Alteracions del genoma i el

transcriptoma en càncer colorectal

Aplicació a la recerca de factors de pronòstic

Memòria presentada per

Elisenda Vendrell i Soler

per optar al grau de

Doctor en Biologia

Tesi realitzada sota la direcció del Dr. Miquel Àngel Peinado

a l’Institut de Recerca Oncològica.

Tesi adscrita al Departament de Genètica de la Facultat de Biologia.

Programa de Genètica, bienni 1999-2001.

Tutora: Dra. Montserrat Corominas Guiu.

Miquel Àngel Peinado Montserrat Corominas Elisenda Vendrell

Barcelona, gener de 2005

A la meva mare

Al meu pare

Als meus tres germans

“Aquell que comparteix el seu saber i el discuteix

amb els altres obté un coneixement universal. En

canvi, és pobre qui creu saber i guarda els seus

coneixements per a ell mateix, perquè així s’endinsa

en el camí sense sortida de la limitació.”

I Ching, el llibre de les transformacions.

AGRAÏMENTS

“Res no és res, ningú no és ningú, si no és en les

seves relacions. El «jo» no existeix si no és amb els altres. Gotes d’aigua al corrent d’un riu, pedres en un mur”

Pep Subirós, escriptor i filòsof. “Sobre la felicitat i altres neguits”, Ediciones Destino, 2003.

La tesi que teniu entre mans és el resultat d’uns quants anys de feina i vivències, que arribats a aquest punt em passen tot d’un plegat per la ment. Són molts records, bons i dolents, i són molta la gent que m’ha ajudat durant aquest camí. Per això no puc deixar d’agrair a tothom la seva col·laboració i ajuda.

En primer lloc el meu director de tesi, el Miquel Àngel Peinado (MAP). Qui un bon dia em va trucar per preguntar si encara estava interessada en la recerca, i no m’ho vaig pensar dues vegades. Gràcies per tots els teus bons consells científics, gràcies per la teva manera de deixar-nos fer mentre no ens trobem en un atzucac. Gràcies per la teva direcció i optimisme. Què hagués fet sense la teva visió realista de les coses? Sort del teu recolzament en aquest camí feliç a vegades, i trist només algun dia. L’art de la discussió és una bona manera per aprendre, com el saber escoltar i el deixar parlar. I durant aquests anys hem discutit molt, t’he escoltat més, i sempre m’has deixat dir el que volia. Gràcies de nou per tot plegat!

En segon lloc, he d’agrair-li a la Maria (na Marieta de can Trias, no us confongueu) el seu ajut i participació directa en la part de la CGH. També la seva direcció i consells han estat imprescindibles per tirar endavant aquest treball. La teva manera de viure la ciència va ser una injecció d’energia al grup del MAP. La teva disposició a discutir en qualsevol moment cap qüestió científica van ser una font de coneixements constant. Gràcies per tantes converses, per les apostes guanyades i perdudes, per les novatades que ens van fer riure tant! Els congressos compartits i les vacances a Eïvissa. A on anirem a sopar per la propera aposta?

I ara toquen els companys de feina. Jordi (el patumaire de Banyoles), durant aquests anys hem xerrat, ens hem ajudat, i hem après plegats. Tot i que les teves estades en terres llunyanes van ser llargues, sempre has estat molt a prop. Els teus e-mails des de l’altre punta del món em van ser d’una gran ajuda durant l’època que escrivia aquesta tesi. Gràcies per aconsellar-me i saber dir les paraules més adequades i que més necessitava sentir en els moments difícils. I gràcies per encomanar-nos el teu somriure. Tots hem viatjat una mica a través de les narracions de les teves aventures. I per cert, on vols anar a sopar? Un deute és un deute!

Al PJ (el patumaire de Sabadell) vull agrair-li la seva simpatia. El teu bon humor i optimisme són encomanadissos. Compartir la feina, el Colgate, les partides de ping-pong, l’esquaix, i les sortides de camp va ser molt divertit. I la ruta del tast de braves sempre es pot ampliar, tot i la nostra fidelitat al Tomàs... Per quan les properes braves?

A la Gemma Aiza li dec els meus primers coneixements de les tècniques del laboratori. La seva experiència i el seu sentit pràctic de fer les coses sempre han estat de molt bona ajuda. Tot i la nostra diversitat d’opinions, treballar com a veïnes mai ha estat un problema. I una altra de les meves primeres mestres al lab, va ser l’Olga Campos. A ella també vull agrair-li la seva paciènca a explicar-me les coses, la seva disposició constant a ajudar, i la seva amistat. I gràcies també per la Glòria, qui amb el seu sentit de l’humor sempre fa que se’ns escapi un somriure. Gràcies a totes tres!

A la Rosana li dono les gràcies per la seva amistat i l’acollida que em va fer quan vaig arribar al grup. Sempre disposada a exlpicar-me qualsevol dels meus dubtes. Juntament amb la Gemma Tarafa van ser les nostres mestres en el camp de les microarrays. Tancava el grup la Mònica. Totes quatre vam viure molt bons moments, congressos, i també decepcions quan les hibridacions no sortien. A la vida no tot són flors i violes... I en l’última etapa també li dono les gràcies a l’Antònia per la seva col·laboració amb la feina de les hibridacions.

A la Cristina li agraeixo la seva ajuda amb la tècnica de la CGH. Així com la seva col·laboració amb la posada a punt de la PCR quantitativa. La seva companyia durant els nostres viatges al Clínic. Les estones d’espera fins a veure els resultats es feien més amens.

Jairo, el megacrack de la informàtica i el meu mecànic de bici particular. Gràcies per la teva ajuda a cada pregunta que t’he fet. I també gràcies per escoltar-me a les tardes solitàries de l’IRO, quan tots dos trobàvem que teníem el budell buit. I tampoc puc deixar d’agrair tots els teus esforços perquè la meva bici pugui circular. Et pago una copa quan vulguis!

A la Mar li dono les gràcies per la seva participació al projecte de les microarrays. La seva capacitat de treball és inesgotable, i el seu cop de dreta a l’esquaix impossible de tornar. També vull agrair-te totes les vegades que ens has alimentat amb les magnífiques magdalenes que fa el teu pare!

A la Regina, l’última en arribar, li agraeixo la seva simpatia i el somriure generós. Gràcies per totes les sortides que hem organitzat, ja sigui amb bici, amb cotxe o en avió. I per totes les converses compartides.

A l’Elena (la caçadora de baldriga cendrosa), li agraeixo la seva amistat i companyia. Conèixer com treballa un biòleg de bota és sempre interessant. A cada campanya per mostrejar ens ha fet una mica d’enveja, perquè mentre ella recórrer illes a la

recerca de les aus amb els seus ajudants inexperts, nosaltres ens quedem a Barcelona. I també li agraeixo al Jacob els sopars i sortides que ha organitzat, ràpidament la col·laboració va passar a amistat.

I de tota la gent que en un moment o altre han passat pel grup del MAP en guardo un molt bon record, com la Laia i el Jorge, amb els que vaig coincidir uns quants mesos.

Al Xavi li dec tots els meus coneixements d’R. Gràcies per haver-me obert la finestra [x11()] a aquest nou llenguatge. Tot i la dificultat inicial reconec que el resultat ha estat molt satisfactori. Tot són avantatges quan treballes amb R, m’has ben convençut! I gràcies també pel teu sentit de l’humor, les teves converses a través del messenger, i totes les hores que t’has trencat les banyes intentant optimitzar i automatitzar les meves necessitats programàtiques. Que mai eren problemes trivials com a mi em semblava...

Al Joan em toca agrair-li les anàlisis de l’última part d’aquesta tesi, però no per això menys important. Gràcies per les teves lliçons de l’ACP, gràcies per l’esforç que has fet responent a les meves preguntes. I gràcies per la teva bonhomia.

Al Gabriel Capellà i al Víctor Moreno vull agrair-los tots els esforços que han posat per tirar endavant el projecte de microarrays.

A la Laura i la Sandra els dono les gàcies per fer els talls dels blocs d’OCT. I a la Laura també he d’agrair-li la seva amistat i els seus últims consells estètics. Quan tornarem a Eïvissa? L’hivern ja s’acaba...

Al Felip, li agraeixo la revisió histològica de totes les mostres d’aquesta tesi. Gràcies per la teva dedicació i per voler compartir tots els teus coneixements, sempre que xerrem aprenc alguna cosa nova!

I també vull agrair al grup de l’Elías Campo la facilitat que ens van donar per instal·lar-nos al seu laboratori per fer les PCRs quantitatives, i especialment a la Sílvia qui ens va explicar tots els detalls de la tècnica. Gràcies pel teu pragmatisme i alegria.

I ara toca la part dels nostres veïns del COM: a la Mireia li dono les gràcies per la seva generositat, sempre a punt per ajudar; a l’Anna, per la seva sinceritat; a l’Antònia per la seva ajuda tècnica i pel seu art culinari; a l’Eva per la seva simpatia i per ajudar-me en aquelles coses que sabem són importants de debò; i també un esment per a l’Anna Llorens. A la Berta vull dir-li que moltes gràcies pels bons moments que hem viscut plegades, i per regalar-me unes cadires (...). I a l’Eder li agraeixo la seva alegria i li dono ànims per la seva immersió ràpida al català.

Dels que han canviat el COM per NYC també en guardo bons records: Yolanda, Olga i Àlex. A aquest últim gràcies per deixar-nos un tros del teu pis. I també una salutació als que s’han traslladat a Salamanca, Ruth i David, us dec una visita!

I pel què fa a l’altre veïnat, els de l’ICO, vull esmentar el Paco, disposat a buscar neu carbònica per tot l’hospital cada vegada que en necessitava; el Josep Maria disposat a xerrar i divertir-me sempre que coincidim; a l’Álvaro sempre disposat a anar de festa i a parlar dels seus viatges; i al David sempre disposat a fer un tast d’un bon vi, i per ajudar-me amb el disseny de la portada. I gràcies finalment a la resta de gent del laboratori de l’ICO, amb qui compartim aparells del lab i sortides. I a la Isa, per preguntar-me dia sí i dia també quan em faltava per acabar, i preocupar-se de si tenia una casa on dormir.

I també li dono les gràcies a l’Àngela per tot el seu ajut en la meva estada a Los Angeles. Gràcies a ella i al seu cotxe per les vegades que em van acompanyar per aquelles autopistes.

Durant un temps vaig compaginar la feina de la tesi amb la col·laboració amb l’associació D-Recerca (www.come.to/drecerca), que lluita per millorar les condicions del personal investigador en formació (altrament dit becaris), així com per millorar la qualitat de la recerca a Catalunya. Gràcies per la feina feta i ànims pels que continueu! De tots ells n’he tret uns quants amics: Teresa, Edu, Xavi de P., Cesca, Miquel Àngel Pujana, Ana, Marc, Hèctor, Òscar i Elena. Però la feina que fem des d’aquí no tindria tant ressò, ni seria tanta si no fos pel treball que es fa en coordinació amb la federació d’associacions Precarios (www.precarios.org), on també vaig fer unes quantes amistats: Pastora, Toni, Marta, Cristina, i Pablo. Suerte de las listas de correo electrónico para continuar charlando de vez en cuando.

I ja per acabar, vull donar les gràcies a tots els amics i amigues que durant aquests anys m’han recolzat en els bons i, de tant en tant, mals moments. Ada, Gemma i Feliu, sempre sou allà a punt per quedar i organitzar el que sigui: sopars, cines i viatges. A la Maria i la Marta, gràcies per deixar-me disfrutar de La Patum com una berguedana més. I per tantes converses telefòniques… A les amigues del Costa i Llobera, Àgata, Maria José, i Èlia, sé que sempre puc contar amb vosaltres pel que sigui. A l’Anna i el Tomàs per convidar-me a tots els sopars i sortides que organitzen.

I ara només falta la família. A la meva mare no sé com donar-li les gràcies per ser com és. El seu suport incondicional, i els seus consells sempre han estat un referent per a mi. Sort de la seva despreocupació per aquelles coses que no valen la pena, i saber sempre què és el que necessito. Deixar-me emprenyar i no dir res, i també consolar-me quan cal. Al meu pare, el senyor discursos, li dono les gràcies per enrotllar-se com una persiana sobre tots els temes que el preocupen i li interessen. Escoltar-te i intentar rebatre’t sempre és un esforç d’enginy i dialèctica. Gràcies pels vermuts dels diumenges, i les sobretaules allargassades dels caps de setmana a La Gola. A la Carme li agraeixo les excursions amb barca de l’estiu, les tardes de

jardineria i bricolatge, i la seva opinió respecte tots els temes que afecten els becaris i la recerca d’aquest país. Als meus germans, gràcies per portar-me tant sovint la contrària. Roger, les teves opinions sempre són benvingudes, i gràcies per totes les prediccions del temps que m’has fet; Francesc, la teva passió per la música, la informàtica, i la vida són un bon exemple; Genís el teu interès pel jazz, l’esport i els viatges, també són una font d’aprenentatge. I a l’Anna li agraeixo el seu recolzament i interès pel desenvolupament d’aquesta tesi, que és quasi el temps que fa ens coneixem. I a tota la família torroellenca gràcies per cuidar-nos tan bé els caps de setmana: Astèrio, Nuri, Montserrat, Eduard, Georgina, Pol i Aida.

