UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

,,Grigore T.Popa”, IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

ALIMENTELE ŞI SUPLIMENTELE

NUTRITIVE - SURSE DE VITAMINĂ A

PENTRU ORGANISM

OH

CH3

CH3CH3CH3 CH3

- REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT -

Coordonator ştiinţific,

Prof. Univ. Dr. Rodica Cuciureanu

Doctorand,

Lăcrămioara Elena Patriche (Lisă)

IAŞI

2014

Conform Deciziei Rectorului Universităţii de Medicină şi Farmacie

„Gr. T. Popa” Iaşi nr. 14060 din 08.07.2014 a fost numită comisia pentru

susţinerea publică a tezei de doctorat intitulată „Alimentele şi

suplimentele nutritive - surse de vitamină A pentru organism”

elaborată de Farm. Lăcrămioara Elena Patriche (Lisă), în vederea

conferirii titlului de doctor în ştiinţe Medicale, domeniul Farmacie.

Componenţa comisiei de doctorat:

PREŞEDINTE: Decan Prof. univ. dr. Monica Hânceanu

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi

CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. univ. dr. Rodica Cuciureanu

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi

REFERENŢI OFICIALI:

Prof. univ. dr. Daniela Lucia Muntean

Universitatea de Medicină şi Farmacie, Târgu Mureş

Prof. univ. dr. Doina Miere

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca

Conf. dr. Nela Bibire

Universitatea de Medicină şi Farmacie „Grigore T. Popa”, Iaşi

Susţinerea publică a tezei de doctorat va avea loc în data de

19.09.2014 ora 11.00 în Sala Societăţii de Medici şi Naturalişti, Iaşi.

Prezenta teză de doctorat cuprinde 143 pagini, este ilustrată

prin 86 figuri şi 45 tabele şi conţine 219 indicaţii bibliografice,

rezumatul cuprinde un număr limitat din totalul acestora.

În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru

cuprins, tabele şi figuri.

CUPRINS

INTRODUCERE ………………………………………………………………. 1

Motivaţia cercetării ……………………………………………………………... 3

Structura şi obiectivele tezei de doctorat ……………………………………….. 3

PARTEA GENERALĂ …………………………………………………………. 5

Capitolul I

Vitamina A şi organismul uman ………………………………………………... 6

I.1. Vitaminele – aspecte generale ……………………………………... 6

I.2. Vitamina A: structură şi proprietăţi fizico – chimice ………………. 8

I.2.1. Sinteza vitaminei A ………………………………………… 10

I.2.2. Biosinteza vitaminei A ……………………………………... 13

I.2.3. Farmacocinetica vitaminei A .................................................. 14

I.2.4. Rolul vitaminei A în organismul uman .................................. 17

I.2.5. Necesarul zilnic de vitamină A ............................................... 24

I.2.6. Deficitul de vitamină A–consecinţele şi populaţiile cu risc ... 31

I.2.7. Toxicitatea vitaminei A …………………………………….. 33

Capitolul II

Alimentele şi suplimentele nutritive – aspecte generale ....................................... 36

II.1. Surse alimentare de vitamină A ……………………………………. 36

II.1.1. Alimentele de origine animală - surse de vitamină A ……… 37

II.1.2. Alimentele de origine vegetală - surse de vitamină A ……… 37

II.2. Reglementări legislative privind suplimentele nutritive .................... 37

II.3. II.3.1. Suplimentele nutritive – surse de vitamină A .………………………. 38

Capitolul III

Detecţia şi cuantificarea vitaminei A …………………………………………… 40

III.1. Extracţia vitaminei A din probe ………………………………….. 40

III.2. Determinarea cantitativă a vitaminei A …………………………... 40

PARTEA PERSONALĂ ………………………………………………………... 46

Capitolul IV

Estimarea conţinutului în vitamină A din produse alimentare ………………….. 47

IV.1. Introducere .…………………………………………………............ 47

IV.2. Determinarea spectrofotometrică a vitaminei A din produsele

alimentare …………………………………………………………... 48

IV.2.1. Determinarea vitaminei A din probele de margarină prin

metoda spectrofotometrică Carr - Price ..................................... 49

IV.2.2. Reactivi ……………………………………………………... 49

IV.2.3. Protocol experimental ……………………………………..... 49

IV.2.3.1. Trasarea curbei de calibrare ……………………... 49

IV.2.3.2. Determinarea randamentului de recuperare ……... 50

IV.2.4. Evaluarea stabilităţii vitaminei A în probele de margarină … 50

IV.2.5. Determinarea vitaminei A din probele de margarină ………. 52

IV.2.6. Rezultate ……………………………………………………. 52

IV.2.7. Discuţii ……………………………………………………… 53

IV.2.8. Concluzii ……………………………………………………. 53

Capitolul V

Determinarea HPLC a vitaminei A din suplimente nutritive …………………… 54

V.1. Introducere …………………………………………………………. 54

V.2. Validarea unei metode HPLC de determinare a vitaminei A ………. 56

V.2.1. Protocol de validare a metodelor analitice ………………... 56

V.3. Raport de validare ………………………………………………….. 62

V.3.1. Reactivi …………………………………………………… 62

V.3.2. Condiţii cromatografice de analiză ……………………….. 62

V.3.3. Liniaritatea (curba de calibrare) …………………………... 62

V.3.4. Selectivitatea ……………………………………………… 63

V.3.5. Limita de cuantificare …………………………………….. 64

V.4. Determinarea vitaminei A din probe de suplimente nutritive ……… 65

V.4.1. Reactivi ……………………………………………………... 65

V.4.2. Probele de analizat ………………………………………….. 65

V.4.3. Prepararea soluţiei de bază de retinil acetat (SI)……………. 66

V.4.4. Analiza cromatografică ……………………………………... 66

V.4.5. Separarea vitaminei A din probe …………………………… 66

V.4.6. Rezultate ……………………………………………………. 66

V.4.7. Discuţii ……………………………………………………… 72

V.4.8. Concluzii ……………………………………………………. 72

Capitolul VI

Determinarea HPLC a vitaminei A din probe de ser uman …………………….. 74

VI.1. Introducere …………………………………………………………. 74

VI.2. Materiale şi metodă ............................................................................ 75

