AKIM SİTOMETRİAKIM SİTOMETRİPRENSİPLERİPRENSİPLERİ

İrem Akar Soycan (Becton Dickinson)

Belli bir hızda akan hücreleri eş

zamanlı olarak farklı özelliklerine göre

Flow sitometri;

2

zamanlı olarak farklı özelliklerine göre

tanımlayan sistemdir.

Ortak özellikleri nedir?

alg kromozomlar

3

Kanhücreleri

protozoa

Hücre Hakkında Bize Ne Söyler?

— Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC)

— Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC)

4

— Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC)

— Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve FL4)

FSC ve SSC ÖzellikleriSide Scatter DetektörüHücrenin içsel yapısı

Forward Side Scatter DetektörüHücre büyüklüğü

Laserden gelen ışık kaynağı

5

Forward Scatter— yüzeyden yansıyan ışınlar— Hücrenin büyüklüğü ile ilişkilidir.

Side Scatter— içerden kırılıp yansıyan ışınlar— Hücrenin granüllüğü ve içsel yapısı ile ilgilidir.

Hücre büyüklüğükaynağı

Eritrositleri uzaklaştırılmış tam kan örneği

Nötrofiller

Side Scatter

600

800

1000

6

Side Scatter

Forward Light Scatter

0 200 400 600 800 1000

0200

400

Monositler

Lenfositler

Hücre Hakkında Bize Ne Söyler?

— Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC)

— Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC)

7

— Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC)

— Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve FL4)

Fluoresan ışık nedir?

λ = 488 nm

Açığa çıkan ışık enerjisi

Antikor

Işık enerjisi

FluoresanMolekülü

λ ≅ 530 nmHO

CO2H

O

C

8

— Florokrom laserden gelen enerjiyi emer.

— Florokrom tarafından emilen enerji; – Vibrasyon ve ısı salınımı

– Uzun dalga boylu fotonların emisyonu ile açığa çıkar.

Floresans yoğunluğu

FITC FITC

FITC

FITC

Salınan enerjinin miktarı, hücrede bulunan bağlanma bölgelerinin miktarı ile doğru orantılıdır.

9

FITC

FITC

FITC

FITCFITC

FITC

FITC

Floresan Yoğunluğu

Hücrelerin Sayısı

Görüntüleme..

1010

Sitometri hangi sistemlerin varlığına ihtiyaç duyar?

— Sıvı Sistem Hücrelerin lasere taşınması ve tek tek lazerden geçişini

sağlar.

— Optik Sistem

11

— Optik SistemIşık enerjisinin oluşmasını ve sonrasında da

toplanmasını sağlar.

— Elektronik SistemOptik sinyallerin veri aktarımını sağlamak üzere dijital

sinyallere çevrimini sağlar.

HavaHavaPompasıPompası

Hava Flitresi

Sıvı Sistem-FACS Calibur

12

Örnek

SheathSheathDüzenleyiciDüzenleyici

Sheath Filitresi

Flow Cell

AtıkAtıkSheathSheathÖrnekÖrnek

geçiş düzenleyicigeçiş düzenleyici

Sıvı Sistem–FACSCanto II™

Compressor in wet cartCompressor in wet cart

SheathSheathRegulatorRegulator

Sheath Filitresi

Hava Filitresi Atık TankıAtık Tankı

Flow Cell

FACSFlow FACSFlow tanktankıı FACSCanto Wet

cart

13

Plenum Plenum reservoirreservoir

Örnek tüpü

SampleSampleRegulatorRegulator

FACSCantocihazı

Sıvı Sistem:BD FACSAriaII�Fluidic cart

– Cihaza sıvı akışını

sağlar ve vakum oluşturur.

1414

Optik Sistem:FACSCalibur 4CFL1

SSC

FL4 661/16

585/42

488/10

90/10 Beam Splitter

DM 560SP

FL2

530/30

15

Red Diode LaserRed Diode Laser~635 nm~635 nm

FL3

670LP

Floresans toplama lensi

DM 640LP

Yarım Ayna

488/10

488 nm488 nmBlue LaserBlue Laser FSC Diode

Odaklayıcı Lens

Beam Combiner

FlowCell

Optik Sistem: FACS CantoII-Aria II

Waste line

488 nm Mavi Lazer

FocusingLens

FSC

Beamreshape

To PMTTo PMT

633 nm Kırmızı Lazer

Collection lens

Pin hole block

Fiber optics

16

488 / 10

488 nm Mavi Lazer DiodeFSC

FACSFlowFACSFlow

Positive Positive Differential Differential PressurePressure

405 nm Mor Lazer

Optik Sistem:FACSCanto II-Aria II

Trigons Octagon

17

Elektronik Sistem

— Optik sinyalleri voltaj değerlere dönüştürür.

