AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BUAH DAN

DAUN MENGKUDU

ANNISA MULYANINGRUM UTAMI

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

ABSTRAK ANNISA MULYANINGRUM UTAMI. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah dan Daun

Mengkudu. Dibimbing oleh ELLY SURADIKUSUMAH dan ZULHAN ARIF.

Bagian buah dan daun mengkudu (Morinda citrifolia) memiliki kemampuan sebagai antioksidan alami. Penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas antioksidan, total

fenol, dan golongan senyawa antioksidan dari fraksi ekstrak daun dan buah mengkudu.

Ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu difraksionasi menggunakan kromatografi

kolom menghasilkan 4 dan 7 fraksi berdasarkan profil kromatografi lapis tipis (KLT) yang sama. Aktivitas antioksidan dari fraksi-fraksi ekstrak ditentukan menggunakan

metode 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dan kandungan fenol totalnya diukur

menggunakan metode Folin-Cioacalteau. Fraksi 1 (IC50 38.18 ppm) dari 4 fraksi ekstrak buah dan fraksi 5 (IC50 85.86 ppm) dari 7 fraksi ekstrak daun menunjukkan aktivitas

antioksidan tertinggi, tetapi lebih rendah daripada vitamin C (IC50 3.85 ppm). Kandungan

fenol total sebesar 0.40 mg ekuivalen asam galat/g serbuk buah kering dan 1.15 mg

ekuivalen asam galat/g serbuk daun kering. Berdasarkan hasil uji fitokimia, diduga senyawa alkaloid dan flavonoid berperan sebagai antioksidan di dalam buah dan daun,

serta senyawa selain fenol berperan sebagai antioksidan di dalam buah.

ABSTRACT

ANNISA MULYANINGRUM UTAMI. Antioxidant Activity of Noni`s Fruit and Leaf

Extract. Supervised by ELLY SURADIKUSUMAH and ZULHAN ARIF.

Different parts of noni (Morinda citrifolia) plant including fruit and leaf exhibited

antioxidant activity. This study was conducted to investigate the antioxidant activity, total phenol, and antioxidant compound group of Noni`s leaf and fruit extracts fractions. This

fruit and leaf ethyl acetate extracts were fractionated by column chromatography, yielded

4 and 7 fractions based on the identical thin layer chromatography (TLC) profile. Antioxidant activities of extracts fractions were determined by radical scavenging assay

using 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) radical and the total phenolic contents were

measured using Folin-Ciocalteau method. Fraction 1 (IC50 38.18 ppm) of 4 fruit extract fractions and fraction 5 (IC50 85.86 ppm) of 7 leaf extract fractions revealed the highest

antioxidant activity, though lower than vitamin C (IC50 3.85 ppm). The total phenolic

contents varied from 0.40 mg of gallic acid equivalent/gram dry fruit and 1.15 mg of

gallic acid equivalent/gram dry leaf. The result of phytochemical analysis confirmed the responsible antioxidant compounds present in fruit and leaf were considered as alkaloid

and flavonoid. In addition, nonphenol compounds had a role as antioxidant acitivity in

fruit.

AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BUAH DAN

DAUN MENGKUDU

ANNISA MULYANINGRUM UTAMI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2010

Judul : Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah dan Daun Mengkudu

Nama : Annisa Mulyaningrum Utami

NIM : G44050304

Menyetujui

Pembimbing I, Pembimbing II,

Ir. Elly Suradikusumah, MS

NIP 19450214 197010 2 001 Zulhan Arif, SSi

Mengetahui

Ketua Departemen,

Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS

NIP 19501227 197603 2 002

Tanggal Lulus :

PRAKATA Segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan segala rahmat-Nya,

sehingga penulis mampu menyelesaikan karya ilmiah yang dilaksanakan sejak bulan Juni

hingga Oktober 2009 di Laboratorium Kimia Analitik dan Pusat Studi Biofarmaka. Tema yang dipilih adalah antioksidan, dengan judul “Aktivitas Antioksidan Ekstrak Buah dan

Daun Mengkudu”

Selama penelitian sampai penulisan karya ilmiah ini, penulis mendapatkan

banyak bimbingan dan dorongan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Ir Elly Suradikusumah, MS. dan Bapak Zulhan

Arif, SSi. selaku pembimbing penelitian ini. Ucapan terima kasih tak terhingga kepada

ayah, ibu, dan adik-adik atas doa-doa, nasihat, semangat, dan bantuan materi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf laboratorium Kimia

Analitik (Pak Eman, Bu Nunung, Pak Dede, Pak Kosasih, Pak Ridwan) dan Pusat Studi

Biofarmaka, serta teman-teman angkatan 42 yang selalu memberikan dorongan dan doa

(Ida, Ufa, Malia, Siti, Rhenny, Ecep, Ois, Mbak Janti, Eem). Terima kasih atas bantuan dan semangat yang diberikan, semoga mendapat balasan pahala dari Allah SWT.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Januari 2010

Annisa Mulyaningrum Utami

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 29 Januari 1987 dari pasangan

H. Sutarno dan Hj. Darmani. Penulis merupakan anak pertama dari lima bersaudara.

Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Bhinneka Karya 2 Boyolali dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).

Penulis memilih Program Studi Kimia, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif mengikuti organisasi kemaha-siswaan atau Himpunan Profesi Kimia/Imasika menjadi staf Departemen Keilmuan.

Penulis menjadi asisten praktikum Kimia Fisik Layanan pada tahun ajaran 2007/2008;

Kimia Analitik Layanan 2008/2009; Kimia Analitik 2 2008/2009; Kimia Tingkat Persiapan Bersama (TPB) 2008/2009; dan Analisis Komponen Aktif dan Uji aktivitas

Diploma 2009/2010. Pada bulan Juli-Agustus 2008, penulis berkesempatan melaksanakan

kegiatan praktik lapangan di PT Jakarana Tama di bagian Quality Control.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ................................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. viii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................... ix

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA

Mengkudu .................................................................................................... 1 Antioksidan .................................................................................................. 2

Mekanisme Kerja Antioksidan ...................................................................... 2

2,2’-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) ............................................................. 3

Analisis Kuantitatif Total Fenol .................................................................... 3

Ekstraksi dan Fraksionasi Senyawa Metabolit Sekunder ............................... 3

BAHAN DAN METODE

Lingkup Kerja ............................................................................................ 4

Alat dan Bahan ........................................................................................... 4

HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air ................................................................................................... 6

Ekstrak ....................................................................................................... 6

Ekstrak Teraktif .......................................................................................... 7

Fraksi ......................................................................................................... 7 Kandungan Fitokimia ................................................................................. 8

Aktivitas Antioksidan ................................................................................. 8

Kandungan Fenol Total .............................................................................. 10

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ................................................................................................... 11

Saran .......................................................................................................... 11

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 11

LAMPIRAN ........................................................................................................... 13

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Uji fitokimia buah mengkudu ............................................................................... 8

2 Uji fitokimia daun mengkudu ............................................................................... 8

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Mengkudu ........................................................................................................... 1

2 Reaksi DPPH dan antioksidan ............................................................................. 3

3 Fraksionasi dengan kromatografi kolom. ............................................................ 4

4 Kromatografi lapis tipis (KLT) ............................................................................ 4

5 Profil KLT bioautografi dengan larutan DPPH 1 mM dari berbagai ekstrak ......... 7

6 Profil KLT eluen terbaik ...................................................................................... 7

7 Profil KLT bioautografi dengan larutan DPPH 1 mM dari fraksi ekstrak etil asetat mengkudu ............................................................................... 8

8 Nilai IC50 fraksi teraktif ....................................................................................... 9

9 Reaksi antara flavonoid dan DPPH ...................................................................... 9

10 Reaksi antara asam askorbat dan DPPH ............................................................... 10

11 Kandungan fenol total fraksi teraktif .................................................................... 10

12 Hubungan antara IC50 dan kandungan fenol total. ................................................ 11

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Diagram alir penelitian ....................................................................................... 14

2 Diagram alir uji fitokimia ................................................................................... 15

3 Penetapan kadar air buah dan daun mengkudu ................................................... 16

4 Penentuan rendemen ekstrak kasar buah dan daun mengkudu.............................. 17

5 Penentuan eluen terbaik menggunakan kromatografi lapis tipis ........................... 17

6 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat buah

mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1) ............................................... 18

7 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat daun

mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1) ............................................... 19

8 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0.05 mM ....... ……….. 22

9 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak buah mengkudu………… 23

10 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak daun mengkudu ............... 24

11 Penentuan aktivitas antioksidan vitamin C .......................................................... 25

12 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan asam galat 100 ppm ............... 26

13 Penentuan kandungan fenol total dari fraksi teraktif ekstrak buah dan daun

mengkudu .......................................................................................................... 27

PENDAHULUAN

Antioksidan merupakan senyawa yang

mampu memperlambat, menghambat, atau

mencegah oksidasi lemak atau molekul lain.

Berdasarkan asalnya, terdapat dua macam antioksidan, yaitu antioksidan alami dan

antioksidan sintetik. Tubuh manusia tidak

mempunyai cadangan antioksidan dalam

jumlah berlebih, sehingga jika terdapat radikal

berlebih maka tubuh membutuhkan antioksi-

dan eksogen. Adanya kekhawatiran akan

kemungkinan efek samping yang belum

diketahui dari antioksidan sintetik menyebab-

kan antioksidan alami menjadi alternatif yang

sangat dibutuhkan (Javanmardi et al. 2003).

Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan spesies

oksigen reaktif, mampu menghambat terja-

dinya penyakit degeneratif serta mampu

menghambat peroksida lipid pada makanan.

Meningkatnya minat untuk mendapatkan

antioksidan alami terjadi beberapa tahun

terakhir ini.

Mengkudu (Morinda citrifolia) meru-

pakan salah satu tanaman obat yang dapat

digunakan untuk pengobatan berbagai macam

penyakit di antaranya kanker, infeksi, artritis,

diabetes, asma, hipertensi, dan luka (Wang et al. 2002). Zin et al. (2002) menyatakan bahwa

bagian buah dan daun mengkudu memiliki

kemampuan sebagai antioksidan alami.