VI.2.1. Design-ul studiului clinic în vederea recoltării probelor

biologice ……………………………………………………. 75

VI.2.2. Protocolul studiului …………………………………………. 76

VI.2.2.1. Reactivi ………………………………………….. 76

VI.2.2.2. Soluţiile standard ………………………………... 76

VI.2.2.3. Prepararea probelor ……………………………… 76

VI.2.2.4. Echipamente şi condiţii cromatografice ................ 76

VI.2.3. Studiul liniarităţii …………………………………………… 77

VI.2.4. Limita de detecţie …………………………………………... 77

VI.2.5. Limita de cuantificare ………………………………………. 78

VI.3. Rezultate ………....………………………………………………… 78

VI.4. Discuţii ………....…………………………………………………... 83

VI.5. Concluzii …………………………………………………………… 85

Capitolul VII

Farmacocinetica retinolului administrat pe cale orală la femei ………………… 86

VII.1. Introducere …………………………………………………………. 86

VII.2. Studii clinice realizate ……………………………………………… 87

VII.3. Subiecți …………………………………………………………….. 87

VII.4. Design-ul studiului în vederea recoltării probelor biologice ………. 88

VII.5. Metoda analitică …………………………………………………. 88

VII.6. Concentraţiile plasmatice ale retinolului …………………………... 88

VII.7. Analiza farmacocinetică noncompartimentală …………………….. 92

VII.7.1. Parametrii farmacocinetici ai retinolului …………………. 94

VII.7.2. Analiza statistică a parametrilor farmacocinetici …………. 97

VII.8. Concluzii …………………………………………………………… 97

Capitolul VIII

Evoluţia unor parametri biochimici după administrarea orală de vitamină A ….. 98

VIII.1. Introducere ……………………………………………………….. 98

VIII.2. Materiale şi metode ………………………………………………. 98

VIII.3. Eşantionare ……………………………………………………….. 100

VIII.3.1. Repartiția lotului luat în studiu funcţie de sex ………... 100

VIII.3.2. Repartiţia lotului luat în studiu funcţie de vârstă ……… 100

VIII.3.3. Repartiţia lotului luat în studiu funcţie de înălțime …… 102

VIII.3.4. Repartiţia lotului luat în studiu funcţie de greutate …… 104

VIII.4. Evoluţia parametrilor biochimici diferenţiată pe sexe …………… 106

VIII.4.1. Determinarea activităţii transaminazelor ……………... 106

VII.4.1.1. Determinarea activităţii alanin-aminotransferazei ……. 106

VII.4.1.2. Determinarea activităţii aspartat-aminotransferazei …… 108

VIII.4.2. Determinarea activităţii γ-glutamil transpeptidazei …... 109

VIII.4.3. Determinarea fosfatazei alcaline (ALP) ………………. 110

VIII.4.4. Determinarea proteinelor totale ……………………….. 111

VIII.4.5. Determinarea bilirubinei ……………………………… 112

VIII.4.5.1. Determinarea bilirubinei totale ……………………….. 113

VIII.4.5.2. Determinarea bilirubinei directe şi indirect …………… 114

VIII.4.6. Determinarea colesterolului …………………………... 115

VIII.4.7. Determinarea trigliceridelor …………………………... 116

VIII.5. Discuţii …………………………………………………………… 117

VIII.6. Concluzii …………………………………………………………. 125

Concluzii generale ……………………………………………………………... 126

Bibliografie ……………………………………………………………………... 128

Index Tabele …………………………………………………………………… 145

Index Figuri ……………………………………………………………………. 147

Anexa 1. Aviz comisia de etică a cercetării …………………………………….. 151

Anexa 2. Formular de informare ……………………………………………….. 153

Anexa 3. Formular de consimţământ informat în cercetare ……………………. 155

Anexa 4. Lista de articole publicate din tematica tezei de doctorat ……………. 157

Motivaţia cercetării

Suplimentele alimentare care au vitamină A în compoziţia lor sunt

recomandate şi administrate pentru completarea necesarului de vitamină A

pentru organism. Deoarece, în general aceste suplimente nu se

administrează după evaluarea statusului nutriţional al organismului în

vitamină A, se impun precauţii pentru a se evita aportul excesiv al acestui

micronutrient. Înregistrarea şi punerea pe piaţă a suplimentelor alimentare

nu este supusă aceloraşi reglementări ca şi în cazul medicamentelor şi de

aceea, în cazul vitaminei A, micronutrient la care balanţa deficit/exces este

în limite foarte înguste este necesară respectarea concentraţiei

micronutrientului pe doza unitară administrată.

Asigurarea aportului optim de vitamine liposolubile este o

necesitate în asigurarea unei alimentaţii echilibrate. Sursele alimentare de

vitamine liposolubile nu sunt întotdeauna suficiente pentru a asigura acest

aport. Suplimentele nutritive cu vitamine pot completa acest aport.

Avantajul recurgerii la suplimente este acela al estimării aportului zilnic,

dar este contracarat de insuficienta cunoaştere a biodisponibilităţii fiecărui

component a produsului administrat, în condiţiile în care standardizarea

diferitelor principii nutritive sub formă de „supliment nutritiv” nu este strict

controlată.

Vitamina A se găseşte în mod natural în multe produse alimentare,

de origine vegetală şi animală. Unele alimente (margarina) sunt îmbogăţite

în vitamină A pentru a li se îmbunătăţi calitatea. Margarina este un aliment,

de origine vegetală, mult utilizat în alimentaţie datorită aportului crescut în

grăsimi vegetale, vitamină A şi vitamină D. Legislaţia sanitară în vigoare,

prevede pentru vitamină A şi esterii săi în margarină, un minimum de

25.000 U.I./kg, în funcţie de sortul acesteia. Complexitatea chimică a

produsului alimentar studiat, dar mai ales stabilitatea chimică extrem de

redusă a vitaminei A fac destul de dificilă determinarea acesteia în

margarină.

Studiile de farmacocinetică a vitaminelor liposolubile din

suplimentele nutritive autorizate în România pot contribui la optimizarea

formulării (concentraţii, asocieri posibile, incompatibilităţi), administrării şi

biodisponibilităţii principiilor nutritive.

Structura şi obiectivele tezei de doctorat

Memoriul tezei de doctorat este structurat în două părţi: Partea

Generală şi Partea Experimentală.

Partea Generală cuprinde trei capitole în care sunt prezentate

informaţii privind: principalele proprietăţi fizico-chimice ale vitaminei A,

metodele de sinteză şi de biosinteză, farmacocinetica şi rolul vitaminei A în

organsim, necesarul zilnic de vitamină A, precum şi consecinţele

deficitului/excesului de vitamină. De asemenea, tot în cadrul acestei părţi

sunt prezentate aspecte generale privind alimentele şi suplimentele

alimentare ca surse de vitamină A, alături de extracţia şi determinarea

cantitativă a acesteia.

Partea Experimentală alcătuită din cinci capitole, prezintă

urmatoarele obiective principale:

determinarea conţinutului în vitamină A din diferite sorturi de

margarină şi evaluarea stabilităţii chimice a acesteia (Cap. IV);

validarea unei metode lichid cromatografice (HPLC) cuplată cu

detecţie UV adaptată dozării vitaminei A, precum şi aplicarea

metodei validate în vederea determinării conţinutului de vitamină

A din unele suplimente alimentare de pe piaţa românească (Cap.

V);

determinarea concentraţiei plasmatice de vitamină A din sânge prin

metoda HPLC (Cap. VI);

studierea din punct de vedere farmacocinetic a retinolului după

administrarea orală a unei doze unice de vitamină A la femei

sănătoase, unele dintre ele gravide (Cap.VII);

studierea diferenţiată pe criterii de sex, vârstă, înălţime, greutate, a

evoluţiei unor parametri biochimici, după administrarea orală în

doză unică a 100.000 U.I. vitamină A (Cap.VIII).

PARTEA EXPERIMENTALĂ

Capitolul IV. Estimarea conţinutului în vitamină A

din produse alimentare

Vitamina A se găseşte ca atare în produsele alimentare de origine

animală sau sub formă de caroteni, provitamine în produsele alimentare de

origine vegetală. Unele alimente (margarina) sunt îmbogăţite în vitamină A

pentru a li se îmbunătăţi calitatea. Margarina este un aliment, de origine

vegetală, mult utilizat în alimentaţie datorită aportului crescut în grăsimi

vegetale, vitamină A şi vitamină D.

Legislaţia sanitară în vigoare, prevede pentru vitamina A şi esterii săi

în margarină, un minimum de 25.000 U.I./kg, în funcţie de sortul acesteia

(Norma din 22.11.2001). Complexitatea chimică a produsului alimentar

studiat, dar mai ales stabilitatea chimică extrem de redusă a vitaminei A fac

dificilă determinarea acesteia în margarină. Cercetările experimentale

incluse în acest capitol au avut ca obiective:

Determinarea conţinutului în vitamină A din diferite sorturi

de margarină prin metoda spectrofotometrică Carr-Price;

Evaluarea stabilităţii vitaminei A în probele de margarină.

IV.2.1. Determinarea vitaminei A din probele de margarină prin

metoda spectrofotometrică Carr-Price

Vitamina A formează cu triclorura de stibiu (reactivul Carr-Price) în

soluţie cloroformică, o coloraţie albastră, cu maximum de absorbţie la 620

nm. Reacţia este dată şi de β-caroten, şi de aceea se dozează în prealabil

carotenii.

IV.2.3.1. Trasarea curbei de calibrare Metoda este liniară pentru domeniul de concentraţii 10 - 150 μg

retinol. Ecuaţia de regresie liniară obţinută este y = 0,0042x – 0,0053,

valoarea coeficientului de corelaţie R2 este 0,9966.

Fig. IV.1. Curba de calibrare pentru acetat de retinol la concentraţii

cuprinse între 10 şi 150 g/ml.

IV.2.4. Evaluarea stabilităţii vitaminei A în probele de margarină

Cunoscută fiind fotostabilitatea redusă a vitaminei A, am realizat un

studiu al dinamicii conţinutului în vitamină A pe o durată de 60 de zile. S-a

lucrat pe probe de margarină „Unirea” şi margarină „vrac”, achiziţionate de

la producători, imediat după condiţionare. Determinarea vitaminei A s-a

efectuat imediat după achiziţionarea probelor şi la 7, 15, 30 şi 60 de zile.

Rezultatele sunt consemnate în figurile IV.2. şi IV.3. din care se constată

după 60 de zile, scăderi puţin semnificative ale conţinutului iniţial de

vitamină A Abaterile procentuale medii rezultate din evaluarea stabilităţii

vitaminei A din probele de margarină luate în studiu faţă de concentraţiile

declarate sunt 6,45% pentru margarina „Unirea”, respectiv 8,85% pentru

margarina „vrac”.

Fig. IV.2. Dinamica valorilor vitaminei A în probele de margarină

„Unirea” pe o perioadă de 60 de zile.

Fig. IV.3. Dinamica valorilor vitaminei A în probele de margarină „vrac”

pe o perioadă de 60 de zile.

IV.2.5. Determinarea vitaminei A din probele de margarină

S-au analizat 9 probe de margarină; probele au fost achiziţionate

din reţeaua comercială a oraşului Galaţi.

Separarea vitaminei A din probele de margarină s-a realizat prin

hidroliză alcalină. Calculul conţinutului de vitamină A din probe s-a

realizat cu ajutorul relaţiei: y = 0,0042x – 0,0053.

