8/3/2019 Ailsa M. Campbell- Conformational Variation in Superhelical Deoxyribonucleic Acid

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B i o c h e m . J . ( 1 9 7 8 ) 1 7 1 , 2 8 1 - 2 8 3P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

C o n f o r m a t i o n a l V a r i a t i o n i n S u p e r h e l i c a l D e o x y r i b o n u c l e i c A c i dBy AILSA M. CAMPBELLD e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , U n i v e r s i t y o f G l a s g o w , G l a s g o w G 1 2 8QQ, S c o t l a n d , U . K .

( R e c e i v e d 2 3 J a n u a r y 1 9 7 8 )S e d i m e n t a t i o n e x p e r i m e n t s h a v e s h o w n t h a t s u p e r h e l i c a l DNA u n d e r g o e s a s h a r ps t r u c t u r a l t r a n s i t i o n a t l o w i o n i c s t r e n g t h . L i g h t - s c a t t e r i n g e x p e r i m e n t s s h o w t h a t t h i s i sd u e t o a c h a n g e i n c o n f o r m a t i o n o f t h e DNA r a t h e r t h a n t o a c h a n g e i n i n t e r a c t i o n samong DNA m o l e c u l e s . T h e r e s u l t s s h o w t h a t t w o p o s s i b l e c o n f o r m a t i o n s c a n o c c u r f o rs u p e r h e l i c a l DNA u n d e r r o u t i n e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a n d may e x p l a i n t h e d i s -c r e p a n c i e s i n t h e n u m b e r o f e a r l y u n w i n d i n g s i t e s e x p o s e d b y d i f f e r e n t t e c h n i q u e s .

T h e b a s i c s t r u c t u r e a d o p t e d b y s m a l l s u p e r c o i l e dDNA m o l e c u l e s i n s o l u t i o n i n t h e i o n i c - s t r e n g t hra n ge 0 . 0 7 5 t o 4 . 0 h a s b e e n s h o w n t o b e a b r a n c h e dc o n f o r m a t i o n made up o f i n t e r w o u n d s u p e r h e l i c a lt u r n s ( J o l l y & C a m p b e l l , 1 9 7 2 ) . T h e n u m b e r a n dn a t u r e o f t h e b r a n c h e s d e p e n d s on b o t h t h e sequence( C a m p b e l l & E a s o n , 1 9 7 5 ) a n d t h e s i z e ( C a m p b e l l ,1 9 7 6 a ) o f t h e DNA a n d i s s p e c i f i c f o r DNA m o l e c u l e sf r o m e a c h d i f f e r e n t s o u r c e . The p r e v a i l i n g e v i d e n c es u g g e s t s t h a t t h e p o s i t i o n s o f t h e e n d s o f t h e arms ared i c t a t e d b y t h e l o c a t i o n o f t h e e a r l y d e n a t u r i n g orp a l i n d r o m e r e g i o n s i n t h e p r i m a r y s t r u c t u r e , a n d i t i st h e presence o f t h e s e r e g i o n s t h a t make s u p e r c o i l su n i q u e l y s u s c e p t i b l e t o r e a g e n t s t h a t r e a c t w i t h s i n g l e -s t r a n d e d DNA ( J a c o b e t a l . , 1 9 7 4 ; B r o c k e t a l . , 1 9 7 5 ) .S u p e r c o i l s t r u c t u r e i s d i c t a t e d b y t h e r e l a t i v e s t r e n g t h so f t h r e e e n e r g e t i c a l l y u n f a v o u r a b l e t o p o l o g i c a lr e s t r a i n t s p l a c e d on t h e DNA b y t h e i n a b i l i t y o f t h ed o u b l e s t r a n d t o u n w i n d ( D a v i d s o n , 1 9 7 2 ) . The f i r s ttwo are t h e r e q u i r e m e n t f o r t h e s t i f f d o u b l e h e l i x t ob e n d a l o n g i t s a x i s a n d t w i s t a b o u t i t s a x i s , a n d t h et h i r d i s f o r two s e g m e n t s o f d o u b l e - s t r a n d e d DNA i nt h e same m o l e c u l e t o l i e a l o n g s i d e e a c h o t h e r d e s p i t et h e o b v i o u s m o l e c u l a r r e p u l s i o n . T h e l a s t i n t e r a c t i o nenergy i s a k e y c o n t r o l l i n g f o r c e i n s u p e r c o i l s t r u c t u r ea n d i s r e s p o n s i b l e f o r t h e i n a b i l i t y o f s u p e r h e l i c a lDNA t o t a k e up t h e more t i g h t l y wound C f o r m i n -d u c e d b y many p r o t e i n s ( C a m p b e l l , 1 9 7 6 b ) . M o l e -c u l e s s u c h as b a c t e r i o p h a g e - P M 2 DNA m a i n t a i nt e r t i a r y s t r u c t u r e s i n w h i c h t h e d i a m e t e r o f e a c hs u p e r h e l i c a l t u r n i s e x a c t l y e q u a l t o i t s s e g m e n tl e n g t h , so t h a t i n t w o - d i m e n s i o n a l p r o j e c t i o n t h es t r u c t u r e appears as a s e r i e s o f j o i n t e d s p h e r e s w i t h ad i a m e t e r o f 14nm i n 0 . 2 M - N a C I a n d lOnm i n 4 M -N a C l . The a b o l i t i o n o f t h i s b r a n c h e d s t r u c t u r e a n dt h e c o n c o m i t a n t l o s s o f t h e e a r l y u n w i n d i n g r e g i o n sh a s b e e n shown t o occur a t very l o w s u p e r h e l i xd e n s i t y ( C a m p b e l l & J o l l y , 1 9 7 3 ) .R e c e n t u l t r a c e n t r i f u g a l e x p e r i m e n t s h a v e s h o w nt h a t b a c t e r i o p h a g e - P M 2 DNA e x h i b i t s u n u s u a lb e h a v i o u r a t l o w i o n i c s t r e n g t h ( V o l l e n w e i d e r e t a l . ,V o l . 1 7 1

