önceki
araştırmacıların belirttiği üzere W129C ve L137R mutasyonlarının antijenik bölge
2’ye yakın olmaları, E131K ve L134R mutasyonlarının ise yine antijenik bölge
2’deki E-F kıvrımında (131.-134. rezidüler arası) yer alarak heparin bağlanma
alanlarına yakınlık göstermeleri sebebiyle antijenik olarak önemli olabilecekleri ve
virusun hücreye adaptasyonu sırasında hücresel reseptörlerle etkileşimini
değiştirerek plak morfolojisini etkiliyor olabilecekleri düşünülmüştür.
Bolwell ve arkadaşları (1989a) tarafından BHK hücre kültüründe monolayer
ve süspanse pasajları yapılan A22 Irak 24/64 aşı suşunun plak çapının süspanse
pasajdan sonra monolayer pasaja göre küçüldüğü, küçük plak çapı kazanılmasının
konakçı hücrede gelişmek için bir adaptasyon olduğu ve plak çapındaki küçülmenin
hücre kültüründen seçilen varyantlarda görüldüğü belirtilmiştir. Bu araştırıcılar
tarafından monolayer ve süspanse hücrelere adapte olmuş virusların kapsit gen
bölgelerinden elde edilen nükleotid dizileri karşılaştırıldığında, tüm kapsit
bölgesinde oniki nükleotid değişimi olduğu bildirilmiştir. Bu nükleotid
değişimlerinin; VP4, VP3 ve VP1’de herhangi bir aminoasit değişimi oluşturmadığı,
VP2 geninde ise G82E, T88K ve Y207H olarak üç aminoasitte değişime neden
olduğu açıklanmıştır. VP2 geni 82. rezidüsünde görülen mutasyonun, bu rezidünün
VP1 geni G-H kıvrımına yakın lokalize olmasından dolayı süspanse hücreye adapte
71
varyantların fenotipi için anahtar olduğu düşünülmüştür. Bolwell ve arkadaşları
(1989a) tarafından bildirilen diğer bir konu; her ne kadar monolayer ve süspanse
BHK-21 hücreleri arasında reseptörel farklılıklar tam olarak bilinmese de süspanse
hücrelerin integrinlerin değişik bir dizisini sergiliyor olabileceğidir. Süspanse
hücreye adapte olan varyantın her iki hücre tipine de iyi şekilde bağlanmasının, bu
virusun hem monolayer hem de süspanse hücre yüzeyinde bulunan değişik bir
reseptöre bağlanabildiği veya ana virus monolayer hücredeki bir integrine
bağlanarak sınırlanırken, süspanse hücredeki reseptöre bağlanamadığı varsayımı
önerilmiştir.
Mason ve arkadaşları (2002) tarafından şap virusu genomunun replikasyonu
için kesin varlığı gereken cre bölgesindeki AAACA motifinde mutasyon oluşturulan
replikonların plak fenotipleri incelendiğinde; bunlardan üç tanesinin vahşi tip virustan
önemli ölçüde küçük, bir tanesinin ise daha büyük plaklar oluşturduğu, ayrıca cre
3’ucuna alındığı zaman plak fenotipinin küçüldüğü gösterilmiştir. Bu araştırma
kapsamında çalışılan viruslarda ise cre bölgesi AAACA motifinde veya diğer
rezidülerinde herhangi bir mutasyon görülmemiştir.
Rosas ve arkadaşları (2008) tarafından 3A ve 3B’nin viral enfeksiyona
katılımları ekspresyon sistemleri kullanılarak çalışılmış ve yalnızca 3A veya 3A ve
3B proteinlerini eksprese eden klonların enfekte hücrelerin yüzdesini, plak oluşturma
ünitesini ve virus ürününü arttırdığı açıklanmıştır. Pacheco ve arkadaşları (2003) ise
3A geni 93.-102. ve 133.-143. aminoasitlerinde delesyon oluşturdukları virusların
sığır kökenli hücrelerde zayıf fakat domuz kökenli hücrelerde iyi replike olduğunu,
BHK hücrelerinde şekilleri ve ölçüleri aynı olan plaklar oluşturduklarını
belirtmişlerdir. Bu araştırmada 3A geninde tespit edilen mutasyonların plak
morfolojisi düzeyindeki olası etkileri mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır
Şap virusu dışındaki viruslarla ilgili bildirilmiş olan plak fenotipi çalışmaları
da vardır. Hohdatsu ve arkadaşları (1990) tarafından Getah virus Kanagawa suşu, bu
suştan plak klonlaması ile elde edilen büyük ve küçük plak varyantları ve sadece
72
küçük plak oluşturan Haruna suşunun süt emen fareler için patojenitesi ve plak
ölçüleri çalışılarak, Getah virusların patojenitesinin süt emen farelerde plak çapı ile
bir ilişkisi olmadığı bildirilmiştir. Schloer ve Hanson (1968) tarafından ise
Newcastle virusunun (NDV) yüksek virulense sahip suşlarının çeşitli tipte plaklar
içerdikleri ve bu heterojenitenin laboratuvar pasajları sırasında mutantların birikmesi
sonucu oluştuğunun tartışılabilir bir bulgu olduğu belirtilmiştir. Ancak saha
olgularından elde edilen virusların ikinci ve üçüncü pasajlarında da iki veya üç tipte
plak görülmesi sonucunda, plak heterojenitesinin laboratuvar kültürlerine özgü
olmadığı önerilmiştir. Ayrıca ortalama ve standart sapmaya dayanarak plak
ölçüsünün kantitatif bir özellik olarak tanımlanmasının eksik bir bilgi olarak,
dayanıklı klonların elde edilmesindeki zorlukların bir parçası olabileceği
belirtilmiştir.
Bu araştırmada Virus 2, Virus 3, Virus 6 ve Virus 8 için seçilen plak
klonlarının seçildikleri pasajın dizisi ile aynı nükleotid diziye sahip olduğu, Virus 2
ve Virus 3 için farklı fenotiplerde iki plak klon seçilmesine rağmen bunların
nükleotid dizilerinin de hem birbiri ile hem de seçildiği pasajın nükleotid dizisi ile
aynı olduğu gözlenmiştir. Piatti ve arkadaşları tarafından (1995) da plak seçiminin
her zaman virusun pedigrisini garanti etmediği ve ayrıca virusun çoğaltılmasındaki
koşulların varyantların seçiminde kilit faktör olduğu belirtilmiştir. Çelik (1998)
tarafından yapılan bir çalışmada BHK-21 hücre kültürlerinde seri pasajlar sonucu
üreme süresinin uzaması nedeni ile tohum virus olma özelliğini kaybettiği
düşünülen monolayer O virusu 15. pasaj (MOP-15) şap virusu suşu klonlanarak,
klon viruslar ile tohum virusun antijenik karakterleri karşılaştırılmış ve aynı
zamanda bu viruslarla hazırlanan aşıların in vivo bağışıklık özellikleri araştırılmıştır.
Plak test sonucunda tohum virusun küçük plak, plak klon virusların seçildiği MOP-
15 şap virusunun çok küçük plak ve plak klon virusların küçük plak oluşturduğu
belirtilmiştir. Klon virusların MOP-15 şap virusuna göre üreme sürelerinin kısaldığı,
146S antijen miktarı, antijenik ve enfektif titrelerinin yükseldiği belirtilmiştir. Klon
viruslar ve tohum virusun ise antijenik titrelerinin komplement fikzasyon testinde
paralellik gösterdiği, 146S antijen miktarları, ELISA antijenik titreleri ve enfektif
73
titrelerinin benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Sonuç olarak tohum virus olarak
kullanılabilme özelliklerini kaybetmiş MOP-15 virusundan klonlama yöntemi ile
antijenik ve immunojenik olarak üstün bir virus elde edilebileceği ortaya konulmuş
olmakla beraber klon virusun tohum virus olarak kullanılabilmesi için O tipi saha
virusları ile çapraz bağışıklık testlerinin yapılması ve dominantlık faktörünün
incelenmesi önerilmiştir.
Araştırmadaki plak test enfektif titre sonuçlarının, indirekt sandviç ELISA
O.D. değerleri ile uyumsuz olduğu (enfektif titrenin düşük olduğu pasajda O.D. nin
yüksek olduğu veya tam tersi, plak testte sonuç alınamadığı halde ELISA’da
pozitiflik görülmesi veya tam tersi) tespit edilmiştir. Bu nedenle ELISA sadece
virusların serotipik identifikasyonu amacı ile kullanılmıştır. Plak çaplarında genel
olarak küçülme tarzında meydana gelen değişimlerin görüldüğü bazı viruslarda bu
küçülmeyle birlikte enfektif titrede de düşüşler tespit edilmiş olmakla beraber, genel
olarak plak çapındaki değişimlerle enfektif titrelerin ilişkili olmadıkları tespit
edilmiştir.