IV.2.6. Rezultate

Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A din probele de

margarină sunt inserate în tabelul IV.5.

Tabel IV.5.

Conţinutul de vitamină A în probelor de margarină analizate.

Nr.

crt. Denumirea probei

Concentraţia vitaminei A

(µg/g) Diferența

Declarată Determinată

1 Margarina „Unirea” 7,50 7,24 0,26

2 Margarina „Linco” 7,50 6,18 1,32

3 Margarina „Delma” 8,00 7,25 0,75

4 Margarina „Holland” 7,50 6,93 0,57

5 Margarina „Wiesana Omega 3 + 6” 8,00 7,69 0,31

6 Margarina „Wiesana Light” 8,00 7,53 0,47

7 Margarina „Fruhstuck” 7,50 7,05 0,45

8 Margarina „Rama Clasic” 8,00 7,82 0,18

9 Margarina „vrac” 5,00 4,12 0,88

IV.2.7. Discuţii

Determinarea vitaminei A din probele de margarină prin metoda

spectrofotometrică Carr-Price a condus la rezultate bune.

Metoda este liniară pentru domeniul de concentraţii 10-150 μg

retinol; valoarea coeficientului de corelaţie R2 este 0,9966. Conţinutul în

vitamină A s-a calculat după formula: y = 0,0042x – 0,0053.

Randamentul de recuperare pentru vitamina A a fost determinat

după îmbogăţirea probelor de margarină „Unirea” şi margarină „vrac” cu

acetat de retinil.

Procentele de regăsire variază între 88,42% - 93,14% pentru probele

de margarină „Unirea” şi, respectiv 85,34% - 89,13% pentru probele de

margarină „vrac”. Rezultatele obţinute în acest studiu sunt comparabile cu

cele existente în literatura de specialitate. Astfel, Egbuonu (1986) a raportat,

pentru probe de ficat de porc, procente de recuperare de vitamină A de 93 -

94%, utilizând metoda spectrofotometrică Carr-Price, în cazul în care s-au

adăugat 5μg acetat de retinol la fiecare 1 mL de extract. Media de

recuperare a fost 93,89 cu amestec de solvenţi clorură de metilen și

cloroform.

Evaluarea stabilităţii vitaminei A în margarină pe o perioadă de 60

zile a evidenţiat scăderi cu 6,5% pentru margarina „Unirea” și cu 8,86%

pentru margarina vrac. Se observă o stabilitate mai bună a margarinei

„Unirea” ambalată comparativ cu margarina „vrac” care este supusă acțiunii

factorilor fizico-chimici din mediul înconjurător.

Metoda spectrofotometrică Carr-Price a fost aplicată la determinarea

vitaminei A din probe de margarină. Pentru toate probele analizate valorile

obţinute au fost mai mici comparativ cu conţinutul declarat pe etichetă de

producator.

IV.2.8. Concluzii Metoda spectrofotometrică Carr-Price este liniară pentru domeniul

de concentraţii 10-150 μg retinol.

Valorile obţinute pentru probele de margarină analizate au fost mai

mici comparativ cu conţinutul declarat pe etichetă de producator, ceea ce

confirmă încă o dată instabilitatea vitaminei A în prezenţa luminii şi a

oxigenului din produsele alimentare. Dezavantajul metodei constă în timpul

extrem de scurt în care trebuie realizată citirea, ceea ce necesită viteză mare

de lucru.

Capitolul V. Determinarea HPLC a vitaminei A

din suplimente nutritive

Metodele cromatografice de lichide de înaltă performanţă (HPLC)

utilizate pentru separarea vitaminelor liposolubile sunt folosite încă din

1973. În majoritatea cazurilor, aceste metode folosesc cromatografia de

lichide cu fază inversă pentru determinarea trans-retinolului (Zaman et al.,

1993; Abahusain et al., 1998). Alte lucrări, deasemenea, confirmă precizia

cuantificării carotenoidelor şi retinoizilor prin această metodă (Talwar et

al., 1998; Gueguen et al., 2002; Nikolin et al., 2004; Moren et al., 2005).

Suplimentele alimentare pe bază de vitamină A sunt recomandate şi

administrate în vederea completării necesarului de vitamină A pentru

organism. Înregistrarea şi punerea pe piaţă a suplimentelor alimentare nu

este supusă aceloraşi reglementări ca şi medicamentele. De aceea, în cazul

vitaminei A - micronutrient la care balanţa deficit/exces prezintă limite

foarte înguste, este necesară respectarea concentraţiei pe doza unitară

administrată.

Cercetările experimentale au urmărit două obiective:

Validarea unei metode HPLC de determinare a vitaminei A;

Aplicarea metodei validate pentru determinarea conţinutului în

vitamină A al unor suplimente alimentare de pe piaţa

românească.

V.3. Raport de validare

În cercetările realizate am adaptat metoda HPLC aplicată de către

Bui-Nguyen şi Blanc în determinarea vitaminei A din lapte şi din brânză pe

probe de suplimente alimentare (Bui-Nguyen şi Blanc, 1979).

V.3.3. Liniaritatea (curba de calibrare)

Curba de calibrare a fost liniară în intervalul de concentraţii 0,05 -

10 g/ml. Ecuaţia de regresie liniară obţinută este y = 5368x + 346, cu un

coeficient de corelaţie: r2= 0,9995.

Fig. V.1. Curba de calibrare obţinută pentru soluţii de trans-retinol în amestec

metanol/apă 95:5 (v/v), pentru concentraţii cuprinse între 0,05 şi 10 g/ml.

V.3.4. Selectivitatea

Selectivitatea metodei a fost determinată prin modificări în

compoziţia fazei mobile. Pentru obţinerea unor timpi de retenţie diferiţi (o

bună rezoluţie) au fost testate mai multe amestecuri de solvenţi pentru faza

mobilă. Timpii de retenţie obţinuţi (în minute), pentru mai multe

amestecuri de fază mobilă studiate, sunt prezentaţi în tabelul V.1.

Tabel V.1.Timpii de retenţie obţinuţi (în minute) pentru amestecuri de faza mobilă.

Faza mobilă trans-retinol Retinil acetat

Metanol 2,34 2,52

Metanol/apă (99:1) 3,81 4,19

Metanol/apă (95:5) 4,15 4,70

Metanol/apă (90:10) 4,52 5,22

Metanol/acetonitril/apă (75:20:5) 2,49 2,85

Rezoluţia separării

Folosind ca fază mobilă amestecul metanol/apă (95:5) a fost

determinată rezoluţia separării cromatografice, valoarea obţinută Rs = 1,82

indică o bună separare a celor doi compuşi, fapt ce reiese şi din

cromatograma prezentată în Figura V.3.

Fig. V.3. Cromatograma amestecului de trans-retinol şi retinol acetat (S.I.) pentru

concentraţii de 10 g/ml retinol şi 4 g/ml retinol acetat.

Retenţia relativă s ca o măsură a selectivităţii metodei, are

valoarea medie 1,4 ± 0,2 determinată pentru un număr de trei analize pe trei

concentraţii diferite: 0,5; 2 respectiv 5 g/ml.

V.3.5. Limita de cuantificare Limita de cuantificare a fost determinată prin diluţii repetate ale

soluţiilor etalon, pentru un raport semnal/zgomot (S/N) egal cu trei, a fost

de 20 ng/ml pentru trans-retinol şi de 50 ng/ml pentru retinol acetat (S.I.),

metoda de analiză putând fi folosită pentru determinarea vitaminei A din

probe în care se găseşte în concentraţii foarte mici.

V.4. Determinarea vitaminei A din probe de suplimente nutritive

Dozarea vitaminei A din suplimente nutritive se realizează prin

simpla extracţie a retinolului din produs.

V.4.2. Probele de analizat În cercetările noastre au fost analizate

cinci suplimente alimentare conţinând vitamină A achiziţionate din reţeaua

farmaceutică a oraşului Galaţi:

V.4.5. Separarea vitaminei A din probe Pentru analiza vitaminei A prezentă sub formă de retinil esteri în

suplimente nutritive separarea vitaminei A s-a realizat în două variante:

extracţie în n-hexan şi extracţie în amestec apă - n-hexan (5 : 1) cu 0,05%

2,6-diterţbutil-4-metilfenol.

V.4.6. Rezultate

În Figura V.5. este prezentată cromatograma obţinută pentru retinil

acetat (standard intern) în concentraţie de 5 g/ml (reprezentare plană şi

tridimensională), în condiţiile cromatografice menţionate.

Timpii de retenție pentru determinarea retinolului din produsele

studiate prezintă valoarea medie 4,5082 ± 0,033, determinarea acestuia

bazându-se pe analiza statistică elementară aplicată pe seriile de date

experimentale obținute (Tabel V.2.).

a. b.

