AILAR VE ÜRETİM TEKNOLOJİLERİeczacilik.anadolu.edu.tr/bolumSayfalari/belgeler/AŞILAR... · 2014-04-09 · Mekanizma • Antijen vücudagirdiğinde,antijen prezente eden hücreler(APC)

Hazırlayan

AŞILAR VE ÜRETİM TEKNOLOJİLERİ

Yard.Doç.Dr.Gülay Büyükköroğlu

AŞILAR

• yaşayan veya ölmüş antijenik organizmaları

• bakteri toksinlerini

• Toksoitleri• bakterilerin ve virüslerin belirli bölgelerinden alınmış antijenik

materyalleri içeren• uygulandıkları organizmada belirli bir enfeksiyon veya

intoksikasyon etkenine karşı özgül ve etkin bağışıklık sağlayan

farmasötik preparatlar

Dünyada,

2 milyon kişi/yıl aşı ile korunurken,

2 milyon kişi/yıl aşı ile korunabilir hastalıklardan ölüyor

AŞILAR

• hastalıktan, hastalığın neden olabileceği komplikasyonlardan korur

• hastalığa neden olan mikroorganizmanın bir kişiden diğerine yayılımını önler

• aşılanmamış bireyleri ve dolayısıyla TÜM TOPLUMU korur

aşılama ile

Çiçek

Difteri

Tetanoz

Sarı humma

Boğmaca

Çocuk felci

Kızamık

Kabakulak

Kızamıkçık

Haemophilus influenzae Tip B’nin neden olduğu hastalıklar

Aşılamanın tarihçesi

• 7. yüzyılda bazı Hintli Budistler yılan zehirini içerek onun etkilerine karşı bağışıklık geliştirmeye çalışmışlardır.

• 10. yüzyıldan 17. yüzyıla kadar Cin’de çiçek hastalığına karşı;

– Çiçek geçiren hastanın toz haline getirilmiş yara kabuklarının buruna tampon şeklinde uygulanması

– Çiçek geçiren hastanın toz haline getirilmiş yara kabuklarının burnuna çekilmesi

– Çiçek geçiren bir hastanın iç çamaşırlarının sağlıklı çocuğa giydirilmesi

– Çiçek geçiren hastanın döküntülerinin içerdiği sıvının sıvandığı bir pamuğun buruna tamponlanması

gibi dört tip aşılama tekniğinin geliştirildiği bilinmektedir.

• 16. yüzyılda Hindistan’da sağlıklı kişilerin kollarında, iğne ile çizmek suretiyleaçılmış küçük kesiklerin üzerine kurumuş çiçek döküntülerinin tatbiki ile çiçekhastalığına karşı bağışıklık sağlama Jenner’in keşfine kadar uygulanmıştır.

20. yy başlarında aşılama

Canlı aşı

Jenner’ın orijinal Çiçek aşısı

Pasteur’ün kuduz aşısı

Ölü aşı

kolera

tifo

veba


Canlı aşı



Ölü aşı

kolera

tifo

veba


Canlı aşı



Ölü aşı

kolera

tifo

veba

AŞI TİPLERİ

• Bakteri aşıları

• Virüs aşıları– Canlı virüs aşıları

– Öldürülmüş virüs aşıları

– Virüs altbirim aşıları

– Viral polipeptidler

• Alt birim aşılar

• Rekombinant aşılar

• DNA aşıları

Bakteri Aşıları

• Canlı veya ölü bakterilerden hazırlananaşılardır

• Öldürme işlemi ısı veya kimyasal maddelerlemuamele sonucu gerçekleştirilmektedir

• Bakteri aşıları arasında ticari olarak mevcutolan tek canlı aşı tüberkülozun önlenmesi içinkullanılan BCG aşısıdır

Virüs Aşılar

• Bazı virüslerin neden olduğu infeksiyonlarınönlenmesinde etkili olan aşılardır

• Canlı virüsler, öldürülmüş virüsler, virüsaltbirimleri veya viral polipeptidlerkullanılabilmektedir

Virüs Aşılar

• Canlı virüs aşıları

• Hastalık yapma etkisi azaltılmış virüslerkullanılmaktadır

• Bu aşılar infeksiyonun doğal seyri sırasında tek dozuygulama ile antikor oluşumunu sağlayabilmekte

• Sitotoksik hücreleri indükleyebilmektedirler

• Yarılanma ömürleri kısadır

Virüs Aşılar

• Öldürülmüş virüs aşıları• Tüm virüsün ısı ya da kimyasal maddelerle inaktivasyonu

yoluyla, hastalık yapma etkisinin giderilmesiyle hazırlanırlar

• Vücuda enjekte edildikleri zaman virüsün yalnız yüzeyantijenlerine karşı antikorlar oluşmasını sağlarlar

• Hücre aracılı yanıtın zayıf olması ve aşırı duyarlılıkoluşturabilmeleri istenmeyen yanlarıdır

Virüs Aşılar

• Virüs altbirim aşıları

• Virüslerden elde edilen saflandırılmışproteinlerdir (viral reseptörler)

• Öldürülmüş aşılar ile aynı özelliklere sahiptirler

• Adeno-virüslere karşı uygundurlar

Virüs Aşılar

• Viral polipeptidler

• Virüs reseptörlerinin polipeptid zincirleridir

• Öldürülmüş aşılar ile aynı özelliklere sahiptirler

• Hepatit B virüsüne karşı kullanılan aşı bugruba örnektir

İmmün Sistem

• İmmünite, Latince “immunis=vergiden muaf” sözcüğündentüretilmiş, konağın hastalıklara karşı muafiyetini, yani direncinibelirtmek için kullanılan sözcüktür

• Çok genel kapsamda immünite (bağışıklık) hastalıktankorunma, özellikle de infeksiyöz hastalıklardan korunmaanlamına gelir

• Bunun için vücudun yabancı etkenlere karşı gösterdiğitepkilerin tümüne kollektif olarak immün yanıt (bağışıklıkyanıtı) denir

İmmün Sistem

Ana işlevi, bizi yabancı ve zararlı maddelerden,mikroorganizmalardan, toksinlerden ve malign hücrelerdenkorumaktır

Dış ve iç ortamlardan kaynaklanan etkenlere karşı yaşayanorganizmaların korunması, immün sistemin ancak devamlı birgelişim halinde olması ile sağlanabilir

Böylece immün sistem, endojen maddelere karşı yıkıcı cevaplarıinaktif hale getirmeyi ve komşu dokularda gelişebilecek hasarlarıöğrenmiştir

Birçok ümmin cevap sınırlı bir süre devam eder ve aşırıreaksiyonların önlenmesi için düzenleyici mekanizmalarla kısıtlanır

İmmün Sistem

İmmün sistemin esas görevi tehlikeli etkileri yararlı olanlardanayırmasıdır

İmmün Sistem

İmmün sistemin esas görevi tehlikeli etkileri yararlı olanlardanayırmasıdır

• İmmün sistemin kendine karşı yıkıcı olaylardan kaçınmasıtolerans olarak adlandırılır

• Primer lenfoid organlarda mevcut oto antijenlere karşıyönlendirilmiş lenfositlerin bir çoğu santral tolerans denilenbir olayla ortadan kaldırılır

• Priferik tolerans ise daha nadir endojen yapılarda veyavücudun belli bölgelerinde gelişen bir diğer mekanizmadır

İmmün Yanıt

– doğal-doğuştan (innate) var olan (Nonspesifikİmmün Sistem) bağışıklık

– geliştirilebilir (adaptif) bağışıklık (Spesifik İmmünSistem)

Doğal (innate) Bağışıklık Sistemi

Organizma bir patojene maruz kaldığındaöncelikle geliştirilen immün sistem kısmınıoluşturabilen hücre grubunun görev aldığısistemidirBunlar;

• Fagositik hücreler (makrofajlar, mast hücreleri)

• T-helper hücreleri

• Natural Killer (NK, katil hücreler) hücreleri


• Doğuştan savunma mekanizmaları etkili patojenden bağımsız olarakgeliştiklerinden nonspesifik olarak tanımlanır

• Spesifik gelişimleri için hiçbir bireysel hücre klonu gerekmediğinden bunlaranonklonal savunma mekanizmaları denir

• İnflamatuar cevap, çözünür ve hücresel komponentlerin kompleks etkileşimi ileolay yerinde savunma güçlerinin konsantrasyonunun artmasını sağlar


• Doğuştan savunma mekanizmaları etkili patojenden bağımsız olarakgeliştiklerinden nonspesifik olarak tanımlanır

• Spesifik gelişimleri için hiçbir bireysel hücre klonu gerekmediğinden bunlaranonklonal savunma mekanizmaları denir

• İnflamatuar cevap, çözünür ve hücresel komponentlerin kompleks etkileşimi ileolay yerinde savunma güçlerinin konsantrasyonunun artmasını sağlar– Bu olaydaki ilk basamak kan damarlarının dilatasyonunu sağlayarak kapiller geçirgenliğini arttıran

mediatör salınımıdır

• İnfeksiyon bölgesi daha sonra granülositler tarafından infiltre edilir ve reaksiyonunileri aşamasında ise makrofajlar granülositlerin yerini alır