1 9 7 6 ) . W h e r e a s l i n e a r DNA m o l e c u l e s s h o w ad e c r e a s e i n s v a l u e as t h e i o n i c s t r e n g t h i s l o w e r e d ,c o r r e s p o n d i n g t o a l o o s e r s t r u c t u r e c o m p a t i b l e w i t hh i g h i n t r a m o l e c u l a r r e p u l s i o n , b a c t e r i o p h a g e - P M 2DNA m o l e c u l e s s h o w a r i s e i n s v a l u e over t h e s a m erange, a p p a r e n t l y i n d i c a t i n g t h a t a more compacts t r u c t u r e i s p r e f e r r e d b e l o w I O . 1 d e s p i t e t h e i n c r e a s e di n t r a m o l e c u l a r r e p u l s i o n s . I n a d d i t i o n , e l e c t r o nm i c r o g r a p h s s h o w e d t h a t t h e customary b r a n c h e ds t r u c t u r e o f b a c t e r i o p h a g e - P M 2 DNA was a b s e n t .A s i n g l e s e d i m e n t a t i o n e x p e r i m e n t d o e s n o t , h o w e v e r ,d e m o n s t r a t e u n e q u i v o c a l l y t h a t a s t r u c t u r a l c h a n g eh a s o c c u r r e d w i t h i n a m o l e c u l e . I t c o u l d w e l l s h o wc h a n g e s i n i n t e r a c t i o n s among m o l e c u l e s w h i c hw o u l d a l s o a f f e c t t h e s e d i m e n t a t i o n r a t e . L i g h t -s c a t t e r i n g o f f e r s a n e x c e l l e n t m e t h o d o f a n a l y s i n gm o l e c u l a r s h a p e a n d i n t e r a c t i o n s e p a r a t e l y . Thee x t r a p o l a t i o n o f t h e Zimm p l o t t o zero concen-t r a t i o n a f f o r d s u n a m b i g u o u s s h a p e d e t e r m i n a t i o na n d t h e e x t r a p o l a t i o n t o zero a n g l e d e t e r m i n e sr e l a t i v e m a s s a t a n y c o n c e n t r a t i o n . The workd e s c r i b e d i n t h e p r e s e n t paper s h o w s t h a t t h e morec o m p a c t c o n f o r m a t i o n i s t o r o i d a l i n n a t u r e a n d moref a v o u r e d b y t h e m o l e c u l e b e c a u s e o f t h e d e c r e a s e i ni n t e r n a l r e p u l s i o n s i n t h e s u p e r h e l i x . T h i s s t r u c t u r a la l t e r a t i o n h a s o b v i o u s e f f e c t s on t h e p o t e n t i a lr e a c t i v i t y o f s u p e r h e l i c a l DNA m o l e c u l e s w i t hs p e c i f i c p r o t e i n s a n d u n w i n d i n g a g e n t s a n d maye x p l a i n t h e d i s c r e p a n c i e s b e t w e e n t h o s e l a b o r a t o r i e swh o d i f f e r i n t h e i r e s t i m a t e s o f t h e n u m b e r o f e a r l yu n w i n d i n g s i t e s i n t h e s u p e r c o i l s .M a t e r i a l s a n d M e t h o d s