Fig. V.5. Cromatograma soluţiei de retinol acetat-standard intern (5 g/ml):

a) reprezentare plană; b) reprezentare tridimensională.

Tabel V.2. Valorile medii ale timpilor de retenție a retinolului și

retinil acetatului în produsele farmaceutice studiate.

Sursa de Vitamină A Valorile medii

tR retinol tR retinol acetat

A 4,413 4,980

B 4,607 5,208

C 4,478 5,070

D 4,490 5,072

E 4,553 5,152

Imaginea cromatografică obţinută pentru Proba A din cele 5

suplimente alimentare analizate este prezentată în figura V.6..

Fig. V.6. Profilul cromatografic HPLC al retinolului și acetatului de retinol din

produsul A: Retinol (tR = 4,413) Acetat de retinol (tR = 4,980).

Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A prin metoda

HPLC din probele de analizat sunt inserate în figura V.11.. S-a constatat că

pentru cele 5 probe de suplimente nutritive nu există diferenţe

semnificative între conţinutul declarat şi valoarea determinată a retinolului

total din suplimentele alimentare studiate.

V.4.7. Discuţii

În urma evaluării experimentale a parametrilor de validare au fost

stabilite condiţiile de lucru care au confirmat validitatea metodei propuse.

Validarea metodei a fost realizată urmărind parametrii: de liniaritate,

selectivitate, rezoluţia separării, retenţia relativă, limita de detecţie.

Curbele de calibrare atât pentru trans-retinol, cât şi pentru retinil

acetat (standardul intern) au fost lineare în intervalul de concentraţii 0,05-

10 μg/ml. Ecuaţia de regresie liniară obţinută este y = 5368x + 346, cu un

coeficient de corelaţie r2 = 0,9995.

Limita de cuantificare găsită pentru un raport semnal/zgomot (S/N)

egal cu trei, a fost de 20 ng/ml pentru trans-retinol şi de 50 ng/ml pentru

retinil acetat. Timpii de retenţie: 4,413 min. pentru trans-retinol şi 5,080

min. pentru retinil acetat au fost obţinuţi după folosirea mai multor

amestecuri de fază mobilă.

1

2

Fig. V.11. Conţinutul în retinol al probelor analizate.

Folosirea metodei HPLC permite măsurarea retinolului liber şi a

esterilor săi, chiar în prezenţa altor componente care pot interfera în

cuantificare. Această metodă poate fi complementară metodei

spectrofotometrice, mai ales prin evitarea metodelor laborioase de

saponificare. Din analiza rezultatelor obţinute la determinarea vitaminei A

din probele de suplimente alimentare luate în studiu nu se constată variaţii

semnificative faţă de concentraţiile declarate. Abaterile procentuale faţă de

concentraţiile declarate variază între 1,25% şi 14,35%. S-a constatat că

pentru două probe (A şi C) există diferenţe semnificative între conţinutul

declarat şi valoarea determinată.

V.4.8. Concluzii Pe baza parametrilor de validare analizaţi se poate concluziona ca

metoda HPLC validată corespunde cerinţelor metodelor HPLC pentru

determinarea principiilor active medicamentoase din medii complexe.

Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A din probele de

suplimente alimentare luate în studiu nu evidenţiază variaţii semnificative

faţă de concentraţiile declarate. Abaterile procentuale variază faţă de

concentraţiile declarate între 1,25% şi 14,35%, valori care se încadrează în

limitele impuse de legislaţia în vigoare

Capitolul VI. Determinarea HPLC a vitaminei A

din probe de ser uman

Vitamina A aparţine grupului de vitamine liposolubile. La om

vitamina A (all-trans-retinolul) este esenţială pentru procesul vederii, în

reproducere, în reglarea sistemului imunitar, pentru dezvoltarea osoasă, în

timpul embriogenezei precum, şi pentru troficitatea mucoaselor și

tegumentelor (Binkley şi Krueger, 2000). Deasemenea s-a publicat ca

aceasta ar avea un rol preventiv în bolile cardiovasculare şi în mai multe

tipuri de cancer (Wolf, 1984; Uni et al., 2000; Fields et al., 2007).

Cercetările experimentale incluse în acest capitol au urmărit:

Validarea unei metode lichid cromatografice (HPLC) cuplată

cu detecţie UV pentru dozarea vitaminei A din sângele uman;

Determinarea concentraţiei plasmatice de vitamină A.

VI.2.1. Design-ul studiului clinic în vederea recoltării probelor

biologice

În derularea cercetării au fost respectate normele generale de

conduită privind necesitățile etice în cercetare la nivel național (Codul

Deontologiei Medicale din 06.06.1997) cât și a Declarației de la Helsinki

(Sommerset West Amendment, 1996) actualizate de Asociația Medicală

Mondială în 1996 și a Convenției asupra drepturilor omului și biomedicină

a Consiliului Europei adoptată în 1996. Pentru fiecare studiu clinic în parte,

protocolul clinic şi analitic al studiului a fost aprobat de către Comitetul de

Etică al Spitalului „Buna Vestire” din Galaţi (Anexa 1). În studiu au fost

incluși 24 voluntari sanătoși (12 femei și 12 bărbați cu vârste cuprinse între

20 și 64 de ani). Cu 48 h înaintea recoltării, voluntarilor nu li s-a permis, să

consume alimente şi băuturi cu conţinut bogat în vitamină A.

VI.2.2.4. Echipamente şi condiţii cromatografice

Analiza cromatografică a fost efectuată cu un cromatograf de

lichide „Thermo Finnigan Surveyor” cu pompă cuaternară şi degazor de

fază mobilă, echipat cu un detector cu reţea de fotodiode (DAD) şi un

sistem de operare Chrom Quest versiunea 4.1.

Separarea a fost realizată folosind o coloană cromatografică cu faze

inverse de tip C18 (Thermo Scientific Hypersil GOLD) cu lungimea de 250

mm, diametrul interior 4,6 mm şi cu grosimea particulelor de fază

staţionară de 5m.

Compuşii au fost eluaţi izocratic la un debit de 1,5 mL/min

folosind ca fază mobilă amestec metanol/apă 95:5 (v/v).

Monitorizarea s-a făcut cu ajutorul detectorului cu reţea de

fotodiode (DAD) atât prin monitorizarea întregului spectru UV, cât și

la lungimea de undă de 325 nm, toate analizele desfăşurându-se la

temperatura camerei.

VI.2.3. Studiul liniarității

Pentru determinarea liniarităţii, au fost preparate 7 soluţii standard

de lucru prin diluţia soluţiei stoc de all-trans-retinol în metanol, la

următoarele concentraţii: 1,88; 1,13; 0,94; 0,565; 0,18; 0,14 ; 0,07 g/mL.

Probele au fost preparate şi analizate cromatografic de trei ori. Pentru

analiza retinolului a fost folosită metoda regresiei liniare.

Curba de calibrare

RETINOL

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

0 0.5 1 1.5 2

conc. microg/ml

S r

eti

no

l

Fig. VI.1. Curba de calibrare obţinută pentru soluţii de all-trans-

retinol în metanol pentru concentraţii cuprinse între 0,07 şi 1,88 g/mL.

Concentrația retinolului din probele necunoscute a fost determinată

prin aplicarea ecuației curbei de regresie liniară la raportul suprafețelor: y =

255,4 + 33967,61x, cu un coeficient de corelare: r2 = 0,9989.

VI.3. Rezultate

În figurile VI.2. - VI.4. sunt prezentate cromatogramele rezultate în

urma analizei unor probe de ser, şi indică peak-urile obţinute pentru retinol

(peak-ul 1) cu tR = 4,200 min, 4,245 min, 4,193 min şi pentru standardul

intern (peak-ul 2) cu tR = 5,328 min, 5,380 min, 5,313 min, în condițiile

cromatografice utilizate în acest studiu.

Fig. VI.3. Cromatograma unei probei după injecţia a 20 μg de extract ser

şi standard intern (Pacientul nr. 2).

Metoda a fost aplicată pentru analiza cantitativă a retinolului

din sângele uman.

VI.4. Discuţii

Limita de detecție și limita de cuantificare, sunt suficient de mici

pentru a evidenția cele mai mici concentraţii de retinol prezente în sânge.

Datele prezentate sunt din analiza a 24 de subiecţi, 12 femei şi 12

bărbaţi, cu vârste cuprinse între 20 de ani şi 64 de ani. Concentraţiile pentru

all-trans-retinol au fost cuprinse între 0,509 μg/mL şi 1,580 μg/mL.

Intervalele pentru all-trans-retinol sunt în acord cu valorile de referinţă

recomandate pentru populaţia din România (0,600 – 1600 μg/mL).

Există mici diferențe între rezultatele obținute noi şi rezultatele

publicate de diverși autori și. Astfel, intervalele de concentraţii raportate

într-un studiu cu 221 de participanţi: 0,34 – 1,18 μg/mL (Siluk et al., 2007).