• Granülositler patojenlerin çoğunun ortadan kaldırıldığı ‘ilk savunma basamağını’oluştururlar

• Geri kalan patojenler ile ilk savunma basamağının artıkları makrofajlarca fagositeedilir

Geliştirilebilir (adaptif) Bağışıklık Sistemi

• Daha özel ve etkili immün yanıt oluşturmaküzere geliştirilen bağışıklıktır

• Doğal bağışıklık sisteminin geliştirilmiş şekliolup sadece omurgalılarda mevcuttur

• B ve T lenfositleri en önemli hücreleridir

• Hücresel ve Humoral bağışıklık olmak üzereiki şekilde gelişir

Geliştirilebilir (adaptif) Bağışıklık Sistemi

• Spesifik bir stokin ortamında, vücut daha humoral ya da dahahücresel bir savunma çizgisine doğru ilerleyeceğine karar verir

• Antijen prezente eden hücrelerin (APC) lenfoid organlara göçüsistemik immün cavabın ilk tetikleyicisidir sonrasında bellekcevabı oluşur

• Bu hücre sistemleri antijenlere karşı ileri derecede spesifikreaksiyonlar meydana getirerek klonal genişleme ile adı geçenantijenlere çok etkin bir cevap ve bellek oluştururlar

Hücresel bağışıklık

• T lenfosit hücrelerinin bakterileri önceduyarlılıkla tespit etmeleri ve sonrasındafagosite etmeleriyle yok edilmesine dayalıhücresel bağışıklıktır

Humoral bağışıklık

B lenfosit hücrelerinin sentezledikleri antikorlar aracılığı ile patojenleri,bakterileri yok eden salgısal bağışıklık olarak da tanımlanan sistemdir

• Fagositik makrofajlar ve dentritik hücreler gibi antijen prezenteeden hücreler (APC)

• T helper hücreleri

• B lenfosit hücreleri

• Plazma hücreleri

• MHC II (major histocompatibility complex) gibi hücre grupları

• Sitokinler, immünoglobünler gibi moleküller görev almaktadır

Mekanizma

• Antijen vücuda girdiğinde, antijen prezente eden hücreler (APC) tarafındantanınır ve taşıdıkları MHC class II aracılığı ile T helper lenfosit hücrelerlekonjuge olmasını sağlar

• Buna bağlı olarak T helper lenfositler aktive olurlar ve bu hücrelerdensitokinler salınmaya başlar

• Sitokinler ile B lenfosit hücrelerinin uyarılması sonucu B lenfositler antijenspesifik plazma hücrelerine dönüşürler ve matür hücrelerdenimmunoglobünlerin (Ig) salınması gerçekleşir

• Böylece antijenler, üretilen bu Ig’ler yani antikorlar tarafından sarılarakinaktive edilip parçalanarak yok edilir

Mekanizma

• Kazanılmış immün yanıtta antijeni tanımada antikorlar engeniş çeşitlilikte antijenik yapıyı tanıyabilen, farklı antijenikyapıları ayırt edebilen ve antijenlere güçlü bağlanabilen tekmoleküldür

• Antikorlar, salgısal immün yanıtın en etkili kolunu oluşturur

• İmmün sistem çok sayıda farklı özgüllükte antikor üretebilir

• İnsanda immün sistem 108’den fazla antijene özgül çeşitlilikteantikor üretebilir

• Bu antikorlar yapı olarak birbirlerine yakın yapısal özellikgösterirler

Antikor nedir?

• Yabancı ve enfeksiyon etmeni ajanlara bağlanıp onları yok etmek için , vücuttaki B-lenfositleri tarafından üretilen protein yapıda moleküllerdir.

• Organizmalarda yabancı maddelere (antijenlere) karşı gelişen tepkinin en önemli unsuru antikorlardır.

Antikor nerede üretilir?

• B hücreleri ; kemik iliğinde “Bone marrow” oluşurlar.

• Her bir B hücresinin membranında antijen bağlayan reseptör (Antikor) bulunur.

• Antikorlar, özdeş yapıda 2 hafif, 2 ağır polipeptidzincirinden oluşan proteinlerdir.

• Her bir ağır zincir hafif zincire ve diğer ağır zincire disülfit bağlarıyla bağlıdır.

Antikorun yapısı:

• Antikor (Immunoglobulin) 2 hafif, 2 ağır zincir olmak üzere 4 altbirimden olusanproteindir.• Hem hafif, hem de ağır zincir

bir adet C (sabit) “Constant”, bir adet V (degisken)“Variable” altbirim içerir.• V altbirimi antijenin

tanınmasından sorumludur.• Bütün bir Ig geni, V ve C gen

parçalarının somatik rekombinasyonla birarayagelmesiyle olusur.

Antikorun yapısı:

• Kol uzantılarında bulunan FAb(Antijen Bağlayıcı Bölge) ile antijenlere bağlanırlar. • “Y” şeklindeki molekülün

boyun kısmında bulunan Fcalmaç bölgesiyse, immünsistemin hücreleriyle etkileşir. • Fab bölgesiyle bakteriye

bağlanan antikor, Fcbölgesiyle mikrop yok edici hücreleri kendilerine çekerek, bakterinin parçalanmasını sağlar.

1) Her bir antikorun sadece tek bir antijene bağlanma özgüllüğü göstermesi

2) Bazı antijenlerin bağışıklık sistemini bir kez uyarmaları sonrasında o hastalık için ömür boyu dayanıklılık sağlaması (Örneğin; kızamık ve suçiçeği gibi çocuk hastalıklarına karşı vücudun ürettiği antikorlar, hayat boyu bu hastalıklara karşı vücutta direnç oluşmasını sağlar).

• Antijen-antikor reaksiyonu bağışıklık sağlayıcı birçok yöntemin geliştirilmesine yol açmış durumdadır.

• Bunlardan en yoğun kullanılan ve güncel olanıELISA.

• ELISA (Enzyme Linked Immuno Assay = enzime bağlı bağışıklık test) iki değişik antikorun kullanıldığı ve araştırılan antijenin varlığını renk değişimiyle gösteren bir test yöntemidir.

• Bir antijen (bakteri, virüs, hücre veya molekül) “epitop” adı verilen birçok antijenik bölge içerir.

• Her epitop ayrı bir antikor tipi tarafından tanınır. Bir antijen organizmaya girdiğinde her epitop için bir grup B-lenfosit hücresi özgül antikor üretmeye ve bölünerek çoğalmaya başlarlar. Böylece her epitop için özgül antikor üreten bir B-lenfosit kolonisi oluşur. Bir antijene karşı değişik B-lenfosit kolonileri oluştuğu için elde edilen antikora “poliklonal” (çok kolonili) antikor adı verilir.

• Monoklonal antikorlar(mAb):Tek bir B-lenfosit hücresi tarafından üretilen antikorlardır.

mAb tarihçe:

• 1975 yılında Cambridge Üniversitesi’nden G. Köhler ve C. Milstein’ın geliştirdikleri yeni bir teknik, bir tek epitopa özgü (monoklonal) antikorların bolmiktarlarda elde edilebilmelerine olanak sağlamıştır.

• Bu tekniğe hibridoma teknolojisi adı verilmiştir.

• Bu buluşlarıyla 1984 yılında Fizyoloji-Tıp Nobel Ödülüne layık görülmüşlerdir.

Georges J.F. Köhler

César Milstein

Hibridoma teknolojisinin temelinde

üç bilgi bulunur:

1- B-lenfositler tek bir epitopa özgü antikor üretip

salgılayan, yaşam süreleri birkaç günle sınırlı kan hücreleridir.

2- Tümör hücreleri bölünerek çoğalma kontrolünü kaybetmiş, hızla üreyen ölümsüz hücrelerdir.

3- Belli koşullarda aynı organizmaya ait değişik hücreler birleştirilerek her iki hücrenin özelliklerini taşıyabilen melez hücreler (hibridoma) elde edilebilir.

Hibridoma Tekniği:

• Monoklonal antikor elde etmek için kullanılan melezleme tekniği, yararlı özelliklere sahip iki hücrenin birleştirilmesi ile gerçekleşir.

• Hücre kültüründe hızla çoğalabilen, ölümsüzlük özelliği kazanmış myeloma (kanser) hücreleri ile aktif olarak istediğimiz antikoru üreten bağışık bir hayvanın dalak lenfositleri birleştirilir.

• Sonuçta, kompleks bir antijenin tek bir belirleyici grubuna (epitop) karşı monoklonal antikor üretenölümsüz hibrit hücreler elde edilir.