I res més, que em sento afortunada d’haver-vos conegut, a tots i cada un de vosaltres!

“No tinguis por de res més que de no fer res” Salvador Sostres

AVUI, 05/08/2004

La feina presentada en aquesta tesi ha estat finançada amb les ajudes

de les següents institucions:

• Ministerio de Sanidad y Consumo, Instituto de Salud Carlos III

(BEFI 99/9277).

• Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 00/81 i SAF 03/5821).

ÍNDEX

i

Abreviatures v

Relació de figures vii

Relació de taules x

I. INTRODUCCIÓ 1

1.1. Càncer colorectal (CCR). Trets generals. 3

Anatomia i histologia del còlon i el recte 3

El càncer colorectal 5

Epidemiologia del càncer colorectal 6

Cribratge 8

Classificació i estadis del carcinoma colorectal 10

Teràpia i desenllaç 14

1.2. Genètica del càncer colorectal 16

Síndromes hereditàries i casos esporàdics 16

Altres gens implicats en el càncer colorectal 19

Model de Vogelstein 25

Inestabilitat genètica i dany genòmic 26

La inestabilitat genètica és suficient com a motor de la tumorigènesi? 32

Amplificacions de DNA 34

Progressió tumoral 35

1.3. Estudis moleculars a gran escala 38

II. PREMISSA 43

III. OBJECTIUS 47

IV. MATERIALS I MÈTODES 51

4.1. Pacients i tipus de mostra 53

4.2. Extracció de DNA 55

4.3. Microdissecció 55

4.4. Extracció de l’RNA total 55

4.5. Hibridació genòmica comparada 56

a) Introducció a la tècnica 56

b) Protocol 57

c) Anàlisi de les dades 62

4.6. PCR quantitativa (QPCR) 62

ii

4.7. RNA Arbitrarily Primed PCR (RAP-PCR) 66

a) Introducció a la tècnica 66

b) Protocol 69

4.8. Microarrays de cDNA 72

a) Introducció a la tècnica 72

b) Esquema del mètode seguit 77

c) Protocol 78

d) Anàlisi de les dades de microarrays 82

4.9. Anàlisi estadístic 86

Classificar 86

Anàlisi de clusters no supervisats 86

Anàlisi de components principals (ACP) 87

V. RESULTATS 89

5. 1. Hibridació genòmica comparada 91

a) Perfil 91

b) Idiograma dels 50 casos 91

c) Detall de les alteracions cromosòmiques 94

d) Grups de tumors en funció de les alteracions cromosòmiques 98

Supervivència 107

Amplificacions 111

Associacions amb supervivència 112

Alteracions numèriques i estructurals 114

Mutacions a TP53 i LOHs a 17p 114

Mutacions a TP53 i Inestabilitat cromosòmica 114

TP53 i amplificacions 115

5. 2. Amplificació del gen de la ciclina D1 (CCND1) 115

5. 3. Expressió gènica diferencial 117

Normalització i transformació de les dades 120

Selecció dels gens 124

Descriptiva dels 128 gens 125

Anàlisi de components principals: ACP 129

Agrupaments jeràrquics a partir de les dades d’expressió 133

Supervivència lliure de malaltia 137

Amplificació i expressió del gen CCND1 137

iii

VI. DISCUSSIÓ 139

VII. CONCLUSIONS 159

VIII. BIBLIOGRAFIA 163

IX. ANNEXOS 181

Annex I. Informació complementària 183

Annex II. Article 195

v

ABREVIATURES

2D-PAGE two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis

ACP anàlisi de components principals

APC adenomatosis polyposis coli

AP-PCR arbitrarily primed polimerase chain reaction

BFB breakage-fusion-bridge

CIN inestabilitat cromosòmica

CCR càncer colorectal

CDK cyclin-dependent kinase

CGH hibridació genòmica comparada

cm centímetre

CSIRO Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization

DCC deleted in colorectal cancer

DD differential display

DLBCL diffuse large B-cell lymphoma

DM double minutes

DNA àcid desoxiribonucleic

dNTP deoxinucleòtids trifosfat

dsDNA double strand DNA

FISH fluorescence in situ hybridization

FOBT faecal ocult blood testing

g, mg, µg, ng gram, mil·ligram, microgram, nanogram

GDP guanosina difosfat

GTP guanosina trifosfat

HNPCC hereditary nonpolyposis colorectal cancer

HSR homogeneously staining region

ICML inestables cromosòmicament monosomic like

ICR inestables cromosòmicament restants

l, ml, µl litre, mil·lilitre, microlitre

LOH loss of heterozigosity

m, cm, mm, µm metre, centímetre, mil·límetre, micròmetre

M, mM, µM molar, mil·limolar, micromolar

Mb, kb, pb megabase, quilobase, parell de bases

M-FISH multiplex-FISH

vi

MMR mismatch repair

MS microsatèl·lits

MSI microsatellite instability

PBS phosphate-buffered saline

PMT photomultiplier

QPCR PCR quantitativa

RAP-PCR RNA AP-PCR

RDA representational difference analysis

RLGS restriction landmark genome scanning

RNA àcid ribonucleic

SAGE serial analysis of gene expression

SD desviació estàndard

SDS dodecil sulfat sòdic

SKY spectral karyotyping

SNP single nucleotide polyimorphism

SSC citrat sòdic salí

SSCP single strand conformation polymorphism

TCF transcription factor

vii

RELACIÓ DE FIGURES

Figura 1. Esquema de l’intestí gros. 3

Figura 2. Esquema d’una secció transversal del còlon. 3

Figura 3. (A) Representació esquemàtica d’una cripta del còlon. (B) Expressió de CD44, que és diana del tàndem β-catenina/TCF de la via de WNT. 4

Figura 4. El sistema de classificació de Dukes. 5

Figura 5. El sistema de classificació de Astler-Coller. 12

Figura 6. El sistema de classificació TNM. 13

Figura 7. Esquema de la via de senyalització de WNT. 18

Figura 8. Esquema de la via de TP53 en condicions d’homeòstasi cel·lular i càncer. 20

Figura 9. Esquema de les vies de regulació de RAS. 22

Figura 10. Extreta de l’article de Toribara i Sleisenger (1995). 25

Figura 11. Superació de barreres selectives en la cursa de la tumorigènesi. 33

Figura 12. Esquema de la CGH (hibridació genòmica comparada). 56

Figura 13. Esquematització gràfica dels passos a seguir per fer una CGH. 59

Figura 14. Esquema del mètode de PCR quantitativa Taqman (veure text). 63

Figura 15. Recta patró dels gens β2-microglobulina i ciclina D1. 64

Figura 16. Esquema del procés d’amplificació de l’RNA mitjançant RNA Arbitrarily Primed PCR (RAP-PCR). 67

Figura 17. Esquema del disseny experimental dut a terme amb les 50 mostres de l’estudi. 68

Figura 18. Concepte d'un experiment en format de microarray. 73

Figura 19. Esquema general del material necessari per dur a terme una hibridació sobre microarray. 77

Figura 20a. Esquema de les hibridacions. 78

Figura 20b. Esquema del xip Human-4.6K (HU4.6K) fabricat a la Universitat de Yale (EE.UU.). 80

Figura 21. Cambra d’hibridació de Corning. 81

Figura 22. Exemple dels resultats de la hibridació del cas 16 i el POOLN. 81

Figura 23. Gràfica de densitat de les intensitats mitjanes de la hibridació de 13 mostres REFERÈNCIA (mescla de 12 teixits normals). A l’eix de les abscisses es representen les intensitats expressades en logaritme en base 2. 83

Figura 24. Esquema dels càlculs realitzats amb totes les hibridacions. 85

Figura 25. Perfil i metafase del cas 109. 92

Figura 26. Idiograma dels 50 casos de càncer colorectal de l’estudi. 92

Figura 27. Histograma de freqüència dels guanys i pèrdues cromosòmiques. 93

viii

Figura 28. Histograma de freqüències del nombre d’alteracions cromosòmiques de la sèrie de 50 casos. 99

Figura 29. Heat map dels 50 casos. 102

Figura 30. Dendrograma dels casos. 103

Figura 31. Nombre d’alteracions de cada un dels grups definits seguint dues classi-ficacions independents. 104

Figura 32. Corbes de Kaplan-Meier de la supervivència lliure de malaltia en funció de l’estadi de Dukes. 108

Figura 33. Corbes de Kaplan-Meier de la supervivència lliure de malaltia per a la classi-ficació basada en els grups de la CGH. 108

Figura 34. Corbes de Kaplan-Meier de la supervivència lliure de malaltia pels diferents rangs en el número d’alteracions a nivell de la CGH. 109

Figura 35. Corbes de Kaplan-Meier de la supervivència lliure de malaltia pel conjunt de casos del grup ICML en funció del número d’alteracions. 109

Figura 36. Corbes de Kaplan-Meier de la supervivència lliure de malaltia pel conjunt de casos del grup ICR en funció del número d’alteracions. 111

Figura 37. Exemple dls cinc tipus d’amplificacions trobades a la sèrie de 50 casos. 111

Figura 38. Corbes de Kaplan-Meier de la supervivència lliure de malaltia en funció dels guanys al braç 11q. 113

Figura 39. Corbes de Kaplan-Meier de la supervivència lliure de malaltia en funció de la pèrdua del braç 12p. 113

Figura 40. (a) Imatge obtinguda a l’escannejar a una longitud d’ona de 550 nm. La paleta de colors és arbitrària: s’ha escollit un gradient que va del negre (poc senyal) a verds més intensos (més senyal). Els punts blancs indiquen els pícsels saturats. El material hibridat és la RAP-PCR del POOLN. (b) Imatge obtinguda a l’escannejar a una longitud d’ona de 650 nm. La paleta de colors és arbitrària: s’ha escollit un gradient que va del negre (poc senyal) a vermells més intensos (més senyal). Els punts blancs indiquen els pícsels saturats. El material hibridat és la RAP-PCR tumor número 67. 117

Figura 41. Detall de la mateixa àrea d’una hibridació amb quatre paletes de colors diferents. (a) L’escala de colors segueix la següent pauta de menys a més intensitat: negre < blau < verd < groc < vermell < blanc (saturat). (b) Imatge en blanc i negre, on el color blanc correspon a intensitats baixes, i el negre a intensitats altes. El color vermell indica els pícsels saturats. (c) Paleta de color verd. (d) Paleta de color vermell. 118

Figura 42. Imatge del canal Cy3 de dues hibridacions de mostres de teixit normal. (a) A l’àrea de la dreta es pot detectar una zona bruta on la sonda no s’ha rentat eficaçment. (1578a Cy3) (b) Veiem com quasi no hi ha senyal específica. 119

Figura 43. Intensitat mitjana dels 4608 gens de les 13 hibridacions del POOLN (eix de les abscisses) i de les 50 hibridacions dels teixits tumorals (eix de les ordenades). El codi de colors s’explica a la Figura 44. 122

Figura 44. A l’eix de les abscisses es representa la raó de la mitjana d’intensitat dels 50 casos entre el POOLN pels 4608 gens (les dades estan expressades en logaritme en base 2). 123

Figura 45. Histograma de freqüències dels p-valors de les correlacions entre les 8128 parelles de gens. 125

ix

Figura 46. Histograma de freqüències dels 8128 p-valors dels 128 gens agafats 2 a 2. La línia horitzontal contínua correspon a la distribució esperada si la correlació entre tots ells fos nul·la. La línia discontínua és a l’alçada de la distribució estimada. 125

Figura 47. Graph. Representació de les correlacions superiors a 0,9. 126

Figura 48. Heat map de les correlacions. Els valors propers a 1, que corresponen a una correlació positiva, apareixen de color verd, i els valors propers a –1, que corresponen a una correlació negativa, apareixen de color vermell. És de destacar que totes les correlacions més fortes son positives. 127

Figura 49. Graph. Representació de les correlacions superiors a 0,85. 127

Figura 50. Heat map de les correlacions. Els valors propers a 1, que corresponen a una correlació positiva, apareixen de color verd, i els valors propers a –1, que corresponen a una correlació negativa, apareixen de color vermell. 128

Figura 51. Desviacions recollides pels metagens. Observem que a partir del desè metagen, aproximadament, la desviació explicada es podria considerar residual. 130

Figura 52. Dendrograma dels 50 casos utilitzant com a distància les diferències d’expressió de 128 gens. 133

Figura 53. Dendrograma dels 128 gens utilitzant com a distància les diferències d’expressió. 134

Figura 54. Heat map dels resultats d’expressió dels 128 gens. 134

Figura 55. Corbes de Kaplan Meier de la supervivència lliure de malaltia dels 4 grups definits per microarrays. 136

x

RELACIÓ DE TAULES

Taula 1. Principals causes de mort per grans grups a Catalunya l’any 1997. Entre parèntesi (%): percentatge de la mortalitat total. 6

Taula 2. Càlcul dels casos nous anuals de les principals causes de càncer en homes (1998-2005). 7

Taula 3. Càlcul dels casos nous anuals de les principals causes de càncer en dones (1998-2005). 7

Taula 4. Detecció precoç del càncer colorectal. Intervencions proposades a grups de risc.