Deasemenea, intervalele de concentraţii raportate (0,24 – 1,28 μg/mL) în

studiul NHANES III pe populaţie din Statele Unite (NHANES, 2006), sunt

nesemnificativ diferite de rezultatele obţinute în acest studiu.

Distribuţia concentraţiilor de all-trans-retinol în ser a voluntarilor

participanţi la studiu sunt prezentate în Fig. VI.8.

Valorile statistice descriptive relevă o distribuție normală a

valorilor retinolului seric la subiecții de sex feminin și masculin luați în

1

2

studiu. Aceasta se evidențiază prin valorile indicilor Skewness și Kurtosis

mai mici de ±1,39, avand o valoare medie de 0,79 µg/mL pentru sexul

feminin și de 1 pentru sexul masculin.

Fig. VI.8. Distribuţia frecvențelor concentraţiilor de retinol în ser a lotului

luat în studiu.

VI.5. Concluzii

Curba de calibrare demonstrează o foarte bună liniaritate exprimată

prin coeficientul de corelare pentru întreg domeniul de concentrații de

interes clinic.

Utilizarea detectorului cu rețea de fotodiode permite obținerea unei

purități a peak-ului cromatografic necesară analizei. Selectivitatea obținută

prin modificarea lungimii de undă către maximul de absorbție al analitului

este esențială pentru o corectă determinare cantitativă a analitului.

Limita de detecție obținută a fost de 30 ng/ml, iar limita de

cuantificare a fost de 100 ng/ml. Aceste limite sunt suficient de mici pentru

determinarea cantitativă a celor mai mici concentraţii de retinol prezente în

sânge.

Metoda HPLC prezentată pentru determinarea retinolului în sânge

este precisă, exactă, selectivă, sensibilă şi reproductibilă. Metoda poate fi

aplicată în studiile clinice pentru investigarea retinolului în sânge.

Concentrația sanguină a retinolului nu s-a apropiat de nivelurile

toxice (1800 μg/mL). Nivelurile mai mari de retinol se datorează probabil

consumului excesiv de suplimente alimentare pe bază de retinol.

Capitolul VII. Farmacocinetica retinolului administrat

pe cale orală la femei

VII.1. Introducere

Farmacocinetica studiază viteza proceselor de absorbţie, distribuţie,

metabolizare şi excreţie a substanţelor medicamentoase şi a metaboliţilor

lor, precum şi a răspunsului farmacologic, terapeutic sau toxic, la animale

sau om.Pentru a descrie procesele cinetice pe care le suferă substanţa

medicamentoasă în organism, farmacocinetica utilizează noţiunile de model

farmacocinetic şi compartiment. Acestea sunt alese astfel încât să existe o

bună concordanţă între datele experimentale şi ecuaţiile matematice care

descriu modelul ales.

O condiţie esenţială pentru realizarea unei analize farmacocinetice

o constituie posibilitatea dozării substanţei medicamentoase în lichidele

biologice. Dificultăţile care apar la dozare constau în faptul ca în general

concentraţiile terapeutice ale celor mai multe substanţe active sunt mici, de

ordinul nanogramelor sau zecilor de nanograme şi în faptul că lichidele

biologice reprezintă matrici complexe de compuşi endogeni de care trebuie

separat compusul activ. Tehnicile analitice actuale (cromatografia de

lichide de înalta performanţă, cromatografia de gaze, electroforeza capilară)

permit dozarea cu mare acurateţe a substanţelor medicamentoase utilizate

în terapie.

În cadrul acestui capitol va fi studiată farmacocinetica retinolului

după administrarea pe cale orală a unei doze unice la femei sănătoase, unele

dintre ele gravide.

VII.2. Studiu clinic realizat

Pentru studiul farmacocineticii retinolului administrat în doză unică

pe cale orală la femei a fost realizat un studiu clinic „Studiul farmacocinetic

al vitaminei A administrată individual sau în asocieri similare celor din

suplimentele nutritive”, aprobat de către Comitetul de Etică al Spitalului

„Buna Vestire” din Galaţi (Anexa 1). Studiul farmacocinetic a fost realizat

prin injectarea unor voluntari sănătoși, conform protocolului de desfăşurare

a studiului, a unei doze unice de vitamină A și colectarea probelor de

sânge la intervale de timp bine stabilite.

VII.3. Subiecţi

În studiu au fost incluşi 12 voluntari sănătoşi, femei cu vârste

cuprinse între 22 şi 63 ani. S-au constituit doua loturi de voluntari: lotul

martor, femei la care s-a administrat vitamina A în doză unică de 100.000

U.I. (Vitamina A forte, capsule 50.000 U.I., S.C. Biofarm S.A., Bucureşti)

şi lotul cu femei gravide la care s-a administrat vitamina A în doză unică de

3.600 U.I. (Elevit Pronatal, comprimate filmate, Bayer S.R.L.). Subiecţii au

primit şi semnat câte un formular de consimţământ informat (Anexa 3) cu

privire la scopul studiului şi eventualele riscuri care pot apărea. După

semnarea formularului de consimţămât, subiecţilor li s-au prelevat probele

de sânge conform protocolului.

VII.5. Metoda analitică

Metoda analitică utilizată pentru determinarea concentraţiilor

plasmatice ale retinolului este metoda HPLC, validată în Capitolul VI.

VII.7. Analiza farmacocinetică noncompartimentală

Aceasta metodă de analiză îşi propune estimarea unor parametri

farmacocinetici ai substanţei medicamentoase pe baza datelor

experimentale, fără a face însă nici o presupunere referitoare la existenta

unui model matematic care să descrie cinetica substanţei respective în

organism. Valorile medii ale parametrilor farmacocinetici ai retinolului in

functie de starea de graviditate sunt prezentate în Tabelele VII.7 - VII.8.

Tabel VII.7. Valorile medii ale parametrilor farmacocinetici ai retinolului

administrat la femei non-gravide.

Parametru Media

aritmetică DS Min. Mediana Max. CV%

Media

geometrică

ASCall

(h·g/mL) 158,8 89,11 49,16 169,4 267,2 56,11 133,3

ASClast

(h·μg/mL) 158,8 89,11 49,16 169,4 267,2 56,11 133,3

Cl_F_obs

(mL/h) 26,08 10,77 16,03 21,63 46,13 41,31 24,56

Cmax

(μg/mL) 1,449 0,3661 0,9070 1,591 1,882 25,26 1,406

HL_Lambda

_z (h) 304,5 109,9 133,3 319,0 428,9 36,07 284,3

Lambda_z

(1/h) 0,002657 0,001343 0,001616 0,002183 0,005202 50,52 0,002438

Tmax (h) 38,00 22,02 12,00 36,00 72,00 57,94 32,35

Vz_F_obs

(L) 10390 2885 7063 9305 14670 27,77 10070

Tabel VII.8. Valorile medii ale parametrilor farmacocinetici ai retinolului

administrat la femei gravide.

Parametru Media

aritmetică DS Min. Mediana Max. CV%

Media

geometrică

ASCall

(h·μg/ml) 139,3 57,08 77,46 123,8 210,4 40,98 129,9

ASClast

(h·μg/ml) 139,3 57,08 77,46 123,8 210,4 40,98 129,9

Cl_F_obs

(mL/h) 48,07 34,32 13,55 36,16 104,2 71,39 38,58

Cmax

(μg/ml) 1,129 0,3138 0,7140 1,168 1,444 27,79 1,090

HL_Lambda

_z (h) 259,3 140,1 72,69 246,4 493,9 54,04 223,9

Lambda_z

(1/h) 0,003754 0,002933 0,001403 0,002821 0,009536 78,14 0,003096

Tmax (h) 42,00 33,51 6,000 48,00 72,00 79,80 26,19

Vz_F_obs

(L) 13020 4403 9008 11330 20070 33,81 12460

VII.8. Concluzii

A fost realizată analiza farmacocinetică a concentraţiilor plasmatice

ale retinolului obţinute în urma unui studiu clinic în care s-a administrat

3.600 U.I. palmitat de retinol la femei gravide şi 100.000 U.I. palmitat de

retinol la femei non-gravide.

În prima parte a analizei datelor obţinute a fost aplicată analiza

farmacocinetică noncompartimentală. Au fost calculate valorile

parametrilor farmacocinetici Cmax, Tmax, ASClast, ASCall, Lambda_z

(constanta de viteza a eliminarii), t½, Cl aparent şi Vd aparent. Valorile

parametrilor farmacocinetici au fost comparate în funcţie de factorul

fiziologic graviditate, negăsindu-se diferenţe statistic semnificative între

parametri.