1- Fare, antijene karsı antikor üretiminiortaya çıkarmak için ilgili antijen ile immünize edilir,

2a- Dalaktan, antikor üreten B lenfosithücreleri izole edilir,2b-İnsan kemik iligi kanser hücresi olan

myeloma hücreleri toplanır,3-Hibridoma oluşturmak için PEG aracılığı ile

hücreler birleştirilir. Birleşmeyen hücreler ölür,

4- Hibridomalar kültür plaklarında bölünmek üzere bırakılırlar,

5-Antikor sentezleyen klonlar ELISA yöntemi ile belirlenir,

6-Hibridomalar invitro (hücre kültürü) veya invivo (farede acid fluid oluşumu) koşullarda geniş ölçekte üretilir,

7-Fare asid sıvıdan veya kültür üstsıvılarından antikorların saflaştırılması.

1.HGPRT( hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase )(büyüme için seçici HAT besiyerineihtiyaç duyar) enziminden yoksun ölümsüz miyeloma hücreleri ile antijen X ile immünize edilen bir hayvandan alınan, antikor üreten normal dalak hücreleri ile birleştirilir. Dalak hücreleri HGPRT üretebilir.

2.HAT besiyeri üzerine yayıldığında; birleşmemiş hücreler , aynı zamanda HGPRT bağımlı metabolikyolla pürinleri yapamadıkları için mutant myelomahücreleri ve kültürde sınırlı yaşam süreleri olduğu için dalak hücreleri büyümez.Dolayısıyla sadece birleşmiş hücreler HAT besiyeri üzerinde büyür ;hibridoma denen klonları oluşturur.Her hibridomatek tip antikor üretir.

3. Her bir klon test edilir , X antijenini tanıyanları tanımlamak için.İstenen antikoru üreten hibridomatanımlandıktan sonra , bu klon ,büyük miktarlarda antikor eldesi için kültüre edilir.

• Ancak bu özel hibridomalar, insan bağışıklık sistemi tarafından “yabancı” (antijen) olarak algılanan fare kökenli antikorların oluşumuna neden olurlar.

• Fare antikoru aşılanan hastalarda genellikle, eklem bölgelerinde şişlik ve kızarıklıklarla kendini gösteren HAMA cevabı (insanda anti-fare antikorlarınınoluşumu) görülür.

• Böbrek yetmezliğine de neden olan HAMA,yaşamsal tehlike oluşturmasının yanısıra, verilen antikorların vücut tarafından yok edilmesine de yol açar.

• Bu nedenle, hem HAMA cevabının oluşmasını hem de fare antikorlarının bağışıklık sistemi tarafından vakitsiz bir şekilde etkisizleştirilmesini önlemek amacıyla, fare antikorlarının “insanlaştırılması” için çeşitli teknikler geliştirilmiş bulunuyor.

• Fare monoklonal antikorlarının insanlaştırılması ve tamamen insansı olan monoklonal antikorların geliştirilmesi, immün cevap oluşturmamaları nedeniyle önemlidir.

• Bu nedenle ticari firmaların neredeyse tamamınca üretilen antikorların insanlaştırılması ya da tamamen insansı hale getirilmesi üzerinde yoğunlaşılmaktadır.

Günümüzde oluşturulabilen antikor tipleri:

• Murine(mouse) mAb: Tamamıyla fareden üretilen antikorlar (℅ 100 fare proteini).

• Kimerik mAb:Değişken bölümleri fare kaynağından , sabit bölümleri insan kaynağından oluşturulan antikorlar (℅ 33 fare proteini)

• Humanized mAb: Sadece antijen-bağlayıcı bölgesi ( ayrıca ‘CDR’=‘complementarity-determining regions’ olarak da isimlendirilir) fareden ,geri kalan değişken ve sabit bölgeleri insan kaynağından oluşturulan antikorlar (℅ 5-10 fare proteini).

• Human mAb: Tamamıyla insan kaynağından gelen antikorlar(℅ 100 insan proteini).

MONOKLONAL ANTİKORLARIN KULLANIM

ALANLARI:1. Hastalıkların teşhisinde,

2.Hastalıkların tedavisinde,

3. Hastalıklardan korunmada (pasif bağışıklık),

4. Antijenlerin saflaştırılmasında,

5. Tanı kitlerinin hazırlanmasında,

6. Araştırma ve teşhis çalışmalarında,

7. Tümörle ilgili çalışmalarda,

8. Aşı suşlarının hazırlanmasında.

Farmasötik Yaklaşım

• Üretim• Sentetik aşılar haricindeki diğer aşılar mikroorganizmalar ya da

hayvan hücreleri türevleridir

• İstenilen aşı bileşenlerinin ekspresyonu için bu mikro organizmalar veya hayvan hücreleri genetik olarak modifiyeedilir

• Hayvan hücreleri virüslerin üretilmesi ve bazı alt birim aşıların bileşenlerinin üretilmesi için kullanılır

• Kültür ortamına aşı bileşenlerinin salınmasını da mümkün kılar

Hücre kaynaklı aşıların üretilmesinde üç

aşama vardır

• Kültür hazırlama (Cultivation=Yetiştirme)

• Downstream processing (sonraki işlem)

• Formülasyon

Cultivation

• Ekilecek suşun seçimi aşı üretiminde en önemli aşamadır

• Cultivasyon süresince antijeni sentezleyecek özelliklerini kaybetmemeleri gerekmektedir (Genetik kararlılık)

• Ekilen suşların üretimleri ve kontrolleri GMP koşullarına uymalıdır

• Bakteri ve mayaların cultivasyonu fermantörler ve bioreaktörlerle kolaylıkla sağlanabilmektedir

• Hayvan hücrelerinin cultivasyonu oldukça komplikedir

– Oksijenkonsatrasyonu ve sürtünme gibi çevresel faktörlere hassastırlar

– Kültür ortamının bileşenleri gelişimlerinde etkendir

• Her iki suş için medium komposizyonu, pH ve çözünmüş oksijen gibi cultivasyon koşulları ve hasat zamanı iyi belirlenmelidir

• Cultivasyon için seçilen koşullar Büyük ölçekte cultivasyon sonrasında aşı bileşenlerini etkilememelidir

Airlift Bioreactor

Stirred-tank bioreactor3

Stirred-tank bioreactor

• Cultivasyondan sonra aşı bileşenleri bakteri, maya veya hayvan hücrelerinden vediğer istenmeyen hücre bileşenleri veya ürünleri (proteinler gibi)nden ayrılmalıdır

• Uygulanacak olan downstream prosesi için

– hücre tipi

– Aşı bileşeninin lokalizasyonu( hücre içinde ya da salınmış olması)

– Aşı komponentinin fizikokimyasal özellikleri önemlidir

• Eğer aşı bileşeni mikroorganizmaya ya da hücreye bağlı ise; mikroorganizma vehücre toplanmalıdır

• Eğer aşı bileşeni salgılanıyor ise; hücre içermeyen sıvı toplanmalıdır

• Her iki ürün için de filtrasyon ve santrifügasyon yöntemleri sıklıklakullanılmaktadır

Hücre bağlantılı aşı bileşenlerinin eldesi için

• Hücre fiziksel, kimyasal ve enzimatik yöntemlerle ekstakte edilir

• Hücresel artıklar santrifügasyon ya da filtrasyon yöntemi ile ayrıştırılır

Hücreden bağımsız bileşenler için

• Kolon kromotografisi

• Organik solventle ekstraksiyon

• Çöktürme

• İnaktivasyon aşaması uygulanır

Bu aşamalardan sonra elde edilen bulk materyal saflaştırılır ve formülasyon için hazırdır

• Modern aşı üretiminde tutarlılık en büyük önemi taşımaktadır

• Her lot’da ürün kalitesi aynı olmaya zorlanmalıdır

• GMP kuralları çok sıkı uygulanmalı ve her üretim safhası Valide edilmelidir

– İyi yazılmış standart prosedürler olmalı

– Her üretimde ürünün verilerini içeren geniş bilgiler olmalı

– Her üretilen ürün bir önceki ürün ile karşılaştırılmalı

Aşı Formülasyonu

• Aşı Formülasyonu;

• Çözücü bileşenleri, Tuzlar, koruyucular ve stabilizanları içermelidir

• Bu bileşenler aşı komponenti ile olumsuz etkileşim göstermemelidir

• Saklama koşullarını etkilememeli ve uygulamada sorun oluşturmamalıdırlar

• Koruyucular; Tımerosal, Fenoksietanol, Fenol, Antibiyotikleri içerir

SEMPLE TİPİ AŞILAR (KUDUZ Aşısı)

İnsanlara uygulama için beyin dokusu aşılarının üretiminde genellikle tavşanlarkullanılmaktadır. Bunula birlikte koyun ve keçilerde tercih edilebilmektedir. Butip aşılar fenol ile inaktive ve fosfat tamponunda süspanse edilerek hazırlananaşıdır

Aşı formülü

• Bu tip virüs aşılarının insanlara uygulamalarında tavşan, koyun ve keçi gibihayvanların beyinleri kuduz virusü ile infekte edilir

• İnfekte beyin dokularınden elde edilen virüsler fosfat tamponunda fikslenirve bu şekilde oluşturulan 2 mL süspansiyonda inaktive kuduz virüsü %5’denaz olmamalıdır


Kaynak Virüslerin HazırlanmasıVirüs Suşu• Üretimde kullanılan suş yüksek antijeniteye sahip diğer virüslerden elde edilen suşlardır.