B a c t e r i o p h a g e - P M 2 DNA was g e n e r o u s l y g i v e nb y D r . R o s a l i n d C o t t e r , S e a r l e R e s e a r c h L a b o r a -t o r i e s , H i g h Wycombe, B u c k s . , U . K . L i g h t - s c a t -t e r i n g a n d computer curve g e n e r a t i o n h a v e b e e nd e s c r i b e d b e f o r e ( J o l l y & C a m p b e l l , 1 9 7 2 ; C a m p b e l l ,1 9 7 6 a , b ) . T h e r e f r a c t i v e i n c r e m e n t o f t h e DNAr a n g e d f r o m 0 . 1 7 0 . 0 0 3 m l / g a t t h e l o w e s t i o n i c

2 8 1

8/3/2019 Ailsa M. Campbell- Conformational Variation in Superhelical Deoxyribonucleic Acid

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A . M . CAMPBELL

( a )1 0 _ 10 EE x t r a p o l a t i o n

t o z e r oc o n c e n t r a t i o n

0 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 0 . 2 0 . 4 0 . 6 0 . 8 1 . 0 1 . 2 1 . 4 1 . 6 1 . 8 2 . 0s i n 2 ( 0 9 / 2 ) + 1 0 - 2 CF i g . 1 . Zimm p l o t s o f b a c t e r i o p h a g e - P M 2 DNA a t i o n i c s t r e n g t h s o f 0 - 0 9 ( a ) a n d 0 . 1 5 ( b )A l l e x t r a p o l a t i o n s a n d c a l c u l a t i o n s were a s d e s c r i b e d i n C a m p b e l l ( 1 9 7 6 a ) . K , o p t i c a l c o n s t a n t ; c , c o n c e r a t i o n i ng / m l ; R, i n t e n s i t y o f s c a t t e r e d l i g h t c o r r e c t e d f o r v i e w i n g a n g l e . E x t r a p o l a t i o n t o z e r o a n g l e g i v e s t h e r e l a t i v e massa t a n y c o n c e n t r a t i o n a n d e x t r a p o l a t i o n t o zero c o n c e n t r a t i o n g i v e s t h e s i m p l e i n t e r f e r e n c e c u r v e o v e r t h e a n g u l a r r a n g e .T h e c o n d e n s e d s t r u c t u r e i n ( a ) o c c u r s a t t h e l o w e r s a l t c o n c e n t r a t i o n . I n t e r m e d i a t e c o n c e n t r a t i o n s were n o t a t t e m p t e d .

1 5 0 r

r-

II00

3 r

100 k

50 F

0 . 0 1 0 . 1I o n i c s t r e n g t h 1 . 0F i g . 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n r a d i u s o f g y r a t i o n ( & ) a n di o n i c s t r e n g t hT h e r a d i u s o f g y r a t i o n i s o b t a i n e d f r o m t h e l i m i t i n g

s l o p e o f t h e Zimm p l o t a t z e r o c o n c e n t r a t i o n . T h ep o i n t a t h i g h i o n i c s t r e n g t h i s t a k e n f r o m C a m p b e l l( 1 9 7 6 b ) .0 . 5s i n 2 ( O / 2 )

s t r e n g t h t o 0 . 1 6 5 m l / g a t t h e h i g h e s t . The b u f f e r wasl O m M - T r i s / H C l / 0 . 7 m M - E D T A , p H 7 . 5 , w i t h v a r i o u samounts o f N a C l . The number o f s u p e r h e l i c a l t u r n sr e m a i n s s l i g h t l y i n d o u b t , as d i s c u s s e d b e f o r e , a n d wast a k e n t o b e 6 0 . H o w e v e r , v a r i a t i o n o f 10 t u r n s h a svery l i t t l e e f f e c t on t h e m o l e c u l a r d i m e n s i o n s , a n d t h eb a s i c c o n c l u s i o n o f t h e paper i s u n a f f e c t e d b y t h enumber o f s u p e r h e l i c a l t u r n s i n t h i s r a n g e .