Capitolul VIII. Evoluţia unor parametri biochimici după

administrarea orală de vitamină A

VIII.1. Introducere

Efectele toxicitaăţii acute și cronice a vitaminei A sunt bine

documentate în literatura de specialitate. Dovezi emergente sugerează că

subtoxicitatea fără semne clinice de toxicitate, poate fi o preocupare tot mai

mare, pentru că aportul din surse de vitamina A preformată depășește de

multe ori doza zilnică recomandată (DZR) pentru adulți, în special în țările

dezvoltate (Fletcher şi Fairfield, 2002). Osteoporoza şi fractura de şold sunt

asociate cu aportul de vitamina A preformată, care sunt doar de două ori

mai mari decât DZR. Evaluarea statusului vitaminei A la persoane cu

subtoxicitate sau toxicitate este complicată, deoarece concentrațiile serice

de retinol sunt indicatori nonspecifici, în acest interval interferând rezervele

de vitamina A din ficat.

În acest capitol cercetările experimentale au urmărit:

Evoluţia unor parametri biochimici la om, după administrarea

orală în doză unică a 100.000 U.I. de vitamină A;

Corelarea statistică a dinamicii parametrilor biochimici cu

concentraţiile serice de vitamină A dupa adminsitrarea orală a

unei doze unice de 100.000 U.I. de vitamină A.

VIII.2. Materiale şi metode

Protocol experimental

Recoltarea probelor de sânge s-a efectuat cu consimțământul

informat al pacienților conform Convenției Internaționale a Națiunilor

Unite. Studiul efectuat a ținut cont de prevederile Conferinței Internaționale

de Armonizare susținută de autoritățile competente în domeniul

medicamentului precum și de ghidurile etice internaționale pentru

cercetarea biomedicală pe subiecți umani revizuită în 1993, 2001 și 2002.

Toți subiecții și-au dat consimțământul pentru participare după ce au fost

informați cu privire la scopul și posibilele riscuri ale acestui studiu. Probele

de sânge (3 mL, puncţie venoasă) au fost recoltate dimineaţa pe nemâncate

(8.00 - 9.00) la Spitalul de Obstetrică şi Ginecologie „Buna Vestire” din

Galaţi, în vacutainere fără anticoagulant şi prelucrate în laboratorul de

analize medicale din cadrul spitalului.

Subiecţi

În studiu au fost incluşi 19 voluntari sănătoşi, 11 femei şi 8 bărbaţi,

cu vârste cuprinse între 22 şi 63 ani. Înainte cu 48 h de începerea studiului

şi pe toată perioada studiului, voluntarilor nu li s-a permis, să consume

alimente şi băuturi cu conţinut bogat în vitamină A. Imediat după

prelevarea primei probe de sânge (proba blank) subiecţilor li s-a administrat

pe cale orală, 100.000 U.I. palmitat de retinol în doză unică (Vitamina A

forte, cps. 50.000 U.I., S.C. Biofarm S.A., Bucureşti). În continuare au fost

prelevate probe la 24h, 72h şi 168h după administrarea vitaminei A.

Investigaţii biochimice

După recoltare, probele de sânge destinate determinărilor

biochimice au fost centrifugate timp de 10 minute la 4.000 rot./min cu o

centrifugă EBA 20 Hettich Zentrifugen.

Serul obţinut a fost supus imediat determinărilor biochimice care s-

au realizat prin metode spectrofotometrice standardizate folosind

microslide-uri VITROS, şi au urmărit evoluţia activităţii următorilor

parametri biochimici: ALAT/TGP; ASAT/TGO; GGT; fosfataza alcalină;

proteine totale; bilirubină totală, direct şi indirectă; cholesterol şi

triglyceride. Determinările cantitative ale parametrilor biochimici vizaţi de

experimentul realizat s-au efectuat la analizorul automat VITROS 250 -

biochimie uscată.Toate rezultatele prezentate reprezintă media a 3

determinări.

VIII.5. Discuţii

Pe baza rezultatelor obţinute a fost evaluată dinamica valorilor

parametrilor biochimici determinaţi (Fig. VIII.23-27.).

Dinamica valorilor transaminazelor serice (TGP, TGO) relevă o

creștere marcantă după 24 de ore în cazul TGO și după 72 h pentru TGP.

Aproape de 168 h valorile transaminazelor încep să scadă.

Dacă valorile GGT și Proteinele totale rămân constante, valorile fosfatazei

alcaline marchează o creștere după 24 de ore de la administrarea a 100.000

U.I. de vitamină A.

Dacă bilirubina totală și cea indirectă creșterea este remarcată ușor

în intervalul 24 - 72 h urmată de scăderea valorilor, pentru bilirubina

directă se constată o creștere cu 66 % după 24 de ore de la administrare

atingând un maxim la 168 h. Retinolul este conjugat cu acidul glucuronic

după care compusul conjugat intră în circuitul enterohepatic și este oxidat

la acid retinoic.

Valorile serice ale trigliceridelor înregistrează o reducere de

aproximativ 13% și o creștere cu 13% a valorilor colesterolului după 72 h

de la administrarea vitaminei A pe cale orală. În prezența vitaminei A,

concentrația serică a celor doi parametri sunt în relație de inversă

proporționalitate.

Fig. VIII.23-27. Dinamica valorilor medii a parametrilor biochimici timp de 168 h

după administrarea a 100.000U.I. vitamină A: (a) ALAT/TGP și ASAT/TGO; (b)

trigliceride și colesterol; (c) bilirubina totala, directă și indirectă; (d) GGT, proteine

totale și fosfataza alcalină.

Studiul statistic corelațional al dependenței dintre valorile serice

ale retinolului și unii parametri biochimici

Cu reazultatele obținute s-a realizat o corelație statistică între

dinamica concentrației serice de retinol după administrarea de vitamină A

și dinamica parametrilor biochimici serici, determinând modul în care

retinolul influențează procesele biochimice de la nivel celular. Valorile

b

d

a

.

b

.

c

. d

.

numerice ale acestor parametri pe baza cărora s-a realizat studiul

corelațional sunt prezentate în tabelul VIII.11.

Tabel VIII. 11.Valorile parametrilor biochimici și concentraţiile retinolului seric

determinate prin analiza HPLC.

Valorile medii Control 24 h 3 zile 7 zile

Nivelul retinolului seric determinat prin HPLC

Concentrația retiolului serc, μg/mL 0,861 1,169 1,177 0,964

Parametri biochimici

ALAT, U/L 27,00 29,20 34,40 26,60

ASAT, U/L 23,00 32,60 27,80 24,40

Colesterol, mg/dL 176,80 171,60 194,20 191,20

Trigliceride, mg/dL 172,20 113,60 102,20 86,00

Bilirubină totală, mg/dL 0,800 0,994 0,814 0,670

Bilirubină directă, mg/dL 0,184 0,304 0,144 0,202

Bilirubină indirectă, mg/dL 0,618 0,654 0,666 0,466

GGT, U/L 27,20 28,.80 24,40 23,00

Fosfatază alcalină, U/L 79,80 91,80 72,20 76,00

Proteine totale, g/100 mL 7,66 7,48 7,40 7,46

Fig. VIII.38. Repartiţia coeficienţilor de corelaţie Pearson a parametrilor

biochimici studiaţi.

Conform interpretării coeficientului Pearson am obţinut, corelații

puternice avem pentru transaminaze (TGP, TGO) și proteine totale,

moderate pentru trigliceride, bilirubină totală și indirectă și slabă pentru

bilirubină directă. Pentru restul parametrilor biochimici analizați nu avem

nici o corelație cu valorile concentrațiilor serice de retinol (Fig. VIII.38.).

VIII.6. Concluzii

Pe baza studiului diferenţiat pe criterii de sex, vârstă, înălţime şi

greutate, a evoluţiei parametrilor biochimici TGP, TGO, GGT, fosfatază

alcalină, proteine totale, bilirubină totală (directă şi indirectă), colesterol si

trigliceride, după administrarea orală în doză unică a 100.000 U.I. vitamină

A, a fost evaluată dinamica valorilor obţinute pentru aceşti parametri. În

aceste condiţii experimentale, s-a constatat faptul că dinamica valorile

transaminazelor serice (TGP, TGO) relevă o creștere marcantă, atât după

24 de ore în cazul TGO (27,60 U/L), cât și după 72 h pentru TGP (27,24

U/L). Dupa 168 h valorile transaminazelor încep să scadă. Dacă valorile

GGT și Proteinele Totale rămân constante, valorile fosfatazei alcaline

marchează o creștere după 24 de ore de la administrarea a 100.000 U.I. de

vitamină A. În ceea ce priveste bilirubina totală și cea indirectă, se remarcă

o uşoară creștere în intervalul 24-72 h, urmată de scăderea valorilor acestor

parametri, în timp ce pentru bilirubina directă se constată o creștere cu 66

% după 24 de ore de la administrare, valoarea acestui parametru atingând

un maxim la 168 h. Valorile serice ale trigliceridelor înregistrează o

reducere de aproximativ 13% și o creștere cu 13% a valorilor

colesterolului după 72 h de la administrarea vitaminei A pe cale orală. În

prezența vitaminei A, concentrația serică a celor doi parametri sunt în

relație de inversă proporționalitate.