Aktivitas antioksidan memiliki hubungan

yang linier positif dengan kandungan fenol di

dalam ekstrak buah mengkudu (Rohman et al.

2006). Senyawaan fenol terutama asam

fenolat dan flavonoid merupakan antioksidan

alami di dalam buah, sayur, dan tanaman lain

(Kahkonen et al. 1999). Pada penelitian ini

melakukan penentuan fraksi teraktif ekstrak buah dan daun mengkudu melalui pengujian

terhadap radikal bebas DPPH, kemudian

menentukan kandungan fenol total, aktivitas

antioksidan, dan identifikasi golongan senya-

wa antioksidannya melalui uji fitokimia.

Penentuan aktivitas antioksidan dari fraksi

ekstrak mengkudu pada penelitian ini adalah

metode DPPH. Metode ini merupakan metode

analisis antioksidan berdasarkan penangkapan

radikal bebas dengan DPPH sebagai radikal

bebasnya serta salah satu metode spektro-

fotometrik yang mudah dan banyak digunakan untuk penentuan aktivitas antioksidan

Metode analisis senyawa metabolit sekun-

der dilakukan dengan pemisahan kromatografi

kolom. Ekstrak difraksionasi dan diuji aktivi-

tas antioksidannya, dan fraksi yang paling

aktif dianalisis kandungan fenol totalnya de-

ngan metode Folin-Ciocalteau. Secara ring-

kas, penelitian ini bertujuan untuk menentu-

kan aktivitas antioksidan dan kandungan fenol

total fraksi ekstrak etil asetat buah dan daun

mengkudu, serta menentukan golongan senya-

wa antioksidannya.

TINJAUAN PUSTAKA

Mengkudu

Mengkudu (Morinda citrifolia) meru-

pakan tanaman liar yang memiliki tinggi 2–6

meter. Daunnya tebal, lebar, dan berbentuk

lonjong mengkilat. Daun mengkudu yang

besar memiliki lebar 15–30 cm dan panjang 20–40 cm. Buah mengkudu bervariasi uku-

rannya, yaitu lebar mulai dari 3 sampai 10 cm

dan kadang ada yang panjang mencapai 20 cm

(Gambar 1). Permukaan buah seperti terbagi

dalam sel-sel poligonal (segi banyak) yang

berbintik-bintik dan berkutil. Mula-mula buah

berwarna hijau, menjelang masak menjadi

putih kekuningan. Setelah matang, warnanya

putih transparan dan lunak. Setelah lunak,

daging buah mengkudu banyak mengandung

air dan aromanya seperti keju busuk

disebabkan adanya asam butirat yang muncul setelah buah matang (McClatchey 2002).

(a) (b)

Gambar 1 Morinda citrifolia a) Buah, b)

Daun.

Mengkudu diklasifikasikan ke dalam

kingdom Plantae, divisi Spermatophyta, sub-

divisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae,

ordo Gentianales, famili Rubiceae, genus Morinda, dan spesies Morinda citrifolia Roxb.

Nama lain mengkudu adalah pace (Jawa

Tengah dan Jawa Timur), cangkudu (Jawa

Barat), sedangkan di Sumatra mengkudu

diberi nama eodu, kumudee, lengkudu,

bangkudu. Mengkudu dikenal di berbagai

negara dengan nama yang berbeda seperti

Indian mulberry (India), nono (Tahiti dan

Rara tonga), polynesian bush fruit, painkiller

tree (Kepulauan Karibia), lada (Guam),

mengkudo (Malaysia), nhau (Asia Tenggara),

-H2O

+H2O

grand morinda (Vietnam), cheesefruit (Aus-

tralia), kura (Fiji), dan bumbo (Afrika) (Elkins

1998).

Antioksidan alami merupakan metabolit

sekunder dalam tanaman. Kandungan senya-

wa antioksidan dari buah dan daun mengkudu

di antaranya β-karoten, terpenoid, asam askor-

bat, alkaloid, β-sitosterol, polifenol seperti

flavonoid, flavon glikosida, dan asam hidroksi

fenolat (Wang et al. 2002). Hasil analisis

aktivitas antioksidan ekstrak kasar etil asetat buah dan daun mengkudu dengan metode

ferric thiocyanate (FTC) dan thiobarbituric

acid (TBA) menunjukkan bahwa ekstrak buah

dan daun mengkudu memiliki aktivitas anti-

oksidan (Zin et al. 2002).

Antioksidan

Antioksidan merupakan inhibitor penting

terhadap peroksidasi lemak, yaitu sebagai

pelindung makanan dan pertahanan sel makhluk hidup melawan kerusakan oksidatif

(Vimala & Adenan 1999). Antioksidan dalam

tubuh bermanfaat untuk mencegah reaksi

oksidasi yang ditimbulkan oleh radikal bebas

baik berasal dari metabolisme tubuh maupun

faktor eksternal lainnya.

Radikal bebas adalah atom atau molekul

yang tidak stabil dan sangat reaktif karena

mengandung satu atau lebih elektron tidak

berpasangan pada orbital terluarnya. Radikal

bebas akan bereaksi dengan molekul di sekitarnya untuk memperoleh pasangan

elektron supaya mencapai kestabilan atom

atau molekul. Reaksi ini akan berlangsung

terus menerus dalam tubuh dan bila tidak

dihentikan akan menimbulkan berbagai

penyakit seperti kanker, jantung, katarak,

penuaan dini, serta penyakit degeneratif

lainnya. Oleh karena itu tubuh memerlukan

suatu substansi penting, yaitu antioksidan

yang mampu menangkap radikal bebas

tersebut sehingga tidak dapat menginduksi

suatu penyakit (Kikuzaki & Nakatani 1993). Beberapa sumber utama antioksidan di

antaranya enzim, molekul besar (albumin,

seruloplasmin, feritin), molekul kecil (asam

askorbat, asam urat, tokoferol, karotenoid,

fenol), dan beberapa hormon seperti estrogen

dan lain-lain (Prior et al. 2005).

Mekanisme Kerja Antioksidan

Mekanisme kerja antioksidan secara

umum menghambat oksidasi substrat yang terjadi dalam tiga tahap utama, yaitu iniasi,

propagasi, dan terminasi. Tahap inisiasi terjadi

pembentukan radikal substrat, yaitu turunan

substrat yang bersifat tidak stabil dan sangat

reaktif akibat hilangnya satu atom H. Radikal

substrat akan bereaksi dengan oksigen

membentuk radikal peroksi pada tahap

propagasi. Radikal peroksi lebih lanjut akan

menyerang substrat menghasilkan hidrope-

roksida dan radikal substrat baru (Javanmardi

et al. 2003).

Reaksi inisiasi

RH R● + H

●

Reaksi propagasi

R● + O2 ROO

●

ROO● + RH ROOH + R

●

Reaksi Terminasi

ROO● + ROO

● ROOR + O2

ROO● + R

● ROOR

Antioksidan mampu mendeaktivasi radikal

melalui dua mekanisme utama, yaitu perpin-dahan atom hidrogen (PAH) dan perpindahan

elektron bebas (PEB). Hasil akhir dari kedua

mekanisme adalah sama tetapi kinetika dan

potensial reaksinya berbeda. Reaksi PEB dan

PAH mungkin terjadi secara paralel. Meka-

nisme yang mendominasi dalam sistem

ditentukan oleh struktur dan sifat antioksidan,

kelarutan dan koefisien partisi pelarut.

Metode PAH mengukur kemampuan dari

antioksidan dalam menstabilkan radikal bebas

dengan memberikan atom hidrogennya (AH). Kapasitas pengukuran berdasarkan pada

kinetikanya. Reaksi PAH tidak bergantung

pada pelarut dan pH, biasanya berlangsung

dengan cepat yaitu hanya beberapa detik atau

menit.

X● + AH XH + A●

Metode PEB mengukur kemampuan dari

antioksidan melalui proses perpindahan satu

elektron untuk mereduksi berbagai senyawa

seperti logam, karbonil, dan radikal (Prior et al. 2005).

(1) X●+ AH X− + AH●+

(2) AH●+ A● + H3O+

(3) X−+ H3O+ XH + H2O

(4) M(III) + AH AH+ + M(II)

Reaksi (1), (2), (3) merupakan reaksi reduksi

senyawa radikal dan karbonil, sedangkan

reaksi (4) merupakan reaksi reduksi senyawa

logam. Reaktivitas relatif metode ini berdasarkan pada deprotonasi dari gugus

fungsional yang reaktif. Secara umum,

meningkatnya kapasitas donor elektron

melalui deprotonasi menyebabkan mening-

katnya pH, sehingga reaksi bergantung pada

pH. Reaksi PAH umumnya lambat sehingga

kapasitas antioksidannya tidak berdasarkan

kinetika, tetapi pada persen penurunan produk

reaksi.

2,2’-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH)

Metode penentuan aktivitas antioksidan

terdiri atas asam 2-tiobarbiturat (TBA), ke-mampuan mereduksi ion feri (FRAP), 2,2’-

Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH), kapasitas

mereduksi kupri (CUPRAC), 2,2’-Azinobis(3-

etil-benzotiazolin-6-asam sulfonat) (ABTS),

dan kapasitas absorbansi radikal oksigen

(ORAC) (Michalowska et al. 2007). Metode

DPPH merupakan metode yang sering

digunakan untuk penentuan aktivitas anti-

oksidan. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil dalam larutan berair atau metanol dan

memiliki warna ungu yang ditunjukkan oleh

pita absorpsi dalam pelarut metanol pada

panjang gelombang sekitar 515-520 nm.

DPPH bersifat peka terhadap cahaya, oksigen,

dan pH. Namun, DPPH bersifat stabil dalam

bentuk radikal sehingga mungkin dilakukan

pengukuran aktivitas antioksidan yang cukup

akurat. Metode DPPH hanya mampu mengu-

kur aktivitas antioksidan yang mekanime

kerjanya PAH. Radikal bebas DPPH dapat menangkap atom hidrogen dari komponen

aktif ekstrak yang dicampurkan, kemudian

bereaksi menjadi bentuk tereduksinya dan

ditandai dengan berkurangnya intensitas

warna ungu larutan DPPH (Gambar 2).