10

Taula 5. Estadis TNM. 14

Taula 6. Comparació entre el sistema dels estadis de Dukes i el TNM (Deans et al, 1992).

14

Taula 7. Tipus de dany genòmic en càncer colorectal (adaptat de Risques et al, 2003). 27

Taula 8. Tècniques emprades per a fer estudis a gran escala. 40

Taula 9. Resum dels 50 casos de càncer colorectal seleccionats. 53

Taula 10. Detall de les característiques clinicopatològiques dels 50 casos escollits. 54

Taula 11. Marcatge de les sondes de la CGH. 59

Taula 12. Condicions de la PCR quantitativa pel gen ciclina D1. 65

Taula 13. Condicions de la PCR quantitativa pel gen ß2-microglobulina. 65

Taula 14. Ús de mostres de complexitat reduïda enfront cDNA total en estudis d’expressió gènica per arrays. 68

Taula 15. Condicions de la transcripció inversa amb l’oligonucleòtid pU6. 69

Taula 16. Condicions de la PCR amb l’oligonucleòtid pU6. 70

Taula 17. Possibles característiques de diferents formats de microarrays. 73

Taula 18. Comparació dels dos tipus de suport dels arrays: el filtre i el vidre. 74

Taula 19. Aplicacions de les arrays. 74

Taula 20. Condicions del marcatge per Kleenow Fragment. 79

Taula 21. Mescla de la sonda per hibridar. 81

Taula 22. Resum de les alteracions cromosòmiques dels 50 casos de la sèrie. 96

Taula 23. Alteracions cromosòmiques recurrents detectades almenys al 15% dels casos. Ordenades de major a menor freqüència. 98

Taula 24. Nombre d’alteracions cromosòmiques en referència a característiques clinico-patològiques i moleculars. 99

Taula 25. Resum de les característiques de cada grup basat en els braços 17p i 18q. 101

Taula 26. Resum de les característiques de cada grup basat en els dendrogrames. 103

Taula 27. Característiques del grup amb inestabilitat de microsatèl·lits 105

Taula 28. Característiques del grup de CGH normal. 105

xi

Taula 29. Característiques del grup de CGH ICML. 106

Taula 30. Característiques del grup de CGH ICR. 106

Taula 31. Alteracions típiques del grup ICML comparat amb el grup ICR. 107

Taula 32. Amplificacions de DNA de la sèrie de 50 casos. 111

Taula 33. Correlació entre l’alteració de cada un dels cromosomes i la supervivència dels 50 casos mirat amb el test de Fisher. Només es donen els resultats que difereixen d’un p-valor=1. 112

Taula 34. Relació entre la supervivència i el guany del braç 11q. 112

Taula 35. Relació entre la supervivència i la pèrdua del braç 12p (no s’inclouen els casos que guanyen el 12p). 113

Taula 36. Relació entre la mutació de TP53 i la pèrdua del braç 17p (no s’inclouen els casos que guanyen el 17p). 114

Taula 37. TP53 i alteracions cromosòmiques (no s’han inclòs les amplificacions). 114

Taula 38. TP53 i les amplificacions. 115

Taula 39. Resultat de la QPCR del gen de la ciclina D1 en 7 teixits controls que no presenten canvis als cromosomes 11 i 15. 116

Taula 40. Resultats de la CGH i QPCR del gen de la ciclina D1. 116

Taula 41. Llistat de gens que presenten una correlació major de 0,9. 129

Taula 42. Gens que contribueixen fins a un 50% en els 10 primers eixos factorials. 131

Taula 43. p-valors inferiors a 0,05 pels metagens que distingeixen les diferents característiques clinicopatològiques. 132

Taula 44. Mitjana de la raó dels gens més diferencialment expressats en els 50 casos. 135

Taula 45. Comparació entre la classificació de la CGH i dels arrays. 136

Taula 46. Comparació entre els resultats dels arrays i la PCR quantitativa. 137

Taula 47. Alteracions cromosòmiques recurrents en càncer colorectal. 146

Taula 48. Nom i localització dels 128 gens amb una SD major de 0,8 seleccionats per a fer els estudis d’expressió. 183

Taula 49. Gens amb una correlació major de 0,85. 189

I. INTRODUCCIÓ

Introducció - 3 -

1.1. Càncer colorectal (CCR). Trets generals.

Per tal de comprendre millor alguns dels conceptes que s’utilitzaran al llarg

d’aquesta tesi començarem per introduir breument les bases anatòmiques i

histològiques del còlon i el recte.

Anatomia i histologia del còlon i el recte

El còlon i el recte són la part terminal del tracte digestiu. Comença a la vàlvula

ileocecal, quan acaba l’intestí prim, i arriba fins a l’anus. El còlon se subdivideix

en quatre trams: ascendent, transvers, descendent i sigmoide. Però a nivell

clinicopatològic sovint se simplifica en dues parts: proximal o còlon dret, que

comprèn el cec, el còlon ascendent i el transvers; i distal o còlon esquerre, format

pel còlon descendent, el sigmoide i el recte (Figura 1).

Figura 1. Esquema de l’intestí gros.

Les diferents capes que formen el gruix del tub són de la llum cap a l’exterior:

teixit epitelial, làmina pròpia, muscularis mucosa, submucosa, muscularis pròpia,

subserosa i serosa (Figura 2).

epitelilàmina pròpia

serosasubserosa

muscularis propia

submucosamuscularis mucosa

epitelilàmina pròpia

serosasubserosa

muscularis propia

submucosamuscularis mucosa

Figura 2. Esquema d’una secció transversal del còlon.

- 4 - Introducció

Les cèl·lules epitelials, d’on provenen els càncers de còlon, revesteixen la part

luminal del tracte digestiu. Aquestes cèl·lules es renoven a partir de les cèl·lules

mare (en anglès stem cells) situades a la base de les criptes de Lieberkühn (Figura

3). La renovació té lloc mitjançant una sèrie de fenòmens coordinats que inclouen la

proliferació, la diferenciació i la migració cap al lumen de l’intestí. Aquestes cèl·lules

totipotents ocupen la tercera part més basal de la cripta, i es divideixen cada 12

hores aproximadament (van de Wetering et al., 2002). A la regió mitjana de la cripta,

les cèl·lules progenitores es diferencien en un dels tipus cel·lulars del còlon:

enteròcits, cèl·lules caliciformes, i cèl·lules neuroendocrines. I quan arriben a la

superfície epitelial, les cèl·lules pateixen un procés d’apoptosi i/o extrusió cap al

lumen. Tots aquests fenòmens tarden aproximadament entre 3 i 5 dies (Potten i

Loeffler, 1990). Es coneixen alguns dels factors moleculars que regulen aquest

procés, i que com després veurem també estan implicats en la carcinogènesi.

Concretament, β-catenina (CTNNB1) i TCF regulen el procés de proliferació i

diferenciació mitjançant l’activació del gen MYC, que alhora reprimeix l’expressió del

gen CDKN1A (abans anomenat p21), un inhibidor de les CDK (van de Wetering et al.,

2002). D’aquesta manera el gradient de CTNNB1/TCF és el responsable que les

cèl·lules de la base estiguin proliferant i indiferenciades (Figura 3).

Figura 3. (A) Representació esquemàtica d’una cripta del còlon. Es dibuixa el model d’actuació de la via de WNT, on les cèl·lules mesenquimals que envolten la part basal de la cripta són la font d’aquesta proteïna (de color vermell). En l’apartat 2.1. s’explica amb més detall aquesta via. (B) Expressió de CD44, que és diana del tàndem CTNNB1/TCF de la via de WNT. S’expressa només a la part basal, marcat amb les fletxes blanques. Model segons van de Wetering, 2002.

Introducció - 5 -

El càncer colorectal

Per tal de no confondre al lector al requadre del glossari es descriuen alguns dels

termes més utilitzats quan ens referim a tumors colorectals.

Glossari (FONT: Diccionari enciclopèdic de medicina. Editorial Fundació Enciclopèdia

Catalana, 1990).

TUMOR: Massa de teixit nou que creix per mitjà de la multiplicació progressiva de les cèl·lules,

de forma autònoma i independent dels teixits normals que l’envolten. Cal distingir-lo d’altres

neoformacions cel·lulars, com la del creixement embrionari, la regeneració tissular i la

hiperplàsia. També és anomenat neoplàsia.

o tumor benigne: qualsevol tumor, de creixement lent i expansiu, habitualment envoltat

d’una càpsula de teixit connectiu, i, per tant, extirpable fàcilment. No compromet la

vida del pacient, llevat que per la seva localització produeixi transtorns importants de

compressió.

o tumor maligne: qualsevol tumor de creixement ràpid i infiltrant, que destrueix els

teixits, forma metàstasis i recidiva amb facilitat.

NEOPLÀSIA: Formació d’un teixit nou anormal, de caràcter tumoral, benigne o maligne.

ADENOMA: Tumor benigne degut a la proliferació d’un epiteli glandular normal, o que adopta la

forma d’una glàndula. Sol ésser ben circumscrit i creix comprimint els teixits veïns, malgrat

que a vegades àdhuc els envaeix. Excepcionalment els adenomes poden degenerar i esdevenir

malignes (adenocarcinomes).

PÒLIP: Massa sèssil (inserit en una base extensa) o pediculada de la superfície lliure d’una

túnica mucosa, que pot correspondre a alteracions histopatològiques molt diverses

(inflamatòries, degeneratives, neoplàstiques o hamartomatoses).

DISPLÀSIA: Anomalia en el desenvolupament de teixits, d’òrgans o de parts anatòmiques, que

produeix deformitats (fins i tot, monstruositats) que poden arribar a ésser incompatibles amb

la vida. D’altres vegades, només és observable microscòpicament. En ocasions es fa sinònim

de distròfia.

RECIDIVA: aparició d’una malaltia en un individu que l’ha passada poc temps abans. Es

diferencia de la recaiguda pel fet d’haver-hi un interval de salut perfecta.

L’epiteli del còlon és una mucosa glandular, per tant els tumors colorectals en les

seves fases inicials poden aparèixer en forma d’adenomes benignes. Amb el

temps poden adquirir una estructura més desorganitzada formada per cèl·lules

que presenten displàsia i evolucionar cap a tumors malignes. Es parla de càncer

quan les cèl·lules invasives arriben a la membrana basal de l’epiteli.

Per tant, i vist amb més detall, el càncer de còlon i recte és el resultat d’un

procés gradual d’adquisició de noves característiques per part de les cèl·lules

epitelials. És un procés continu d’acumulació de múltiples canvis genètics i

- 6 - Introducció

epigenètics que permeten escapar dels controls cel·lulars i de l’ambient (vegeu

l’apartat 1.2. de la Introducció). Aquestes alteracions poden afectar gens de

control del cicle cel·lular, de l’apoptosi, l’angiogènesi, l’adhesió, la senyalització

transmembrana, la reparació del DNA i l’estabilitat genòmica. Per tant, cal

l’acumulació de múltiples mutacions al llarg d’uns quants anys perquè la

neoplàsia inicial es transformi en un càncer.

Epidemiologia del càncer colorectal

Incidència a Catalunya

El càncer és la causa de mort més freqüent a Catalunya entre els homes, i la

segona entre les dones (Taula 1).