F i g . 3 . T h e o r e t i c a l s t r u c t u r e f o r s u p e r h e l i c a l DNAc o m p a r e d w i t h e x p e r i m e n t a l p o i n t sT h e s t r u c t u r e s a r e a l l c a l c u l a t e d f o r a m o l e c u l e t h a th a s t h e s i z e ( 5 . 9 x 1 0 6 d a l t o n s ) a n d r a d i u s o f g y r a t i o n( 7 3 n m ) m e a s u r e d d i r e c t l y f r o m t h e Zimm p l o t . Thel a r g e r a d i u s o f t h e t o r o i d a l m o l e c u l e s h o w n i s c o m -p u t e d f r o m J o l l y & C a m p b e l l ( 1 9 7 2 ) t o b e 7 3 n m a n dt h e s m a l l r a d i u s 8 n m . P ( 0 ) - I r e p r e s e n t s t h e r e c i p r o c a lp a r t i c l e - s c a t t e r i n g f a c t o r .

1 9 7 8

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8/3/2019 Ailsa M. Campbell- Conformational Variation in Superhelical Deoxyribonucleic Acid

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RAPID PAPERS 2 8 3

R e s u l t s a n d D i s c u s s i o nF i g . 1 s h o w s t h e t y p i c a l Zimm p l o t s f o r b a c t e r i o -p h a g e - P M 2 DNA a t i o n i c s t r e n g t h s o f 0 . 0 9 a n d 0 . 1 5 .T h e f i r s t r e p r e s e n t s a h i g h l y c o n d e n s e d m o l e c u l e . T h em o l e c u l e s s h o w a t e n d e n c y t o i n t e r a c t i n s o l u t i o n .