(a) (b)

Gambar 2 Reaksi DPPH dan antioksidan, (a)

DPPH bentuk radikal, (b) DPPH

bentuk nonradikal (Molyneux 2004).

Berdasarkan reaksi tersebut, senyawa

antioksidan (RH) melepas atom hidrogen

menjadi radikal senyawa antioksidan (R●).

DPPH yang merupakan radikal bebas

direaksikan dengan senyawa antioksidan dan

membentuk DPPH yang nonradikal (DPPHn)

(Molyneux 2004).

Pengujian keberadaan senyawa antioksi-

dan dalam bahan dapat dilakukan mengguna-kan metode kromatografi lapis tipis (KLT)

bioautografi, yaitu menggabungkan KLT dan

bioassay. Metode ini cepat dan melokalisasi

senyawa aktif dari ekstrak. Ekstrak dipisahkan

secara kromatografi menggunakan eluen

terbaik, kemudian plat diuji dengan pereaksi

DPPH. Warna noda yang pucat menunjukkan

adanya senyawa antioksidan (Hostettman et

al. 1997).

Kuantitatif Total Fenol

Kadar fenol total dapat ditentukan dengan

pereaksi Folin-Ciocalteau. Pereaksi ini biasa-

nya digunakan pada metode Lowry untuk

menentukan konsentrasi protein. Pereaksi

Folin tidak memiliki gugus fenol, tetapi

bersifat sensitif untuk mengoksidasi senyawa-

senyawa fenol. Reaksi antara pereaksi Folin

dan senyawa fenol menghasilkan senyawa

kompleks warna biru, sehingga dapat diukur

serapannya dengan spektrofotometer Ultra-

violet-Tampak (UV-tampak) pada panjang gelombang 750 nm (Rohman et al. 2006).

Ekstraksi dan Fraksionasi Senyawa

Metabolit Sekunder dari Tumbuhan

Ekstraksi merupakan suatu proses yang

secara selektif mengambil zat terlarut yang

terkandung dalam suatu campuran dengan

bantuan pelarut. Metode pemisahan pada

ekstraksi pelarut menggunakan prinsip kelaru-

tan like dissolve like, yaitu pelarut polar akan melarutkan zat polar dan sebaliknya. Hal-hal

yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan

pelarut adalah selektivitas, sifat racun, dan

kemudahannya untuk diuapkan (Khopkar

2002).

Salah satu prosedur klasik untuk mem-

peroleh kandungan senyawa organik dari

jaringan tumbuhan ialah maserasi. Metode

maserasi digunakan untuk mengekstraksi

contoh yang relatif tidak tahan panas. Metode

ini dilakukan hanya dengan merendam contoh

dalam suatu pelarut dengan lama waktu tertentu, biasanya selama 24 jam tanpa meng-

gunakan pemanasan. Kelebihan metode mase-

rasi, yaitu sederhana, tidak memerlukan alat-

alat yang rumit, relatif murah, serta dapat

menghindari kerusakan komponen senyawa

yang tidak tahan panas. Kelemahannya di

antaranya dari segi waktu yang lama dan

penggunaan pelarut yang tidak efisien. Pemi-

lihan pelarut untuk proses maserasi akan

memberikan efektivitas yang tinggi dengan

memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam pada pelarut tersebut (Rohman et al.

2006).

Fraksionasi adalah proses pemisahan kom-

ponen dalam suatu ekstrak menjadi kelompok-

kelompok senyawa yang memiliki kemiripan

karakteristik secara kimia (Houghton &

Raman 1998). Teknik fraksionasi dapat dila-

kukan dengan kromatografi kolom, yaitu

teknik analisis untuk menentukan jumlah

komponen dalam suatu campuran senyawa,

dan juga untuk memisahkan dan memurnikan

komponen senyawa tertentu dari campuran-

nya. Pemisahan kromatografi kolom ini meng-gunakan suatu pelarut pengelusi yang dialir-

kan secara kontinu melalui kolom dan kompo-

nen demi komponen dari campuran pada

akhirnya keluar dari kolom kemudian dapat

dikumpulkan dan difraksionasi (Gambar 3)

(Rouessac & Rouessac 1994).

Gambar 3 Fraksionasi dengan kromatografi

kolom (a) bahan yang dibutuhkan

(C, kolom; SP, fase stasioner; MP,

fase mobil; dan S, contoh); (b)

contoh dimasukkan; (c) proses elusi

dimulai; (d) hasil separasi

diperoleh; (Rouessac & Rouessac

1994).

Kromatografi lapis tipis merupakan jenis

kromatografi partisi menggunakan sebuah

lapis tipis silika atau alumina yang seragam

pada sebuah lempeng gelas atau logam yang

keras. Fase diam untuk kromatografi lapis

tipis seringkali juga mengandung substansi yang dapat berpendar dalam sinar ultraviolet.

Fase gerak merupakan pelarut atau campuran

pelarut yang sesuai (Furniss et al. 1989).

Pergerakan zat relatif terhadap garis depan

pelarut dalam sistem kromatografi tertentu

dapat didefinisikan sebagai nilai Rf, yaitu

perbandingan jarak tempuh zat dengan jarak

tempuh garis depan pelarut (Gambar 4).

(a) (b)

Gambar 4 Kromatografi lapis tipis, (a)

chamber, tempat pengembangan

pelat KLT; (b) plat KLT dalam

penentuan Rf (Furniss et al.

1989).

BAHAN DAN METODE

Lingkup Kerja

Secara garis besar metode penelitian ini

dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama adalah ekstraksi maserasi buah dan daun

mengkudu dengan metanol lalu ekstraksi cair-

cair dengan etil asetat. Tahap kedua, yaitu

melakukan fraksionasi terhadap ekstrak kasar

etil asetat buah dan daun, menentukan aktivi-

tas antioksidan dan kandungan fenol total

terhadap fraksi teraktif dari ekstrak. Bagan alir

penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah

spektrofotometer UV-tampak (Shimadzu

PharmaSpeck UV-1700).

Bahan-bahan yang digunakan dalam

penelitian ini adalah contoh buah dan daun

mengkudu dari perkebunan Pusat Studi Bio-

farmaka, DPPH dari Sigma, plat KLT SiO2 60

F254 dan silika gel G60 F254 dari Merck.

Penentuan Kadar Air (AOAC 2006)

Cawan porselin dikeringkan pada suhu

105 ºC selama 30 menit lalu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 3 g

contoh buah dan daun mengkudu masing-

masingnya dimasukkan dalam cawan dan

dipanaskan pada suhu 105 ºC selama 3 jam

sampai diperoleh bobot konstan, kemudian

didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.

Penetapan kadar air ini dilakukan berdasar-

kan penentuan jumlah bobot kering contoh.

Kadar air (%) = %100A

BA

keterangan:

A adalah bobot contoh (g)

B adalah bobot bahan setelah dikeringkan (g)

Ekstraksi Buah dan Daun Mengkudu (Zin

et al. 2002)

Serbuk buah dan daun mengkudu dibebas-

kan dari lemak dengan menggunakan heksana.

Sebanyak 150 gram serbuk kering buah dan

daun mengkudu masing-masingnya dimasuk-

kan ke dalam labu erlemeyer, ditambah 300

mL heksana, dan direndam selama 12 jam.

Residu dikeringkan pada suhu kamar selama

24 jam, selanjutnya diekstraksi dengan

metanol. Residu ditambah 600 mL metanol dan direndam selama enam jam sambil sekali-

kali diaduk, kemudian didiamkan selama 24

jam. Maserat dipisahkan dan proses diulang 2

kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang

sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuap-

kan dengan penguap putar tekanan rendah

hingga diperoleh ekstrak metanol yang

volumenya 1/10 volume awal. Ekstrak

metanol diekstraksi cair-cair sebanyak tiga

kali dengan etil asetat dengan perbandingan

volume 1:1. Fraksi yang larut dalam etil asetat

dikumpulkan, kemudian diuapkan dengan

penguap putar tekanan rendah dan dike-ringbekukan, serta dilanjutkan dengan uji

berikutnya.

Uji Fitokimia (Harborne 1987)

Uji Flavonoid. Sebanyak 0.1 gram

ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu

ditambahkan 10 mL air panas kemudian

dididihkan selama 5 menit dan disaring.

Sebanyak 10 mL filtrat ditambahkan 0.5 gram

serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 1 mL amil

alkohol. Campuran dikocok kuat-kuat. Uji positif ditandai dengan munculnya warna

merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil

alkohol.

Uji Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak

0.1 gram ekstrak etil asetat buah dan daun

mengkudu dilarutkan dengan 25 mL etanol

(50 ºC), disaring dan residu ditambahkan eter.

Filtrat ditambahkan 3 tetes asam asetat anhi-

drat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara

berurutan. Larutan dikocok perlahan dan

dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu

untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk

steroid.

Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 gram ekstrak

etil asetat buah dan daun mengkudu dilarutkan

dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes

NH4OH dan disaring ke dalam tabung reaksi

tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung

reaksi dikocok dengan penambahan 10 tetes

H2SO4 2 M kemudian lapisan asamnya

dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain.

Lapisan asam ini diteteskan pada pelat tetes dan ditambahkan pereaksi Meyer, Wagner,

dan Dragendorf yang akan menimbulkan

endapan warna berturut-turut putih, cokelat,

dan merah jingga.

Uji Saponin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak

etil asetat buah dan daun mengkudu ditam-

bahkan ke dalam 10 mL air panas dan didi-

dihkan selama 5 menit lalu disaring. Filtrat

dikocok dalam tabung reaksi tertutup selama

10 detik untuk kemudian dibiarkan 10 menit.

Adanya saponin ditunjukkan dengan terben-tuknya buih stabil.

Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram ekstrak etil

asetat buah dan daun mengkudu ditambah-

kan ke dalam 10 mL air panas dan dididihkan

selama 5 menit lalu disaring. Filtrat di-

tambahkan 10 mL FeCl3 1%. Uji positif

ditandai munculnya warna hijau kehitaman.