Elde edilen suş PV suşu (Pasteur Vaccine) olarak adlandırılırVirüs suşunun korunması• Aşı üretimi için kullanılan kaynak virüsler tavşan beyni aracılığıyla pasajlanır• Steril su içerisindeki %10’luk infekte tavşan beyni süspansiyonunun 0.25 mL’lik miktarının

tavşan beynine intraserebral injeksiyonundan sonra 5-7 gün içinde tavşanlarda felçmeydana gelmektedir

• Bu beyinlerden elde edilen beyin dokularının %10’luk süspansiyonları ampul ya da ağzı sıkıkapalı camlarda -70°C’lik kuru buzlu ortamda ya da en az -15°C’lik ortamlarda saklanmasıuygundur

• Virüs suşunun özgüllüğü periyodik olarak farelerde sokak virüsüne (Street virüs;doğal yollainfekte edilmiş hayvanlardan elde edilen virüs) karşı koruyuculuğu kanıtlanan anti-kuduzhiperimmün serumu ile titrasyon yapılarak test edilir.


%10’luk kaynak virüsünün üretimi

• İntraserebral olarak kuduz virüsü tavşan beynine inoküle edilir ve enfekte edilen tavşanlar ölmeden önce tamamiyle felç durumundayken beyinleri alınır

• Çıkarılan beyinler steril distile su içerisinde hemen dondurulur ve çalışma anına kadar kuru buzda saklanır

• Beyinler süspansiyon hale getirilmeden


İnokulasyon ve Harvest

İnokulumun hazırlanması ve inokulasyontekniği

• Kaynak virüs ün %10’luksüspansiyonunun 10-1 dilüsyon olduğudüşünülmektedir ve bu süspansiyondandistile su ve %2’lik at serumu içindetekrar dilüsyon yapılarak bir virüssüspansiyonu hazırlanır


Farelerin öldürülmesi

• Nefes almaya devam eden fakat tamamiyle felç durumundaki tavşanların göz damarına20mL intravenöz hava enjeksiyonu yapılır

• Ölüm 1-2 dk içerisinde gerçekleşir. Yeni öldürülmüş tavşan beyinleri aşı üretimi içinkullanılmaktadır

• Kuduz hastalığından ya da başka nedenlerle ölmüş hayvanlar kesinlikle kullanılmaz.

Otopsi

• Uygun olmayan tavşanların kullanımını önlemek için beynin çıkarılmasını takibenhayvanlara otopsi yapılır

• Bütün otopsi bilgileri kayıt altında tutulmalıdır

• Vücudun herhangi bir yerinde koksidiyoz (kanlı ishal) belirtileri gösteren tavşanlar,koksidiyozun kuduz hastalığından daha fazla felç etkisi gösterebilmesinden dolayıkullanılmamalıdır


Beyin harvesti

• Tavşanlar %5’lik fenol ya da uygun bir antiseptik solüsyon ile yıkanmalıdır

• Dekapitasyon (başını kesme) mümkün olduğunca omuzlara yakın yapılmalıdır

• Uygun bir tutucuyla bağlı kesilen baş etanollü iyot ile temizlenmeli ve beynin çıkartılmasıiçin steril odaya götürülmelidir

• Kafa derisi ve kafatası dikkatlice temizlendikten sonra çıkrılan beyinden alınan küçük birparçada bakteriel sterilite için test edilir. Testin pozitif çıkması halinde beyin kullaılmaz

• Eğer çıkarılan beyin uygun ise hemen -15°C’nin altında kullanılıncaya kadar saklanır


%40’lık aşı süspansiyonu üretimi

Emülsifikasyon

• Dondurulmuş beyinler tartılır ve içinde yeterli miktarda fenol bulunan 2 litrelik fosfat tamponu içerisine yerleştirilir

• Çözünen beyinler daha sonra uygun cihazlarla emülsifiye edilir.

• Emülsifikasyon sırasında aşırı ısınmayı önlemek için buzlu ortam kullanılır

Dilüsyon

• Fosfat tamponu; 0.5M sodyum dihidrojen fosfat, 0.5 M potasyum dihidrojen fosfat ve %0.85 sodyum klorür içerir, pH:7 ye ayarlanır.

• %40’lık doku süspansiyonda %0.5’lik fenol bulunmaktadır. Beynin ağırlığı önemlidir.

• Fenol içeren süspansiyon fenolün antijeniteye hasar vermesi sebebi ile dondurulmaması gerekmektedir


İnkübasyondan önce beyin dokusundan virüs titrasyonu

• %40’lık doku süspansiyonu tartılır ve 10-6,10-7 ve 10-8’e dilüe edilerek 11-15 gramlıkfarelerde intra serebral olarak enjekte edilerek titrasyon yapılır. Titre (LD50) en az 10-6

olmalıdır.

İnkübasyon

• %0.5 fenol içeren emülsifiye aşı 1 saat 20°-30°C’lik su banyosunda 1 saat bekletilir vedaha sonra 20°-30°C’lik inkübatörde mekanik olarak karıştırılarak inaktive olana kadarbekletilir

• İnaktivasyon için gerekli inkübasyon süresi beyin dokusunun emülsifikasyon metoduna(parçacık büyüklüğü) ve virüs suşlarının çeşitliliğine göre değişmektedir

• Süre laboratuvar deneyimlerine göre belirlenebilir


Aşı süspansiyonunda sterilite tayini

• Aşı kütlesinde sterilite testi sıvı tiyoglikolat besiyerinde yapılmaktadır

• Her bir kaptan en az 10mL örneklem alınarak yapılır

• Örnekler besiyeri ile daha düşük dilüsyonlara ayrılır ve 30°-32°C’de en az 7gün inkübe edilir

• İnkübasyona süresinde herhangi bir üreme olup olmadığı değerlendirilir

• İnkübasyona süresi sonunda bütün kaplar hafifçe çalkalandıktan sonra herbir kaptan 1 mL örnek alınarak yeni steril bir test besiyerine aktarılır ve 7gün daha inkübasyona bırakılır kontaminasyon görülen aşı örnekleriyeniden teste maruz bırakılır.


Aşı süspansiyonunda zararsızlık testi

• Zararsızlık testi aşı süspansiyonu içinde canlı virüs olup olmadığını kontroletmek için hem tavşanlarda hem de farelerde uygulanır

• Eğer aşı üretimi başka hayvanlarda yapılmış ise test içinde bu hayvanlar vefareler kullanılmalıdır

• Test için en az iki tür hayvan kullanılmalıdır

• Bu test için aşı süspansiyonu bulunan her kaptan bir örneklem yapabilecekkadar örnek alınır

• Test uygulamasında en az %5 beyin örneği içerecek şekilde tavşanlarda0.25mL, 18-20g ağırlığındaki farelere ise 0.03 mL örnek intraserebralolarak enjekte edilir

• En az 14 gün boyunca tavşan ya da çalışılan diğer hayvanlarda santral sinirsistemi ya da diğer semptomlar açısından izlenir


Aşının son haliAşı süspansiyonun uygulanan tüm testler uygun çıkması halinde aşılar son dolum kaplarına aktarılırve etiketlenir. Daha sonra diğer testler için örneklem alınabilir. Bu testler;

Analitik testler; toplam katı, fenol konsantrasyonu, pH ve tiomersal ya da diğer koruyucukonsantrasyonları incelenir

Genel güvenlik testi; yanlışlıkla eklenen herhangi bir toksik maddenin belirlenmesi için dilüeedilmemiş kaplardan rastgele seçim yapılır. Yaklaşık 20g ağırlığındaki farelere 0.5mL ya da 350gağırlığındaki kobaylara parenteral enjeksiyon sonunda belirgin herhangi bir işaret ya da ölümgöstermemelidir. Testin uygulamasında en az iki hayvan türü seçilmeli ve uygulama süresi en az 7gün olmalıdır.

Sterilite testi; sterilite testi için tüm kaplardan örneklemi sağlayabilecek en az 20 adet örnekseçilmelidir. Eğer kaplarda 1 mL ya da daha az örnek var ise tüm kap test için kullanılmalıdır. Dahafazla örnek var ise test edilecek miktar ya en büyük tez doz ya da 1mL olmalıdır. Aşısüspansiyonunda Sterilite testi konusunda anlatılan sıvı tiyoglikolat besiyerine ek olarakSabouraud’s besiuyeri küf kontaminasyonunun belirlenmesi için eklenmelidir. Bu test içinuygulama sıcaklığı 20°-25°C’de 10-21 gün arasında yapılmalıdır.