Bu araştırmada VP1 geninde Virus 5 için H108R, Virus 7 için T13A ve S30T,
Virus 8 için E83K ve R172W, Virus 9 için T96K, A Tur 04-06 kontrol virusu için
E174A ve O1 Manisa kontrol virusu için H108R, VP2 geninde Virus 3 için T201A,
VP3 geninde Virus 9 için C34R, 3A geninde Virus 9 için T119A, N139D, V143A
ve A22 Irak kontrol virusu için L129P olarak tespit edilen mutasyonların plak
morfolojisi düzeyindeki olası etkileri mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır ve
ileri çalışmalara ihtiyaç duymaktadır. VP4 geni nükleotid dizilerinde ise virus
pasajları arasında herhangi bir mutasyon tespit edilmemiştir. Bu durumun VP4’ün
kapsitin iç kısmında yer alarak yüksek derecede korunmasından ve hücresel
reseptörlerle ilişkili fonksiyonu olmamasından kaynaklanabileceği düşünülmüştür.
Pasajlar arasında hiçbir mutasyonun görülmediği cre ve VP4 genlerinin bu araştırma
için plak morfolojisi değişimleri ile ilişkili olmadıkları düşünülmüştür. Bu nedenle
daha sonra yapılacak benzer çalışmalarda sadece dış kapsit proteinlerini kodlayan
VP1, VP2 ve VP3 genleri üzerine yoğunlaşılaşılması önerilmektedir.
74
Araştırmada ilerleyen virus pasajlarına paralel olarak meydana gelen
mutasyonlar incelendiğinde, 41 mutasyondan sadece 5 tanesinin (Virus 6 için
VP1’de tespit edilen E198K, Virus 7 için VP1’de tespit edilen T13A, S30T, E198K
ve A22 Irak kontrol virusu için 3A’da tespit edilen L129P) orijinal virus
süspansiyonunun BHK-21 An31 monolayer hücresine adapte edilmesinden sonra
şekillendiği belirlenmiştir. Diğer tüm mutasyonların BHK-21 An30 hücre kültürü
pasajlarında şekillendiği tespit edilmiştir. Bunun sebebinin, farklı hücre kültürlerine
adaptasyon sırasında şekillenen koşullara uyum sağlamak için oluşan bir seleksiyon
olabileceği düşünülmüştür. Yalnızca bir virus için BHK-21 An30 monolayer
pasajında VP1 geninde geri dönüşümlü bir mutasyon görülmüştür. Bu virus için
orijinal süspansiyon ve BHK-21 An31 monolayer pasajındaki VP1 dizisi BHK-21
An30 monolayer pasajında değişmiş fakat süspanse pasajda tekrar orijinale
dönmüştür. Plak morfolojilerindeki değişimler incelendiğinde ise genel olarak
bütün viruslarda ilerleyen pasajlarda küçük plak tipi baskın hale geçmekle birlikte,
tür benzeri kavramını destekler nitelikte çalışılan her virus için serotiplerin kendi
içinde bile birbirinden farklı ve değişken plak fenotipleri olduğu görülmüştür.
Genel olarak küçük plak fenotipinin baskın duruma geçmesinin sebebi olarak,
Bolwell ve arkadaşları (1989a) tarafından belirtilmiş olan BHK hücre kültürü
monolayer ve süspanse pasajlarında küçük plak çapı kazanılmasının konak hücrede
gelişmek için bir adaptasyon olabileceği ve plak çapındaki küçülmenin hücre
kültüründen seçilen varyantlar için normal olarak görülebileceği düşünülebilir.
Fakat Schloer ve Hanson’ın (1968) belirttiği gibi, yüksek virulense sahip suşların
çeşitli tipte plaklar içermeleri ve bu heterojenitenin laboratuvar pasajları sırasında
mutantların birikmesi sonucu oluşması da tartışılabilir bir bulgu olarak
düşünülebilir. Çünkü bu araştırmada, Schloer ve Hanson’ın (1968) belirttiği gibi
saha olgularından elde edilen bazı virusların ikinci ve üçüncü pasajlarında, hatta
birinci pasajlarında bile birden fazla tipte plak görülmesi plak heterojenitesinin
laboratuvar kültürlerine özgü olmadığını düşündürmektedir.
Bu araştırma kapsamında incelenen virusların ilerleyen hücre kültürü
pasajlarında dış kapsit genlerinde tespit edilen mutasyonlardan heparin bağlanma
75
alanlarına yakın olanların, daha önceki araştırmacıların bildirdiği üzere hayvanlarda
patojeniteyi etkileyip etkilemeyeceğinin daha sonra yapılacak hayvan denemeleri
ile araştırılabileceği ve bu çalışmanın ileride yapılabilecek şap virusu çalışmaları
için yararlı olabileceği düşünülmektedir. Ayrıca ileride yapılacak çalışmalar
açısından virusların süspanse hücrelere adaptasyonunun sağlanmasından sonra
tekrar monolayer hücrelere inokule edilmesinin, bu mutasyonlarda ne gibi
değişimlere neden olabileceği de önemli bir araştırma konusu olarak karşımıza
çıkmaktadır. Bu araştırmadan elde edilen bulgular neticesinde sorgulanması önem
arz eden bir diğer konu da kültür ortamı değişikliğinin neden olduğu fenotipik
değişikliklerin virusların immunojeniteleri üzerine etkisi olmalıdır.
76
5. SONUÇ ve ÖNERİLER
Bu araştırmada, 2007 yılında Türkiye’nin çeşitli illerinde hastalığa sebep olmuş beş
adet A/IRN/2005 suşu ve beş adet O PanAsia-2 suşundan olmak üzere on adet aşı
suşu aday virusu ve A22 Irak, A Tur 04-06 ve O1 Manisa olmak üzere üç adet aşı
suşu niteliğindeki kontrol virusunun monolayer (BHK-21 An31 ve BHK-21 An30) ve
süspanse (BHK-21 An30) hücre kültürüne adaptasyon çalışmaları ile ELISA ve plak
testleri yapılmış, ilerleyen pasajlar sırasında plak morfolojilerinde meydana gelen
değişiklikler VP1, VP2, VP3, VP4, 3A ve cre genleri düzeyinde incelenmiş ve bu
genlerde söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonlar
sorgulanmıştır. Çalışılan virusların da tür benzeri yapısında olan diğer şap virusu
populasyonları gibi fenotipik ve genotipik olarak heterojen varyantların
karışımından oluştukları ve hücre pasajları sırasında değişen ortam şartlarına uyum
sağlamak için populasyon içindeki sağlam varyantların fenotipik ve genotipik
özelliklerini gösterdikleri düşünülmüştür.
Araştırma kapsamında çalışılan virusların VP1 geninde tespit edilen
mutasyonlar incelendiğinde daha önceden A tipi viruslar için plak çapının kazanılmış
fenotipi ile ilişkili olabileceği belirtilmiş olan 110. pozisyonda iki adet A tipi virusta
Q110K ve iki adet A tipi virusta Q110R mutasyonlarının şekillendiği tespit
edilmiştir. Bir adet A tipi virusta şekillenen T48K ve D199G, iki adet A tipi virusta
şekillenen H57R, dört adet O tipi virusta şekillenen E198K ve iki adet O tipi virusta
şekillenen E138K mutasyonlarının antijenik olarak önemli pozisyonlarda
olmalarından dolayı plak morfolojisi ile ilişkili olabilecekleri düşünülmüştür.
Virusların VP2 geninde tespit edilen mutasyonlar incelendiğinde bir adet A
tipi virusta şekillenen W129C ve L134R, üç adet A tipi virusta şekillenen E131K ile
iki adet O tipi virusta şekillenen L137R mutasyonlarının VP2 geni antijenik bölge
2’ye ve heparin bağlanma alanına yakın olmalarından dolayı daha önceki
araştırmacılar tarafından belirtildiği üzere antijenik olarak önemli olabileceği ve
77
virusun hücreye adaptasyonunda hücresel reseptörlerle etkileşimini değiştirerek plak
morfolojisini etkiliyor olabilecekleri düşünülmüştür.
Virusların VP3 geninde tespit edilen mutasyonlar incelendiğinde daha önceden
hücre tropizmi ve plak fenotipi için kritik belirleyici olarak identifiye edildiği
bildirilmiş olan VP3 geni 56. kodonda şekillenen H56R mutasyonu, D60G
mutasyonu ile birlikte iki adet O tipi virusta tespit edilmiştir. Birer adet A tipi virusta
şekillenen D174G ve T178G mutasyonlarının ise, VP3 için heparin bağlanma alanı
olan 173. rezidüye yakın olmalarından dolayı önemli olabilecekleri düşünülmüştür.