Bagan alir uji fitokimia dapat dilihat pada

Lampiran 2.

Pemilihan Eluen Terbaik

Pelarut atau fase gerak yang akan digu-nakan untuk fraksionasi ekstrak buah dan

daun mengkudu dipilih pelarut terbaik yang

dihasilkan dari kromatografi lapis tipis, yaitu

heksana:etil asetat 1:1, heksana:etil asetat 2:1,

etil asetat:toluena 1:1, metanol:kloroform 1:9

etil asetat:diklorometana 7:3. Noda hasil elusi

oleh berbagai pelarut dilihat di bawah sinar

lampu ultraviolet pada panjang gelombang

254 dan 366 nm.

Fraksionasi dengan Kromatografi Kolom

(Rouessac & Rouessac 1994)

Fraksionasi dilakukan dengan pengemasan

kolom sebanyak 30 g silika gel untuk pemisa-

han 1.5 gram ekstrak dengan diameter 2 cm

dan tinggi kolom 30 cm. Pengemasan kolom

menggunakan silika gel 15-20 kali jumlah

ekstrak dan perbandingan tinggi adsorben dan

diameter kolom 8:1. Ekstrak etil asetat buah

dan daun mengkudu dilarutkan dalam eluen

terbaik, kemudian dipisahkan komponen-

komponennya dengan kolom kromatografi dengan elusi gradien (peningkatan kepolaran).

Eluat ditampung setiap 5 mL dalam tabung

reaksi yang telah diberi nomor kemudian diuji

dengan KLT. Noda pemisahan dideteksi di

bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm. Eluat

yang memiliki Rf dan pola KLT yang sama

digabungkan sebagai satu fraksi dan diuji

aktivitas antioksidan dengan KLT bioautogra-

fi sehingga diperoleh fraksi teraktif.

Penentuan Aktivitas Antioksidan (Hanani

2005) Sebanyak 10 mg ekstrak dilarutkan dengan

metanol dalam labu takar 10 mL, maka

didapatkan konsentrasi 1000 ppm. Kemudian

ekstrak 1000 ppm diencerkan dengan menam-

bahkan metanol sehingga diperoleh ekstrak

dengan konsentrasi 10, 30, 50, 70, 90 ppm.

Masing-masing konsentrasi larutan contoh

dipipet 0.2 mL ke dalam vial, kemudian

ditambahkan 3.8 mL larutan DPPH 50 µM.

Campuran dihomogenkan dan dibiarkan sela-

ma 30 menit di tempat gelap. Serapan diukur dengan spektrofotometer UV-tampak pada

panjang gelombang 515 nm. Sebagai pemban-

ding digunakan asam askorbat (konsentrasi 2,

3, 4, 5, 6 ppm) dengan perlakuan yang sama

dengan contoh uji. Nilai IC50 fraksi dan asam

askorbat dihitung dengan menggunakan ru-

mus persamaan regresi.

Persentase inhibisi =100

)(01

K

SSK

K : absorbansi kontrol negatif/blanko DPPH S1 : absorbansi contoh dengan penambahan

DPPH

S0 : absorbansi contoh tanpa penambahan

DPPH

Penentuan Kandungan Fenol Total (Chun

et al. 2003)

Kandungan fenol total fraksi ekstrak etil

asetat ditentukan menggunakan metode Folin-

Ciocalteau. Sebanyak dua mg ekstrak di-

larutkan dengan tiga mL metanol, maka

didapatkan konsentrasi ekstrak 2 mg/3 mL pelarut. Sebanyak 200 μL larutan asam galat

berbagai konsentrasi (50, 75, 100, 125, 150

ppm) dan larutan contoh (2 mg/3 mL) ma-

sing-masing dimasukkan ke dalam labu takar

10 mL dan ditambahkan 3 mL akuabides.

Pereaksi Folin-Ciocalteu sebanyak 400 μL

ditambahkan ke dalam campuran lalu dihomo-

genkan. Setelah lima menit, 4 mL larutan

Na2CO3 7% ditambahkan ke dalam campuran

lalu dihomogenkan. Campuran ditambahkan

akuabides hingga tepat 10 mL. Selanjutnya campuran didiamkan selama 90 menit,

kemudian diukur absorbansinya dengan

spektofotometer UV-tampak pada panjang

gelombang maksimum (750 nm). Kandungan

fenol total fraksi ekstrak etil asetat dinyatakan

sebagai mg ekuivalen asam galat/g bobot

contoh kering.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kadar Air

Serbuk buah dan daun mengkudu yang

diperoleh dari kebun Pusat Studi Biofarmaka

ditentukan kadar airnya. Penentuan kadar air

ini bertujuan menentukan jumlah air suatu

contoh sehingga dapat diketahui cara penyim-panan yang terbaik agar tidak terjadi kerusak-

an contoh. Kadar air buah dan daun meng-

kudu yang diperoleh sebesar 13.27% dan

12.52% (Lampiran 3). Nilai yang diperoleh

>10% menunjukkan contoh tidak baik jika

disimpan dalam jangka waktu lama sehingga

contoh yang telah diekstraksi dan dipekatkan

harus segera dianalisis dengan memperhatikan

faktor koreksi. Serbuk contoh dikeringkan

terlebih dahulu sebelum diekstraksi. Penge-

ringan bertujuan agar contoh tidak mudah

rusak sehingga dapat disimpan dalam jangka

waktu yang lama karena dengan mengurangi

kadar air, kerusakan contoh oleh mikroba

dapat dihindari.

Kadar air pada contoh tidak selalu sama

karena dipengaruhi oleh kelembaban, perla-

kuan terhadap contoh, dan besarnya peng-

uapan. Kandungan air dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 105 ºC. Menurut Har-

jadi (1993), air yang terikat secara fisik dapat

dihilangkan dengan pemanasan pada suhu

100-105 ºC.

Ekstrak

Sebelum serbuk contoh buah dan daun

mengkudu diekstraksi, komponen lemak atau

nonpolar dari contoh dihilangkan terlebih

dahulu menggunakan pelarut yang bersifat nonpolar seperti heksana. Komponen nonpolar

yang terdapat dalam contoh dapat menggang-

gu proses analisis. Lemak dapat menghambat

penguapan pelarut pada saat ingin memper-

oleh ekstrak pekat. Selain itu, lemak dikhawa-

tirkan juga dapat terjerap dalam fase diam

pada saat analisis menggunakan kromatografi

(Kramer 1985).

Pelarut ekstraksi komponen aktif meng-

kudu yang digunakan adalah metanol. Meta-

nol merupakan pelarut yang dapat melarutkan hampir semua senyawa organik yang ada pada

contoh, baik senyawa polar maupun semi

polar. Metanol mudah menguap sehingga

mudah dibebaskan dari ekstrak, dan metanol

lebih ekonomis dibandingkan dengan pelarut

organik yang lain. Ekstrak metanol yang

diperoleh kemudian diekstraksi cair-cair de-

ngan etil asetat. Menurut Zin et al. (2002),

ekstrak kasar etil asetat buah dan daun

mengkudu memiliki aktivitas antioksidan

tinggi. Heinicke (1985) menyatakan bahwa

senyawa antioksidan yang berperan besar di dalam ekstrak etil asetat adalah alkaloid yang

terdapat di dalam buah dan daun mengkudu.

Metode ekstraksi yang digunakan adalah

maserasi karena cara ini merupakan metode

yang mudah dilakukan dan menggunakan alat-

alat sederhana, yaitu cukup dengan merendam

contoh dalam pelarut. Rendemen ekstrak etil

asetat buah dan daun mengkudu, yaitu 2.24%

dan 2.95% (Lampiran 4). Rendemen ekstrak

yang diperoleh tidak berbeda jauh dengan

hasil penelitian Jayaraman et al. (2008), yang menunjukkan bahwa rendemen ekstrak etil

asetat buah mengkudu sebesar 1.90%. Rende-

men ekstrak etil asetat daun mengkudu sedikit

lebih besar karena mungkin senyawa kimia

yang memiliki sifat kepolaran sama dengan

etil asetat di dalam daun mengkudu jumlahnya

sedikit lebih besar daripada di dalam buahnya.

Ekstrak Teraktif

Pengujian potensi bahan sebagai penang-

kap radikal bebas dan antioksidan dilakukan

menggunakan KLT bioautografi karena mu-dah, cepat, dan hanya membutuhkan jumlah

contoh yang sedikit. Bahan yang diujikan

antara lain ekstrak etil asetat (EA), ekstrak

metanol (EM), dan estrak metanol hasil

ekstraksi cair-cair dengan etil asetat (EMP)

dari buah dan daun mengkudu. Penentuan

ekstrak teraktif melalui KLT bioautografi,

yaitu berdasarkan penampakan warna noda

ekstrak dengan cara menyemprotkan larutan

DPPH 1 mM dalam metanol (Hanani 2005)

pada beberapa ekstrak mengkudu yang sudah ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis

dengan fase diam silika gel.

Gambar 5 Profil KLT bioautografi dengan

larutan DPPH 1 mM dari (a) EA

buah, (b) EA daun, (c) EMP buah, (d) EMP daun, (e) EM buah, (f)

EM daun.

Larutan DPPH menghasilkan warna ungu

pada pelat KLT. Komponen aktif bereaksi

dengan DPPH sehingga DPPH menjadi

bentuk tereduksinya dan ditandai dengan

berkurangnya intensitas warna ungu dari

larutan DPPH pada noda ekstrak. Ekstrak ter-

aktif dilihat pada noda-noda ekstrak yang

memiliki intensitas warna ungu yang rendah atau terlihat paling pudar. Hasil pewarnaan

noda ekstrak dengan DPPH menunjukkan

bahwa ekstrak teraktif adalah ekstrak etil

aseatat (EA) buah dan daun mengkudu

(Gambar 5). Hal ini didukung oleh pernyataan

Zin et al. (2002) bahwa ekstrak metanol tidak

memiliki aktivitas antioksidan, sedangkan

ekstrak etil asetat buah dan daun mengkudu

memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi.