Tarihlendirme

• Son kullanım tarihi yayın tarihi ya da üretim tarihinden sonra 6ayı geçmemelidir

• Üretim tarihi en son etkinlik testinden de geçildiği gündür

• Yayın tarihi üretim tarihinden sonra 3 aylık dönem olabilir ve buzaman sürecinde aşılar 2-5°C’de üretici tarafından saklanır

• Fenollü kuduz aşılarının dondurulması etkinliği bozacağındanaşılar 2-5°C’de saklanmalıdır

FERMİ-TİP AŞI

Fermi tip aşının avantajı hazırlama kolaylığıdır. Tam bir etkinlik testininyapılamayacağı zamanlarda kalıntı virülansın titresinden etkinlik kabacadeğerlendirilebildiği için hızlıca üretilebilmektedir. Bununla birlikte bazılaboratuvarlar inaktive edilmiş aşı üretiminde değişiklik yapmışlardır. ÖrneğinParis’teki Pasteur Enstitüsü Fermi-Tip aşının üretimini 1967’den sonratamamen bırakmıştır. Fakat Etiyopya’da bu aşının üretimi hala devametmektedir. Ve şu an da dondurularak kurutulmuş β-propiyolaktonla inaktiveedilmiş yüksek etkinliğe sahip, daha uzun saklanabilen ve tropik ülkelerdekiyüksek ısıya dayanıklı aşılar üretilmektedir.

FERMİ-TİP AŞI

Aşı formülü

• Bu aşılar, kuduz virüsü ile karıştırılarak koyun ya da keçi beyinineinokulasyonu sonucu elde edilen %5’lik beyin dokusu süspansiyonlarıdır

• Bu süspansiyonlar başlangıçta %1’lik daha sonra final konsantrasyonu %0.5olacak şekilde fenol ile muamele edilmiştir

• Fermi-tip aşılar inaktive aşılar olarak sınıflandırılmakla birlikte inaktivevirüsün yanında aktif virüs de belirgin miktarlarda bulunmaktadır

• Böylece atenüe-inaktive bir aşı modeli ortaya çıkmaktadır

Aşı üretimi

• Bu tip aşıların üretimi aynı semple tip aşı gibi belirli miktarlarda kuduzvirüsünün koyun ya da keçi beynine inokulasyonundan sonra beyninçıkartılması ve sterilite ve infektivite testlerinin yapımını içermektedir

FERMİ-TİP AŞI

İnaktivasyon

• Fosfat tamponu içindeki %10’luk beyin dokusu ve %1’lik fenolün homojen karışımı 22°C’lik etüvde 24 saat karıştırılır

• İnaktivasyon 22°C’nin altında gerçekleşmez. 24 saat sonunda inaktive olan aşı 4 gün boyunca 4°C’de saklanır ve daha sonra %5 beyin dokusu ve %0.5 fenol olacak şekilde dilüsyon yapılır.

• Aşıların kaplara doldurulma aşamasında süspansiyonlar sürekli çalkalanır

FERMİ-TİP AŞI

Hazırlanan aşılarda yapılan testler• Hazırlanan aşılardaki virülans kalıntısı farelerde test edilmelidir• Bu test fenol eklenmesinden sonra 9 gün boyunca yapılmalıdır• Acil durumlarda bu süre kısaltılabilir fakat iki günden az olmamalıdır• Test edilecek aşı örneği düşük hızda santrifüj uygulanır ve süpernanat 10-

1, 10-2 ve 10-3 olacak şekilde serum fizyolojik ile dilüe edilir• Her bir dilüsyon en az 5 fareden oluşan bir gruba intraserebral olarak

verildikten sonra 15 gün boyunca hayvanlar felç gibi semptomlar ya daölüm açısından izlenir

• Sterilite, etkinlik ve analitik testlerde yine semple tipi aşılardaki gibiuygulanır.

Tarihlendirme• Son kullanım tarihi yayın tarihinden itibarinden 5 aydır ve bu süre

zarfında aşılar 2-5°C’de saklanmalıdır• Daha düşük ısılarda saklamak tavsiye edilmez. İklim şartlarına göre son

kullanım tarihi 2-3 aya kadar düşebilmektedir.

FENOLLÜ, DONDURULARAK KURUTULMUŞ

KOYUN BEYNİ AŞILARI

• A. Rusya’da kullanılan Metot

Aşı içeriği

• Aşılar kuduz virüsü ile karıştırılmış %5 beyin dokusu, en fazla %0.25 fenol ve %3.75 sukroziçeren dondurularak kurutulmuş maddelerdir.

Kaynak virüs üretimi

• Bu virüs Pastör suşundan orijin alan bir kuduz virüsüdür

• Virüs tavşan beyninde üretildikten sonra hemen çıkarılır ve beyin porsiyonlar halinde%50’lik gliserolde +4°C’de ya da saf gliserolde -40°C’de saklanmalıdır

• Koyunlar infekte edilmeden önce tavşan beyin dokuları gliserolün uzaklaştırılması için etsulu-pepton besiyerinde ya da pH 7.2’lik distile su ile yıkanır

• Dokular daha sonra homojen olarak parçalanır ve 10-2’lik dilüsyonlar hazırlanır

• Sterilite testleri uygulanır



Koyunların Hazırlanması ve İnfeksiyonu

• Aşı üretimi için sağlıklı 4-12 aylık koyunlar kullanılmaktadır

• Koyunlar infeksiyonun olmadığı kanıtlanmış bölgelerden seçilir ve çalışmaya başlamadanönce 30 gün karantinada bekletilir

• Uygun koyunların kafatasında küçük bir delik açılarak buradan kuduz virüsü enjeksiyonuyapılır

• Enjeksiyonu takiben 80-144 saat içerisinde kuduz virüsünün klinik göstergeleribaşlamaktadır

• Bundan sonra koyun boynu kırılarak öldürülür derisi ve kasları ayrıldıktan sonra %5’likfenolle muamele edilir

• Serebrospinal kanal steril bir pamuk vasıtasıyla kapatılır ve steril kaplara aktarılır

• Patalojik incelemeler yapılır



Beynin Çıkarılması

• Normal olarak koyunun kesilmesinden hemen sonra aşıların hazırlanması gerekmektedir

• Eğer hemen hazırlanamayacaksa en fazla 12 saat 2-4°c’de bekletilebilir

• Kafatası açıldıktan sonra alkol ile muamele edilir ve küçük parçalara ayrılır, kaplarakoyularak tartılır

• Beyinden alınan küçük parçalarda sterilite testi de yapılır.

Aşının Hazırlanması

• Beyin dokusu parçaları sterilize edilmiş parçalayıcı bir cihaza alınarak %1’lik tuz, fenol içerendistile su içerisinde 10-12 dk kadar parçalanır

• Parçalanan süspansiyon filtrasyona tabi tutulur. %1 fenol içeren %20’lik aşı süspansiyonugünde 2-3 kez çalkalamak şartıyla 14 gün boyunca 22°C’de inkübasyona bıralıkarakinaktivasyon sağlanır

• Süspansiyona %15’lik sükroz eklenir. Oluşan yeni süspansiyon ampüllere aktarılır dahasonra dondurularak kurutulur



Hazırlanan Aşılarda Yapılan Testler

• Fiziksek özelliklerin belirlenmesi (görünüş ve çözünebilirlik) (aşılar 1-2 dakika içindeçözünmelidir)

• Sterilite testi (her bir partiden 10 ampülde yapılmalıdır)

• Rekonstitüsyon (sulandırma) sıvısında sterilite testi

• Yeniden sulandırılan sıvıda ve santrifüj sonrasında süpernanat ve pellette bakteriyelkontaminasyon testi

Farelerde güvenlik testi; %5’lik aşıdan 5.5 mL subkutan enjeksiyon sonunda farelerde 5 gündeölüm ya da herhangi bir infiltrasyon gözlenmemelidir.

Virülans kalıntısı testi: ampül içerisindeki kuru aşı üzerine 1.5mL su eklendikten sonra santrifüjyapılır. Süpernatant sıvısı dilüsyonlara ayrıldıktan sonra 6 fareye intraserebral olarak verilir. 14gün boyunca fareler gözlemlenir.

• Etkinlik testi

• Nem içeriğinin tayin edilmesi

Tarihlendirme

• Son kullanma tarihi etkinlik testinden sonra 2 yıldır



B. Patör enstitüsünde kullanılan methot

• Bu aşılar kararlı virüs suşuyla infekte edilen çok genç koyunlarınbeyinlerinden hazırlanmaktadır

• Kararlı virüs β-propiyolakton ile inaktive edilir

• Tüm çalışmalar antiseptik koşullarda mümkünse kapalıortamlarda yapılmalıdır

• β-propiyolakton kullanılan dozda bakterisidal özelliktedir amabunun yeterli olmadığı durumlarda gerekli antimikrobiyallerdekullanılabilir



Kararlı Virüs suşunun üretimi

• Genç koyunlara inoküle edilecek virüs suşunun yüksek antijeniteye sahipolmalı ve periyodik kontroller yapılmalıdır

• Ya orijinal Patör suşu ya da ondan türeyen suşlar kullanılmalıdır

• Pastör enstitüsünde kullanılan suş liyofilize VP11 ( Pastör virüs no:11) ‘dir

• Her yıl yaklaşık 2 kg ağırlığındaki bir miktar tavşan bu suş ile intraserebralolarak inoküle edilmektedi

• İnfekte olan ve paraliz halindeki hayvanlar hemen çalışmaya alınmaktadır

• %2 at serumu içeren distile su içerisinde dilüe edildikten sonra ampüliçerisine doldurulur ve -20°C’de saklanır.