Bu araştırmada VP1 geninde tespit edilen T13A, S30T, E83K, T96K, H108R,
R172W ve E174A, VP2 geninde tespit edilen T201A, VP3 geninde tespit edilen
C34R ve 3A geninde tespit edilen T119A, L129P, N139D ve V143A mutasyonlarının
plak morfolojisi düzeyindeki olası etkileri mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır ve
ileri çalışmalara ihtiyaç duymaktadır. Pasajlar arasında hiçbir mutasyonun
görülmediği cre ve VP4 genlerinin ise bu araştırma için plak morfolojisi yönünden
potansiyel gen bölgeleri olmadıkları düşünülmüştür. Daha sonra yapılacak benzer
çalışmalarda sadece dış kapsit genleri olan VP1, VP2 ve VP3 genleri üzerine
yoğunlaşılması önerilebilir.
Türkiye’de ilk olarak yapılan bu çalışma sonucunda elde edilen bulguların,
şap virusu ile ilgili yapılabilecek başka çalışmalara bilgi sağlayabileceği
düşünülmektedir. İlerleyen hücre kültürü pasajlarında dış kapsit genlerinde tespit
edilen mutasyonlardan heparin bağlanma alanlarına yakın olanların yapılacak
hayvan denemeleri ile daha önceki araştırmacıların bildirdiği üzere hayvanlarda
patojeniteyi etkileyip etkilemeyeceği, virusların süspanse hücrelere adaptasyonunun
sağlanmasından sonra tekrar monolayer hücrelere inokule edilmesinin şekillenmiş
mutasyonlarda ne gibi değişimlere neden olabileceği ve kültür ortamı değişikliğinin
neden olduğu fenotipik değişikliklerin virusların immunojeniteleri üzerine etkisinin
tespiti daha sonra çalışılması önerilebilecek konulardır.
78
Ayrıca, bu çalışmanın Türkiye’de şap aşısı üretimi konusunda da katkısı
olacağı düşünülmektedir. Nitekim, çalışma sırasında Aday Virus 8 (O tipi 3)’in
BHK-21 hücre hatlarında yapılan virus pasajlarında plak test sonucu elde edilen
enfektif titrelerinin araştırmada çalışılan diğer O tipi viruslara göre farklılık
göstermesi üzerine, ülkemizde 2006 yılından beri salgınlara neden olan O PanAsia-
2 için hazırlanacak aşıda kullanılacak aşı suşu olarak değerlendirilebileceği
düşünülmüş ve bu bağlamda O tipi aday virusların süspanse kültürdeki son
pasajlarının 146S değerleri de incelenmiştir. Bu çalışmalar sonucunda çalışmada
kullanılan aday viruslar içinde en yüksek enfektif titreye sahip olduğu belirlenmiş
olan Virus 8’in 146S için de en yüksek değeri verdiği tespit edilmiştir. Bu
farklılığın plak morfolojisindeki değişimlerle ilişkisini tam olarak ortaya koyan
bilimsel veriler olmamakla birlikte, Virus 8 için elde edilen 146S verisi Şap
Enstitüsü Müdürlüğü tarafından önemli bir veri olarak değerlendirilerek, Virus 8’in
O PanAsia-2 suşu için aşı suşu adayı olarak deneysel bağışıklık çalışmalarına
alınmasına karar verilmiştir. Şap Enstitüsü’nde yapılan bu çalışmalar sonucunda
oldukça tatminkâr immunojenite özelliği sergileyen deneysel aşının diğer
kontrolleri de tamamlanarak O Tur 07 adıyla 2011 Bahar Dönemi Şap Aşısı
Kampanyası’ndan itibaren resmi aşı suşu olması için Şap Enstitüsü Müdürlüğü
tarafından Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’na başvuru yapılmıştır.
79
ÖZET
Aşı Suşu Olarak Kullanılacak Şap Virusu Plak Morfolojisindeki Farklılıkların Genetik Olarak İncelenmesi
Bu çalışmada, şap aşılarının hazırlanmasında aşı suşu adayı olarak seçilen saha suşlarının ve güncel bazı aşı suşlarının BHK-21 hücre kültürlerine adaptasyonları sırasında ortaya çıkan farklı plak fenotiplerinin genetik düzeyde incelenmesi ve söz konusu fenotipik değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonların sorgulanması amaçlanmıştır. Bu amaçla, 2007 yılında Türkiye’nin çeşitli illerinde hastalığa sebep olmuş beş adet A/IRN/2005 suşu ve beş adet O PanAsia-2 suşundan olmak üzere on adet aşı suşu aday virusu ve A22 Irak, A Tur 04-06 ve O1 Manisa olmak üzere üç adet aşı suşu niteliğindeki kontrol virusunun BHK-21 hücre kültürlerine adaptasyon çalışmaları, ELISA ve plak testleri yapılarak, pasajlar arasında plak morfolojilerinde meydana gelen değişiklikler genetik düzeyde incelenmiş ve söz konusu değişikliklerden sorumlu olabilecek mutasyonlar sorgulanmıştır. Viruslara ait orijinal virus süspansiyonları, monolayer BHK-21 An31 hücre kültüründe altıncı pasaj, monolayer BHK-21 An30 hücre kültüründe beşinci pasaj ve süspanse BHK-21 An30 hücre kültüründeki son pasajlarından elde edilen VP1, 3A ve cre genlerine ait nükleotid diziler ve orijinal virus süspansiyonları ile süspanse BHK-21 An30 hücre kültüründeki son pasajlarından elde edilen VP4, VP2 ve VP3 genlerine ait nükleotid diziler her virus için kendi içinde karşılaştırılmıştır.
Çalışılan virusların hücre kültürlerine adaptasyonları için yapılan pasajlar sırasında plak ölçülerinde genel olarak küçülme ve heterojen plak morfolojisi oluştuğu tespit edilmiştir. Nükleotid diziler incelendiğinde; VP1 genindeki T48K, H57R, Q110K, Q110R, E138K, E198K ve D199G, VP2 genindeki W129C, E131K, L134R ve L137R ve VP3 genindeki H56R, D60G, D174G ve T178G mutasyonlarının daha önceki çalışmacıların bildirdikleri doğrultusunda plak morfolojisi ile ilişkili olabilecekleri düşünülmüştür. VP1 genindeki T13A, S30T, E83K, T96K, H108R, R172W ve E174A, VP2 genindeki T201A, VP3 genindeki C34R ve 3A genindeki T119A, L129P, N139D ve V143A mutasyonlarının plak morfolojisi ile ilişkisi ise mevcut bilgilerle ortaya konulamamıştır. Pasajlar arasında hiçbir mutasyonun görülmediği cre ve VP4 genlerinin bu çalışma için plak morfolojisi yönünden potansiyel gen bölgeleri olmadıkları düşünülmüştür. İlerleyen hücre pasajlarında plak fenotiplerinde görülen değişimlerin ve diziler arasındaki aminoasit farklılıklarının, şap virusunun tür benzeri doğasının sonucu olarak populasyon içinde değişken ortam şartlarına uyum sağlayan baskın varyantların özelliklerini göstermeleri sonucu şekillendiği düşünülmüştür. Elde edilen bulgular şap aşısı üretimi ve şap virusu ile ilgili yapılabilecek başka çalışmalara bilgi sağlayabilir.
Anahtar Sözcükler: Hücre kültürü, genetik analiz, plak fenotipi, şap virusu
80
SUMMARY Genetical Investigation On The Differences of Plaque Morphology of FMDV Which Will Be Used As Vaccine Strain
In this study, it was aimed to genetically investigate the different plaque phenotypes that occured during the adaptation of field strains which were selected as candidate vaccine strains to prepare vaccine for foot-and-mouth disease and some current vaccine strains to BHK-21 cell cultures and to examine the mutations that may be responsible for such phenotypical alterations. For this purpose; the studies for adaptation to BHK-21 cell lines, ELISA and plaque assays of ten candidate vaccine strain viruses of five A/IRN/2005 strain and five O PanAsia-2 strain which have caused the disease in several provinces of Turkey in 2007 and three vaccine strains A22 Iraq, A Tur 04-06 and O1 Manisa which were used as control viruses were done and the plaque morphology alterations occured between the passages were genetically investigated and the mutations that may be responsible for these alterations were examined. The nucleotide sequences of VP1, 3A and cre genes obtained from the original virus suspensions, the sixth passage in monolayer BHK-21 An31 cell line, the fifth passage in monolayer BHK-21 An30 cell line and the last passage of the viruses in suspension BHK-21 An30 cell line and the nucleotide sequences of VP4, VP2 and VP3 obtained from the original virus suspensions and the last passage of the viruses in suspension BHK-21 An30 cell line were compared in itself for each virus.