Fraksi

Pelarut atau fase gerak yang akan

digunakan untuk fraksionasi ekstrak buah dan

daun mengkudu dipilih pelarut terbaik yang

dihasilkan dari kromatografi lapis tipis

(Lampiran 5). Noda hasil elusi oleh berbagai

pelarut dilihat di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 254 dan

366 nm. Pelarut yang akan dijadikan sebagai

penyusun fase gerak adalah pelarut yang

menghasilkan jumlah noda terbanyak dan

memiliki pemisahan yang baik.

Fraksionasi dilakukan terhadap ekstrak etil

asetat buah dan daun mengkudu. Fraksionasi

menggunakan eluen terbaik dengan perban-

dingan heksana:etil asetat (2:1) (Gambar 6).

Pemisahan dilakukan dengan elusi gradien

(peningkatan kepolaran), hal ini bertujuan agar peningkatan polaritas sistem eluen

menyebabkan semua komponen akan terbawa

lebih cepat (Harvey 2000).

(a) (b)

Gambar 6 Profil KLT eluen terbaik heksana:etil

asetat (2:1) ekstrak etil asetat buah

(a) dan daun mengkudu (b). (Kondisi

KLT: plat KLT SiO2 60 F254, visual-

isasi noda: UV 254 nm dan 366 nm).

Elusi diawali dengan pelarut heksana,

kemudian campuran kedua pelarut dan di-akhiri dengan pelarut etil asetat. Hasil pemi-

sahan ekstrak ditampung sebanyak 5 ml dalam

tiap tabung reaksi. Pemisahan ekstrak buah

mengkudu tersebut diperoleh 88 tabung

reaksi, sedangkan ekstrak daun menghasilkan

117 tabung reaksi. Hasil pemisahan dimo-

nitor dengan kromatografi lapis tipis (KLT).

Fase gerak yang digunakan dalam KLT adalah

eluen terbaik heksana:etil asetat (2:1). Pemi-

sahan dengan KLT dan kolom didasarkan

pada interaksi antara fase gerak, fase diam,

dan analat.

a b c d e f

Pergerakan suatu senyawa pada bidang

adsorben tergantung pada kepolaran antara

eluen dengan senyawa tersebut. Fraksionasi

ini menggunakan adsorben silika gel. Sifat

dari silika gel adalah polar sehingga silika gel

akan mengikat senyawa yang bersifat polar

juga, sedangkan hubungannya dengan eluen,

yaitu senyawa yang polar akan cepat bergerak

jika menggunakan pelarut yang polar begitu

juga sebaliknya (Harvey 2000). Senyawa yang

kurang polar akan keluar terlebih dahulu dari kolom dengan eluen heksana dan dilanjutkan

dengan senyawa semi polar dengan campuran

kedua eluen, dan terakhir senyawa polar de-

ngan eluen etil asetat.

Noda yang terbentuk dapat dideteksi

dengan sinar UV pada panjang gelombang

254 nm dan 366 nm. Pada panjang gelom-

bang ini adanya senyawa yang berpendar jika

disinari dengan sinar ultraviolet sehingga noda

akan terlihat. Eluat dalam tabung reaksi yang

memiliki pola dan Rf yang sama dijadikan satu fraksi. Fraksionasi buah mengkudu

menghasilkan 4 fraksi, sedangkan daun meng-

kudu menghasilkan 7 fraksi (Lampiran 6 dan

Lampiran 7).

Fraksi-fraksi yang diperoleh selanjutnya

diuji aktivitas antioksidannya secara bioauto-

grafi. Penentuan fraksi teraktif melalui KLT

bioautografi menghasilkan fraksi teraktif

ekstrak buah dan daun mengkudu adalah

fraksi 1 dan fraksi 5 (Gambar 7).

(a) (b)

Gambar 7 Profil KLT bioautografi dengan larutan DPPH 1 mM dari fraksi

ekstrak etil asetat (a) buah

mengkudu (F1–F4), (b) daun

mengkudu (F1–F7).

Kandungan Fitokimia

Analisis fitokimia adalah salah satu cara

untuk mengetahui kandungan metabolit se-

kunder pada suatu tanaman. Analisis fitoki-

mia dilakukan dua kali, yaitu terhadap ekstrak kasar dan fraksi teraktif buah dan daun

mengkudu.

Berdasarkan hasil uji fitokimia terhadap

ekstrak dan fraksi 1 ekstrak buah mengkudu

(Tabel 1), menunjukkan bahwa ekstrak buah

mengkudu mengandung flavonoid, alkaloid,

saponin, tanin, kuinon, dan triterpenoid.

Fraksi 1 ekstrak buah mengkudu mengan-

dung flavonoid, alkaloid, saponin, dan triter-

penoid.

Tabel 1 Uji fitokimia buah mengkudu

Senyawa Ekstrak Fraksi teraktif

Alkaloid + +

Meyer – +

Wagner + +

Dragendorf + +

Flavonoid + +

Saponin + +

Tanin + – Kuinon + –

Triterpenoid + +

Steroid – –

Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi

Tabel 2 Uji fitokimia daun mengkudu

Senyawa Ekstrak Fraksi teraktif

Alkaloid + +

Meyer + +

Wagner + +

Dragendorf + +

Flavonoid + + Saponin – –

Tanin – –

Kuinon – – Triterpenoid – –

Steroid + –

Keterangan: (-): tidak terdeteksi; (+): terdeteksi

Hasil uji fitokimia terhadap ekstrak dan

fraksi teraktif daun mengkudu (Tabel 2), menunjukkan bahwa ekstrak daun mengkudu

mengandung flavonoid, alkaloid, dan steroid.

Fraksi 5 ekstrak daun mengkudu mengan-

dung flavonoid dan alkaloid.

Hasil uji negatif pada analisis fitokimia

dapat disebabkan oleh rusaknya senyawa

ekstrak atau memang kandungan fitokimia

yang terdapat dalam contoh sangat kecil. Hasil

positif analisis fitokimia menunjukkan bahwa

kemungkinan golongan senyawa yang aktif

sebagai antioksidan pada buah dan daun mengkudu adalah golongan senyawa flavo-

noid, alkaloid, dan terpenoid.

Aktivitas Antioksidan

Penentuan aktivitas antioksidan dari fraksi

teraktif mengkudu didasarkan pada penang-

kapan radikal bebas DPPH dan aktivitasnya

ditentukan menggunakan metode spektros-

kopi. Radikal bebas DPPH memiliki warna

ungu yang ditunjukkan oleh pita absorpsi

dalam pelarut metanol pada panjang gelom-

bang maksimum 515 nm (Lampiran 8).

Larutan DPPH diukur serapan cahayanya

dan dihitung aktivitas antioksidannya dengan

menghitung persentase inhibisi, yaitu banyak-

nya aktivitas senyawa antioksidan yang dapat

menangkap radikal bebas DPPH. Parameter yang juga digunakan untuk pengukuran aktivi-

tas antioksidan dari mengkudu adalah IC50,

yaitu bilangan yang menunjukkan konsentrasi

ekstrak yang mampu menghambat aktivitas

DPPH sebesar 50%.

Penentuan nilai IC50 menggunakan persa-

maan kurva hubungan antara %inhibisi seba-

gai sumbu y dan konsentrasi fraksi antioksi-

dan sebagai sumbu x. Nilai IC50 dihitung

dengan cara memasukkan nilai 50% ke dalam

persamaan kurva sebagai sumbu y kemudian dihitung nilai x sebagai konsentrasi IC50.

Perhitungan IC50 bertujuan menentukan besar-

nya konsentrasi senyawa antioksidan yang

diperlukan untuk dapat menghambat setengah

aktivitas radikal bebas. Semakin kecil nilai

IC50 menunjukkan semakin tinggi aktivitas

antioksidannya (Molyneux 2004). Radikal

bebas diharapkan dapat ditangkap oleh

senyawa antioksidan hanya dengan

konsentrasi yang kecil. Berdasarkan peng-

ujian aktivitas antioksidan, nilai IC50 untuk fraksi teraktif buah mengkudu sebesar 38.18 ppm (Lampiran 9) dan nilai IC50 untuk fraksi

teraktif daun mengkudu sebesar 85.86 ppm

(Lampiran 10).

Gambar 8 Nilai IC50 dari fraksi teraktif buah,

daun mengkudu, dan vitamin C.

Gambar 8 menunjukkan bahwa nilai IC50

fraksi ekstrak buah mengkudu lebih kecil

daripada fraksi ekstrak daun, yang berarti

fraksi ekstrak buah mengkudu memiliki

aktivitas antioksidan lebih besar daripada

fraksi ekstrak daun mengkudu. Hal ini

berbeda dengan pernyataan Zin et al. (2002)

bahwa aktivitas antioksidan ekstrak daun mengkudu lebih besar daripada ekstrak

buahnya. Perbedaan hasil diduga disebabkan

contoh yang dianalisis berbeda umur, asal dan

tempat tumbuh. Perbedaan ini menyebabkan

kandungan metabolit sekunder di dalam con-

toh berbeda sehingga aktivitas antioksidannya

juga berbeda.

Senyawa antioksidan seperti alkaloid,

flavonoid, asam fenol, alkohol, gula atau

glikosida di dalam buah mengkudu diduga

lebih banyak daripada di dalam daunnya,

sehingga menghasilkan aktivitas antioksidan

fraksi ekstrak buah yang lebih besar. Selain itu, kandungan triterpenoid dan saponin yang

ditemukan di dalam fraksi ekstrak buah

mengkudu tidak ditemukan di dalam fraksi

ekstrak daun sehingga diduga senyawa selain

fenol ini berperan besar sebagai antioksidan.

Gambar 9 Reaksi antara senyawa flavonoid

dan DPPH (Williams et al.1995).