Taula 1. Principals causes de mort per grans grups a Catalunya l’any 1997. Entre parèntesi (%): percentatge de la mortalitat total.

TOTAL homes dones

1a causa càncer (31,7) malalties cardiovasculars (41,2)

2a causa malalties cardiovasculars (31,2) càncer (21,6)

3a causa malalties aparell respiratori (11,1) malalties aparell respiratori (7,7)

4a causa causes externes (6,1) transtorns mentals (6,2)

5a causa malalties aparell digestiu (5,1) malalties aparell digestiu (5,1)

FONT: Pla director d’oncologia a Catalunya: 2001-2004. Generalitat de Catalunya. Departament de Sanitat i Seguretat Social.

Mirat per franges d’edat tant en homes com en dones, entre els 35 i els 74 anys,

el càncer colorectal és la primera causa de mort, sent el responsable de més del

40% de totes les morts.

Projecció del nombre de casos nous de càncer a Catalunya

Durant els anys 1992-1993 el nombre de casos diagnosticats de càncer a

Catalunya va ser de 13.000 homes i 10.000 dones. Aquestes xifres es preveu que

augmentin fins a 19.800 i 13.500 respectivament l’any 2005, suposant un

increment del 40% en els homes i del 25% en les dones en 8 anys. S’ha de tenir

en compte que no tot aquest augment es deu a la dinàmica demogràfica

d’envelliment de la població, que explicaria només un 40% d’aquest augment. La

resta seria causada per la tendència originada en els factors de risc o altres

factors no coneguts.

Introducció - 7 -

Si desglossem aquestes dades pels diferents tipus de càncer, veiem la gran

importància del càncer colorectal, sent el primer en tant per cent d’increment en

el cas de les dones (Taula3) i segon en els homes (Taula 2).

Taula 2. Càlcul dels casos nous anuals de les principals causes de càncer en homes (1998-2005).

homes 1998-1999 2000-2001 2002-2003 2004-2005 % increment

pulmó 2880 3310 3815 4400 52,8

colorectal 1690 1900 2130 2370 40,2

cavitat oral 690 765 850 930 34,8

estómac 845 855 870 880 4,1

bufeta urinària

1650 1680 1900 2000 21,2

pròstata 1240 1390 1535 1680 35,5

FONT: Pla director d’oncologia a Catalunya: 2001-2004. Generalitat de Catalunya. Departament de Sanitat i Seguretat Social.

Taula 3. Càlcul dels casos nous anuals de les principals causes de càncer en dones (1998-2005).

dones 1998-1999 2000-2001 2002-2003 2004-2005 % increment

colorectal 1780 2080 2400 2900 62,9

estómac 580 590 605 620 6,9

mama 3250 3460 3650 3815 17,4

coll uterí 590 480 375 305 48,3

cos uterí 685 705 720 750 9,5

FONT: Pla director d’oncologia a Catalunya: 2001-2004. Generalitat de Catalunya. Departament de Sanitat i Seguretat Social.

Factors ambientals: la dieta

La dieta en el cas dels tumors de còlon i recte, té una importància clara. Tots els

aliments circulen pel tracte digestiu, i per tant, aquest està sotmès durant força

temps a tots els nutrients i additius que porta el menjar. És per això que s’han fet

diversos estudis amb l’objectiu de clarificar quins poden ser els factors protectors

i de risc de la nostra dieta (Willett, 2001).

Un altre punt a favor de la importància de l’ambient, és la gran diferència en la

incidència de càncer entre diferents països; així com el canvi d’aquesta en la

població immigrant, que ràpidament s’equipara al país d’acollida. Però és difícil

discernir entre els factors de risc que són conseqüència de la dieta, d’aquells

merament resultat de l’estil de vida dels països occidentals.

- 8 - Introducció

En estudis fets a partir de casos i grups control, sembla que hi ha evidències que

les dietes riques en vegetals protegeixen enfront del càncer colorectal, en canvi

l’efecte de la fruita no és tan clar degut a dades contradictòries.

En estudis prospectius (Bingham, 2000), s’observa que dietes riques en fibres

poden disminuir el risc de CCR, gràcies a la protecció per mecanismes que

inclouen la dilució de les toxines o l’adsorció. Juntament, també s’ha estudiat

l’efecte d’alguns micronutrients com els carotenoids, l’àcid ascòrbic, i l’àcid

fòlic sense treure’n cap conclusió definitiva degut a la falta de dades

(Giovannucci et al., 1993).

També s’ha mirat l’efecte de la ingesta de carn (especialment la carn vermella, i

les carns processades) i sí que s’ha trobat una associació positiva amb la

incidència de càncer (Giovannucci i Willett, 1994); però en d’altres estudis això

no s’ha confirmat (Howe et al., 1990). Així i tot, es creu que les evidències

apunten cap a un lleuger augment del risc, encara que no es conegui el

mecanisme que està actuant.

Altres elements que sembla incrementen el risc de CCR és la ingesta de greixos

saturats o d’origen animal (Potter, 1999). Paral·lelament s’ha suggerit que la

ingesta de grans quantitats de calci té un efecte de protecció contra aquest risc.

El mecanisme que està actuant sembla que pot ser la unió del calci als àcids

grassos i a la bilis, que és citotòxica (Kleibeuker et al., 1996); o bé que el calci

redueixi la proliferació de la part apical de la cripta (Bostick et al., 1995).

Finalment, des de l’any 1957 Stocks ja va apuntar el lleuger increment del risc de

CCR degut al consum d’alcohol (Stocks, 1957). Posteriors estudis no van deixar

el tema lliure de controvèrsia, però últimament hi ha autors que apunten una

certa associació amb el consum d’etanol, independentment de quin tipus de

beguda es tracti (World Cancer Research Fund, WCRF 1997).

Cribratge

Hi ha poques opcions de tractaments pels pacients que presenten un estat

avançat del tumor, en canvi, la supervivència és molt alta si el tumor és extirpat

en els estadis inicials de la malaltia. Per tant la millor manera de prevenir el

càncer colorectal és el diagnòstic en les primeres fases del tumor. Per això és

necessària una bona estratègia de control.

Degut a la biologia del càncer de còlon l’estratègia d’una detecció precoç dels

malalts és plausible. Molts càncers provenen de pòlips o adenomes, que amb el

temps progressen cap al càncer colorectal.

La incidència d’adenomes és elevada en els països occidentals (~30%), però

molts adenomes no evolucionen cap a la formació de càncers. Actualment no hi

Introducció - 9 -

ha manera de preveure com evolucionarà un adenoma, i el que és més greu, no

hi ha cap manera simptomàtica de saber si una persona té un adenoma. Esperar

a veure els símptomes que provoquen, sovint significa que el càncer ja estigui en

fases molt avançades i no sigui curable. Afortunadament el desenvolupament

d’un adenoma cap a una carcinoma pot tardar entre 5 i 10 anys (Schoen, 2002).

Durant aquest temps es pot intervenir per tal de detectar i eliminar els adenomes

gràcies a l’endoscòpia (sigmoïdoscòpia o colonoscòpia).

Hi ha diferents tipus de test per tal d’identificar la presència d’adenomes o

carcinomes:

• FOBT (de l’anglès, faecal ocult blood testing): es tracta de buscar restes de

sang en femta que evidencien la presència indirecta d’adenomes o càncer de

còlon. El problema rau en el fet que molts adenomes no sagnen, per tant

estarem obtenint falsos negatius. Així i tot, els estudis fets fins ara semblen

indicar que els beneficis són més que els punts en contra. L’avantatge és que

el test és simple i segur. I només en casos de falsos positius serà necessària

una colonoscòpia posterior per descartar la presència de càncer.

En dos estudis independents fets a Minesota (Mandel et al., 1999) i Dinamarca

(Kronborg et al., 1996), es va establir que la reducció de la mortalitat era del

21% i del 15-18% respectivament, quan els exàmens es feien de forma

bianual.

• sigmoïdoscòpia: es tracta d’una endoscòpia del tram descendent del còlon.

Alhora que es visualitza la part distal del còlon, es poden fer biòpsies de pòlips

petits. Així i tot, els individus que presenten una sigmoïdoscòpia positiva

sovint són enviats a fer-se una colonoscòpia.

Estudis de l’eficàcia del test en base a un grup control similar al dels pacients

evidenciava una reducció de la mortalitat d’entre el 60-95% l’any 1992

(Newcomb et al., 1992).

• colonoscòpia: es tracta d’una endoscòpia de tot l’intestí gros, així s’estudia tot

el tram del còlon i a més permet l’escissió d’adenomes grans i petits. Degut a

que l’examinació és més llarga, aquesta requereix l’administració de sedants

perquè sigui tolerable. Això fa que el risc sigui més gran que la

sigmoïdoscòpia, i a més es pot provocar una perforació del budell, complicació

que requereix cirurgia major.

En aquest cas no s’han fet estudis dirigits a avaluar l’eficàcia del test, però

s’estima que redueix la incidència del càncer colorectal (Citarda et al., 2001).

El problema d’ambdues tècniques, tant la sigmoïdoscòpia com la colonoscòpia, és

el seu caràcter invasiu. És per això que es qüestiona el seu ús generalitzat. Així i

tot, l’estratègia proposada per la població general és la de fer una sigmoïdoscòpia

- 10 - Introducció

a partir dels 50 anys i cada 2 anys. I aquelles persones que tenen més d’un

familiar de primer grau afectat es proposa un seguiment més exhaustiu

mitjançant la colonoscòpia.

Les intervencions proposades al Pla Director d’Oncologia a Catalunya (2001-

2004) són les següents en el cas del càncer colorectal:

Taula 4. Detecció precoç del càncer colorectal. Intervencions proposades a grups de risc.

grup d’edat tipus d’intervenció freqüència població de risc a qui es dirigeix

50 anys i més sigmoïdoscòpia

sang als dipòsits fecals

biennal tota la població

antecedents de poliposi, malaltia inflamatòria, de l’intestí o càncer

familiars de primer grau de pacients amb càncer colorectal

colonoscòpia biennal poliposi adenomatosa familiar

Síndrome de Lynch

Colitis ulcerosa

FONT: Pla director d’oncologia a Catalunya: 2001-2004. Generalitat de Catalunya. Departament de Sanitat i Seguretat Social.

En resum, l’aplicació d’aquests exàmens pot representar un clar benefici per la

detecció precoç de càncers colorectals. De totes maneres, la seva aplicació

massiva és molt qüestionable i cal desenvolupar noves estratègies més sensibles

i menys invasives.

Classificació i estadis del carcinoma colorectal

Hi ha diferents classificacions alhora de definir l’estadi del tumor en funció del seu

grau de desenvolupament i avenç en l’espai a través de les diferents capes de

l’intestí gros. És una manera de classificar els tumors segons l’espai ocupat i el

grau de disseminació. El tractament i predicció de la seva evolució depenen, en

gran mesura, de l’estadi en què es troba en el moment del diagnòstic. Per estadis

inicials només és necessària la cirurgia, en canvi per estadis més avançats també

cal una teràpia adjuvant mitjançant la quimioteràpia i/o la radioteràpia.

La definició dels diferents estadis no és fàcil degut als múltiples sistemes de

classificació existents. Tots ells classifiquen els tumors en funció de les àrees

afectades i de la presència o no de metàstasi a nòduls limfàtics o a distància. El

primer sistema de classificació va ser descrit per Dukes (Dukes, 1932). Però

durant els anys posteriors van anar apareixent modificacions que usaven noves

nomenclatures. Tres dels sistemes de classificació utilitzats actualment pels

metges són:

Introducció - 11 -

Estadis de Dukes

És la classificació original de Dukes. Es basa en l’extensió que ocupa el tumor

primari a través de les diverses capes de la paret intestinal i l’afectació d’òrgans

veïns. Aquest sistema defineix els diferents estadis de la següent manera (Figura

4):

Dukes A- el tumor està situat a la mucosa i submucosa.

Dukes B- el tumor envaeix la capa muscular, i arriba fins a la serosa, sense

afectar els ganglis limfàtics.

Dukes C- el tumor també arriba fins a la capa serosa, i a més presenta

invasió de ganglis limfàtics regionals. Posteriorment es va distingir entre C1,

quan estan afectats només nòduls perirectals; i C2, quan es troben afectats

nòduls a l’alçada de la lligadura del vas mesentèric (els anomenats nòduls

apicals).

mucosa

muscularis mucosa

submucosa

muscularis propia

subserosa

serosa

nòduls limfàtics regionals

A B C1 C2

mucosa

muscularis mucosa

submucosa

muscularis propia

subserosa

serosa

nòduls limfàtics regionals

A B C1 C2

Figura 4. El sistema de classificació de Dukes.