T h e n e g a t i v e v i r i a l e f f e c t s d i s p l a y e d b y s u p e r c o i l s i nc o n t r a s t w i t h t h e i r c o r r e s p o n d i n g n i c k e d c o n f o r -m a t i o n i s w e l l k n o w n a n d r e p r e s e n t s a l a c k o f a f f i n i t yo f t h e m o l e c u l e s f o r s o l v e n t r a t h e r t h a n a t r u e a f f i n i t yf o r e a c h o t h e r . I t h a s b e e n s u g g e s t e d ( J o l l y &C a m p b e l l , 1 9 7 2 ) t h a t t h i s i s d u e t o t h e h y d r o p h o b i cb a s e s s w i n g i n g o u t i n t o t h e medium c a u s i n g u n -f a v o u r a b l e o r d e r i n g o f t h e s u r r o u n d i n g w a t e r s h e l l ,a n d t h e s l i g h t i n c r e a s e i n t h i s p h e n o m e n o n o b s e r v e da t l o w r a t h e r t h a n h i g h i o n i c s t r e n g t h r e f l e c t s t h ei n c r e a s e d t o r s i o n a l r e s t r a i n t s i n t h e t o r o i d a l s t r u c t u r e .F i g . 2 s h o w s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i o n i c s t r e n g t ha n d r a d i u s o f g y r a t i o n o v e r t h e i o n i c - s t r e n g t h r a n g et e s t e d . I t i s a p p a r e n t t h a t t h e t r a n s i t i o n i n s h a p eo c c u r s o v e r t h e s a m e r a n g e a s t h e t r a n s i t i o n i ns e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t . I t i s c l e a r t h a t t h e c h a n g ei n s e d i m e n t a t i o n r e p r e s e n t s a g e n u i n e c o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o n , s i n c e t h e r a d i u s o f g y r a t i o n i s m e a s u r e d b ye x t r a p o l a t i o n t o z e r o c o n c e n t r a t i o n . F i g . 3 s h o w s t h ec o m p u t e d i n t e r f e r e n c e c u r v e s f o r m o l e c u l e s w i t hr a d i i o f g y r a t i o n c o r r e s p o n d i n g t o t h e m e a s u r e dv a l u e o f 7 3 n m . T h e c o r r e s p o n d e n c e o f t h e d a t a t o t h et o r o i d a l c u r v e i s a p p a r e n t . Any f o r m o f i n t e r w o u n ds u p e r c o i l o f t h i s r a d i u s o f g y r a t i o n i s a n u n r e a l i s t i cp r o p o s i t i o n a s t h e s e g m e n t l e n g t h o f 4 n m c l e a r l yr e p r e s e n t s g r o s s l y u n f a v o u r a b l e s t r a n d p r o x i m i t y .I t h a s o f t e n b e e n p o i n t e d o u t ( e . g . C r i c k , 1 9 7 1 ) t h a tt h e s u p e r s t r u c t u r a l f o r m s o f b i o p o l y m e r s t e n d t oa d o p t a h e l i c a l s e n s e t h a t r e v e r s e s t h a t o f t h e s u b -s t r u c t u r e . T h e l e f t - h a n d e d t o r o i d a l f o r m o f t h e s u p e r -c o i l i s t h e r e f o r e a n a t u r a l s t r u c t u r e t o e x p e c t f r o mr i g h t - h a n d e d DNA, i f o n e r e g a r d s t h e DNA m o l e c u l ea s a s i m p l e b i o p o l y m e r . H o w e v e r , t h e u n i q u e r e g i o n si n t h e s e q u e n c e n o r m a l l y o v e r c o m e t h e s e g e n e r a lr u l e s . T h e o p e n e d a r e a s a t t h e e n d s o f t h e a r m s a l l o wa n i n t e r w o u n d s t r u c t u r e , w h e r e t h e r e i s m i n i m a lc u r v a t u r e a n d t o r s i o n o n a l l o t h e r r e g i o n s o f t h eDNA. T h e l i m i t i n g f e a t u r e o f t h i s s t r u c t u r e i s t h eu n f a v o u r a b l e i n t e r a c t i o n e n e r g y w h i c h d o m i n a t e s t h er e f u s u a l t o t a k e o n t h e e x t r a C - s t r u c t u r e t r a n s i t i o n i nh i g h s a l t a n d c l e a r l y d i c t a t e s a c o m p l e t e c o n f o r -m a t i o n a l t r a n s i t i o n t o a t o r u s i n l o w s a l t . T h ed i m e n s i o n s o f t h e t o r u s a r e 7 3 n m f o r t h e l a r g e r a d i u sa n d 8 nm f o r t h e s m a l l o n e o v e r t h e i o n i c - s t r e n g t hr a n g e m e a s u r e d , a n d a p p e a r t o v a r y o n l y m a r g i n a l l yamong t h e s e s a l t c o n c e n t r a t i o n s . T h i s may i n d i c a t et h a t f l e x i b i l i t y p a r a m e t e r s a r e c o n t r o l l i n g t h e s t r u c t u r e