Reaksi yang terjadi antara senyawa

antioksidan (contoh flavonoid) dan DPPH

(Gambar 9) meliputi pemberian atom hidro-

gen dari senyawa flavonoid untuk mereduksi

radikal DPPH. Selanjutnya radikal aril dari

flavonoid mengalami resonansi dan memberi-

kan atom hidrogennya kembali kepada radikal

DPPH. Pembentukan kompleks antara anti-

oksidan dan DPPH bergantung pada kesta-

bilan dan potensial reaksi dari struktur molekulnya. Berdasarkan mekanisme tersebut,

maka dapat dikatakan bahwa senyawa anti-

oksidan mempunyai sifat yang relatif stabil

dalam bentuk radikalnya (Williams et al.

1995). Sifat ini yang menyebabkan golongan

senyawa flavonoid, terpenoid, dan alkaloid

diduga senyawa yang berpotensi sebagai

antioksidan.

Penelitian ini menggunakan asam askorbat

atau vitamin C sebagai kontrol positif anti-

oksidan. Molekul asam askorbat atau vitamin

C mereduksi dua radikal DPPH (2Z●) melalui

pelepasan dua atom hidrogennya, sehingga

membentuk DPPH nonradikal (Gambar 10)

(Blouis 1958). Senyawa ini mampu memberi-

kan atom hidrogennya kepada radikal bebas

sehingga aktivitasnya dapat diukur menggu-

nakan metode DPPH. Senyawa ini merupakan

salah satu antioksidan sekunder dan memiliki

cara kerja yang sama dengan vitamin E, yaitu

menangkap radikal bebas dan mencegah terjadinya reaksi berantai (Praptiwi et al.

2006). Lampiran 11 menunjukkan bahwa nilai

IC50 asam askorbat sebesar 3.85 ppm. Hal ini

menunjukkan bahwa fraksi ekstrak dan vita-

min C mempunyai aktivitas antioksidan yang

kuat karena mempunyai IC50 kurang dari 200

ppm (Blouis 1958).

Gambar 10 Reaksi antara asam askorbat dan

DPPH (Blouis 1958).

Reaksi antara DPPH dan senyawa anti-

oksidan menghasilkan dehidrogenasi pada

molekul antioksidan, sedangkan DPPH ber-

ubah menjadi DPPHn dengan n menunjukkan

jumlah atom H yang diterima oleh DPPH dari

antioksidan. DPPH berwarna violet dan

DPPHn tak berwarna sehingga memung-

kinkan pengukuran dengan spektrofotometri

dari penurunan intensitas warna DPPH.

Absorbansi yang rendah menunjukkan kapasi-

tas penangkapan radikal DPPH yang lebih

tinggi.

Kandungan Fenol Total

Penentuan kadar senyawa fenolat total

menggunakan asam galat sebagai larutan

standar. Serapan maksimum asam galat

diperoleh pada panjang gelombang 750 nm

(Lampiran 12). Kurva kalibrasi larutan standar

asam galat dibuat terlebih dahulu dengan

konsentrasi 50; 75; 100; 125; 150 mg/L,

sebelum kadar fenol total diperiksa. Pembuatan kurva kalibrasi berguna untuk

membantu menentukan kadar fenol dalam

contoh melalui persamaan regresi dari kurva

kalibrasi. Pemeriksaan larutan standar asam

galat menghasilkan kurva kalibrasi dengan

persamaan regresi y = 0,002x - 0,069 dan

harga koefesien korelasi (r) yaitu 0,9849.

Nilai r yang mendekati 1 membuktikan

bahwa persamaan regresi tersebut adalah

linier.

Konsentrasi larutan contoh dapat

ditentukan dengan menggunakan kurva

kalibrasi dengan cara mengukur absorbansi

contoh kemudian kadar fenolat total dalam

mengkudu dihitung dengan menggunakan

persamaan regresi linear.

Gambar 11 Kandungan fenol total dalam

fraksi teraktif ekstrak etil asetat

buah dan daun mengkudu.

Menurut Pratt & Hudson (1992), senyawa

fenol ditemukan di semua bagian tanaman

seperti buah, akar, bunga, batang, dan daun.

Gambar 8 menunjukkan bahwa fraksi 1 dari

ekstrak buah mengkudu mengandung 0.40 mg

ekuivalen asam galat /g bobot contoh kering, sedangkan fraksi 5 ekstrak daun mengkudu

adalah 1.15 mg ekuivalen asam galat /g bobot

contoh kering (Lampiran 13). Hal ini

menunjukkan bahwa kandungan fenol total

dari buah mengkudu lebih kecil daripada

daunnya, sehingga hasil menunjukkan bahwa

tidak ada hubungan yang linier positif antara

aktivitas antioksidan ekstrak buah dan daun

megkudu dengan kandungan fenol totalnya

(Gambar 12). Hal ini tidak sesuai dengan

Rohman et al. (2006) yang menyatakan bahwa terdapat hubungan yang linier positif antara

aktivitas antioksidan dengan kandungan fenol

total ekstrak buah mengkudu.

Gambar 12 menunjukkan bahwa kan-

dungan sejumlah senyawa fenol bukan satu

faktor utama aktivitas antioksidan, dan

senyawa selain fenol berperan penting

terhadap aktivitas antioksidan (Zin et al.

2004). Selain itu, tidak semua senyawa fenol

memiliki aktivitas antioksidan yang sama,

beberapa ada yang kuat dan lainnya lemah.

Senyawa fenol ini bekerja secara antagonis atau sinergis saat bercampur dengan sesama

senyawa fenol atau senyawa selain fenol (Lien

et al. 1999). Berdasarkan hasil uji fitokimia,

diduga senyawa alkaloid dan flavonoid dalam

fraksi ekstrak buah dan daun berperan sebagai

antioksidan. Fraksi teraktif ekstrak buah

mengkudu mengandung senyawa selain fenol

seperti triterpenoid dan saponin yang juga

berperan sebagai antioksidan. Hal ini didu-

askorbat, senyawa karotenoid dan minyak

atsiri di dalamnya juga berperan sebagai

antioksidan (Javanmardi et al. 2003).

Gambar 12 Hubungan antara aktivitas anti-

oksidan (IC50) dan kandungan

fenol total (mg ekuivalen asam

galat/g contoh kering).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Pemisahan ekstrak etil asetat buah dan

daun mengkudu menghasilkan 4 dan 7 fraksi.

Fraksi teraktif dari ekstrak buah dan daun

mengkudu memberikan nilai IC50 38.18 ppm

dan 85.86 ppm. Kandungan fenol total dalam

fraksi teraktif dari ekstrak buah dan daun

mengkudu, yaitu 0.40 mg ekuivalen asam

galat/g bobot contoh kering dan 1.15 mg ekuivalen asam galat/g bobot contoh kering.

Berdasarkan hasil uji fitokimia, senyawa

alkaloid dan flavonoid berperan sebagai

antioksidan di dalam buah dan daun mengku-

du, serta senyawa selain fenol berperan besar

sebagai antioksidan di dalam buah mengkudu.

Saran

Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan

untuk menguji hasil secara in vivo dan untuk

mengidentifikasi senyawa yang berperan se-bagai antioksidan.

DAFTAR PUSTAKA

Abbott IA. 1992. La`au Hawai Traditional

Uses of Plants. Hawai: Bishop Musesum

Press.

[AOAC] The Association of Official

Analytical Chemist. 2006. Official

Methods of Analysis. Ed ke-18.

Washington DC: Association of Official

Analytical Chemist.

Blouis MS. 1958. Antioxidant Determi-

nations By The Use Of a Stable Free

Radical. Nature 181: 1199-1200.

Chun OK, Kim DO, Lee CY. 2003. Superoxide Radical Scavenging Activ-ity

of The Major Polyphenols in Fresh Plums.

Journal of Agricultural and Food

Chemistry 51: 8067-8072.

Elkins R. 1998. Hawaiian noni (Morinda

citrifolia) Prize Herb of Hawaii and the

South Pacific. Utah: Woodland Pub-

lishing.

Furniss BS, Hannaford AJ, Smith PWG, Tatchell AR, Vogel AI. 1989. Vogel’s

Textbook of Practical Organic Chemistry

4th. New York: Wiley.

Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar.

Jakarta: Gramedia.

Hanani E, Abdul M, Ryany S. 2005.

Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam

Spons Callyspongia sp dari Kepulauan

Seribu. Majalah Farmasi Indonesia 2: 127 – 133.

Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. K

Padmawinata & I Sudiro, penerjemah.

Bandung: Institut Teknologi Bandung.

Terjemahan dari: Phytochemical Methods.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chem-

istry. Washington DC: McGraw-Hill.

Heinicke RM. 1985. The pharmacologically

active ingredient of Noni. Bulletin of the National Tropical Botanical Garden 165.

Hostettmann K, Terreaux C, Marston A,

Potterat O. Strategy for the Biological and

Chemical Evaluation of Plant Extracts.

1997. Journal of Planar Chromatography

10: 251-257.

Houghton J, Raman A. 1998. Laboratory

handbook for the Fractionation of Natural

Extract. London: Chapman & Hall.

Buah

Daun

Jayaraman SK, Manoharan MS, Illanchezian

S. 2008. Antibacterial, Antifungal and

Tumor cell suppression potential of

Morinda citrifolia fruit extracts.

International Journal of Integrative

Biology 1: 44-49.

Javanmardi J, Stushnoff C, Locke E, Vivan-co

JM. 2003. Antioxidant Activity and Total

Phenolic Content of Iranian Ocimum

Accessions. Journal of Agricultural and Food Chemistry 83: 547-550.

Kahkonen MP, Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha

JP, Pihlaja K, Kujala TS, Heinonen M.

1999. Antioxidant activity of extracts

containing phenolic compounds. Journal

of Agricultural and Food Chemistry 47:

3954-3962.

Khopkar. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik.

Saptorahardjo, penerjemah. Jakarta: UI Press. Terjemahan dari: Basic Concept of

Analitical Chemistry.

Kikuzaki H, Nakatani N. 1993. Antioxidant

effects of some ginger constituents.

Journal of Food Science 58: 1407–1410.

Kramer RE. 1985. Antioxidants in Clove.

Journal of the American Oil Chemist`s

Society 62: 111-113.

Lien EJ, Ren S, Bui HH, Wang R. 1999.

Quantitative structure activity relation-ship

analysis of phenolic antioxidants. Free

Radical Biology and Medicine 26: 285–

294.