KOYUN BEYNİ AŞILARIKuduz koyun beyninin hazırlanması• Çalışma için genellikle 1-2 aylık koyunlar kullanılmaktadır. Çalışma anına kadar koyunlar

uzman bir veteriner gözetiminde karantinada tutulur• İnokülasyondan iki gün önce uygulama yapılacak yer türlerden temizlenir ve belli aralarla

tentürdiyot ile silinir• 10-1 dilüsyonluk inokülasyon sıvısı çözündürüldükten hemen sonra bekletilmeden ön lobun

sol tarafında dikkatice açılan delikten 0.5mL olarak enjekte edilir• Koyunlar özel izolasyon odalarına götürülür. İnokülasyonu takiben 5 gün sonra hayvanlarda

denge problemlerinin ilk izleri görünmeye başlar• 6. Günde paraliz görüldükten sonra koyunun başı kesilir. Tüm kanın akıtılmasından sonra

derisi soyulur ve alevde dış taraftaki etlerinin yakma işlemi gerçekleştirilir.• Dikkatice beyin çıkartıldıktan sonra steril bir kaba koyulur ve -25°C’de saklanır.• Beyinden küçük parçalar alınarak virüs titresi ölçümü ve sterilite testleri yapılır• Sterilite testi aerobik ve anaerobik organizmaların tesbiti için Bonnel&Raby besiyerinde

yapılır• Virüs titrasyonu ölçümü ise 14-16g ağırlığındaki beyaz farelere intraserebral inokulasyonu ile

yapılır. Titre yaklaşık 0.03 mL için LD50 10-5.5 olmalıdır. Steril ve uygun titeye sahip beyinörnekleri 1 yıla kadar -25°C’de saklanır


KOYUN BEYNİ AŞILARIAşı hazırlanması

Aşı hazırlanmasında aşağıda içeriği belirtilen tampon kullanılmaktadır.Sodyum klorit 5.85g

Sodyum dihidrojen fosfat dihitrat 6.24g

Sodyum hidroksit 1.62g

Distile su km 1000mL

• Tampon pH’sı 7.2 olmalıdır. Liyofilize tozlar bu tampon ile yeniden sulandırılmadan öncetampona 75 g sukroz eklenmelidir

• Dolaptan alınan yaklaşık 400g koyun beyni hızla çözündürülerek aşağıda resimde görülendüzenekteki parçalayıcı içerisine koyulur, üzerine bir kısım tampon eklenerek parçalamaişlemi gerçekleştirilir

• Homojeniasyon işlemi bittikten sonra kütle sukrozlu tampon bulunan şişeye basınçlı havaaltında aktarılır

• Daha sonra aşı süspansiyonu naylon filtreden geçirilierek steril toplama şişesine aktarılır.Burada toplanan örnekler içinde distile su bulunan ve β-propiyolaktonla muamele edilecekşişeye aktarılır. Şişeye koyulan süspansiyon üzerine eklenen β-propiyolakton’dan sonra şişehızlıca birkaç saniye çalkalanır daha sonra şişe 22-25°C’de 3 saat inaktivasyona bırakılır.



fenollü koyun beyni aşısının hazırlanmasında kullanılan düzenek



Süre sonunda oluşan emülsiyonun içeriği;

Kuduz koyun beyni 10g

Sodyum klorit 0.585g

Sodyum dihidrojen fosfat dihitrat 0.624g

Sodyum hidroksit 0.162g

Sukroz7.5g

Distile su km 100mL

• β-propiyolakton süreç içerisinde hızlıca hidroliz olacak ve tümüyle toksik olmayan β-propiyonik ve hidrakrilik asit türevlerine dönüşecektir

• Emülsiyon oluşturma aşamasında eklenen β-propiyolakton yeterli bakterisidal etkiye sahipolmadığından fenol eklenmesi gereklidir



Çözünürlük ve Liyofilizasyon

• Aşı emülsiyonu dolaptan çıkarıldıktan sonra hemen 10mL’lik bir şişeiçerisinde 2.5mL ile çözündürülür ve homojen bir şekilde -40°’de dondurulur

• Bu sıcaklıktaki kap vakum cihazına alınır, ısı yavaş bir şekilde +22°C’yeçıkartılırken liyofilizasyon işlemi gerçekleştirilir

Yeniden sulandırma ve Dozajlama

• Liyofilize tozlar içerisine 5mL distile su koyularak yavaşça çalkalanır. Yenidensulandırma işlemi kullanımdan hemen önce gerçekleştirilmelidir

• Aşı subkutan olarak yetişkinlerde günlük 2.5mL ve çocuklarda 1mL olacakşekilde verilmelidir

Tarihlendirme

• Düzgün bir şekilde liyofilize edilen ve azot gazı ile kapatılan kaplar 2 yıl süre ile saklanabilir


KOYUN BEYNİ AŞILARIHazırlanan aşı üzerinde yapılan testlerpH’nın belirlenmesi: pH 6.6 ve 7.0 arasında olmalıdırsterilite testi: Liyofilize toz içeren her 10 şişeye 5mL distile eklendikten sonra yapılmalıdır.Aerobik ve anaerobik organizmaların belirlenmesi: her şişeden alınan 3mL ‘lik örnek ikiayrı Bonnel&Raby soyum hidrojen sülfit besiyeri içeren tüpe aktarılır. Bir tüp 37°C’de,diğer tüp 22°C’de inkübasyona bırakılır. Daha sonra bu tüp içerikleri agar-agar besiyerineaktarılarak bir hafta gözlem yapılır.Mantar ve maya belirlenmesi: şişeden alınan 2mL örnek Segrétain malt ekstraktı içerenbesiyerine aktarılır ve laboratuvar ortamında 2 hafta izlenir.Virüs inaktivasyon testi: test aşı emülsiyonuna fenol eklemeden β-propiyolakton ileinaktivasyondan 3 saat sonra gerçekleştirilir. Şişenin kapağını açmak kontaminasyonuartırabileceğinden özel bir tüp vasıtasıyla şişe içinden örnek alınır. Bu örnekler 14-16gağırlığındaki 20 fareye intraserebral olarak verilir ve 14 gün boyunca gözlemlenir. 4günden önce ölüm olmamalı ve bütün hayvanlar bu süreçten fazla yaşamalıdır. Eğerolağan dışı durumlar gözlenirse test daha çok liyofilize toz ile 40 hayvan üstünden yenidentekrarlanır. Bütün hayvanlar yaşamalıdır aksi takdirde hazırlanan aşılar elemine edilir.



Etkinlik ve stabilite testi: Habel testi uygulanır. Birinci testte +4°Cde bekletilen liyofilize aşılarfarelere inoküle edilirken diğer testte 1 hafta boyunca +37°C’de bekletilen aşılarla fareler immünizeedilir. Her iki testte de aşılar LD50 103 ‘e karşı korumalıdır.

Kontaminantların belirlenmesi: iki genç koyun 0.5mL yeniden sulandırılmış aşı ile intraserebralolarak inokule edilir ve hayvanlar 3 hafta boyunca izlenir. Bu süreç zarfında hayvanlar sağlıklıkalmalıdır aksi takdirde test 4 hayvan üzerinden tekrarlanır.

β-propiyolakton titrasyonu: β-propiyolakton tuzlu su içerisinde hemen hidrolize olacağı için titresiniölçülmesi önemlidir. En azından %80 aktif olarak bulunmalıdır. Aksi takdirde aşının son hazırlanmaaşamasına kadar β-propiyolakton kalmaz. Bu titrasyonun belirlenmesi içinde Tylor&Bessing’ingeliştirdiği yöntem kullanılmaktadır. Bu yöntemde test örneği içerisine koyulan çeşitli çözeltilerletitrasyon yapılır ve indikatör olarak nişasta kullanılır.

Artık fenol içeriğinin belirlenmesi: kontaminasyonu önlemek amacı ile koyulan fenolün çoğuliyofilizasyon işlemleri sırasında elemine edilmektedir fakat yine de artıkların kalıp kalmadığı ya da nekadar kaldığının belirlenmesi gereklidir. Kabul edilebilir aralık %0.1 gramdır. Testte aşı örneğine Folin-Ciocalteu ajanı eklenmesi ve bir takım laboratuvar işlemleri yapılmaktadır. Sonuta örnek içinspektrofotometrede konsnatrasyonu bilinen fenol içeriğine karşı okuma yapılır.