El sistema de classificació d’Astler-Coller

Aquest sistema va ser proposat l’any 1954 (Astler i Coller, 1954), i sovint ha dut

a la confusió, degut al solapament que hi ha amb la nomenclatura de Dukes. Es

diferencien sis grups (Figura 5):

A- el tumor està situat a la mucosa.

B1- el tumor envaeix la capa muscular, però no arriba fins a la serosa.

B2- el tumor travessa la capa muscularis pròpia.

C1- afecta les mateixes capes que B1 i a més presenta metàstasi en nòduls

limfàtics.

- 12 - Introducció

C2- afecta les mateixes capes que B2 i a més presenta metàstasi en nòduls

limfàtics.

D- en aquesta categoria s’inclouen els tumors que presenten metàstasi a

distància.

mucosa

muscularis mucosa

submucosa

muscularis propia

subserosa

serosa

nòduls limfàtics regionals

A B1 C1 C2B2

mucosa

muscularis mucosa

submucosa

muscularis propia

subserosa

serosa

nòduls limfàtics regionals

A B1 C1 C2B2

Figura 5. El sistema de classificació d’Astler-Coller.

El sistema de classificació TNM

Els sistema de classificació TNM va ser establert per l’American Joint Committee

on Cancer l’any 1986 (Hutter i Sobin, 1986), amb l’objectiu d’aclarir la confusió

que hi havia en aquell moment entre el sistema de Dukes i d’altres modificacions

que havien aparegut. El sistema TNM és més complert, però alhora més difícil

d’aplicar, degut a que el nombre de categories que es poden definir és molt gran

(fins a vint-i-quatre de diferents). Per això sovint se simplifica en quatre estadis

diferents.

Les sigles T, N i M, es refereixen a l’extensió que ocupa el tumor primari (T), a

l’absència o presència de metàstasi als nòduls limfàtics (N), i a l’absència o

presència de metàstasi a distància (M) (Figura 6). Se segueix la següent

nomenclatura:

Categories de la T

Tx- la informació és incompleta i no es pot definir l’extensió que ocupa el

tumor.

Tis- carcinoma in situ. És l’estadi més inicial, quan el càncer no ha crescut per

sota la capa de mucosa.

T1- El càncer ha crescut a través de la capa de mucosa i també de la

muscularis mucosa, i s’estén fins la submucosa.

Introducció - 13 -

T2- El càncer ha crescut a través de la capa de mucosa, la muscularis

mucosa, la submucosa, i s’estén fins la muscularis pròpia.

T3- El càncer ha crescut a través de la capa de mucosa, la muscularis

mucosa, la submucosa, la muscularis pròpia, i s’estén fins la subserosa sense

arribar a cap teixit veí.

T4- El càncer s’ha escampat completament fins la paret del còlon o recte

arribant als teixits o òrgans contigus.

Categories de la N

Nx- no hi ha descripció de l’afectació de nòduls limfàtics perquè la informació

és incompleta.

N0- no hi ha cap nòdul afectat.

N1- presència de cèl·lules tumorals entre 1 i 3 nòduls.

N2- presència de cèl·lules tumorals en 4 o més nòduls.

Categories de la M

Mx- no hi ha descripció de metàstasi a distància perquè la informació és

incompleta.

M0- No hi ha metàstasi.

M1- Presència de metàstasi a distància.

Un cop les categories T, N, i M han estat definides es combinen de tal manera

que defineixen els diferents estadis possibles d’un tumor. N’hi ha fins a quatre, i

s’anomenen amb números romans. A la Taula 5 s’expliquen les equivalències.

mucosa

muscularis mucosa

submucosa

muscularis propia

subserosa

serosa

nòduls limfàtics regionals

Tis T1 T3 T4T2 N1 N2

mucosa

muscularis mucosa

submucosa

muscularis propia

subserosa

serosa

nòduls limfàtics regionals

Tis T1 T3 T4T2 N1 N2

Figura 6. El sistema de classificació TNM.

- 14 - Introducció

Taula 5. Estadis TNM. estadi descripció

0 Tis, N0, M0

I T1, N0, M0 T2, N0, M0

II T3, N0, M0 T4, N0, M0

III T*, N1, M0 T*, N2, M0

IV T*, N*, M1

Entengui’s * per qualsevol número possible.

Com ja s’ha dit abans, el fet que existeixin diferents tipus de classificació genera

certa confusió. Per això és imprescindible que a nivell institucional es defineixin

bé els criteris i siguin utilitzats de forma acurada i sistemàtica per tot el col·lectiu

de metges. Per evitar cap confusió, sovint a nivell clínic els metges utilitzen tots

tres sistemes. El de Dukes, tot i haver estat criticat per una definició imprecisa,

és defensat per la seva simplicitat. El d’Astler i Coller és molt popular pel seu

valor pronòstic (Deans et al., 1992). I a més distingeix en l’estadi C aquells

tumors que arriben a la làmina pròpia dels que no, però no té en compte el

número de nòduls limfàtics afectats. En canvi el sistema TNM sí que ho té en

compte, però és criticat per ser el més complex d’aplicar. A la Taula 6 es poden

veure les equivalències entre els sistemes de Dukes i TNM.

Taula 6. Comparació entre el sistema dels estadis de Dukes i el TNM (Deans et al., 1992).

T1 T2 T3 T4

N0 estadi I Dukes A estadi II Dukes B

M0 N1

N2 estadi III Dukes C

N3

M1 estadi IV Dukes D

Teràpia i desenllaç

Com ja s’ha dit, la detecció precoç del càncer en els primers estadis del

desenvolupament és molt important perquè millora notablement la supervivència

dels pacients. Així trobem que després de la cirurgia i la recessió total del tumor

la resposta és diferent en funció de l’estadi d’aquell tumor i de l’aplicació o no de

teràpies adjuvants. D’aquesta manera segons l’estadi TNM del tumor els

Introducció - 15 -

percentatges de curació (entesa com a absència de malaltia residual després de

cinc anys de seguiment) són els següents (Markowitz et al., 2002):

• estadi I – 90% dels operats es curen.

• estadi II – 75% dels operats es curen.

• estadi III – 40% dels operats es curen. I si a aquest grup de més alt risc,

per la presència de nòduls limfàtics afectats, són tractats amb quimioteràpia

mitjançant 5-Fluorouracil, la supervivència incrementa fins al 60%.

Així i tot, s’han de continuar buscant noves teràpies adjuvants per reduir el

nombre de casos que no es curen. Així com determinar el benefici del tractament

amb quimioteràpia dels pacients en estadi II per intentar millorar el pronòstic del

25% de casos que moren. Aquest és un tema controvertit. Però en general els

pacients en estadi II i III reben un tractament combinat de quimioteràpia i

radioteràpia juntament amb la cirurgia. Ja que s’ha vist que l’aplicació de la

radioteràpia abans o després de la cirurgia redueix el nombre de casos amb

recidiva (Skibber, 1999).

• estadi IV – del 5% al 10% sobreviuen després de 5 anys (Schoen, 2002).

Només una fracció molt petita d’aquests pacients tenen metàstasis

localitzades i són aquests els que es poden operar amb una probabilitat d’èxit

més gran (~30%) (Markowitz et al., 2002).

En conjunt, un 20% dels pacients presenten metàstasi al moment del diagnòstic,

i dels que tenen el tumor localitzat al còlon un 30% desenvolupen metàstasis

abans dels 5 anys. Els llocs més comuns on apareixen són el fetge i els pulmons,

juntament amb el peritoneu, així com recidives locals a l’intestí gros.

En els casos on la cirurgia no és possible, els pacients són tractats amb

quimioteràpia, principalment mitjançant administració sistèmica de 5-

Fluorouracil. En aquest casos només es busca un benefici pal·liatiu amb un petit

increment en la supervivència i la qualitat de vida, però la majoria de pacients

moren abans dels 2 anys. És per això que hi ha dubtes de si és o no un benefici el

seu tractament. En els últims anys s’han trobat nous agents quimioteràpics, com

l’irinotecan (inhibidor de la topoisomerasa I) (Saltz et al., 2000) i l’oxaliplatí

(anàleg al cisplatí).

És per això que cal buscar nous factors pronòstics diferents dels estadis TNM o

Dukes, per tal d’identificar millor els grups de pacients que es poden beneficiar o

no de les teràpies adjuvants. Així com poder identificar aquells casos que en

estadis inicials també tenen un mal pronòstic, i que per tant es podrien beneficiar

d’unes estratègies més agressives. El millor coneixement que tenim dels

processos moleculars implicats en càncer i el desenvolupament de noves

- 16 - Introducció

metodologies analítiques ha fet que es posin en marxa molts estudis adreçats a la

cerca de marcadors moleculars de pronòstic (Watanabe et al., 2001).

1.2. Genètica del càncer colorectal

El càncer colorectal és el resultat de la progressiva acumulació d’alteracions

genètiques i epigenètiques que condueixen a la transformació de l’epiteli del

còlon normal en adenocarcinoma. Degut al seu desenvolupament lent, tant a

nivell histològic com molecular, l’estudi dels diferents passos ha permès un

coneixement molecular de la patologia molt més detallat que qualsevol altre tipus

de tumor. Això també gràcies a la seva accessibilitat i la possibilitat d’obtenir

biòpsies del còlon en les diferents etapes de l’avenç del tumor.

Síndromes hereditàries i casos esporàdics

El càncer és una malaltia genètica, i per tant es pot heretar la predisposició a

desenvolupar un tumor. Són molts els tipus de càncer on s’han descrit mutacions

a la línia germinal de determinats gens que predisposen a l’aparició de tumors.

Cal destacar la paradoxa que el fet d’heretar una sola còpia d’un gen alterat és

suficient per tenir una predisposició ben clara a l’aparició de càncer colorectal. És

a dir, que el fet de tenir un al·lel mutat és suficient per desenvolupar la malaltia,

ja que sempre té lloc la mutació o la pèrdua de l’al·lel salvatge. Això és el que

succeeix en dues síndromes familiars conegudes amb els noms de FAP i HNPCC.

FAP (de l’anglès, Familial Adenomatous Polyposis)

La poliposi adenomatosa familiar és una malaltia autosòmica dominant que afecta

1/7000 individus (Kinzler i Vogelstein, 1996). Es caracteritza per l’aparició de

centenars a milers d’adenomes o pòlips a partir dels 20 anys. Aquests no són

malignes a l’inici, però amb el temps sovint n’hi ha algun que acaba progressant

fins provocar una lesió invasiva o carcinoma. Paral·lelament els pacients de FAP

també desenvolupen altres afectacions extracolòniques com lesions a la retina,

osteomes, tumors desmoides de la pell i tumors al cervell.

El gen responsable de la malaltia és l’APC (de l’anglès, Adenomatous Polyposis

Coli). Va ser identificat primerament mitjançant estudis de lligament com un

marcador a la banda cromosòmica 5q21 (Bodmer et al., 1994; Leppert et al.,

1987). I després es va poder identificar gràcies a la cerca d’alteracions en

cèl·lules germinals (de pacients de FAP) i en cèl·lules somàtiques (de casos

esporàdics). Així es va arribar a demostrar la cosegregació de les mutacions en

APC amb els individus afectes (Groden et al., 1991; Nishisho et al., 1991).

Introducció - 17 -

Perquè es desenvolupi un adenoma en els casos hereditaris, cal una mutació

somàtica o la pèrdua de l’al·lel salvatge heretat del progenitor no afectat. Donant

suport a la teoria formulada per Knudson dels dos cops (en anglès, two-hit) per

explicar la incidència de retinoblastoma en les famílies amb una alta incidència

d’aquest tipus de càncer (Knudson, 1993).

La importància del descobriment del gen APC va augmentar quan es va veure que

la majoria de càncers esporàdics, no familiars, també presentaven mutacions en

aquest gen. L’anàlisi de 23 línies cel·lulars de càncer colorectal va evidenciar que

més del 80% d’aquestes presentaven mutacions en el gen APC (Kinzler i

Vogelstein, 1996).

Paral·lelament, en una sèrie de 106 pacients de Gran Bretanya van trobar el gen

APC mutat en un 56% dels casos (Smith et al., 2002), estudiant només un

fragment del gen. Aquest fragment és anomenat MCR, de l’anglès Mutation

Cluster Region. Està situat entre els codons 1286 i 1513, a l’exó 15 (Nakamura et

al., 1993), i conté el 90% de les mutacions presents en APC.