McClatchey W. 2002. From Polynesian

healers to health food stores: changing

perspectives of Morinda citrifolia

(Rubiaceae). Integrative Cancer Therapies

1: 110-120.

Michalowska AG, Korczak J, Hes M. 2007.

Purification process influence on green tea

extracs polyphenol content and antioxidant

activity. Acta Scientiarum Polonorum

Technology Aliment 6: 41-48.

Molyneux P. 2004. The use of the stable free

radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH)

for estimating antioxidant activity. Jounal

of Science Technology 26: 211-219.

Praptiwi, Dewi P, Harapini M. 2006. Nilai

Peroksida dan Aktivitas Anti Radikal

Bebas Diphenil Picrylhidrazil Hydrate

(DPPH) Ekstrak Metanol Knema laurina.

Majalah Farmasi Indonesia 17: 32-36.

Pratt DE dan Hudson BJF. 1990. Natural

Antioxidants Not Exploited Commer-

cially. Elsevier Applied Science 1: 239-

243.

Prior RL, Wu X, Schaich K. 2005.

Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and

phenolics in foods and dietary

supplements Journal of Agricultural and

Food Chemistry 55: 2698 A-J.

Rohman A, Riyanto S, Utari D. 2006.

Aktivitas antioksidan, kandungan fenolik

total dan kandungan flavonoid total

ekstrak etil asetat buah mengkudu serta

fraksi-fraksinya. Majalah Farmasi Indo-

nesia 17: 136-142.

Rouessac F, Rouessac A. 1994. Chemical

Analysis Modern Instrumentation Methods

and Techniques 2nd. New York: Wiley.

Vimala S, Adenan MI. 1999. Malaysian

tropical forest medicinal plants: a source

of natural antioxidants. Journal of

Tropical Forest Products 5: 32–38.

Wang MY, West BJ, Jensen CJ, Nowicki D, Su C, Palu AK, Anderson G. 2002.

Morinda Citrifolia (noni): A literature

review and recent advances in noni

research. Acta Pharmacologica Sinica 23:

1127-1141.

Williams B, Cuvelier WME, Berset C. 1995.

Use of a Free Radical Method to Evaluate

Antioxidant Activity. Lebens-mittel-

wissenschaft und Technology 28: 25-30.

Zin M, Abdul H, Osman. 2002. Antioxidative Activity of Extracts from Mengkudu

(Morinda citrifolia) Root, Fruit, and Leaf.

Food Chemistry 78: 227-231.

Zin M, Abdul H, Osman A, Saari N. 2004.

Antioxidative activities of chromato-

graphic fractions obtained from root, fruit

and leaf of Mengkudu (Morinda citrifolia

L). Food Chemistry 08: 048.

LAMPIRAN

Lampiran 1 Diagram alir penelitian

Ekstraksi cair-cair dengan etil asetat

Ekstrak Etil asetat

Simplisia sampel (buah,

daun mengkudu)

Penentuan Eluen Terbaik

dengan KLT

Fraksionasi dengan

kromatografi kolom

Fraksi teraktif

Analisis kuantitatif

Aktivitas Antioksidan

Ekstrak Metanol

Penentuan Kandungan

Fenolik Total

Uji Fitokimia

Penghilangan lemak dengan heksana

Residu sampel bebas

lemak

Maserasi dengan Metanol

Eluen terbaik

Uji Fitokimia

Lampiran 2 Uji Fitokimia

a) Uji Alkaloid

0.1 gram sampel

ekstrak dengan 10 mL kloroform dan beberapa tetes amonia

saring

10 tetes H2SO4

lapisan asam +pereaksi

Dragendorf Meyer Wagner

endapan jingga endapan putih endapan coklat

b) Uji saponin, flavonoid, dan tanin

0.1 gram sampel

dilarutkan dalam 10 mL air panas

didihkan selama 5 menit

saring

kocok + 0.5 mg Mg

+1 mL HCl pekat

+ 1 mL amil alkohol

+ 10 mL FeCl3 1%

Busa 10 menit

saponin

Merah/kuning/

jingga (flavonoid)

Biru tua

(tanin)

c) Steroid/triterpenoid

0.1 gram sampel

dilarutkan dalam 25 mL etanol panas

uapkan pelarut

residu dilarutkan dalam eter

ekstrak eter

+ 3 tetes anhidrida asam asetat dan 1 tetes H2SO4 pekat

merah/ungu hijau/biru

(triterpenoid) (steroid)

Lampiran 3 Penentuan kadar air buah dan daun mengkudu

a) Kadar air buah mengkudu

Ulangan Bobot cawan Bobot sampel Bobot cawan+sampel Kadar Air

(% b/b) kosong (g) (g) kering (g)

1 1.9672 3.0202 4.5870 13.26

2 1.8780 3.0109 4.4906 13.23

3 1.9915 3.019 4.6081 13.33

Rerata 13.27

b) Kadar air daun mengkudu

Ulangan Bobot cawan Bobot sampel Bobot cawan+sampel Kadar Air

(% b/b) kosong (g) (g) kering (g)

1 1.9263 3.0278 4.569 12.72

2 1.9855 3.0210 4.6369 12.23

3 2.0331 3.0417 4.6913 12.61

Rerata 12.52

Contoh perhitungan ulangan 1 buah mengkudu:

%13.25

100%gram3.0202

gram1.9672)(4.587023.020

100%sampelBobot

kosong)cawan Bobot kering) sampel cawan ((BobotsampelBobot airKadar

Lampiran 4 Penentuan rendemen ekstrak kasar buah dan daun mengkudu

Ekstrak Bobot ekstrak Bobot sampel Faktor Rendeman

(% b/b) (g) (g) koreksi

Buah Etil asetat 2.9632 150.0061 1.1327 2.24

Daun Etil asetat 3.939 150.2231 1.1252 2.95

Contoh perhitungan ekstrak buah etil asetat:

100

100 airkadarkoreksiFaktor

100

2705.13100

= 1.1327

%100Re xfkxsampelBobot

EkstrakBobotndemen

%1001327.10061.150

9632.2xx

g

g

= 2.24%

Lampiran 5 Penentuan eluen terbaik menggunakan kromatografi lapis tipis

Pelarut Ekstrak etil asetat Nilai Rf

Heksana:etil asetat 2:1 buah

(1) 0.1125, (2) 0.1688, (3) 0.2250,

(4) 0. 3875, (5) 0.5813

daun (1) 0.1511, (2) 0.4250, (3) 0.5750

(4) 0.7688, (5) 0.7875, (6) 0.9819

Heksana:etil asetat 1:1 buah (1) 0.2901, (2) 0.4074, (3) 0.5494

daun (1) 0.3703, (2) 0.5123, (3) 0.6296

(4) 0.7407, (5) 0.8765

Metanol:kloroform 1:9 buah (1) 0.5125, (2) 0.6500, (3) 0.7188

(4) 0.7688

daun (1) 0.5625, (2) 0.6375, (3) 0.7188

(4) 0.7625, (5) 0.8750

Etil asetat:dikorometana 7:3 buah (1) 0.6173, (2) 0.7777

daun (1) 0.2592, (2) 0.6605, (3) 0.7777

(4) 0.8395, (5) 0.9136

Etil asetat:toluena 1:1 buah (1) 0.4500, (2) 0.6375

daun (1) 0.1375, (2) 0.4375, (3) 0.6188

(4) 0.8563, (5) 0.9125

Lampiran 6 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat

buah mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1)

F1 F2 F3 F4

Tabung

ke-

Jarak spot

dari garis

awal (cm)

Jarak tempuh

eluen dari garis

awal (cm)

Rf Fraksi

ke-

Bobot

(gram)

Rendemen

(% b/b)

1−20 − − − − − −

21 6.6 7.9 0.84 1 0.2931 19.54

29 6.6 7.9 0.84

30 3.7 8 0.46 2 0.0384 2.56

1.7 8 0.21

33 3.8 8 0.48

1.6 8 0.20

35 3.7 8 0.46

1.5 8 0.19

40 3.7 8 0.46

1.5 8 0.19

41 3.7 8 0.46

1.8 8 0.23

42 3.7 8 0.46

1.6 8 0.20

43 1.8 8 0.23 3 0.0439 2.93

1.4 8 0.18

1 8 0.13

61 1.8 8 0.23

1.4 8 0.18

0.8 8 0.10

62 1.7 8 0.21

1.3 8 0.17

0.8 8 0.10

Lanjutan lampiran 6 Hasil fraksionasi ekstrak etil asetat buah mengkudu

Tabung

ke-

Jarak spot

dari garis

awal (cm)

Jarak tempuh

eluen dari garis

awal (cm)

Rf Fraksi

ke-

Bobot

(gram)

Rendemen

(% b/b)

63 1.2 8 0.15 4 0.021 3.16

65 1.2 8 0.15

70 1.2 8 0.15

75 1.2 8 0.15

80 1.2 8 0.15

85 1.2 8 0.15

88 1.3 8 0.16

Lampiran 7 Hasil fraksionasi dan profil KLT hasil fraksionasi ekstrak etil asetat

daun mengkudu dengan eluen heksana:etil asetat (2:1)

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7

Tabung

ke-

Jarak spot

dari garis

awal (cm)

Jarak tempuh

eluen dari garis

awal (cm)

Rf Fraksi

ke-

Bobot

(gram)

Rendemen

(% b/b)

1 7.8 8 0.98 1 0.0993 6.62

5 7.8 8 0.98

7 7.8 8 0.98

15 7.8 8 0.98

20 7.8 8 0.98

25 7.8 8 0.98

28 7.6 8 0.95

29 6.6 8 0.83 2 0.0252 1.68

31 6.6 8 0.83

32 6.9 8.1 0.85

33 6.9 8.1 0.85

34 6.9 8.1 0.85

35 6.8 8 0.85

36 6.8 8 0.85

Lanjutan lampiran 7 Hasil fraksionasi ekstrak etil asetat daun mengkudu

Tabung

ke-

Jarak spot

dari garis

awal (cm)

Jarak tempuh

eluen dari garis

awal (cm)