Pe baza rezultatelor obţinute a fost realizat şi un studiu statistic

corelaţional între concentraţiile serice de retinol, după administrarea dozei

unice de vitamină A, şi parametrii biochimici menţionaţi (TGP, TGO,

GGT, fosfataza alcalină, proteine totale, bilirubina totală directă şi

indirectă, colesterol şi trigliceride). Conform interpretărilor coeficientului

Pearson, s-au observat corelații puternice pentru transaminazele (TGP,

TGO) și proteinele totale, în timp ce pentru trigliceride, bilirubină totală și

indirectă corelaţiile sunt moderate. În ceea ce priveşte bilirubina directă,

corelaţia conform interpretărilor coeficientului Pearson este slabă. Pentru

restul parametrilor biochimici analizați (GGT, fosfatază alcalină, colesterol)

nu avem nici o corelație cu concentrația de retinol seric.

CONCLUZII GENERALE

Cercetările efectuate în cadrul tezei de doctorat au permis atingerea

obiectivelor fixate corespunzătoare fiecărui capitol din Partea

Experimentală şi formularea unor concluzii generale, care au condus la

finalizarea tezei de doctorat conform obiectivelor propuse, după cum

urmează:

A fost efectuat un studiu experimental privind determinarea

conţinutului în vitamină A prin metoda spectrofotometrică Carr-

Price din diferite sorturi de margarină şi evaluarea stabilităţii

chimice a acesteia (Cap. IV). Valorile obţinute pentru probele de

margarină analizate au fost mai mici comparativ cu conţinutul

declarat pe etichetă de producător, ceea ce confirmă încă o dată

instabilitatea vitaminei A în prezenţa luminii şi a oxigenului din

produsele alimentare.

Studiul privind validarea unei metode cromatografice (HPLC)

cuplată cu detecţie UV adaptatată dozării vitaminei A (Cap. V), a

permis dezvoltarea unei metode rapide şi exacte de determinare a

vitaminei A din suplimentele nutritive.

Validarea metodei a fost realizată pe un cromatograf de lichide de

tip Thermo Finnigan Surveyor cu pompă cuaternară şi degazor de

fază mobilă cu detector cu reţea de fotodiode (DAD), prevăzut cu

un sistem de operare Chrom Quest versiunea 4.1. şi o coloană

Hypersil GOLD (Thermo Scientific) cu lungimea de 250 mm,

diametrul 4,6 mm şi mărimea particulelor 5m (250 mm x 4,6 mm

I.D. particle size 5 m). Au fost urmăriţi parametrii de liniaritate,

selectivitate, rezoluţia separării, retenţia relativă, limita de

cuantificare şi au fost stabilite urmatoarele condiţii de lucru pentru

determinarea HPLC a vitaminei A: faza mobilă utilizată

corespunde unui amestec metanol-apă (95 : 5, v/v), cu un debit de

1,5 mL/min, detecţia fiind de 325 nm, volumul de probă de injectat

corespunde valorii de 20 l, iar timpul de analiză este 10

min/probă. În condiţiile cromatografice descrise mai sus, curbele de

calibrare atât pentru trans-retinol, cât şi pentru retinil acetat

(standardul intern) au fost lineare în intervalul de concentraţii 0,05

- 10 μg/ml. De asemenea, limita de cuantificare determinată pentru

un raport semnal/zgomot (S/N) egal cu trei, a fost de 20 ng/ml

pentru trans-retinol şi de 50 ng/ml pentru retinil acetat. Timpii de

retenţie obţinuţi după testarea mai multor amestecuri de fază

mobilă, au fost de 4 min. pentru retinol şi de 5 min. pentru retinil

acetat.

Metoda de lucru astfel validată a putut fi aplicată în vederea

determinării conţinutului de vitamină A din unele suplimente

alimentare de pe piaţa românească, după extracţia lichid - lichid a

probelor în amestec apa : n-hexan (5:1) (utilizat ca solvent), in

prezenţă de 0,05% 2,6-diterţbutil-4-metilfenol, ca antioxidant.

Analiza parametrilor de validare arată că metoda validată

corespunde cerinţelor metodelor HPLC pentru determinarea

principiilor active medicamentoase din mediile complexe.

Rezultatele obţinute la determinarea vitaminei A din probele de

suplimente alimentare luate în studiu nu evidenţiază variaţii

semnificative faţă de concentraţiile declarate. Abaterile procentuale

variază faţă de concentraţiile declarate între 1,25% şi 14,35%.

Determinarea concentraţiei plasmatice de vitamină A din sânge

prin metoda HPLC (Cap. VI) a permis determinarea cantitativă a

retinolului seric. Curba de calibrare a fost obţinută pentru domeniul

de concentrații 0,07 şi 1,88 g/mL. Ecuația de regresie liniară

(y=255,4+33967,61x) și coeficientul de corelare (r2=0,9989)

demonstrează o liniaritate bună. Concentraţiile serice pentru all-

trans-retinol se situează între 0,509 μg/mL şi 1,580 μg/mL, fiind în

acord cu valorile de referinţă recomandate pentru populaţia din

România. Valorile statistice descriptive relevă o distribuție normală

a valorilor retinolului seric la subiecții de sex feminin și masculin

luați în studiu.

Studierea din punct de vedere farmacocinetic a retinolului după

administrarea orală a unei doze unice de vitamină A pe doua loturi

de femei sănătoase: gravide şi non-gravide (Cap. VII) a permis

determinarea valorilor parametrilor farmacocinetici Cmax, Tmax,

ASClast, ASCall, Lambda_z (constanta de viteza a eliminarii), t½, Cl

aparent şi Vd aparent. Valorile parametrilor farmacocinetici au fost

comparate în funcţie de factorul fiziologic graviditate, negăsindu-se

diferenţe statistic semnificative între parametri.

Pe baza studiului diferentiat pe criterii de sex, vârstă, înălţime şi

greutate, a evoluţiei parametrilor biochimici TGP, TGO, GGT,

fosfatază alcalină, proteine totale, bilirubină totală (directă şi

indirectă), colesterol şi trigliceride, după administrarea orală în

doză unică a 100.000 U.I. vitamină A (Cap. VIII), a fost evaluată

dinamica valorilor obţinute pentru aceşti parametri. În aceste

condiţii experimentale, s-a constatat faptul că dinamica valorile

transaminazelor serice (TGP, TGO) relevă o creștere marcantă, atât

după 24 de ore în cazul TGO (27,60 U/L), cât și după 72 h pentru

TGP (27,24 U/L). După 168 h valorile transaminazelor încep să

scadă. Dacă valorile GGT și Proteinele Totale rămân constante,

valorile fosfatazei alcaline marchează o creștere după 24 de ore de

la administrarea a 100.000 U.I. de vitamină A. În ceea ce priveşte

bilirubina totală și cea indirectă, se remarcă o uşoară creștere în

intervalul 24 - 72 h, urmată de scăderea valorilor acestor parametri,

în timp ce pentru bilirubina directă se constată o creștere cu 66 %

după 24 de ore de la administrare, valoarea acestui parametru

atingând un maxim la 168 h. Valorile serice ale trigliceridelor

înregistrează o reducere de aproximativ 13% și o creștere cu 13% a

valorilor colesterolului după 72 h de la administrarea vitaminei A

pe cale orală. În prezența vitaminei A, concentrația serică a celor

doi parametri sunt în relație de inversă proporționalitate.

Pe baza rezultatelor obţinute a fost realizat şi un studiu statistic

corelaţional între concentraţiile serice de retinol, după

administrarea dozei unice de vitamină A, şi parametrii biochimici

menţionaţi (TGP, TGO, GGT, fosfatază alcalină, proteine totale,

bilirubină totală directă şi indirectă, colesterol şi trigliceride).

Conform interpretărilor coeficientului Pearson, s-au observat

corelații puternice pentru transaminazele (TGP, TGO) și proteinele

totale, în timp ce pentru trigliceride, bilirubină totală și indirectă

corelaţiile sunt moderate. În ceea ce priveşte bilirubina directă,

corelaţia conform interpretărilor coeficientului Pearson este slabă.

Pentru restul parametrilor biochimici analizați (GGT, fosfatază

alcalină, colesterol) nu avem nici o corelație cu concentrația de

retinol seric.

Originalitatea tezei constă în abordarea complexă a posibilităţilor

de determinare a vitaminei A din produse alimentare, suplimente

alimentare şi lichide biologice (sânge uman), de prelucrare

statistică şi de corelare a parametrilor analizaţi. Tehnicile de

cercetare sunt moderne şi performante, în concordanţă cu

dezvoltările ştiinţifice contemporane. Rezultatele cercetărilor

prezintă un interes deosebit pentru domeniul alimentaţiei şi pentru

sănătatea populaţiei în România.