YENİDOĞAN RAT BEYİN AŞILARI

Aşı hazırlamada en önemli noktalardan birisi aşının sadece optimum koşullardadeğil bir takım çevre değişikliklerinde de etkinliğini uzun süre devamettirebilmesidir. Bu özellikle acil durumlarda istenilen yere istenildiği andaantikuduz aşılarının gönderilebilmesinde dikkat çekmektedir. Sıvı antikuduzaşılarının saklama koşulları son kullanma tarihlerini de etkilediği için uzun sürelimuahafazaları ve taşınmaları zordur. Bu nedenle dondurarak kurutma yöntemibakteri ve virüs aşıları için uzun zamandır kullanılmaktadır. İlk deneme 1964yılında Moskova’da gerçekleştirilmiş ve o günden beri sıvı aşılar içerisine stabilizörolarak sukroz eklenerek liyofilize edilmektedir.

Fakat liyofilizasyonunda bazı komplikasyonlara neden olabildiğini saptanmıştır. Bunedenle araştırmacılar yenidoğan rat beyinlerinde alerjensiz aşı üretim metodugeliştirmişlerdir.


Aşı hazırlanması

• Liyofilize antikuduz aşı üretiminde 4-8 günlük yenidoğan ratlar kullanılmaktadır

• İnfekte tavşandan alınan steril beyin süspansiyonu 1:100 dilüsyon olacak şekilde0.03 mL dozda intraserebral olarak enjekte edilir

• Yaklaşık 70-74 saat sonra hayvanlarda kuduz belirtileri görülmeye başlanır

• Bu belirtilerden sonra hayvanlar öldürülür ve beyinleri çıkartılarak fenollü distile suiçerisine koyulur

• Ratlardan çıkarılan beynin bir kısmı sterilite testi için şekerli broth besiyerine alınır

• Test tamamlanıncaya kadar da beyin +4°C’de tutulur

• Test uygun çıkarda fenol içeren distile suda beyin homojenize edilir

• Oluşan süspansiyon 22°C’de 14 gün boyunca virüs inaktivasyonu için inkübatördeçalkalayarak tutulur

• Beyin süspansiyonunda bulunan virüs konsantrasyonu yenidoğan ratlarda dahayüksek olmaktadır. İnaktivasyonun başladığı ilk 3 günde infektivite yüksektir fakatdaha sonraki günlerde düşer.


Dondurarak kurutma

• Süspansiyon inaktivasyondan sonra %30 sukroz’lu distile ile dilüe edilir

• Final konsantasryonda beyin süspansiyonu %10 olurken sukroz konsantasronu%7.5 olacaktır

• Bu dilüsyonlar daha sonra dikkatlice ampullere doldurulduktan sonra ampuller-40°C ya da -50°C’de vakum altında dondurulurlar

• Bu işlem yaklaşık 26-29 saat kadar sürer. İşlem sonunda ampullerde nemiçeriği tayini yapılır

Yapılan testler

• Örnekler üzerinde sıvı aşılardaki gibi sterilite, güvenlik, infektivite veimmünojenite testleri gerçekleştirilir. Bunun için kuru toz üzerine 3mL serumfizyolojik eklenir.

Tarihlendirme

• Dondurularak kurutulmuş aşı üretimden sonra +37°’de 6ay , +4°C’de 18 aysaklanabilir.

YENİDOĞAN FARE BEYNİ AŞILARI

Aşı formülü

• Her 2mL’lik dozda, inaktive edilmiş virüs içeren 20g yenidoğan fare beyni, 1:1000konsantrasyonunda fenol ve 1:10000 oranında tiomersal içermektedir.

Virüs suşu

• Bu aşının hazırlanması için kuduz virüsünün 3 suşu kullanılır.

Kaynak hazırlanması

• Kaynak stoklar daha önce kuduz virüsü ile inokule edilmiş yetişkin fare beyinlerinden eldeedilen %20’lik süspansiyonlardan hazırlanırlar. Bu süspansiyonlar 0.5mL hacimlerde liyofilizeedilir ve -20°C’de 5 yıl saklanabilirler.

Çalışma süspansiyonunun hazırlanması

• Her bir suşla infekte edilmiş yetişkin fare beyni %2 at serumlu, her mL’sinde 200IU penisilinve 200µg spreptomisin içeren distile su içerisinde %20’lik süspansiyon hazırlanır. Hazırlanansüspansiyonlar küçük şişelerde -30°C’den -70°C’ye düşen sıcaklıklarda saklanır.


Viral kontaminantlar için testler

• Aşı süspansiyonlarının kuduz virüsünden daha çok nörotropik virüslerle kontamine olupolmadığının belirlenmesi için; 1:10 dilüsyonluk süspansiyondan 0.5mL alınarak dilüeedilmemiş antikuduz hiperimmün serum ile 90 dakika 37°C’de inkübasyona bırakılır

• Serumlar fareler dışında diğer hayvanlarda oluşan virüs ile immünize tavşan ya da atlardahazırlanmaktadır

• Serum içeren süspansiyon karışımı intraserebral olarak 8 yenidoğan faresine 0.01mL dozda,3-4 haftalık farelere de 0.03mL dozda inoküle edilir

• İnoküle hayvanlar bu aşamadan sonra 30 gün yaşamalıdır.

İnokulum hazırlama

• İnokulum hazırlamak için çalışma süspansiyonundan elde edilen süpernatant sıvı kısım sterilolmalıdır ve içerik olarak LD50 100 oluncaya kadar dilüe edilir.


İnokulasyon ve Harvest

• En fazla 4 günlük olan yenidoğan farelere 0.01mL inokulum intraserebral olarak inokuleedilir

• Virüs canlılığını belirlemek için 14-16g’lık 10 fareye 0.03mL intraserebral olarak enjekteedilir

• 14 gün içinde bütün fareler kuduz belirtilerini göstermelidir

• Bu süreç zarfında fareler sağlıklı kalmış ise enjeksiyon tekrarlanmalıdır.

• Yaklaşık inokulasyondan 96 saat sonra (inkübasyona bitiminden 1 gün önce) tüm farelereter ya da kloroform kullanılarak öldürülür

• Beyin hijyenik koşullar altında dikkatlice çıkarılır

• Elde edilen beyinler tartılır. Tartımlarda genellikle 0.20 ile 0.25 g beyin dokusu elde edilir.Eğer materyal hemen kullanılmayacaksa -20 ya da -30°C’de saklanmalıdır.


Aşının hazırlanması

• Aşının hazırlanmasından hemen önce beyin dokuları kısım kısım oda ısısında çözündürülür

• Soğuk distile su içine aktarılan dokular parçalayıcıya aktarılarak homojen bir karışım oluncaya kadar parçalanır.

Virüs Titrasyonu

• Süpernatant sıvısındaki virüs titrasyonu farelere seri dilüsyonlar halinde intraserebralinokulasyon ile belirlenir

• Kabul edilebilir virüs titrasyonu 106.3 ve 107.3 olarak belirlenmiştir.

Viral kontaminantları belirleme testi

• Çalışma süspansiyonunda yapılan testlerle aynıdır.


Bakteriyal kontaminantları belirleme testi

• UV ışını ile inaktivasyondan önce bakteriyal kontaminantların olup olmadığı belirlenir

• 9mL tiyoglukat broth içeren 5 ayrı tüpe süspansiyondan 1 mL inoküle edilir

• Birinci tüp el ile çalkalandıktan sonra ikinci seri bir 5 tüpe bu tüplerden 1’er mL aktarılır

• Bu dilüe etme işlemi dilüsyon oranı 10-6 olana kadar devam edilir

• Tüm tüpler 7 gün boyunca gözlemlenir

• İnsanlara uygulama aşamasında gözlenecek bakteriyel büyüme 10-2 dilüsyonu geçmemelidir

• UV ışını bakteriyel kontaminasyonu engelleme gücü olsa bile yüksek kontaminasyondurumları tehlikelidir.

İnaktivasyon

• %10’luk süspansiyona iki kat soğuk distile su koyularak %5’lik süspansiyon elde edilir. Busüspansiyona daha sonra UV ışınına maruz bırakılır.


Güvenlik testi

• 18-20g ağırlığındaki 10 fare UV ışınından geçirilmiş 0.03mL aşı ile intraserebral olarakinoküle edilir

• İki adet tavşanda 0.25mL aşı ile inoküle edilir. İnoküle edilen tüm hayvanlar en az iki haftaboyunca izlenir. Bu süreç içinde hiçbir hayvanda kuduz belirtisi ya da santral sinir sistemi ileilgili semptomlar göstermemelidir.

Aşıda son dilüsyon

• UV ışınından hemen sonra %5’lik aşı süspansiyonuna yeterli miktarda tiomersal ve fenolbulunan distile su ile 4 kat dilüe edilir. Fenol tiyomersal steriliteyi sağlamanın yanında sinirdokusu enzimlerine karşı antijenlerden korunmak için kullanılır.