Rf Fraksi

ke-

Bobot

(gram)

Rendemen

(% b/b)

37 6.90 8.1 0.85 3 0.2705 18.03

6.50 8.1 0.80

6.00 8.1 0.74

39 6.90 8.1 0.85

6.50 8.1 0.80

5.90 8.1 0.73

40 6.70 7.9 0.85

6.10 7.9 0.77

5.50 7.9 0.70

50 6.60 7.9 0.84

5.90 7.9 0.75

4.90 7.9 0.62

51 6.60 7.9 0.84

5.90 7.9 0.75

4.90 7.9 0.62

54 6.60 7.9 0.84

5.90 7.9 0.75

4.90 7.9 0.62

55 5.9 8 0.74 4 0.1469 9.79

4.9 8 0.61

3.90 8 0.49

2.70 8 0.34

57 5.90 8 0.74

4.90 8 0.61

3.80 8 0.48

2.70 8 0.34

59 5.90 8 0.74

5.00 8 0.63

3.90 8 0.49

2.70 8 0.34

61 5.90 8 0.74

4.90 8 0.61

3.90 8 0.49

2.70 8 0.34

Lanjutan lampiran 7 Hasil fraksionasi ekstrak etil asetat daun mengkudu

Tabung

ke-

Jarak spot

dari garis

awal (cm)

Jarak tempuh

eluen dari garis

awal (cm)

Rf Fraksi

ke-

Bobot

(gram)

Rendemen

(% b/b)

62 3.80 8 0.48 5 0.5673 37.82

2.80 8 0.35

69 3.80 8 0.48

2.80 8 0.35

86 3.80 8 0.48

2.80 8 0.35

94 3.90 8 0.49

2.80 8 0.35

101 3.90 8 0.49

2.60 8 0.33

102 3.80 8 0.48 6 0.1913 12.75

3.00 8 0.38

2.00 8 0.25

108 3.80 8 0.48

3.10 8 0.39

2.00 8 0.25

110 3.80 8 0.48

2.90 8 0.36

1.90 8 0.24

111 3.80 8 0.48 7 0.1626 10.84

2.90 8 0.36

1.50 8 0.19

0.30 8 0.04

114 3.80 8 0.48

3.00 8 0.38

1.40 8 0.18

0.50 8 0.06

115−117 − − − − − −

Contoh perhitungan:

Rf = Jarak spot dari garis awal

Jarak tempuh eluen dari garis awal

= 7.8

8

= 0.98

Lampiran 8 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan DPPH 0.05 mM

Panjang

Gelombang (nm) Absorbansi

Panjang

Gelombang (nm) Absorbansi

500 0.455 515 0.494

501 0.460 516 0.494

502 0.464 517 0.493

503 0.468 518 0.492

504 0.472 519 0.491

505 0.476 520 0.489

506 0.479 521 0.487

507 0.482 522 0.484

508 0.485 523 0.482

509 0.487 524 0.479

510 0.489 525 0.475

511 0.491 526 0.471

512 0.492 527 0.467

513 0.493 528 0.463

514 0.494 529 0.458

Panjang gelombang (nm)

λ maksimum= 515 nm

Lampiran 9 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak buah meng-

kudu dengan metode DPPH

Kons

(ppm) Ulangan

Absorbansi %Inhibisi

Rerata

%Inhibisi

IC50

(ppm) smpl+dpph tanpa dpph

Blanko – 0.463 – – –

38.18

10 1 0.279 0.006 41.04 40.18

2 0.296 0.015 39.31

30 1 0.264 0.016 46.44 46.22

2 0.296 0.046 46.00

50 1 0.265 0.066 57.05 56.85

2 0.302 0.092 54.64

70 1 0.267 0.097 63.28 61.23

2 0.297 0.108 59.18

90 1 0.265 0.120 68.68 60.85

2 0.301 0.139 65.01

Contoh Perhitungan:

% Inhibisi = %100tan

xblankoA

DPPHpasampelADPPHsampelAblankoA

= %100463,0

006,0279,0463,0x

= 41.04%

Perhitungan IC50 :

y = 0.341x + 36.98

50 = 0.341x + 36.98

13.02 = 0.341x

x = 38.18

Jadi, IC50 untuk fraksi aktif ekstrak etil asetat buah mengkudu = 38.18 ppm

Konsentrasi ekstrak (ppm)

Lampiran 10 Penentuan aktivitas antioksidan fraksi teraktif ekstrak daun meng-

kudu dengan metode DPPH

Kons

(ppm) Ulangan

Absorbansi %Inhibisi

Rerata

%Inhibisi

IC50

(ppm) smpl+dpph tanpa dpph

Blanko – 0.463 – – –

85.86

10 1 0.278 0.000 39.96 39.2

2 0.304 0.014 38.44

30 1 0.267 0.003 42.98 41.79

2 0.29 0.015 40.6

50 1 0.27 0.012 44.28 42.88

2 0.287 0.016 41.47

70 1 0.255 0.018 48.81 47.84

2 0.269 0.023 46.87

90 1 0.254 0.030 51.62 51.41

2 0.265 0.040 51.4

100 1 0.259 0.045 53.78 53.03

2 0.276 0.055 52.27

150 1 0.259 0.075 60.26 59.51

2 0.293 0.102 58.75

200 1 0.246 0.097 67.82 67.07

2 0.288 0.132 66.31

250 1 0.231 0.115 74.95 74.41

2 0.271 0.150 73.87

300 1 0.216 0.130 81.43 80.24

2 0.286 0.189 79.05

Konsentrasi ekstrak (ppm)

Contoh Perhitungan:

% Inhibisi = %100tan

xblankoA

DPPHpasampelADPPHsampelAblankoA

= %100463,0

000,0278,0463,0x

= 39.96%

Perhitungan IC50 :

y = 0.145x + 37.55

50 = 0.145x + 37.55

12.45 = 0.145x

x = 85.86

Jadi, IC50 untuk fraksi aktif ekstrak etil asetat daun mengkudu = 85.86 ppm

Lampiran 11 Penentuan aktivitas antioksidan vitamin C dengan metode DPPH

Konsentrasi

(ppm) Ulangan Absorbansi % Inhibisi

Rerata

%Inhibisi

IC50

(ppm)

Blanko – 0.463 – –

3.85

2 1 0.352 23.97

23.90

2 0.350 24.41

3 0.355 23.33

3 1 0.275 40.60

40.75

2 0.272 41.25

3 0.276 40.39

4 1 0.229 50.54

50.97

2 0.225 51.40

3 0.227 50.97

5 1 0.162 65.01

65.08

2 0.160 65.44

3 0.163 64.79

6 1 0.098 78.83

79.19

2 0.086 81.43

3 0.105 77.32

Konsentrasi (ppm)

Contoh Perhitungan:

% Inhibisi = blankoA

sampelAblankoA

= %100463,0

352,0463,0x

= 23.97%

Perhitungan IC50 :

y = 13.49x - 1.986

50 = 13.49x - 1.986

51.986 = 13.49x

x = 3.85

Jadi, IC50 untuk vitamin C = 3.85 ppm

Lampiran 12 Penentuan panjang gelombang maksimum larutan standar fenol

asam galat 100 ppm

Panjang

gelombang (nm) Absorbansi

Panjang

gelombang (nm) Absorbansi

724 0.207 758 0.213

726 0.207 760 0.213

728 0.208 762 0.212

730 0.209 764 0.212

732 0.21 766 0.212

734 0.21 768 0.212

736 0.211 770 0.212

738 0.211 772 0.211

740 0.212 774 0.211

742 0.212 776 0.211

744 0.213 778 0.211

746 0.213 780 0.211

748 0.214 782 0.21

750 0.214 784 0.21

752 0.213 786 0.209

754 0.213 788 0.208

756 0.213 790 0.207

Lampiran 13 Penentuan kandungan fenol total fraksi teraktif ekstrak buah dan

daun mengkudu

Larutan Absorbansi terkoreksi Rerata

Absorbansi

Kadar Fenol

(mg ekuivalen

asam galat/g

sampel kering) ul 1 ul 2 ul 3

Asam galat 50 ppm 0.047 0.047 0.039 0.0443 –

Asam galat 75 ppm 0.164 0.164 0.073 0.1577 –

Asam galat 100 ppm 0.221 0.188 0.156 0.1883 –

Asam galat 125 ppm 0.264 0.26 0.223 0.2490 –

Asam galat 150 ppm 0.348 0.328 0.314 0.3300 –

Daun 2 mg/3 ml 0.122 0.115 0.105 0.1140 1.15

Buah 2 mg/3 ml 0.085 0.102 0.086 0.0910 0.40

Contoh perhitungan:

Perhitungan kadar fenol total fraksi 5 etil asetat daun mengkudu:

y = 0.002x - 0.069

0.1140 = 0.002x - 0.069

x = 69.09 ppm

λ maksimum= 750 nm

Panjang gelombang (nm)

Konsentrasi asam galat (ppm)

Kandungan fenol total

= kadar fenol x konsentrasi fraksi x rendemen fraksi x rendemen ekstrak

=kering sampel100

keringekstrak 93.2

keringekstrak 100

kering fraksi 82.37

kering fraksi 2

3

1000

fenol09.69

g

gx

g

gx

mg

mLx

mL

mg

= 1.15 mg/g sampel kering

Jadi, kandungan fenol total fraksi 5 etil asetat daun mengkudu adalah 1.15 mg

ekuivalen asam galat/g berat sampel kering.

Perhitungan kadar fenol total fraksi 1 etil asetat buah mengkudu:

y = 0.002x - 0.069

0.0910 = 0.002x - 0.069

x = 60.41 ppm

Kandungan fenol total =

kering sampel100

keringekstrak 24.2

keringekstrak 100

kering fraksi 54.19

kering fraksi 2

3

1000

fenol41.60

g

gx

g

gx

mg

mLx

mL

mg

= 0.40 mg/g sampel kering

Jadi, kandungan fenol total fraksi 1 etil asetat buah mengkudu adalah 0.40 mg

ekuivalen asam galat/g berat sampel kering.