During the passages of the studied viruses for their adaptation to cell lines, a general decrease in the plaque sizes and heterogeneous plaque morphology formation was determined. When the nucleotide sequences were investigated; T48K, H57R, Q110K, Q110R, E138K, E198K and D199G mutations in VP1, W129C, E131K, L134R and L137R mutations in VP2 and H56R, D60G, D174G and T178G mutations in VP3 were thought to may be related with plaque phenotype according to the declarations of previous researchers. The relationship between mutations T13A, S30T, E83K, T96K, H108R, R172W and E174A in VP1, T201A in VP2, C34R in VP3 and T119A, L129P, N139D and V143A in 3A and plaque morphology were not able to revealed with existent information. It was thought that cre and VP4 genes in which no mutation was observed between the passages were not the potential genes for plaque morphology for this study. The alterations in plaque phenotypes which were observed in progressive cell culture passages and the aminoacid differences between the sequences were thought to show the properties of dominant variants in the population which were accommodated to changeable media conditions occured as a result of quasispecies nature of foot-and-mouth disease virus. The findings obtained may supply information for other studies that will be done about foot-and-mouth disease vaccine production and foot-and-mouth disease virus.
Key Words: Cell culture, genetic analysis, plaque phenotype, FMDV
81
KAYNAKLAR
ACHARYA, R., FRY, E., STUART, D., FOX, G., ROWLANDS, D., BROWN, F. (1989). The three-dimensional structure of foot-and-mouth disease virus at 2.9 A resolution. Nature, 337: 709-716.
AKTAŞ, S. (1998). Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus types O and A in Turkey. PHD Thesis. Reading University, UK.
AKTAŞ, S., SAMUEL, A. R. (2000). Identification of antigenic epitopes on the foot and mouth disease virus isolate O1/Manisa/Turkey/1969 using monoclonal antibodies. Rev. Sci.Tech., 19: 744-753.
ALEXANDERSEN, S., BROTHERHOOD, I., DONALDSON, A. I. (2002). Natural aerosol transmission of foot-andmouth disease virus to pigs: minimal infectious dose for strain O1 Lausanne. Epidemiology and Infection, 128: 301–312.
ALEXANDERSEN, S., ZHANG, Z., DONALDSON, A. I., GARLAND, A. J. (2003). The pathogenesis and diagnosis of foot-and-mouth disease. Journal of Comparative Pathology, 129: 1-36.
ALEXANDERSEN, S., MOWAT, N. (2005). Foot-and-mouth disease: host range and pathogenesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 9-42.
ARCHETTI, I. L., AMADORI, M., DONN, A., SALT, J., LODETTI, E. (1994). Detection of foot-and-mouth disease virus-infected cattle by assessment of antibody response in oropharyngeal fluids. Journal of Clinical Microbiology, 33(1): 79-84.
BACHRACH, H. L. (1968): Foot-and-mouth disease virus. Annual Review of Microbiology, 22: 201-244.
BAXT, B., MASON, P. W. (1995). Foot-and-mouth disease virus undergoes restricted replication in macrophage cell cultures following Fc receptormediated adsorption. Virology, 207:503–509.
BEARD, C., MASON, P. W. (2000). Genetic determinants of altered virulence of Taiwanese foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, 74(2): 987-991.
BEDARD, K., SEMLER, B. L. (2004). Regulation of picornavirus gene expression. Microbes and Infection, 6: 702-713.
BELSHAM, G. J. (2005). Translation and replication of FMDV RNA. CTMI, 288: 43-70.
BERGELSON, J. M., SHEPLEY, M. P., CHAN, B. M. C., HEMLER, M. E., W.FINBERG, R. (1992). Identification of the integrin VLA-2 as a receptor for echovirus 1. Science, 255:1718–1720.
82
BOLWELL, C., BROWN, A. L., BARNETT, P. V., CAMPBELL, R. O., CLARKE, B. E., PARRY, N. R., OULDRIDGE, E. J., BROWN, F., ROWLANDS, D. J. (1989a). Host cell selection of antigenic variants of foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol., 70: 45-57.
BOLWELL, C., CLARKE, B., PARRY, N., OULRIDGE, E., BROWN, F., ROWLANDS, D. (1989b). Epitope mapping of foot and mouth disease virus with neutralizing monoclonal antibodies. J. Gen. Virol., 70: 59–68.
BRIDGEN, A., ELLIOTT, R. M. (2000). Chapter 9: Reverse genetics of RNA viruses. In: RNA Viruses A Practical Approach, Ed: A. J. Cann, Oxford University Press, p. : 223.
BROOKSBY, J.B. (1982). Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus. Intervirology, 18(1-2):
1-23.
BROWN, F. (1988). Use of peptides for immunization against foot-and-mouth disease virus. Vaccine, 6: 180-182.
BROWN, F. (2003). The history of research in foot-and-mouth disease. Virus Research, 91: 3-7.
CARRILLO, C., TULMAN, E. R., DELHON, G., LU, Z., CARRENO, A., VAGNOZZI, A., KUTISH, G. F., ROCK, D. L. (2005). Comparative genomics of foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, 79: 6487-6504.
CHRISTENSEN, L. S., PARLAK, Ü., ÖZCAN, C., ÇOKÇALIŞKAN, C., SAREYYÜPOĞLU, B., GRAM-HANSENL, L., TEZEL, A., ÖZYÖRÜK, F. (2006). Characterization, including VP1 and full-length sequencing of type A and O strains collected from foot-and-mouth disease outbreaks since 1996 in Turkey. 2006 Report of Session of the Research Group of the Standing Technical Committee European Commission for the Control of Foot and Mouth Disease, Paphos/Cyprus.
CLARKE, B. E., BROWN, A. L., CURREYL, K. M, NEWTON, S. E., ROWLANDS, D. J., CARROLL, A. R. (1987). Potential secondary and tertiary structure in the genomic RNA of foot and mouth disease virus. Nucleic Acid Research. 15(17): 7067-7079.
COLLINS, R. A., KO, L. S., FUNG, K. Y., LAU, L. T., XING, J., YU, A. C. H. (2002). A method to detect major serotypes of foot-and-mouth disease virus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 297(2): 267-274.
CONDIT, R. C. (2007). Principles of virology. In: Fields Virology, 5th Edition, Vol. I, Ed: D. M., Knipe, P. M. Howley, p. : 27-57.
COWAN, K. M. (1966). Heterogenecity of antibodies by cattle infected with foot-and-mouth disease virus. A. J. Vet. Res., 27(120): 1217-1228.
COWAN, K. M. (1968). Antigenic heterogenecity of FMDV as demonstrated with 7 days postinfection guinea pig serum by Ouchterlonyanalysis. Fen. Proc., 27: 733-745.
COWAN, K. M. (1970). Immunochemical studies of foot-and-mouth disease. Differences in antigenic determinant site recognation by guinea pig 19S and 7S antibodies. The Journal of Immunology, 104(2).
83
ÇELİK, N. (1998). Şap O1 Manisa 1969 tohum ve klon viruslarının antijenik karakterlerinin karşılaştırılması ve bunlardan hazırlanan aşıların bağışıklık özelliklerinin araştırılması. Doktora Tezi. Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
DOEL, T. R. (2003). FMD vaccines. Virus. Res., 91: 81-99.
DOMINGO, E. (2002). Quasispecies theory in virology. Journal of Virology, 76: 463-465.
DOMINGO, E. (Ed.), (2006). Quasispecies: concepts and implications for virology. In: Current topics in microbiology and immunology series. Springer Verlag, Berlin, Germany, Vol: 289.
DOMINGO, E., MARTINEZ-SALAS, E., SOBRINO, F., DE LA TORRE, J., PORTELA, A., ORTIN, J., LOPEZ-GALINDEZ, C., PEREZ-BRENA, P., VILLANUEVA, N., NAJERA, R., VANDEPOL, S., STEIHAUER, D., DEPOLO, N., HOLLAND, J. (1985). The quasispecies (extremly heterogeneous) nature of viral RNA genome populations: biological relevance [a review]. Gene, 40: 1–8.
DOMINGO, E., BIEBRICHER, C. K., EIGEN, M., HOLLAND, J. J. (Ed.), (2001). Multiplication strategies of RNA genetic elements. In: Quasispecies and RNA Virus Evolution: Principles and Consequences, Landes Bioscience, Georgetown, Texas, U. S. A. , Eurekah.com, Austin, Texas, U. S. A., p. : 7-24.
DOMINGO, E., PARIENTE, N., AIRAKSINEN, A., GONZALEZ-LOPEZ, C., SIERRA, S., HERRERA, M., GRANDE-PEREZ, A., LOWENSTEIN, P. R., MANRUBIA, S. C., LAZARO, E., ESCARMIS, C. (2005). Foot-and-mouth disease virus evolution: Exploring pathways towards virus extinction. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 149-173.
DONALDSON, A. I., GLOSTER, J., HARVEY, L. D., DEANS, D. H. (1982). Use of prediction models to forecast and analyse airborne spread during the foot-and-mouth disease outbreaks in Brittany, Jersey and the Isle of Wight in 1981. Vet. Rec., 110: 53±7.
EROL, N., WHITELAND, A. P., GÜRSOY, C., ŞENEL, E., GIRARD, H. C. (1975). Plaque and antigenic characteristics concerning O1 FMD virus. Report of the meeting of the Research Group of the Standing Technical Committee of the European Commission for the control of foot-and-mouth disease. Appendix XLX, 104-109.