A més, s’ha vist la importància d’APC en la iniciació dels tumors, ja que la seva

inactivació ha estat demostrada en les lesions neoplàsiques més inicials, com són

les criptes aberrants (Smith et al., 1994; Takayama et al., 2001). Aquestes

estructures es creu que són les precursores dels adenomes.

Les funcions del gen APC van lligades a la seva unió a β-catenina. D’aquesta

manera trobem que:

1) La β-catenina és una proteïna citoplasmàtica que està associada a la

proteïna transmembrana E-cadherina per un costat i a l’α-catenina per

l’altra (Nagafuchi et al., 1994). S’ha vist que les β-catenines són

indispensables per l’adhesió cel·lular. Així quan APC s’uneix a β-catenina es

desfà l’adhesió de la cèl·lula al substrat, modulant aquesta funció. Per tant,

la seva importància en el càncer pot ser degut a la possibilitat de perdre

l’adhesió al substrat i així poder-se desplaçar. Aquesta funció tindria un

paper important en les fases més avançades del tumor podent promoure la

metàstasi.

2) Per altra banda, β-catenina és homòloga al gen Armadillo de Drosophila,

que està implicat en la via de senyalització de WNT (Gumbiner, 1995). La

família de WNT, són unes proteïnes de vertebrats que actuen com a factors

de creixement secretats a l’exterior de la cèl·lula. La proteïna APC

juntament amb GSK3B, AXIN1/AXIN2 (axina/conductina), i β-catenina

formen un complex. La fosforilació de β-catenina per part de GSK3B la

condueix a ubiqüitinar-se i ser destruïda pel proteasoma. D’aquesta

manera, en condicions de no proliferació els nivells de β-catenina són

- 18 - Introducció

baixos. Quan s’activa la via de senyalització de WNT, s’inhibeix l’activitat

de GSK3B, i així β-catenina s’acumula al nucli i s’uneix a la família dels

factors de transcripció TCF que activen la transcripció dels gens efectors

d’aquesta via, com MYC o ciclina D1 (CCND1) (Teh et al., 1999) (Figura 7).

En el cas del càncer de còlon, les mutacions d’APC que generen una proteïna

truncada, condueixen a la formació constitutiva de complexes β-catenina/TCF

nuclear i activa. Mutacions genètiques que alteren la via de WNT, ja sigui del gen

APC, GSK3B, i d’altres, són suficients per formar lesions premalignes de l’intestí

com les criptes aberrants o pòlips petits (Wielenga et al., 1999).

WNT

Frizzled

GSKaxina

APC

cadherina

TCF

Transcripció delsgens diana

MYCCCND1

etc.

P

P

UbqDSH

Destrucció pelproteasoma

α-catenina

ß-catenina

WNT

Frizzled

GSKaxina

APCGSKaxina

APC

cadherina

TCF

Transcripció delsgens diana

MYCCCND1

etc.

P

P

UbqDSH

Destrucció pelproteasoma

α-catenina

ß-catenina

Figura 7. Esquema de la via de senyalització de WNT.

HNPCC (de l’anglès, Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer)

El càncer colorectal hereditari no polipós és una malaltia hereditària autosòmica

dominant que predisposa al desenvolupament de càncer, causada per mutacions

als gens de reparació dels desaparellaments del DNA (en anglès, Mismatch Repair

(MMR) system). Afecta a 1/500 individus (Kinzler i Vogelstein, 1996). Es

caracteritza pel desenvolupament de càncer colorectal a una edat prematura, i

freqüentment és acompanyada per la presència de tumors fora del còlon, com per

exemple a l’endometri, a l’estómac i als ovaris.

L’HNPCC és causat per la mutació heretada d’un dels següents sis gens de

reparació d’aparellaments erronis del DNA: MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS1, i

PMS2 (Grady i Markowitz, 2002). La majoria de famílies afectades d’HNPCC, però,

presenten mutacions a MLH1, o MSH2, i molt poques mutacions han estat

descrites a PMS1, PMS2, MSH3 i MSH6 (Kinzler i Vogelstein, 1996).

Introducció - 19 -

La deficiència d’aquests gens provoca inestabilitat genètica, que es pot detectar

fàcilment en seqüències curtes i repetitives com són els microsatèl·lits. Així es fa

referència a aquesta alteració com a inestabilitat dels microsatèl·lits (en anglès,

MSI de Microsatellite Instability) (Ionov et al., 1993). Del total de pacients

d’HNPCC, un 85-90% presenten MSI, mentre que dels casos esporàdics només

entre un 10-15% (Aaltonen et al., 1993; Ionov et al., 1993; Thibodeau et al.,

1993). Per tant la inestabilitat de microsatèl·lits és un marcador força sensible,

però inespecífic per HNPCC, ja que també trobem MSI en càncers esporàdics. Cal

destacar que a la majoria de càncers colorectals esporàdics amb inestabilitat de

microsatèl·lits, la causa de la inestabilitat és la inactivació del gen MLH1 per

hipermetilació del seu promotor (Herman et al., 1998).

El més interessant del descobriment d’aquesta síndrome és el fet de demostrar

que aquests tumors tenen una taxa de mutació més elevada que el teixit normal.

S’ha descrit que la taxa de mutació s’incrementa entre dos i tres ordres de

magnitud (Bhattacharyya et al., 1994; Eshleman et al., 1995; Shibata et al.,

1994). Aquesta troballa dóna base experimental a la hipòtesi de Loeb que

postulava l’existència d’un fenotip mutador a causa de l’elevat nombre

d’alteracions genètiques que es detecten en molts càncers (Loeb i Christians,

1996).

En definitiva, l’HNPCC representa entre un 2-4% del total de casos de càncer

colorectal en els països occidentals (Lynch et al., 1996). Però els mecanismes

moleculars subjacents que provoquen aquesta síndrome no estan del tot definits.

Alguns sí que es deuen a la presència de mutacions o hipermetilació de

promotors de gens del sistema MMR, però també s’han trobat mutacions en

d’altres gens com en el domini proofreading de la polimerasa δ (da Costa et al.,

1995). Segurament en un futur s’identificaran altres gens que seran responsables

del mateix fenotip.

Altres gens implicats en el càncer colorectal

TP53

La proteïna codificada pel gen TP53 és un factor de transcripció amb una activitat

supressora de tumors. La seva localització subcromosòmica és 17p13.1. Es troba

mutat en un 50% de tots els tumors primaris, la qual cosa ens indica la seva

importància en el procés tumoral en general. En particular en el cas de càncer

colorectal, s’ha trobat mutat entre un 50 i un 70% de casos segons la sèrie de

tumors utilitzats. Es tracta d’un factor de transcripció que s’encarrega de

mantenir l’estabilitat genòmica mitjançant el control de la progressió del cicle

cel·lular i de l’apoptosi en resposta a l’estrès genotòxic.

- 20 - Introducció

En condicions normals la proteïna TP53 és inactivada mitjançant la degradació

per MDM2 (Figura 8). S’activa quan hi ha dany al DNA de resultes de la irradiació

gamma, ultravioleta, agents quimioteràpics, hipòxia, o altres factors d’estrès

cel·lular (Levine, 1997). En aquests casos, TP53 actua com a factor clau per

aturar el cicle cel·lular en la fase G1, permetent que la cèl·lula es recuperi i repari

el DNA, o altrament conduint-la a apoptosi (mort cel·lular programada) (Giaccia i

Kastan, 1998).

Figura 8. Esquema de la via de TP53 en condicions d’homeòstasi cel·lular i càncer. Els gens que s’han trobat inactivats en tumors humans estan pintats de color verd, i els que s’han trobat activats estan pintats de blau (Soussi i Beroud, 2001).

L’activació de TP53 s’aconsegueix via diferents camins en funció del tipus d’estrès

que pateix la cèl·lula. Així per exemple, gens com ATM i CHK2 fosforilen a TP53 i

MDM fent que el complex es dissociï, i quedi activada la proteïna TP53. Com a

conseqüència s’activa la transcripció de gens que regulen directament la

progressió del cicle cel·lular i l’apoptosi. Aquests gens inclouen: CDKN1A, BAX, i

BCL2 entre d’altres (Smith et al., 2002). Així si s’incrementa l’expressió de

MDM2

dany al DNA activació d’un oncogen

ATM E2F1CHK2

CDKN1A BAX PIG NOXA

TP53 actiu

CNTP53 actiu

degradació TP53

ARF

MDM2

ARF

inactiu

MDM2

inactiu

P

P

apoptosiarrest cel·lular

MDM2

dany al DNA activació d’un oncogen

ATM E2F1CHK2

CDKN1A BAX PIG NOXA

TP53 actiu

CNTP53 actiu

degradació TP53

ARF

MDM2

ARF

inactiu

MDM2

inactiu

P

P

apoptosiarrest cel·lular

MDM2MDM2

dany al DNA activació d’un oncogen

ATM E2F1CHK2

CDKN1A BAX PIG NOXA

TP53 actiu

CNTP53 actiu

CN CNNTP53 actiu

degradació TP53

ARFARF

MDM2

ARFARF

inactiu

MDM2

inactiu

P

MDM2MDM2

inactiu

P

P

apoptosiarrest cel·lular

Introducció - 21 -

CDKN1A, s’inhibeix l’activitat dels complexes ciclina-CDK de la fase G1 del cicle

cel·lular. Alhora CDKN1A també bloqueja la replicació mitjançant la inhibició

d’una unitat de la DNA polimerasa δ, la PCNA (de l’anglès, Proliferating Cell

Nuclear Antigen). D’aquesta manera s’atura la divisió cel·lular fins que s’hagi

pogut reparar el dany del DNA, evitant la generació de cèl·lules filles amb

mutacions. Si el dany arriba al punt excessiu de no poder-se reparar TP53

condueix la cèl·lula a apoptosi. En aquest cas, s’ha vist que nivells elevats de

TP53 causen la inducció de BAX (activador de l’apoptosi).

Els mecanismes pels quals segueix una via o l’altra encara s’han d’esbrinar. El

que queda clar és que TP53 és la proteïna central que després de la seva

activació segueixen una sèrie de vies que en últim terme decideixen el destí

d’aquella cèl·lula. La seva funció d’arrest del cicle cel·lular i la conducció de la

cèl·lula a apoptosi ha fet que s’anomenés “guardià del genoma”. Per tant TP53

actua com a gen supressor de tumors.

La majoria de mutacions que presenta el gen TP53 es caracteritzen perquè són

“sense sentit” (en anglès, missense), i es localitzen al llarg de tota la seqüència

codificant. Però, el 97% d’elles s’agrupen als exons que codifiquen pel domini

d’unió al DNA (nucleòtids que van de la posició 92 a la 292). En aquest domini

s’han identificat sis mutacions hot spot (definides com a mutacions amb una

freqüència major al 2% de totes les mutacions) als codons 175, 245, 248, 249,

273, i 282. La posició i la naturalesa de les mutacions varien d’un tipus de càncer

a un altre (Olivier et al., 2002).

Paral·lelament, sovint la mutació de TP53 va acompanyada de la pèrdua al·lèlica

de 17p, confirmant així la seva acció de gen supressor de tumors. En càncers

colorectals, no s’han trobat mutacions en adenomes, en canvi sí en carcinomes.

Per això s’ha postulat que la mutació de TP53 pot mediar la transició d’adenoma

cap a carcinoma. Paral·lelament, s’ha vist que la mutació d’un al·lel amb la

posterior pèrdua d’heterozigositat de l’al·lel salvatge coincideix amb l’aparició del

carcinoma. Això evidencia el seu paper en la transició a la malignitat (Baker et

al., 1990; Boland et al., 1995; Kikuchi-Yanoshita et al., 1992; Ohue et al., 1994).

KRAS

El gen KRAS forma part de la família dels RAS, que representen un conjunt de

proteïnes de 21 kDa altament conservades. La seva funció està relacionada amb

el control del creixement cel·lular. Enllacen els factors de creixement amb vies de

transducció de senyal de les MAP quinases, que condueixen a l’expressió de gens

de resposta ràpida (Figura 9). KRAS està format per quatre exons, que codifiquen

per una proteïna amb tres dominis. Un dels dominis és d’unió a la guanosina

trifosfat o difosfat (GTP/GDP), un altre s’uneix a la part interna de la membrana

- 22 - Introducció

plasmàtica després de la farnesilació de l’extrem carboxi terminal, i el tercer

interactua amb les dianes del citoplasma. Quan s’activa intercanvia el GDP pel

GTP, i és llavors quan interactua amb les molècules efectores que propaguen la

senyal. S’han descrit un gran nombre d’efectors de RAS, que activen una gran

varietat de processos cel·lulars, com són la transcripció, la traducció, la

progressió del cicle cel·lular, l’apoptosi o la supervivència cel·lular (Malumbres i

Barbacid, 2003). El KRAS activat, de seguida es desactiva per la hidròlisi

intrínseca del GTP. Les mutacions oncogèniques alteren l’activitat GTPasa i

permeten que KRAS es mantingui activat. De fet la majoria de mutacions

observades en càncers humans es troben als codons 12, 13, i 61, que

corresponen a les àrees d’unió de GTP/GDP de la proteïna. Per tant, KRAS actua

com a un oncogèn, perquè promou la transformació oncogènica mitjançant el

gunay de funció.