— Voltaj değerinin yüksekliğini, genişliğini ve alanını

18

— Voltaj değerinin yüksekliğini, genişliğini ve alanını hesaplar.

— Bilgi aktarımı görevi görür.

LaLazzerer

Voltaj değerinin oluşması

Zaman

Voltaj

19

LaLazzerer

LaLazzerer

ZamanVoltaj

Zaman

Voltaj

Hesaplanması..

Alan

Yükseklik

20

Zaman(µ Saniye)

Volt

Yükseklik

Genişlik0

Verilerin Dijital Çevrimi

Oluşan voltajların yükseklik değerlendirmeleri

Analogdan dijitale çevrim

Zaman

FSC

SSC

21

1000Kanallar

GPIOInterface

Analogdan dijitale dönüştürücü

0

Zaman

Zaman

Zaman

Zaman

SSC

FL1

FL2

FL3

Zaman

FL4

Dot Plot

Event 1

Event 2

Event 3

FSC SSC FL1 FL2

3030 6060 638638 840840

100100 160160 245245 8585

300300 650650 160160 720720

List-Mode Data

1000 1000

22

1000400 80000 200 400 600 800 1000

0

200

400

600

800

FL1

FL2

840

85

245 638FL1

FL2

0

200

400

600

800

200 600

Özet

FL2

Zaman

ZamanFSC

FL1

Veri

SSC

FSC

23

Zaman

Zaman

FL1

SSC

ZamanFL3

Veri işlemcisi

FL2

Zaman FL4

Örnek Hazırlama100 ul tam kan veya kemik iliği eklenir

20 ul floresan eklenir

Vorteks 15 dk inkübasyon2 ml BD Lysis Buffer eklenir

24

2 ml BD Lysis Buffer eklenir

Vorteks 10 dk inkübasyon

Santrifüj edilerek süpernatant uzaklaştırılır.

Hücreler yıkanır ve analize geçilir.

— BD Anti-CD4’ün CompBeadler üzerindeki yoğunlukları— FITC=1— PE-Cy7=4.9— APC=5.8— PE=4.3— PerCP-Cy5.5=1.5

Florokromların floresan yoğunlukları

25

— PerCP-Cy5.5=1.5 — Alexa700=0.91— APC-Cy7=1.2 — PerCP=0.68— Pacific Blue=0.15— AmCyan=0.1

Florokromlar

—Antijenin düşük seviyede ifade edildiği durumlarda florokromun yüksek

26

durumlarda florokromun yüksek seviyede ışıma vermesi gerekir.

2727

Neden Hücre Ayırırız?

Bir ya da birkaç farklı hücre populasyonu izole etmek için;

2828

Damla Oluşturulması

—Amplitude– Akıma uygulanan şiddeti belirler

—Frequency– Saniyede meydana gelen damla sayısını-sıklığını belirler.

29

—Drop 1– Görüntünün en üst noktası ile meydana gelen ilk damlanın orta noktası arasındaki pixel sayısıdır.

—Gap– Oluşan ilk bağımsız damla ile akım arasındaki pixel sayısıdır.

Analiz edildiği an = hücrenin lazere çarptığı an

Drop Delay; hücrenin A noktasından B noktasına ulaşması

A

Hücre ayrıştırması(Sorting):Nasıl?

3030

Elektrik yüklendiği an = ayrılma noktası

noktasına ulaşması sırasında geçen süredir. Damla sayısı ile ifade edilir.

B

Sorting

Örneğin oluşturduğu ışık saçılımları ve floresan sinyalleri analiz edilir.

Bir kablo yardımı ile akıma elektrik yüklenir

Elektrik yüklü damlacıklar oluşur.

plakalar aracılığı ile yüklü damlacık tüplere yönlendirilir.

31

Yüklü olmayan damlacıklar atık tankına gider.

Sort edilmesi istenen partikülleri içeren yüklenmiş damlalar toplanır.

Sorting öncesi ve sonrası saflık değerlendirmesi

Quadrant Statistics

Acquisition Date: 22-Apr-99

X Parameter: FL1 (Log)

Y Parameter: FL2 (Log)

Quad Events % Gated % Total

UL 3 0.07 0.03

UR 68 1.66 0.68

LL 2071 50.67 20.71

SSSSort öncesi örnek dağılımı

CD3+TCR+

3232

LL 2071 50.67 20.71

LR 1945 47.59 19.45

CD3+ CD3+ CD3+ CD3+ ve TCR+TCR+TCR+TCR+Hücrelerin sort sonrası dağılımı

Saflık %’si

Quadrant Statistics

Acquisition Date: 22-Apr-99

X Parameter: FL1 (Log)

Y Parameter: FL2 (Log)

Quad Events % Gated % Total

UL 0 0.00 0.00

UR 177 99.44 78.67

LL 0 0.00 0.00

LR 1 0.56 0.44

Lösemide BCR-ABL

•t(9;22) Kromozomal translokasyonu (Philadelphia kromozomu) BCR ve ABL genlerinin füzyonuna neden olur.