EROL, N., ŞENEL, E., GÜRSOY, Ç. (1979). Sahadan temin edilerek çeşitli kültür metodları ile üretilen O tipi şap virus suşlarının kalitatif ve kantitatif immünojenik değerlendirilmeleri üzerinde çalışmalar. Şap Enstitüsü Mecmuası, 1: 275-305.
ESCARMIS, C., TOJA, M., MEDINA, M., DOMINGO, E. (1992). Modifications of the 5’ untranslated region of foot-and-mouth disease virus after prolonged persistence in cell culture. Virus Res., 26: 113-125.
FERRIS, N. P, DAWSON, M. (1988). Routine application of enzyme-linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot-and-mouth and swine vesicular diseases. Veterinary Microbiology, 16: 201-209.
FOX, G., STUART, D., ACHARYA, K. R., FRY, E., ROWLANDS, D., BROWN, F. (1987). Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of foot-and-mouth disease virus. J. Mol. Biol., 196: 591-597.
84
FRY, E. E., LEA, S. M., JACKSON, T., NEWMAN, J. W., ELLARD, F. M., BLAKEMORE, W. E., ABU-GHAZALEH, R., SAMUEL, A., KING, A. M., STUART, D. I. (1999). The structure and function of a foot-and-mouth disease virus-oligosaccharide receptor complex. EMBO J., 18: 543-554.
FRY, E. E., STUART, D. I., ROWLANDS, D. J. (2005). The structure of foot-and-mouth disease virus. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 71-101.
GEBAUER, F., TORRE, DE LA J. C., GOMES, I., MATEU, M. G., BARAHONA, H., TIRABOSCHI, B., BREGMAN, I., AUGÉ DE MELLO, P., DOMINGO, E. (1988). Rapid selection of genetic and antigenic variants of foot-and-mouth disease virus during persistence in cattle. Journal of Virology, 62(6): 2041-2049.
GILBERT, M., AKTAŞ, S., MOHAMMED, H., ROEDER, P., SUMPTION, K., TUFAN, M., SLINGENBERG, J. (2005). Patterns of spread and persistence of foot-and-mouth disease types A, O and Asia-1 in Turkey: a meta-population approach. Epidemiol. Infect., 133: 537–545.
GOODFELLOW, I. G., KERRIGAN, D., EVANS, D. J. (2003). Structure and function analysis of the poliovirus cis-acting replication element (CRE). Rna-a Publication of the Rna Society, 9: 124-137.
GRUBMAN, M. J., BAXT, B. (2004). Foot-and-mouth disease. Clin. Microbiol. Rev., 17(2): 465-493.
GRUMURTHY, C. B., SANYAL, A., VENKATAMARAN, R., TOSH, C., GEORGE, M., HEMADRI, D. (2002). Genetic diversity in the VP1 gene of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1. Arch. Virol., 147: 85-102.
GÜRHAN, B., DAKILIR, G. (1994). Çeşitli illerden temin edilen O1 tipi şap virusu suşlarının BHK-21 monolayer ve süspanse hücre kültürlerine adaptasyonu ve halen aşı suşu olarak kullanılan O1 Manisa ile immunolojik yönden karşılaştırılması. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi, 7(5): 143-152.
HALL, T. A. (1999): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 41: 95-98.
HAMBLIN, C., ARMSTRONG, R. M., HEDGER, R. S. (1984). A rapid enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of foot-and-mouth disease virus in epithelial tissues. Veterinary Microbiology, 9: 435–443.
HARE, J. D., MORGAN, H. R. (1962). A polyoma variant with new antigenic determinants. Virology, 19: 105-107.
HARRIS, T. J., BROWN, F. (1977). Biochemical analysis of a virulent and an avirulent strain of foot-and-mouth disease virus. J. Gen. Virol., 34: 87-105.
HEATH, L. E., VOSLOO, W., NEL, L. H. (2001). Analyses of the 3A non-structural protein-coding region of foot-and-mouth disease virus isolates from Africa (Yayınlanmamış veri).
85
HERNANDEZ, J., VALERO, M. L., ANDREU, D., DOMINGO, E., MATEU, M. G. (1996). Antibody and host cell recognation of foot-and-mouth disease virus (serotype C) cleaved at the Arg-Gly-Asp (RGD) motif: a structural interpretation. J. Gen. Virol., 77: 257-264.
HOHDATSU, T., TAKAHASI, N., IDE, S., YAMAGISHI, H., SAITO,H., FUJISAKI, Y., KOYAMA, H. (1990). The relation between pathogenicity and plaque size of Getah virus Kanagawa strain in suckling mice. Jpn. J. Vet. Sci., 52(3): 519-526.
HOGLE, J. M., CHOW, M., FILMAN, D. J. (1985). Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution. Science, 229: 1358-1365.
HOLLAND, J., SPINDLER, K., HORODYSKI, F., GRABAU, E., NICHOL, S., VANDEPOL, S. (1982). Rapid evolution of RNA genomes. Science, 215: 1577-85.
HOUSE, J. A., YEDLOUTSCHNIG, R. J. (1982). Sensitivity of seven different types of cell cultures to three serotypes of foot-and-mouth disease virus. Canadian Journal of Comparative Medicine, 46: 186-189.
HOUSE, C., MEYER, R. F. (1993). The detection of foot-and-mouth disease virus in oesophageal–pharyngeal samples by a polymerase chain reaction technique. Journal of Virological Methods, 43: 1–6.
HUGHES, G. J., MIOULET, V., KITCHING, R. P., WOOLHOUSE, M. E., ALEXANDERSEN, S., DONALDSON, A. I. (2002). Foot and mouth disease virus infection of sheep: implications for diagnosis and control. Vet. Rec., 150: 724-727.
ICTV PICORNAVIRIDAE STUDY GROUP (2009). Picornavirus Type Classification: New and Re-Classified Types. Erişim:
[http://www.picornastudygroup.com/types/index.html]. Erişim Tarihi: 10.10.2009.
İLERLE, M. A., TAN, B. (1987). Sahada hasta sığırlardan elde edilecek O tipi çeşitli saha suşlarının sığır dili epiteline adaptasyonu (Frenkel metodu ile) ve adapte olmuş bu suşların karakteri üzerine çalışmalar. Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 253-274.
JACKSON, T., ELLARD, F. M., GHAZALEH, R. A., BROOKES, S. M., BLAKEMORE, W. E., CORTEYN, A. H., STUART, D. I., NEWMAN, J. W., KING, A. M. (1996). Efficient infection of cells in culture by type O foot-and-mouth disease virus requires binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol., 70: 5282-5287.
JACKSON, T., SHEPPARD, D., DENYER, M., BLAKEMORE, W., KING., A. M. (2000). The epithelial integrin alphavbeta6 is a receptor for foot-and-mouth disease virus. J. Virol., 74: 4949-56.
JACKSON, T., KING, A. M. Q., STUART, D. I., FRY, E. (2003). Structure and receptor binding. Virus Res., 91: 33-46.
JACKSON, A. L, O’NEILL, H., MAREE, F., BLIGNAUT, B., CARRILLO, C., RODRIGUEZ, L., HAYDON, D. T. (2007). Mosaic structure of foot-and-mouth disease virus genomes. J. Gen. Virol., 88: 487-492.
86
KANDA, Y., MELNICK, J. L. (1959). In vitro differentiation of virulent and attenuated polioviruses by their growth characteristics on MS cells. J. exp. Med., 109: 9-24.
KITCHING, R. P. (2002a). Clinical variation in foot-and-mouth disease: cattle. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 21(3): 499-504.
KITCHING, R. P. (2002b). Identification of foot-and-mouth disease virus carrier and subclinically infected animals and differentiation from vaccinated animals. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 21(3): 531-538.
KITCHING, R. P., (2005). Global epidemiology and prospects for control of foot-and-mouth disease. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288:133-148.
KITCHING, R. P., MACKAY, D. K. (1994). Foot and mouth disease virus. State Vet. J., 4: 7-10.
KITCHING, R. P., HUGHES, G. J. (2002). Clinical variation in foot-and-mouth disease: sheep and goats. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 21(3): 505-512.
KLEIN, J., NORMANN, P., ALEXANDERSEN, S. (2006). Genetic analysis of the highly invasive FMDV subtype A/Iran/2005 (Yayınlanmamış veri).
KLEIN, J., HUSSAIN, M., AHMAD, M., NORMANN, P., AFZAL, M., ALEXANDERSEN, S. (2007). Genetic characterisation of the recent foot-and-mouth disease virus subtype A/IRN/2005. Virology Journal, 4:122.
KNOWLES, N. J. (2009). ([email protected]). Welcome to the home of Picornaviruses. Erişim: [http://www.picornaviridae.com/]. Erişim Tarihi: 10.10.2009.
KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R. (1998). RT-PCR and sequencing protocols for the molecular epidemiology of exotic virus diseases of animals. OIE/FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, Molecular Epidemiology Group.
KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R., AKTAŞ, S., ROWE, C. A., ABRAMS, C. C., NEWMAN, J. W. I., KING, A. M. Q. (1999). Phylogenetic comparison of the capsid-coding region of all seven foot-and-mouth disease virus serotypes (Yayınlanmamış veri).
KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R., DAVIES, P. R., KITCHING, R. P., DONALDSON, A. I. (2001). Outbreak of foot-and-mouth disease virus serotype O in the UK caused by a pandemic strain. Veterinary Record, 148: 258–259.
KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R. (2003): Molecular epidemiology of foot-and- mouth disease virus. Virus Research, 91: 65-80.
KNOWLES, N. J., SAMUEL, A. R., DAVIES, P. R., MIDGLEY, R. J., VALARCHER, J. F. (2005). Pandemic strain of foot-and-mouth disease virus serotype O. Emerging Infectious Diseases, 11(12): 1887-1893.
87
KNOWLES, N. J., WADSWORTH, J., SHIRAZI, M. H. N., PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., FERRIS, N., HUTCHINGS, G. H., STIRLING, J. M., KING, D. P., PATON, D. J. Recent Spread of Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype O PanAsia-2, a New Epizootic Lineage Derived from the PanAsia Strain (Yayınlanmamış veri).
LEFORBAN, Y. (1999). Prevention measures against foot-and-mouth disease in Europe in recent years. Vaccine, 17:1755–1759.
LI, D., SHANG, Y. J., LIU, X. T., CAI, X. P. (2007). Molecular relationships between type Asia 1 new strain from china and type O Panasia strains of foot-and-mouth-disease virus. Virus Genes, 35: 273-279.
LOMBARD, M. F., DUBOURGET, P. G., SCHUMACHER, C. L. (2003). Strategic reserves, advantages and disadvantages: the manufacturer’ s experience. In: Foot-and-Mouth Disease: Control Strategies. Ed: B.Dodet, M.Vicari. Paris: Elseiver, p. : 221-231.
LOMBARD, M. F., FUSSEL, A. E. (2007). Antigen and vaccine banks: technical requirements and the role of the European antigen bank in emergency foot and mouth disease vaccination. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 26(1): 117-134.
MAHY, B. W. J. (2005). Introduction and history of foot-and-mouth disease virus. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 288: 1-8.
MARTINEZ, M. A., DOPAZO, J., HERNANDEZ, J., MATEU, M. G., SOBRINO, F., DOMINGO, E., KNOWLES, N. J. (1992). Evolution of the capsid protein genes of foot-and-mouth disease virus: Antigenic variation without accumulation of amino acid substitutions over six decades. Journal of Virology, 66(6): 3557-3565.
MARTINSEN, J. S. (1971). Two plaque size variants of foot-and-mouth disease virus differing in neutralization by guinea pig antisera. Res. Vet. Sci., 12: 399-400.
MASON, P. W., BAXT, B., BROWN, F., HARBER, J., MURDIN, A., WIMMER, E. (1993). Antibody-complexed foot-and-mouth disease virus, but not poliovirus, can infect cells via the Fc receptor. Virology, 192:568–577.
MASON, P. W., RIEDER, E., BAXT, B. (1994). 1994 RGD sequence of foot-and-mouth disease virus is essential for infecting cells via the natural receptor but can be bypassed by an antibody-dependent enhancement pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 91: 1932-6.
MASON, P. W., BEZBORODOVA, S. V., HENRY, T. M. (2002). Identification and characterization of a cis-acting replication element (cre) adjacent to the internal ribosome entry site of foot-and-mouth disease virus. Journal of Virology, 76(19). 9686-9694.
MASON, P. W., GRUBMAN, M. J., BAXT, B. (2003). Molecular basis of pathogenesis of FMDV. Virus Research, 91: 9-32.
MATEU, M. G., MARTINEZ, M. A., ROCHA, E., ANDREU, D., PAREJO, J., GIRALT, F., SOBRINO, F., DOMINGO, E. (1989). Implications of a quasispecies genome structure: effect of frequent, naturally occurring amino acid substitutions on the antigenicity of foot-and-mouth disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci., 86:5883–5887.
88
MATTION, N., KONIG, G., SEKI, C., SMITSAART, E., MARADEI, E., ROBIOLO, B., DUFFY, S., LEON, E., PICCONE, M., SADIR, A., BOTTINI, R., COSENTINO, B., FALCZUK, A., MARESCA, R., PERIOLO, O., BELLINZONI, R., ESPINOZA, A., TORRE, J. L., PALMA, E. L. (2004). Reintroduction of foot-and-mouth disease in Argentina: characterisation of the isolates and development of tools for the control and eradication of the disease. Vaccine, 22(31-32): 4149-4162.
MBAYED, V., SCHIAPPASCASSI, M., COROMINAS, A., CAMPOAS, R. (1997). Characteristic
in vitro evolution pattern of foot and mouth disease virus A81:Castellanos:Arg:87. Virus Research, 48: 157–163.
MCGALL, G. H., CHRISTIANS, F. C. (2002). High density genechip oligonucleotid probe arrays. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 77: 22-41.
MCKENNA, T. S. C., LUBROTH, J. RIEDER, E., BAXT, B., MASON, P. W. (1995). Receptor binding-site-deleted foot-and-mouth disease (FMD) virus protects cattle from FMD. J. Virol., 69: 5787–5790.
MCVICAR, J. W., SUTMOLLER, P. (1976). Growth of foot-and-mouth disease virus in the upper respiratory tract of non-immunized, vaccinated and recovered cattle after intranasal inoculation. J. Hyg. (Lond..), 76: 467-481.
MOFFAT, K., KNOX, C., HOWELL, G., CLARK, S. J., YANG, H., BELSHAM, G. J., RYAN, M., WILEMAN, T. (2007). Inhibition of the secretory pathway by foot-and-mouth disease virus 2BC protein is reproduced by coexpression of 2B with 2C, and the site of inhibition is determined by the subcellular location of 2C. J. Virol., 81: 1129-39.
MORIOKA, K., FUKAI, K., OHASHI, S., SAKAMOTO, K., TSUDA, T., YOSHIDA, K. (2008). Comparison of the characters of the plaque-purified viruses from foot-and-mouth disease virus. J. Vet. Med. Sci., 70(7): 653-8.
MOSS, A., HAAS, B. (1999). Comparison of the plaque test and reverse transcription nested PCR
for the detection of FMDV in nasal swabs and probang samples. Journal of Virological Methods, 80: 59–67.
MUTHUCHELVAN, D., VENKATARAMANAN, R., HEMADRI, D., SANYAL, A., TOSH, C. (2001). Sequence analysis of recent Indian isolates of foot-and-mouth disease virus serotypes O, A and Asia1 from clinical materials. Acta Virol., 45: 159-167.
NICHOLAS, K.B., NICHOLAS, H.B. JR.DEERFIELD, D.W. (1997). GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEWS, 4: 14.
OIE (2010-2011). Hayvan sağlığı Bilgileri, Haftalık Hastalık Bilgisi - WAHID Interface. Erişim: [http://www.oie.int/wahis/public.php?page=weekly_report_index]. Erişim Tarihi: 06.11.2010-16.01.2011.
OKAY, G., KIVILCIM, Y., CERİTOĞLU, T. (1979). O1 tipi şap virusunun sahadaki hasta hayvanlardan elde edilecek suşunun BHK süspanse hücre kültürlerinde üretilmesi ve kültür karakterleri üzerinde çalışmalar. Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 229-252.
OLECHNOWITZ, A. F., ENGLER, E. (1970). [pH inactivation of the foot-and-mouth disease virus]. Arch. Exp. Veterinarmed., 24; 461-471.
89
OLIVER, R. E., DONALDSON, A. I., GIBSON, C. F., ROEDER, P. L., LE BLANC SMITH, P. M., HAMBLIN, C. (1988). Detection of foot-and-mouth disease antigen in bovine epithelial samples: Comparison of sites of sample collection by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and complement fixation test. Researc in Veterinary Science, 44: 315-319.
ÖZTÜRKMEN, H. (1982). İnvitro olarak üretilen O1 (Manisa) şap virusunun değişik plak karakterlerinin immuniteye etkileri üzerinde araştırmalar (Uzmanlık Tezi). Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 123-140.
PACHECO, J. M., HENRY, T. M., O’DONNELL, V. K., GREGORY, J. B., MASON, P. W. (2003). Role of nonstructural proteins 3A and 3B in host range and pathogenicity of foot-and-mouth disease virus. Journal Of Virology, 77(24): 13017–13027.
PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., KNOWLES, N. J., ARMSTRONG, R. M., AKTAŞ, S., ALKAN, F., ÇOKÇALIŞKAN, C., CHRISTENSEN, L. S. (2007). Characterisation of foot-and-mouth disease virus strains circulating in Turkey during 1996–2004. Arch. Virol., 152: 1175–1185.
PATON, D. J., VALARCHER, J. F., BERGMAN, I., MATLHO, O. G., ZAKHAROV, V. M., PALMA, E. L., THOMSON, G. R. (2005). Selection of foot and mouth disease vaccine strains-a review. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 2005, 24(3): 981-993.
PEREIRA, H. G. (1981): Foot-and-mouth disease virus. In: Virus Diseases of Food Animals, Vol. II, Ed.: P. G. Gibbs. New York: Academic Press, p. : 333-363.
PIATTI, P., HASSARD, S., NEWMAN, J. F. E., BROWN, F. (1995). Antigenic variants in a plaque-isolate of foot-and-mouth disease virus: Implications for vaccine production. Vaccine, 13(8): 781-784.
PRESTON, K. J., OWENS, H., MOWAT, G. N. (1981). Relationship between plaque size and the immunising ability of the foot-and-mouth disease virus SAT1Nig10/75. Archives of Virology, 70: 63-67.
RACANIELLO, V. R. (2007). Picornaviridae: The viruses and their replication. In: Fields Virology, 5th Edition, Vol. I, Ed: D. M., Knipe, P. M. Howley, p. : 796-838.
RANDRUP, A. (1954). On the stability of bovine foot-and-mouth disease virus dependent on pH; investigations on the complement fixing and the immunizing antigen as well as on the infective agent. Acta. Pathol. Microbiol. Scand., 35: 388-95.
RAPP, F. (1964). Plaque differentiation and replication of virulent and attenuated strains of measles virus. J. Baet., 88: 1448-1458.
REID, S. M., FORSYTH, M. A., HUTCHINGS, G. H., FERRIS, N. P. (1998). Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction, enzyme linked immunosorbent assay and virus isolation for the routine diagnosis of foot-and-mouth disease. Journal of Virological Methods, 70: 213–217.
REID, S. M., FERRIS, N. P., HUTCHINGS, G. H., ZHANG, Z., BELSHAM, G. J., ALEXANDERSEN, S. (2001). Diagnosis of foot-and-mouth disease by real-time fluorogenic PCR assay. Veterinary Record, 149: 621–623.
90
ROEDER, P. L., LE BLANC SMITH, P. M. (1987). Detection and typing of foot-and- mouth disease virus by enzyme linked immunosorbent assay: a sensitive, rapid and reliable technique for primary diagnosis. Research in Vet. Sci., 43: 225-232.
ROIVAINEN, M., HYYPIA, T., PIIRAINEN, L., KALKKINEN, N., STANWAY, G., HOVI, T. (1991). RGD-dependent entry of coxsackievirus A9 into host cells and its bypass after cleavage of VP1 protein by intestinal proteases. J. Virol., 65: 4735–4740.
ROSAS, M. F., VIEIRA, Y.A., POSTIGO, R., MARTIN-ACEBES, M. A., ARMAS-PORTELA, R., MARTINEZ-SALAS, E., SOBRINO, F. (2008). Susceptibility to viral infection is enhanced by stable expression of 3A and 3AB proteins from foot-and-mouth disease virus. Virology, 380(1): 34-45.
ROWLANDS, D. J. (2008). Foot and mouth disease viruses. In: Encyclopedia of Virology, 3rd Edition, Vol. II, Ed.: B. W. J. Mahy, M. H. V. Van Regenmortel. Elsevier, Academic Press, p. : 265-274.
RWEYEMAMU, M. M. (1984). Antigenic variation in foot-and-mouth disease: studies based on the virus neutralisation reaction. J. Biol. Standard, 12(3): 323-337.
RWEYEMAMU, M. M, BOOTH, J. C., HEAD, M. M., PAY, T. W. F. (1978): Microneutralisation tests for serological typing and subtyping of foot and mouth disease virus strains. J. Hyg. (Lond.) 81: 107–123.
RWEYEMAMU, M. M., ROEDER, P., MACKAYS, D., SUMPTION, K., BROWNLIE, J., LEFORBAN, Y., VALARCHER, J. F., KNOWLES, N. J., SARAIVA, V. (2008). Epidemiological Patterns of Foot-and-Mouth Disease Worlwide. Transboundary and Emerging Diseases. 55: 57–72.
SA-CARVALHO, D., RIEDER, E., BAXT, B., RENATO RODARTE, R., TANURI, A., MASON, P.W. (1997). Tissue culture adaptation of foot-and-mouth disease virus selects viruses that bind to heparin and are attenuated in cattle. Journal of Virology, 71(7): 5115–5123.
SAMUEL, A. R., KNOWLES, N. J. (2001). Foot-and-mouth disease virus: cause of the recent crisis for the UK livestock industry. Trends in Genetics, 17(8): 421-424.
SCHLOER, G. M., HANSON, R. P. (1968). Relationship of plaque size and virulence for chickens of 14 representative Newcastle disease virus strains. Journal of Virology, 2(1): 40-47.
SHAFYI, A. (1968). pH resistance of foot-and-mouth disease virus and its complement-fixing antigen. Am. J. Vet. Res., 29: 1469-1478.
SOBRINO, F., DAVILA, M., ORTIN, J., DOMINGO, E. (1983). Multiple genetic variants arise in the course of replication of foot-and-mouth disease virus in cell culture. Virology, 128: 310-8.
SOBRINO, F., PALMA, E.L., BECK, E., DAVILA, M., DE LA TORRE, J.C., NEGRO, P., VILLANUEVA, N., ORTIN, J., DOMINGO, E. (1986). Fixation of mutations in the viral genome during an outbreak of foot-and-mouth disease: heterogeneity and rate variations. Gene, 50: 149-159.
91
SOBRINO, F., SAIZ, M., JIMENEZ-CLAVERO, M., NUNEZ, J.I., ROSAS, M. F., BARANOWSKI, E., LEY, V. (2001). Foot-and-mouth disease virus: a long known virus, but a current threat. Vet. Res., 32(1): 1-30.
STEINHAUER, D. A., HOLLAND, J. J. (1987). Rapid evolution of RNA viruses. Annu. Rev. Microbiol., 41: 409-433.
SUTMOLLER, P., BARTELING, S. S., OLASCOAGA, R. C., SUMPTION, K. J. (2003). Control and eradication of foot-and-mouth disease. Virus. Res., 91: 101-144.
SÜTÇÜ, M., ERDEM, H., GÜRHAN, S. İ. (1978). Sahada hasta hayvanlardan elde edilecek O tipi şap virusu suşlarının BHK monolayer doku kültürüne adaptasyonu, bu kültürlerde üretilmesi ve virusların karakterleri üzerinde çalışma. Şap Enstitüsü Mecmuası, I: 205-228.
ŞAP ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ (2010a). Duyurular. Erişim: [http://www.sap.gov.tr/page.php?ID=7]. Erişim Tarihi: 10.10.2010.
ŞAP ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ (2010b). Şap hastalığı. Erişim: [http://www.sap.gov.tr/sap_hastaligi.htm]. Erişim Tarihi: 24.03.2010.
TAKEMOTO, K. K., HABEL, K. (1959). Virus-cell relationship in a carrier culture of Hela cells and coxsackie A9 virus. Virology, 7: 28-44.
TAMURA, K., DUDLEY, J., NEI, M., KUMAR, S. (2007). MEGA4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24: 1596-1599.
TARIM VE KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI KORUMA KONTROL GENEL MÜDÜRLÜĞÜ (2009). Şap Hastalığı, Hayvan Hastalık ve Zararlıları ile Mücadele Programı Kitapçığı, s. : 16-21.
THOMSON, G. R. (1994). Foot-and-mouth disease. In: Infectious Diseases of Livestock with Special Reference to Southern Africa, Vol. II, Ed: J. A. W. Coetzer, G. R. Thomson, R. C. Tustin. Cape Town, Oxford, New York: Oxford University Press, p. : 825-852.
THOMPSON, J. D., GIBSON, T. J., PLEWNIAK, F., JEANMOUGIN, F.HIGGINS, D. G. (1997). The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res, 25: 4876-4882.
TUFAN, M. (2006). Animal health authorities and transboundary animal diseases in Turkey. J. Vet. Med., 53: 35-37.
WEDDELL, G., YANSURA, D., DOWBENKO, D., HOATLIN, M.,GRUBMAN, M., MOORE, D., KLEID, D. (1985). Sequence variation in the gene for the immunogenic capsid protein VP1 of foot and mouth disease virus type A. Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 2618–2622.
WILD, T. F., BURROUGHS, J. N., BROWN, F. (1969). Surface structure of foot-and mouth disease virus. J. Gen. Virol., 4: 313-320.