Figura 9. Esquema de les vies de regulació de RAS (Malumbres i Barbacid, 2003). DAG: diacilglicerol. PLC: fosfolipasa C.

KRAS es troba mutat entre un 37 i 41% dels càncers colorectals, i com en la

majoria de tumors afecta els codons 12, 13 i 61 (Grady i Markowitz, 2002).

Vogelstein l’any 1988 van trobar mutacions de KRAS en un 13% d’adenomes

tubulars petits, en un 42% d’adenomes grans, i en un 57% d’adenomes que

contenien àrees de carcinoma invasiu. Per això la presència d’alteracions al gen

KRAS sembla que promou la formació de càncer mitjançant la mediació del

creixement dels adenomes.

factor de creixement

GRB2

SOS1/2

CBL

SPROUTY

ACKRAS-GRFs

RAS-GRP1/2RAS-GRP3/4

RAS-GTP RAS-GDP

RAS-GAP

NF1 GAP1mGAPIII

CAPRI

proteïnes G

RTK

actiu inactiu

PLC

Ca2+DAG

PKC

mol·lèculesd’adhesió

Inositol-P

Ca2+

ésters de forbolfactor de creixement

GRB2

SOS1/2

CBL

SPROUTY

ACKRAS-GRFs

RAS-GRP1/2RAS-GRP3/4

RAS-GTP RAS-GDP

RAS-GAP

NF1 GAP1mGAPIII

CAPRI

proteïnes G

RTK

actiu inactiu

PLC

Ca2+DAG

PKC

mol·lèculesd’adhesió

Inositol-P

Ca2+

ésters de forbolfactor de creixement

GRB2

SOS1/2

CBL

SPROUTY

ACK

SPROUTY

ACKRAS-GRFs

RAS-GRP1/2RAS-GRP3/4

RAS-GTP RAS-GDP

RAS-GAP

NF1 GAP1mGAPIII

CAPRI

proteïnes G

RTK

actiu inactiu

PLC

Ca2+Ca2+DAGDAG

PKC

mol·lèculesd’adhesió

Inositol-P

Ca2+Ca2+

ésters de forbol

Introducció - 23 -

ALTRES GENS

Constantment s’estan descrivint gens amb capacitat cancerígena, per tant

qualsevol llista que es pugui fer no serà mai exhaustiva. La millor manera per

resumir, és classificar-los segons la seva activitat d’una manera simplificada. Així

es parla de:

• gens mutadors

Són aquells gens que tenen una activitat relacionada amb el manteniment de la

integritat del DNA. És a dir que la seva mutació facilita l’aparició de noves

mutacions. Els gens cabdals en aquest grup serien els gens responsables de la

reparació del DNA, com els que ja s’han esmentat anteriorment: MSH2, MSH3,

MSH6, i MLH1, entre d’altres.

• gens supressors de tumors

Són aquells gens que tenen una activitat important a l’hora d’evitar la formació

del tumor. Per tant, és necessària l’alteració dels dos al·lels perquè el seu efecte

es pugui observar. Se suposa que l’efecte de la dosi no és prou important, i que

amb un sol al·lel pot exercir la seva funció. Com per exemple els gens APC o el

TP53, dels quals ja s’ha parlat anteriorment.

• oncogens

Un oncogèn per definició és aquell gen que quan es muta promou la formació

d’una cèl·lula tumoral. Per tant, una sola mutació és suficient per fer aparèixer un

tumor. També s’han anomenat proto-oncogens, perquè promouen l’oncogènesi.

N’hi ha molts tipus i seria molt estens enumerar-los. Per abreujar els podem

classificar segons la seva funció:

a) factors de creixement

Els factors de creixement són proteïnes que activen la proliferació cel·lular i la

diferenciació. N’hi ha molts tipus agrupats en famílies, i sovint s’han trobat

relacionats amb tot tipus de càncer. En el cas del colorectal s’han descrit factors

de creixement de la família de l’EGF (de l’anglès, Epidermal Growth Factor), i

l’FGF (de l’anglès, Fibroblast Growth Factor), entre d’altres.

EGF: EGF, TGF-alfa, HBEGF.

FGF: FGF1, FGF2, i un llarg etc.

b) receptors tirosina quinases

Són receptors cel·lulars lligats a la membrana que tenen un domini extracel·lular

que interactua amb el seu lligand, i un domini intracel·lular responsable de

transferir la senyal a l’interior de la cèl·lula per fer la seva funció. Exemples

- 24 - Introducció

d’aquests receptors són els gens ERBB2, NTRK1 i 2 (de l’anglès, Neurotrophic

Tyrosine Kinase receptor, tipus 1 i 2), entre d’altres.

c) tirosina quinases associades a la membrana no receptores

Són proteïnes que tenen el domini N-terminal associat a la membrana plasmàtica,

per la cara citosòlica, on es troben els substractes diana que han de fosforilar. El

gen més característic és el SRC.

d) receptors acoblats a proteïnes G

La seva funció principal és transmetre la senyal a l’interior de la cèl·lula. Es

caracteritzen per tenir set dominis transmembrana, i poden donar resposta a

gran varietat de molècules que s’uneixen a les voltes extracel·lulars o bé

penetren a l’interior de la membrana. El gen MAS1 és un exemple de receptor

acoblat a proteïna G.

e) proteïnes G associades a la membrana

El més característic és el gen RAS. Hi ha tres gens homòlegs diferents, que van

ser descoberts en tres tipus cel·lulars tumorals: HRAS, NRAS i KRAS. Aquest

últim és el més important en el càncer colorectal, com ja s’ha explicat abans.

f) quinases serina/treonina

Dins d’aquest grup trobem el gen RAF1, que té un lloc d’unió a RAS-GTP, fent que

aquest s’obri i sigui actiu. O bé el gen ATM, que es troba mutat en els pacients

amb atàxia telangectàsia, i que s’encarrega de fosforilar el gen MDM2 inhibint-lo

(Figura 8).

g) factors de transcripció o proteïnes nuclears que s’uneixen al DNA

El gen més característic és el MYC, que va ser descobert en un virus de les aus

(Sheiness et al., 1978). Aquest gen s’ha trobat alterat en molts tipus de càncers

(cèl·lules B, neuroblastomes, càncer de pulmó, càncer colorectal, càncer de

mama, etc.). Es tracta d’un factor de transcripció que activa la síntesi de molts

gens diana. Fins ara n’hi ha descrits uns 600, que es poden consultar a la base de

dades www.myc-cancer-gene.org. Per tant, no és d’estranyar la quantitat de

processos amb els que s’ha relacionat: des de l’entrada a la fase S de la mitosi

(Heikkila et al., 1987), a la correcta regulació de factors angiogènics i anti-

angiogènics (Baudino et al., 2002), i fins i tot amb l’apoptosi (Askew et al., 1991;

Evan et al., 1992). Els mecanismes pels quals es pot activar MYC són molts i

diversos, incloent-hi translocacions, amplificacions, o mitjançant l’activació de la

traducció o l’estabilitat de la proteïna.

Introducció - 25 -

Model de Vogelstein

Gràcies a l’accessibilitat dels tumors de còlon i recte, s’han fet diversos estudis on

s’analitzen els estadis progressius de l’avenç de la malaltia. D’aquesta manera

s’han definit els següents estadis, en ordre creixent de mida, i des de lesions

premalignes fins a les més agressives (Fearon i Vogelstein, 1990):

• criptes aberrants

• adenoma primerenc (menys d’un cm de diàmetre)

• adenoma intermedi (igual o més d’un cm de diàmetre i sense focus de

carcinoma)

• adenoma tardà (més d’un cm de diàmetre i conté focus de carcinoma)

• carcinoma

• metàstasi

Estudis genètics dels diferents estadis van permetre proposar un model de quina

podia ser la seqüència temporal d'adquisició de mutacions en el càncer colorectal

que duien a la malignitat (Vogelstein i Kinzler, 1992). Així, i vist d'una manera

lineal, la mutació en el gen APC inicia el procés neoplàsic provocant un increment

de la proliferació de l'epiteli normal. Les primeres malformacions en aparèixer són

focus de criptes aberrants. Després, algunes d'elles, es transformen en adenomes

primerencs. La mutació del gen KRAS, com ja s'ha dit, provoca el creixement i la

transformació cap a adenoma intermedi. Noves mutacions en gens com DCC (de

l'anglès, Deleted in Colorectal Cancer), apareixen en adenomes tardans.

Finalment, mutacions en gens com TP53 sembla que tenen lloc cap al final del

procés ja que trobem un gran nombre de carcinomes amb aquesta mutació en

comparació als adenomes primerencs (Figura 10).

Còlon normal Epiteli hiperproliferatiu Adenoma Carcinoma

inactivacióAPC

MSH2MLH1

anormalitats en lametilació

mutacióKRAS

delecióDCC

deleció/mutacióTP53

acumulació de noves anormalitats genètiques

Còlon normal Epiteli hiperproliferatiu Adenoma Carcinoma

inactivacióAPC

MSH2MLH1

anormalitats en lametilació

mutacióKRAS

delecióDCC

deleció/mutacióTP53

acumulació de noves anormalitats genètiques

Figura 10. Basat en l’article de Toribara i Sleisenger (Toribara i Sleisenger, 1995).

- 26 - Introducció

Aquest esquema no deixa de ser un model d'un ordre preferencial d’acumulació

de les mutacions, perquè no tots els carcinomes presenten totes aquestes

mutacions alhora, o en tenen d'altres. Per això, sembla molt probable que

l'acumulació de múltiples alteracions genètiques és més important en la

progressió dels tumors, que no pas l'ordre d'aquestes (Fearon i Jones, 1992). La

rellevància del model es fonamenta en la descripció d'una via basada en la suma

de diferents mutacions, i que es tracta d'un procés gradual.

Inestabilitat genètica i dany genòmic

El càncer és una malaltia genètica, com ja s’ha dit. Però a part de fixar-nos en les

mutacions concretes que permeten que el tumor avanci, també hi ha estudis que

es fixen en el dany genètic general acumulat. Els tipus de mutacions que trobem

en un tumor estan clarament relacionades amb l’etiologia de la transformació cap

a la malignitat. Aquestes alteracions, poden ser translocacions específiques,

amplificacions gèniques, i mutacions puntuals, de gens que codifiquen per

proteïnes amb una funció que té alguna relació amb l’oncogènesi (Lengauer et

al., 1997).

El conjunt d’alteracions genètiques presents en una cèl·lula les anomenarem com

a dany genòmic. En diferents estudis s’ha vist que com major és el grau de dany

genòmic, pitjor és el pronòstic, suggerint que la valoració del dany genòmic

global podria tenir alguna utilitat clínica. El problema el tenim alhora de

comprendre quines són les causes subjacents a aquesta acumulació d’alteracions

que duen a la malignitat dels tumors.

Loeb l’any 1991 ja parlava de l’existència d’un fenotip mutador (Loeb, 1991). Un

dels postulats més acceptats és el de la inestabilitat genètica, que tindria com a

conseqüència el dany genòmic. Degut a la inestabilitat genètica la taxa de

mutació és més elevada i facilita l’evolució del tumor des d’estadis inicials (Loeb i

Loeb, 1999; Nowell, 1986). Així i tot hi ha autors que defensen la idea que la

inestabilitat genètica no és necessària per l’evolució de les cèl·lules canceroses, ja

que els tumors poden acumular múltiples alteracions genètiques sense la

necessitat de l’existència d’un mecanisme que incrementi la freqüència de

mutacions, i només cal la pressió de la selecció per tal que evolucioni cap a la

malignitat (Tomlinson i Bodmer, 1999; Tomlinson et al., 2002b). Però aquest és

un tema controvertit i difícil de solucionar mentre no tinguem un manera

d’analitzar i d’interpretar el dany genòmic de forma més clara.