Aşı kütlesinde sterilite testi

• Her bir flasktan alınan 1mL örnek 4 tüp tiyoglukat broth ve 4 tüp Sabouraud’s agar’a inoküleedilir. tüplerin bir kısmı 7 gün boyunca 37°C’de, diğer kısmı 22°C’de inkübasyona bırakılarakgözlemlenir.

Etkinlik testi

• İmmünojenik etkinlik Habel testi ile ya da uygun referans standart ulaşılabilirse NIH testinegöre belirlenir.

YENİDOĞAN TAVŞAN BEYNİ AŞISI

Aşı formülü

• Bu aşı doğumdan sonra 24 saat geçmeden kuduz virüsü ile inoküleedilen yenidoğan tavşan beyninin UV’den geçirilmiş %5’lik süspansiyonudur

• Bu süspansiyon %2 Mcllvain tamponu (pH:7.2) ve %5 laktoz içermektedir

• 2mL’lik tek dozluk liyofilize tozlar halinde bulunur ve sulandırılırken %0.01 tiomersal bulunan distile su kullanılır


Virüs

• Kuduz virüsünü Pastör suşu kullanılır

• Suş 2 ayda bir yetişkin tavşan beyninde pasajlanır

• İnfekte beyinler %70’lik gliserolde -15°C’de saklanır

• Denetim altındaki tavşanlar, %2’lik at serumunda tutulan infekteyetişkin tavşan beyninin %0.1’lik süspansiyonu ile intraserebralolarak inoküle edilir

• Hayvanlar inokülasyonun 6. ya da 7. gününde tam felç belirtilerigösterdiğinde öldürülür

• Beyinleri çıkarılır ve sterilite testi için örnekler alınır

• Diğer işlemler için beklerken birkaç dakikalığına %70’lik gliserolde -15°C’de saklanabilir.


İnokulum• İnokulum son stok virüslerden elde edilir. çıkarılan beyin distile suda yıkanır• %2’lik at serumu içeren distile su içerisinde emülsifiye edilerek %10’luk

süspansiyon elde edilir• %10’luk süspansiyon sterilite testi için kullanılır. Ayrıca küçük parçalar halinde

havasız ortamlarda -70°C’de saklanır ve kaynak virüs olarak kullanılır• Taze inokulum, her bir %10’luk süspansiyondan %2’lik at serumu ile 10-3

dilüsyon yapılarak hazırlanır.İnokulasyon• İnokulasyon için denetim altındaki yenidoğan tavşanlar kullanılmaktadır• Tavşanlar annelerinden ayrı olarak 30-32°C’lik havalandırmalı inkübatörlerde

tutulurlar• Süt ve yumurtadan oluşan yiyeceklerle oral olarak pipet ile günde 2 kez

beslenirler• Yenidoğan tavşanlar kulak ve göz arasında kalan bölgeden kafatasına açılan bir

delikten 24 saat geçmeden kuduz virüsü ile inoküle edilirler.


Harvest

• İnfekte tavşanlar inokulasyonun 3. gününden itibaren felç belirtileri göstermeye başlarlar

• 4. Ve 5. günde tam bir paraliz olan tavşanlar karbondioksit gazı ile öldürülürler. Bu zamaniçinde kendileri ölen hayvanlar kesinlikle kullanılmaz

• Kafatası dikkatlice ayrılan tavşanların beyinleri küçük steril kaplara aktarılır ve bakteriyolojiktestleri gerçekleştirilir

• Kontamine beyinler çalışmadan çıkarılır. Uygun kısımlar geciktirilmeden cam şişe içerisinde -20°C’ye alınır.

Aşının Hazırlanması

• Çalışmaya başlamadan ilk önce çıkarılan beyinler darası alınmış şişe ile birlikte tartılır veçözünmesi beklenir

• Şişenin etrafı pamukla sarılır ve el ile şişe birkaç dakika çalkalanır. Daha sonra şişe içerisineeklenen % 2’lik Mcllvain tamponu içerisinde 1 saat çalkalayıcı üzerinde homojenizasyonyapılır

• Daha sonra eklenen Mc Ilvain tamponu ile son süspansiyon %10’luk hale getirilir. Hazırlanansüspansiyonlar UV ışık altında inaktive edilir

• İnaktive edilen aşı süspansiyonundan sterilite ve güvenlik testleri için örnekler alınır. Dahasonra 2mL’lik süspansiyonlar halinde ampullere doldurulur ve liyofilize edilir.


Mc Ilvain tamponu hazırlanması (%2)

• Çözelti A: 21g Sitrik asit 1000mL distile su içerisinde çözündürülür.

• Çözelti B: 35.6g Sodyum hidrojen fosfat 1000mL su içerisindeçözündürülür.

• 17.65mL Çözelti A’dan 82.35mL çözelti B’den alınarak karıştırılır. Bukarışım üzerine 50 kat distile su eklenerek %2’lik tampon hazırlanır.


Virüs Süspansiyonunun Test Edilmesi

Kimlik belirleme

• 1:10 oranında inaktive edilmiş kuduz serumu ile 1:10 oranında virüssüspansiyonu 37°C’de su banyosunda 1 saat inkübasyona bırakılır

• 11-14g ağırlığındaki 5 fare 0.03mL süspansiyon ile inokule edilir

• Bir diğer grup fare ise normal serum ile karıştırılmış virüs süspansiyonu ileinokule edilir

• ilk gruptaki 5 fareden en az 4’ü yaşarken ikinci gruptaki tüm farelerölmelidir.

Virüs titrasyonu

• UV ışınından önce, virüs süspansiyonu %2’lik normal at serumu içerendistile su içerisinde 10-3,10-4, 10-5, 10-6 ve 10-7 olacak şekilde dilüe edilir veher dilüsyon için 10 fare inokule edilir.


UV Işınından geçirilmiş Aşı Süspansiyonunda TestlerSterilite testi• Örnek içinden 30mL test için kullanılır. Tarozzi besiyeri içeren 2 ayrı tüpe birkaç

damla virüs süspansiyonu inokule edilir• Sabouraud besiyeri içeren 6 tüpe de 1’ermL örnek inokule edilir• Bu 6 tüpten bir tanesi de ek olarak 50 CFU(Colony Forming Unıty) Candida

albicans ile inokule edilir. sıvı tiyoglukat içeren 2 ayrı flaska da aşı kütlesindeninokulasyon yapılır.

• Aşılar 37°C’de 7 gün Tarozzi besiyerinde, 18-25°C’de 14 gün Sabauraudbesiyerinde ve 30°C’de 7 gün tiyoglukat besiyerinde tutulur. Büyüme kontrolüCandida albicans ile yapılır

Güvenlik testi• 18-20 g ağırlığındaki 10 fare ve 1.5-2kg ağırlığındaki 2 tavşan intarserebral

olarak UV ışınından geçirilmiş aşı ile inokule edilir• inokule edilen tüm hayvanlar en az iki hafta boyunca ne felç belirtisi ne de

sinir sistemi ile ilgili bir hastalık göstermemelidir.


Liyofilize Aşıda Yapılan Testler

Sterilite testi; Son taşıyıcı kapları içerisindeki liyofilize tozlarda gerçekleştirilir. Örnekolarak en az 10 kap seçilir ve distile su ile sulandırılır. Sulandırılan aşı süspansiyonlarıtiyoglukat, Tarozzi ve Sabouraud besiyerine inokule edilir ve bakteriyolojik büyümegözlemlenir.

Zararsızlık testi; 20g ağırlığındaki 4 fare ve 350g ağırlığındaki 2 kobay intraperitonelolarak yeniden sulandırılan aşı süspansiyonu ile inokule edilir. Tüm hayvanlar en az 7gün herhangi bir hastalık belirtisi göstermemelidirler.

Etkinlik testi; NIH testi ile yapılır.

Yeniden Sulandırma Ve Dozajlama; Liyofilize aşı içinde %0.01 tiomersal içeren 2mLdistile su ile sulandırılır. 2mL’lik doz, %5 beyin dokusu içermektedir ve 14 günlük dozolarak kullanılır.

Saklama; Liyofilize aşılar üretici tarafından -10°C’de en fazla 18 ay saklanabilir. Sonkullanım tarihi yayın tarihinden itibaren 6°C’nin altında saklandığı sürece 6 ay’dır.

Serolojik Cevap; İnsanlarda 14 günlük tedaviye karşı antikor cevabı nötralizasyon ya dakantitatif indirekt immünofloresans yöntemi ile test edilmelidir. Tedavi edilen tümhastalarda belirgin bir cevap olmalıdır.

• çeviri 1.flv

çeviri 1.flv

Hazırlayan

Monoklonal Antikorlar

• Yard.Doç.Dr. Gülay Büyükköroğlu• ANADOLU ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ

• FARMASÖTİK BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI

Documents

AILAR VE ÜRETİM TEKNOLOJİLERİeczacilik.anadolu.edu.tr/bolumSayfalari/belgeler/AŞILAR... · 2014-04-09 · Mekanizma • Antijen vücudagirdiğinde,antijen prezente eden hücreler(APC)