92
XINGWEN, B., HUIFANG, B., PINGHUA, L., PU, S., WENDONG, K., YIMEI, C., ZENGJUN, L., ZAIXIN, L., XIANGTAO, L. (2010). Genetic characterization of the cell-adapted PanAsia strain of foot-and-mouth disease virus O/Fujian/CHA/5/99 isolated from swine. Virol. J., 7: 208.
VERDAGUER, N., MATEU, M. G., BRAVO, J., TORMO, J., GIRALT, E., ANDREU, D., DOMINGO, E., FITA, I. (1994). Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of a monoclonal antibody Fab fragment against foot-and-mouth disease virus and of its complex with the main antigenic site peptide. Proteins, 18: 201-203.
ZHENG, M., JIN, N. Y., ZHANG, H. Y., WEI, T., YIN, G. F., NU, H. J., QIN, X. B. (2004). Foot-and-mouth disease virus O/NY00 (Yayınlanmamış veri).
93
EKLER
Ek - 1 Standart genetik kodlar
T C A G
T
TTT Phe [F]
TTC Phe [F]
TTA Leu [L]
TTG Leu [L]
TCT Ser [S]
TCC Ser [S]
TCA Ser [S]
TCG Ser [S]
TAT Tyr [Y]
TAC Tyr [Y]
TAA [son]
TAG [son]
TGT Cys [C]
TGC Cys [C]
TGA [son]
TGG Trp [W]
T
C
A
G
C
CTT Leu [L]
CTC Leu [L]
CTA Leu [L]
CTG Leu [L]
CCT Pro [P]
CCC Pro [P]
CCA Pro [P]
CCG Pro [P]
CAT His [H]
CAC His [H]
CAA Gln [Q]
CAG Gln [Q]
CGT Arg [R]
CGC Arg [R]
CGA Arg [R]
CGG Arg [R]
T
C
A
G
A
ATT Ile [I]
ATC Ile [I]
ATA Ile [I]
ATG Met [M]
ACT Thr [T]
ACC Thr [T]
ACA Thr [T]
ACG Thr [T]
AAT Asn [N]
AAC Asn [N]
AAA Lys [K]
AAG Lys [K]
AGT Ser [S]
AGC Ser [S]
AGA Arg [R]
AGG Arg [R]
T
C
A
G
G
GTT Val [V]
GTC Val [V]
GTA Val [V]
GTG Val [V]
GCT Ala [A]
GCC Ala [A]
GCA Ala [A]
GCG Ala [A]
GAT Asp [D]
GAC Asp [D]
GAA Glu [E]
GAG Glu [E]
GGT Gly [G]
GGC Gly [G]
GGA Gly [G]
GGG Gly [G]
T
C
A
G
Ek - 2 Aminoasitler ve sembolleri
A Ala Alanin M Met Metionin C Cys Sistein N Asn Asparjin D Asp Aspartik asit P Pro Prolin E Glu Glutamik asit Q Gln Glutamin F Phe Fenilalanin R Arg Arjinin G Gly Glisin S Ser Serin H His Histidin T Thr Tironin I Ile İzolösin V Val Valin K Lys Lizin W Trp Triptofan L Leu Lösin Y Tyr Tirozin
94
Ek - 3 VP1 genine ait diziler
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
Ek - 4 3A genine ait diziler
110
111
112
113
114
Ek - 5 cre genine ait diziler
115
Ek - 6 VP4 genine ait diziler
116
117
118
Ek - 7 VP2 genine ait diziler
119
120
121
122
123
124
125
126
127
Ek - 8 VP3 genine ait diziler
128
129
130
131
132
133
134
135
ÖZGEÇMİŞ
I. Bireysel Bilgiler
Adı : Müge Soyadı : FIRAT SARAÇ Doğum Yeri ve Tarihi : Ankara-1981 Uyruğu : T.C. Medeni Durumu : Evli İletişim Adresi ve Telefonu : Tarım ve Köyişleri Bakanlığı Şap
Enstitüsü Müdürlüğü, Eskişehir Yolu 7.km, ANKARA 0 312 287 36 00
II. Eğitimi
1999-2004 : Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi 1992-1999 : Ankara Atatürk Lisesi 1987-1992 : Ankara Kurtuluş İlkokulu Yabancı Dili : İngilizce
III. Ünvanları
2004 : Veteriner Hekim
IV. Mesleki Deneyimi
Haziran-Aralık/2009 :WRL-Pirbright/İNGİLTERE 2006- : Şap Enstitüsü 2004-2006 : Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji
Anabilim Dalı
V. Bilimsel İlgi Alanları
Moleküler Viroloji, Biyoinformatik, Aşılar, Üretim Öncesi ve Sonrası Aşı Kontrolü
Yayınları:
ÖZYÖRÜK, F., PARLAK, Ü., FIRAT-SARAÇ, M. (2010). FMDV- A/IRN/2005 endemics in WestEurasia: Estimation of coascelent events in the population history. Bildiri, EuFMD Açık Toplantısı, 27 Eylül-1 Ekim 2010, Viyana-AVUSTURYA.
136
FIRAT-SARAÇ, M., PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., ABDUL-HAMID, F. N., VALDAZO-GONZÁLEZ, B., WADSWORTH, J., KNOWLES, N. J., KING, D. P. (2010). Full-genome sequence analysis of foot-and-mouth disease viruses in Western Eurasia. Bildiri, EuFMD Açık Toplantısı, 27 Eylül-1 Ekim 2010, Viyana-AVUSTURYA.
ALKAN, M., GÜRCAN, S., FIRAT SARAÇ, M., GÜLTEKİN, Y., ARSLAN, A., UZUNLU, E., AKYÜZ, Ş., AYNAGÖZ, G. (2008). Development of a foot-and-mouth disease vaccine potency test without conducting animal challenge experiment. Bildiri, EUFMD Açık Toplantısı, 14-17 Ekim 2008, Erice/Sicilya-İTALYA.
PINAR, D., OĞUZOĞLU, T. Ç., DEMİR, A. B., FIRAT, M., BAŞARAN, Z., AKÇA, Y. (2006). Bir damızlık sığır yetiştiriciliği işletmesinde BVDV ve BLV enfeksiyonları. Bildiri, VII. Ulusal Mikrobiyoloji Kongresi, 26-28 Eylül 2006, Antalya-TÜRKİYE.
FIRAT-SARAÇ, M., ABDUL-HAMID, F. N., VALDAZO-GONZÁLEZ, B., WADSWORTH, J., PARLAK, Ü., ÖZYÖRÜK, F., KNOWLES, N. J., KING, D. P. (2010). Application of tools for high-resolution molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus in Western Eurasia. Poster, EPIZONE 4. Toplantısı, 7-10 Haziran 2010, St Malo-FRANSA.
VI. Bilimsel Etkinlikleri
Yer Aldığı Projeler:
Application of tools for high-resolution molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus in Western Eurasia. FAO Destekli Proje.
Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus in Asia. AB 6. ÇP EPIZONE Destekli Proje.
BOZOĞLU, H., ÇOKÇALIŞKAN, C., ARSLAN, A., FIRAT SARAÇ, M., SAREYYÜPOĞLU, B., UZUNLU, E. Enstitüde üretilen yağ adjuvantlı şap aşılarında bağışıklık süresinin belirlenmesi. Şap Enstitüsü Projesi.
BOZOĞLU, H., ÇOKÇALIŞKAN, C., ARSLAN, A., FIRAT SARAÇ, M., SAREYYÜPOĞLU, B., UZUNLU, E. Enstitüde üretilen yağ adjuvantlı şap aşılarının raf ömrünün belirlenmesi. Şap Enstitüsü Projesi.
BOZOĞLU, H., ÇOKÇALIŞKAN, C., ARSLAN, A., FIRAT SARAÇ, M., SAREYYÜPOĞLU, B., UZUNLU, E., ÖZTÜRK, N. TURVAC-OIL yağ adjuvantlı şap aşılarının doz aşımı ve tekrarlayan doz çalışması. Şap Enstitüsü Projesi.
137
Verdiği Seminerler:
Şap Hastalığının Karıştığı Hastalıklar Ve Ayırıcı Tanısı, Şap Enstitüsü, Şubat 2008, Ankara. Avrupa Domuz Vebası, Doktora 2. semineri, Mayıs 2006, Ankara.
Virusların Doğada Devamlılıkları, Doktora 1. semineri, Aralık 2005, Ankara.
Katıldığı Paneller:
EPIZONE 4. Toplantısı, 7-10 Haziran 2010, St Malo-FRANSA.
TAGEM 2010 Yılı Program Değerlendirme Toplantıları-Hayvan Sağlığı
Program Değerlendirme Toplantısı, 15-19 Mart 2010, Antalya-TÜRKİYE. EPIZONE 1. Toplantısı, 30 Mayıs-1 Haziran 2007, Lublin/Pulawy-POLONYA.
Ulusal Veteriner Hekimliği Öğrencileri Araştırma Kongresi, İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi, 2001, İstanbul-TÜRKİYE.