PERSPECTIVE DE CERCETARE

Consumul excesiv şi neavizat de către specialişti de suplimente

alimentare pe bază de vitamină A reprezintă un subiect sensibil de sănătate

publică. Rezultatele evaluarii acestui micronutrient, la care balanţa

deficit/exces se afla în limite foarte înguste, arată necesitatea reevaluării

periodice a aportului nutriţional al populaţiei.

Astfel, se justifică necesitatea continuării studiilor în următoarele

direcţii:

- Identificarea nutrienţilor critici pentru populaţie;

- Cartografierea deficitului datorat neacoperirii nevoilor zilnice

de vitamină A, şi respectiv depăşirii limitelor maxime tolerate;

- Stabilirea unor strategii de combatere pe termen lung, atât a

deficitului de vitamină A, cât şi a excesului acesteia;

- Metodele validate pot fi aplicate pentru extinderea studiilor

clinice de farmacocinetică a retinolului şi a derivaţilor acestuia;

- Continuarea studiilor de farmacocinetică a vitaminei A din

suplimentele nutritive autorizate în România, fapt ce contribuie

la optimizarea standardizării formelor farmaceutice

(concentraţii, asocieri posibile, incompatibilităţi), administrării

şi biodisponibilităţii principiilor nutritive.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Álvarez R, Vaz B, Gronemeyer H, de Lera AR. Functions. Therapeutic

Applications, and Synthesis of Retinoids and Carotenoids. Chem Rev

2014; 114(1): 1-125.

Amoussa Hounkpatin WBA. Evaluation du potentiel de couverture des

besoins en vitamine A des jeunes enfants à partir des sauces

accompagnant les aliments de base consommés au Bénin. Université

Montpellier 2 (FRA), 2011.

Binkley N, Krueger D. Hypervitaminosis A and bone. Nutr Rev 2000; 58:

138-144.

Carr FH şi Price EA. Colour Reactions Attributed to Vitamin A. J Biochem

1926; 20(3): 497-501.

Carrière I, Delcourt C, Lacroux A, Gerber M. Nutrient intake in an elderly

population in southern France (POLANUT): deficiency in some

vitamins, minerals and omega-3 PUFA. Int J Vitam Nutr Res 2007;

77(1): 57-65.

Chaimongkol L, Pinkaew S, Furr HC et al. Performance of the CRAFTi

portable fluorometer comparing with the HPLC method for

determining serum retinol. Clinical Biochemistry 2011; 44: 1030-

1032.

Chen Y, Okano K, Maeda T et al. Mechanism of all-trans-retinal toxicity

with implications for stargardt disease and age-related macular

degeneration. J Biol Chem 2012; 287(7): 5059-5069.

Ching S, Ingram D, Hahnel R et al. Serum levels of micronutrients,

antioxidants and total antioxidant status predict risk of breast cancer

in a case control study. J Nutr 2002; 132(2): 303-306.

Dufour DR, Lott JA, Nolte FS et al. Diagnosis and Monitoring of Hepatic

Injury. I. Performance Characteristics of Laboratory Tests. Clin

Chem 2000; 46(12): 2027-2049.

Food and Nutrition Board. Institute of Medicine. Dietary Reference Intakes

for Vitamin A, Vitamin K, Arsenic, Boron, Chromium, Copper,

Iodine, Iron, Manganese, Molybdenum, Nickel, Silicon, Vanadium,

and Zinc. Washington DC: National Academy Press, 2001.

Gamache PH, Freeto SM, Acworth IN. Coulometric array HPLC analysis

of lipid soluble vitamins and antioxidants. Am Clin Lab 1999; 6:18-

19.

Goodman AB. Retinoid receptors, transporters, and metabolizers as

therapeutic targets in late onset Alzheimer disease. J Cell Phys 2006;

209: 598-603.

Hao Z, Parker B, Knapp M, Yu L. Simultaneous quantification of alpha-

tocopherol and four major carotenoids in botanical materials by

normal phase liquid chromatography-atmospheric pressure chemical

ionization-tandem mass spectrometry. J Chromatogr A 2005;

1094(1-2): 83-90.

Harrison EH. Mechanisms of digestion and absorption of dietary vitamin

A. Annu Rev Nutr 2005; 25: 87-103.

Kane MA, Folias AE, Napoli JL. HPLC/UV quantitation of retinal, retinol,

and retinyl esters in serum and tissues. Anal Biochem 2008; 378: 71-

79.

Khan A, Khan MI, Iqbala Z et al. An optimized and validated RP-

HPLC/UV detection method for simultaneous determination of all-

trans-Retinol (Vitamin A) and α-Tocopherol (Vitamin E) in human

serum: Comparison of different particulate reversed-phase HPLC

columns. J Chromatogr B 2010; 878: 2339-2347.

Lothar Thomas. Enzymes. In: Clinical laboratory diagnostics: use and

assessment of clinical laboratory results. 1ed. Frankfurt/Main,

Germany: TH-Books Verl., 1998, 80-85.

NHANES III Study - Centers for Disease Control and Prevention,

Inorganic Toxicology and Nutrition Branch, Division of Laboratory

Sciences, National Center for Environmental Health, Laboratory

Procedure Manual, Fat Soluble Micronutrients (Vitamins A, E, and

Carotenoids).

OMS - World Health Organization. Indicators for assessing Vitamin A

Deficiency and their application in monitoring and evaluating

intervention programs. Geneva: WHO, 1996.

Ordinul nr. 1069 din 19/06/2007 pentru aprobarea Normelor privind

suplimentele alimentare.

Siluk D, Oliveira RV, Esther-Rodriguez R M et al. A validated liquid

chromatography method for the simultaneous determination of

vitamins A and E in human plasma. J Pharm Biomed Anal 2007;

44(4): 1001-1007.

Wolf G. The enzymatic cleavage of β-carotene: still controversial. Nutr Rev

1995; 53: 134-137.

Zhang X, Chen K, Ping Q et al. Effect of biscuits fortifed with different

doses of vitamin A on indices of vitamin A status, haemoglobin and

physical growth levels of pre-school children in Chongqing. Public

Health Nutr 2010; 13(9): 1462-1471.

ANEXA 4. LISTA DE ARTICOLE PUBLICATE DIN TEMATICA

TEZEI DE DOCTORAT

Articole ştiinţifice publicate în reviste cotate ISI

1. Elena Lăcrămioara Patriche (Lisă), Octavian Croitoru, Gigi

Coman, Dana Tutunaru, Claudia Simona Ştefan, Rodica Cuciureanu;

Validation of HPLC method for determination of retinol in different dietary

supplements; lucrare acceptată pentru publicare în revista Romanian

Biotechnological Letter Factor de Impact 2012: 0,363.

Articole ştiinţifice publicate în reviste cotate B+ (BDI)

1. Elena Lăcrămioara Patriche (Lisă), Octavian Croitoru, Gigi

Coman, Dana Tutunaru, Claudia Simona Ştefan, Rodica Cuciureanu –

Pharmacokinetic evaluation of serum retinol concentrations correlated with

biochemical parameters on healthy subjects. Analele Universităţii

„Dunărea De Jos” Galaţi, Medicină, Fascicula XVII 2014; 1: 35-41.

Participări la Manifestări Ştiinţifice Naţionale:

1. Croitoru O., Buteică A.S., Lisă E.L.: Analiza vitaminei A prin

cromatografie de lichide şi detecţie cu reţea de diode. Poster. Simpozionul

Actualităţi şi perspective în cercetarea farmaceutică, Craiova, 26-28

septembrie 2012. Rezumat publicat în volumul de rezumate al

simpozionului, ISBN 978-606-11-2833-4, 62.

2. Patriche (Lisă) E.L., Cuciureanu R.: L’évaluation de la

stabilite de la vitamine a dans les aliments. Poster. Septième Colloque

Franco-Roumain de Chimie Appliquée – COFrRoCA 2012, 27-29 iunie

2012, Bacău, România. Rezumat publicat în volumul de rezumate al

simpozionului, ISSN 2068-6382, 107.

3. Lisă E.L.: Dietoterapia deficienţelor vitaminice – Hipo-

vitaminoza A. Comunicare orală. A XV -a reuniune naţională de istoria

farmaciei, Galaţi, 18-20 iunie 2009. Rezumat publicat în volumul de

rezumate al simpozionului, ISBN 978-973-8932-44-9, 37.

4. Lisă E. L., Cuciureanu R.: Suplimente alimentare - Surse de

vitamine liposolubile pentru organism. Poster. Conferinţa Naţională de

Fitoterapie, ed. a-IV-a, Iaşi, 14-16 mai 2008. Rezumat publicat în volumul

de rezumate al simpozionului.