33

• KML’de >%95 (tanı kriteri)

• erişkin precursor B-ALL’de %25-40

• pediatric precursor B-ALL ‘de %3-6

oranında görülmektedir.

BCR-ABL Kalitatif Araştırma Kiti

5' BCR geni ABL geni

füzyon gen

transkripsyon

ÇekirdekÇekirdek bead

bead

CBA BONCUĞU BAĞLIBCR ANTİKORU

Hücre

34

translasyon

AB

SitoplazmaSitoplazma

Füzyon proteini

bead

B

FÜZYON PROTEİNİNİN YAKALANMASI

PEFLOROKROMU İLE TESPİT EDİLMESİPatents:

US 6,610,498 B1 (26 August 2003)US 6,686,165 B2 (3 February 2004)

Hücre

Lizatı

Veri Alımı :

BCR-ABL negatif

35

BCR-ABL pozitif

BCR-ABL’nin tüm alt tiplerinin tanımlanması :

697 (t(1;19) (neg. kontrol)

36

TOM-1, BCR-ABL+ (p190)

LAMA-84, BCR-ABL+ (p210)

AR230, BCR-ABL+ (p230)

Translokasyonların tespitinde kullanılan diğer metodlar

Sitogenetik (RQ)-PCRFISH

37

Metodlara ait Parametreler

Metod Gereken

Zaman

Notlar

Sitogenetik 3-10 gün Hücre kültürü ve birçok farklı ürün gerektirir.

Manuel - Otomatize

38

FISH 1-2 gün,

(gönderilirse 2-7 gün)

Manuel

PCR 3 saat

(gönderilirse 2-7 gün)

Manuel - Otomatize

Foxp3 (259D klonu)(BD)hakkında

—Foxp3 T-regülatör hücrelerini tanımlamak için kullanılır. İnsan T-reg hücrelerini fonksiyonlarına göre belirlemek amaçlı CD127 ile birlikte kullanımı önerilmektedir.

—BD bünyesinde insan T-reg hücrelerini bütünüyle incelemek amaçlı Foxp3 (hücre içi) ve CD127 (yüzey) içeren kitler mevcuttur.

39

mevcuttur.

—Foxp3 259D klonu özgüllüğünden ötürü konu ile ilgili yayınlarda en çok görülen ürün olmuştur.

CD127; insan periferik kan tek çekiredekli hücrelerinden canlı T-reg hücrelerini ayırır.

40

CD4+ kapılanmış hücrelerde CD127 ve CD25 işaretlenmesi gösterilmektedir.

T-reg hücrelerinin fenotipik analizleriHücrelerin CD127 ve CD25 ifade etme özelliklerine göre incelenmiştir.

CD4 -PerC

P

CD25 düşük/CD127 yüksek

CD127yüksek

hücreler, Foxp3’ü neredeyse hiç ifade etmezler.

41

CD4

Foxp3 APCİsotipik kontrol-APC Foxp3 APC

etmezler.

CD25 yüksek/CD127 düşük

CD4 -PerC

P CD127 düşük

hücrelerde Foxp3 ifadesi yüksektir.

BD Stem Cell Enumeration Kit— CD45 FITC/CD34 PE

— Ammonium Chloride Liziz solüsyonu 10x

— 7-aminoactinomycin-D (7-AAD)

42

AAD)

— BD TrucountTM tüpleri

— Kit başına 50 test

— Okutma ve analiz için oluşturulmuş kalıplar

BD Trucount Mutlak Sayım Tüpleri

—Mutlak sayı vermek amaçlı BD Stem Cell Enumeration kit ile kullanılır.

—Lyophilize edilmiş ve bilinen sayıda floresan

43

bilinen sayıda floresan işaretli boncuk içerenpelletten meydana gelir.

Çalışılabilecek Örnek Tipleri

—Periferik Kan

—Kemik İliği

—Aferez Ürünü

44

—Aferez Ürünü

—Kordon Kanı

Veri analizi..

Kapı

Hesaplama için gereken veriler

45

Kapı İstatistikleri

Sonuçlar

Teşekkür Ederim..

46

Ederim..

İrem Akar Soycan