a t t h i s p o i n t ( C o o k & B r a z e l l , 1 9 7 5 ; B e n y a j a t i &W o r c e l , 1 9 7 6 ) . U n t i l r e c e n t l y t h e o n l y way t h e s es p e c i a l s i t e s c o u l d b e r e m o v e d w a s b y d e c r e a s i n gs u p e r h e l i x d e n s i t y . H o w e v e r , i t i s now a p p a r e n t t h a tf l u c t u a t i o n s i n t h e i o n i c e n v i r o n m e n t o f t h e c h r o m o -s o m e c o u l d c o n t r o l t h e r e a c t i v i t y o f t h e s e s i t e s . I t c a nb e e x p e c t e d t h a t a d e c r e a s e i n t h e i o n i c d e n s i t y w i l ll e a d t o a g r e a t e r n u m b e r o f r e a c t i v e s i t e s o n t h ec h r o m o s o m e w i t h much l o w e r s p e c i f i c i t y a n dr e a c t i v i t y a t a n y i n d i v i d u a l s i t e a s t h e t o r o i d a lt r a n s i t i o n o c c u r s . T h i s may w e l l e x p l a i n t h e d i s -p a r i t y i n t h e r e s u l t s o f t h e t w o g r o u p s ( J a c o b e t a l . ,1 9 7 4 ; B r o c k e t a l . , 1 9 7 5 ) who h a v e c l a i m e d f o u r a n de i g h t e a r l y u n w i n d i n g s i t e s r e s p e c t i v e l y f o r b a c t e r i o -p h a g e - P M 2 DNA, s i n c e t h e s i m u l t a n e o u s e x i s t e n c e o fmore t h a n o n e s o l u t i o n c o n f o r m a t i o n i s h i g h l yu n l i k e l y f r o m a t h e o r e t i c a l v i e w p o i n t ( C a m p b e l l ,1 9 7 6 a ) . R e a c t i o n w i t h u n w i n d i n g p r o t e i n s i s f r e -q u e n t l y c a r r i e d o u t a t l o w i o n i c s t r e n g t h ( B r o c k e t a l . ,1 9 7 5 ) a n d may b e e x p e c t e d t o s h o w a l a r g e r n u m b e ro f l o w - a f f i n i t y s i t e s , w h e r e a s r e a c t i o n w i t h f o r m a l d e -h y d e i n n e u t r a l b u f f e r i s c a r r i e d o u t a t h i g h i o n i cs t r e n g t h ( J a c o b e t a l . , 1 9 7 4 ) a n d c a n b e e x p e c t e d o n l yt o e x p o s e t h e f o u r h i g h - a f f i n i t y s i t e s . T h e s t r e n g t h o ft h e i n t e r a c t i o n e n e r g y f a c t o r m a k e s t h e u s e o f a l k a l ia s a n e a r l y d e n a t u r a n t o f t h e s u p e r h e l i c a l m a t e r i a ll i k e l y t o y i e l d v a r i a b l e r e s u l t s , a s a t o r o i d a l c o n -f o r m a t i o n w i l l b e c o m e g r e a t l y f a v o u r e d a n d e r s u c hc o n d i t i o n s .

I t h a n k D r . J . P a r e l l o f o r d r a w i n g m y a t t e n t i o n t o t h ea b n o r m a l s e d i m e n t a t i o n o f b a c t e r i o p h a g e - P M 2 DNA.

R e f e r e n c e sB e n y a j a t i , C . & W o r c e l , A . ( 1 9 7 6 ) C e l l 9 , 3 9 3 - 4 0 8B r o c k , C . , B i c k e l , R . A . & Y u a n , R . ( 1 9 7 5 ) J . M o l . B i o .9 6 , 6 9 3 - 7 0 2C a m p b e l l , A . M. ( 1 9 7 6 a ) B i o c h e m . J . 1 5 5 , 1 0 1 - 1 0 5C a m p b e l l , A . M . ( 1 9 7 6 b ) B i o c h e m . J . 1 5 9 , 6 1 5 - 6 2 0C a m p b e l l , A . M. & E a s o n , R . ( 1 9 7 5 ) F E B S L e t t . 5 5 , 2 1 2 -2 1 5C a m p b e l l , A . M . & J o l l y , D . J . ( 1 9 7 3 ) B i o c h e m . J . 1 3 3 ,

2 0 1 - 2 0 6C o o k , P . R . & B r a z e l l , I . A . ( 1 9 7 5 ) J . C e l l S c i . 1 9 , 2 6 1 - 2 7 9C r i c k , F . H . C . ( 1 9 7 1 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 3 4 , 2 5 - 2 7D a v i d s o n , N . ( 1 9 7 2 ) J . M o l . B i o l . 6 6 , 3 0 7 - 3 0 9J a c o b , R . L . , L e b o w i t z , J . & K l e i d s c h m i d t , A . K . ( 1 9 7 4 )J . V i r o l . 1 3 , 1 1 7 6 - 1 1 8 5J o l l y , D . J . & C a m p b e l l , A . M . ( 1 9 7 2 ) B i o c h e m . J . 1 2 8 , 5 6 9 -5 7 8V o l l e n w e i d e r , H . J . , K o l l e r , T . , P a r e l l o , J . & S o g o , J . M .( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 3 , 4 1 2 5 - 4 1 2 9

V o l . 1 7 1