La dificultat principal a l’hora d’estudiar el dany en general, són la quantitat de

tècniques diferents que podem utilitzar (Taula 7), encara que sembli

contradictori. El problema el trobem perquè fins ara hi ha hagut pocs esforços per

comparar els resultats obtinguts utilitzant diferents metodologies, i no s’ha

Introducció - 27 -

intentat integrar i interpretar de forma conjunta els resultats produïts per les

diferents aproximacions. Llevat d’algunes excepcions, com en un estudi exhaustiu

d’una sèrie de 129 casos de càncer colorectal, dels quals es van analitzar el seu

fingerprint a nivell de DNA, la ploidïa, i les mutacions puntuals dels gens TP53 i

KRAS (Risques et al., 2003).

Inestabilitat de microsatèl·lits (MSI)

És la més estudiada i l’única reconeguda de forma clara. Com ja s’ha dit és

causada per la mutació dels gens de reparació MMR. Està associada en la majoria

de casos a la síndrome familiar HNPCC, malgrat que també es pot produir en

càncers esporàdics. A nivell clínic s’ha observat que apareix amb més freqüència

al còlon proximal, els pacients tenen més bon pronòstic i no presenten alteracions

cromosòmiques, ni pèrdua d’heterozigositat (Remvikos et al., 1995; Schlegel et

al., 1995; Watanabe et al., 2001). Aquest és un exemple clar de com l’increment

de la taxa de mutació, degut a la impossibilitat de reparar els errors

d’aparellament de bases, és suficient per desestabilitzar el funcionament normal

de la cèl·lula conduint-la a la malignitat.

Taula 7. Tipus de dany genòmic en càncer colorectal (Risques et al., 2003).

Tipus de dany Tipus d’alteració Tècnica de detecció Tipus d’inestabilitat

Mutacions de pocs nucleòtids

- mutacions puntuals - delecions i insercions

curtes

- seqüenciació, SSCP, i altres

- anàlisi de MS

- no es detecta - MSI

Aneuploïdia - pèrdua i guany de

còpies de cromosomes

- citometria de flux, estudi de bandes G, CGH, LOH, FISH, fingerprints de DNA (AP-PCR)

- Inestabilitat cromosòmica numèrica (per defectes en la segregació de cromo-somes)

Alteracions cromosòmiques

estructurals

- reorganitzacions cromosòmiques

- estudi de bandes G, M-FISH, SKY, CGH*, LOH*, fingerprints de DNA (AP-PCR)*

- Inestabilitat cromosòmica estructural

Abreviatures. SSCP: Single strand conformation polymorphism, CGH: Comparative genomic hybridization, LOH: Loss of heterozygosity, FISH: Fluorescence in situ hybridization, M-FISH: Multiplex-FISH, SKY: Spectral Karyotyping, AP-PCR: Arbitrarily primed PCR. (*) Aquestes tècniques permeten la detecció de reorganitzacions no equilibrades només.

Malgrat que MSI és un cas clar on la deficiència dels sistemes de reparació del

DNA resulta en una elevada taxa de mutació (manifestada sobretot com a

variacions en les seqüències de microsatèl·lit), la identificació dels casos que la

- 28 - Introducció

presenten no està lliure de controvèrsia. Trobem diferents criteris a la literatura

per definir el llindar de MSI, però sembla força acceptat que a partir de dos

microsatèl·lits mutats de 5 estudiats és suficient (Boland et al., 1998).

Darrerament s’ha volgut distingir entre MSI-H (high) i MSI-L (low), per

diferenciar aquells casos que presenten més marcadors inestables (a partir de

dos) dels que només presenten un marcador alterat respectivament. Però no

sembla una classificació molt clara. Principalment perquè el grau d’inestabilitat

d’un tumor depèn de la taxa de mutació i del número de divisions des de la

pèrdua de la funció reparadora. Per tant, casos amb només un marcador

inestable, no es poden considerar del grup MSI encara. Perquè o bé, l’alteració es

deu a una error a l’atzar i per tant aquell tumor no és inestable, o bé el tumor

està en un procés inicial d’inestabilitat genètica i encara no ha adquirit prou

alteracions per identificar-lo com a tal. El fet d’incloure’l en un nou grup

anomenat MSI-L sembla agosarat, i més si tenim en compte que només

representen un 4% de tots els casos (Loukola et al., 2001). Hi ha estudis que

posen en dubte l’existència d’aquest grup MSI-L, i la rellevància clínica i biològica

que pot tenir una inestabilitat baixa (Gonzalez-Garcia et al., 2000; Tomlinson et

al., 2002a).

Inestabilitat cromosòmica (CIN): numèrica i estructural

Les alteracions que presenten els tumors a nivell cromosòmic poden ser de dos

tipus:

• alteracions numèriques (aneuploïdies o poliploïdies), que es refereixen

a guanys i pèrdues de cromosomes sencers.

• alteracions estructurals, que inclouen amplificacions, guanys,

delecions, inversions i translocacions. Així, estem parlant de guanys i

pèrdues de material genètic inferior a la mida d’un cromosoma (en el cas

de guanys i delecions), o bé només de la reorganització del material

genètic (en el cas de les inversions i translocacions).

A l’hora de parlar de la inestabilitat tenim un greu problema, perquè si ens

referim a inestabilitat cromosòmica en general, estem parlant d’aquests dos

tipus d’alteracions. Però a al literatura s’ha utilitzat sovint el terme d’inestabilitat

cromosòmica per referir-se només a les alteracions numèriques creant una gran

confusió.

En termes generals la inestabilitat cromosòmica es defineix com a una taxa

d’adquisició d’alteracions cromosòmiques elevada. És a dir, paral·lelament al què

passa amb MSI, se suposa que hi ha algun mecanisme de control a la

permissibilitat d’alterar el contingut i l’estructura dels cromosomes que falla. El

problema rau en el fet que així com quan parlem de MSI està molt clar i ben

Introducció - 29 -

definit quins són els gens que la causen, en el cas de CIN hi ha molts dubtes per

resoldre.

Primer de tot, un elevat tant per cent de tumors que no tenen MSI, presenten

alteracions en el seu contingut i estructura cromosòmiques. Però és clar que no

tots ells seran cromosòmicament inestables, ja que la presència d’aneuploïdies,

poliploïdies, o alteracions estructurals per si mateixes no impliquen l’existència de

CIN. Com ja s’ha dit es tracta de la taxa d’adquisició d’alteracions que es veu

incrementada. És sabut que fins i tot en cèl·lules normals a vegades trobem un

nombre de cromosomes aberrant.

En conseqüència, si ja hem vist que en la definició de MSI no hi ha un ple

consens, pel què fa al CIN és evident que ens trobem en un terreny encara més

confús.

Quines són les causes de la inestabilitat cromosòmica?

Diferents estudis han postulat que la CIN podria ser conseqüència del mal

funcionament de diversos processos implicats en l’estructura cromosòmica o en la

segregació dels cromosomes durant la mitosi. Així per exemple, trobem diferents

mecanismes que duen a la inestabilitat cromosòmica:

1) Mutacions en gens que controlen la correcta formació del fus acromàtic, com

són BUB1 i MAD2 (Jallepalli i Lengauer, 2001). Primerament van ser

descoberts en llevats i després s’han trobat els seus homòlegs en humans.

S’ha vist que si es recreen aquestes mutacions en línies cel·lulars sense CIN,

es converteixen en cromosòmicament inestables degut a la pèrdua del control

d’errors en la formació del fus acromàtic durant la mitosi (Cahill et al., 1998).

Perquè si aquestes proteïnes no detecten els errors i el cicle cel·lular no

s’atura, es promou la mala segregació dels cromosomes i l’adquisició

d’alteracions del contingut cromosòmic en les cèl·lules filles.

Però s’han trobat molt pocs casos de càncers que tinguin aquests dos gens

mutats. I per això la seva rellevància és molt discutible. I és que en llevats

s’han identificat més de 100 gens que poden causar CIN (Spencer et al.,

1990). Per això caldrà veure quins són els gens clau responsables de CIN en

cèl·lules humanes. O potser no serà tan fàcil, i no hi haurà cap gen que

expliqui un elevat tant per cent de casos, i seran molts gens diferents els

causants de CIN. Probablement per això no s’ha pogut identificar cap gen

cabdal fins ara. I és lògic pensar que tractant-se d’un procés tan general i

precís com és la divisió cel·lular, molts gens poden donar el fenotip que

condueix a l’aneuploïdia.

2) Alteracions a nivell epigenètic també s’ha postulat que poden tenir un paper

causal. És sabut que a les cèl·lules tumorals s’observa una hipometilació

- 30 - Introducció

general (Feinberg i Vogelstein, 1983), alhora que trobem una hipermetilació

de regions concretes que condueixen al silenciament transcripcional de gens

supressors de tumors. No entrarem en profunditat en aquest tema perquè és

estens i complex. El que sí s’ha pogut comprovar és que hi ha una estreta

relació entre la hipometilació i la inestabilitat cromosòmica. Sembla ser, que

en etapes inicials de la carcinogènesi ja s’ha determinat un baix grau de

metilació que provoca la desestabilització del genoma, afavorint l’adquisició de

noves mutacions (Jones i Baylin, 2002). Recentment, es va comprovar en

fibroblasts de ratolí que la disminució en la metilació provocava un augment

de LOH (Eden et al., 2003). El que no queda clar és quins són els mecanismes

pels quals s’afavoreix aquesta inestabilitat, ja que també hem de tenir en

compte el paper de la metilació en les histones que compacten la cromatina.

Per tant, futurs estudis hauran de caracteritzar la relació entre la metilació del

DNA, la composició de la cromatina, i la seva estructura per poder entendre

com afecta la hipometilació a l’estructura i integritat dels cromosomes.

3) Hi ha autors que defensen que CIN no és causat per cap alteració genètica, ja

que s’han descrit pocs gens mutadors que alterin l’estructura cromosòmica, i

els que s’han identificat afecten a pocs casos. Creuen que l’inici es troba en

una arquitectura cel·lular errònia que permet una mitosi aberrant, donant lloc

a cèl·lules filles amb un cariotip anormal, que si té algun avantatge selectiu es

pot perpetuar en una aneuploïdia. Aquesta aneuploïdia es pot donar de

manera espontània a l’atzar, o bé és afavorida per carcinògens (Duesberg,

2003). També proposen que la gran quantitat d’alteracions cromosòmiques

estan catalitzades per la mateixa aneuploïdia. Concretament, en cultius de

cèl·lules de hàmster s’ha comprovat que com més alta és l’aneuploïdia més

elevada és la taxa d’alteracions cromosòmiques (Fabarius et al., 2003). Això

no implica que la inestabilitat cromosòmica sigui independent dels gens

mutadors, ja que aquests poden actuar afavorint la inestabilitat, però posen

molta més èmfasi en l’aneuploïdia mateixa com a motor de la inestabilitat. I

afirmen la seva importància degut a la ubiqüitat de l’aneuploïdia en tot tipus

de tumors, provocant fenotips anormals causats per la gran quantitat de gens

que es poden veure afectats a nivell de dosi gènica i expressió.

Quines són les conseqüències de la inestabilitat cromosòmica?

Igual que en el cas de MSI, l’elevada taxa d’alteracions crea heterogeneïtat i pot

donar lloc a cèl·lules amb un avantatge estratègic per poder créixer de forma

descontrolada. Però els efectes de les alteracions són més grans en el sentit que

impliquen a molts gens. Així per exemple:

• la pèrdua d’un tros de cromosoma implica la pèrdua d’heterozigositat

(LOH), és a dir, perdem tot un haplotip de la regió afectada. Així es

Introducció - 31 -

posen de manifest aquells gens supressors de tumors que ja tinguin una

còpia mutada. Per tant, CIN pot contribuir a l’acceleració de LOH com a

mecanisme per a la inactivació dels gens supressors de tumors.

• paral·lelament, el fet de guanyar o perdre tots els gens d’un cromosoma

o tros pot causar un gran canvi en l’expressió dels gens afectats, que

passaran a expressar-se al doble o la meitat en un primer moment. I

després hi pot haver dos efectes per equilibrar. Per una banda, un intent

de compensació de dosi mitjançant cercles de regulació de les vies

cel·lulars afectades. I sinó, en el cas de perdre algun cromosoma sencer,

sovint s’acompanya de la reduplicació del restant. Perquè l’haplo-

insuficiència pot dur a la mort cel·lular, i d’aquesta manera la cèl·lula

supera aquest escull i es continua dividint. Però com a conseqüència es

redueixen en homozigosi tots els gens localitzats en el cromosoma

afectat.

Així com ja es va discutir en l’apartat de MSI, aquests canvis fàcilment poden

portar avantatges en el creixement augmentant la proliferació o disminuint la

mort cel·lular. D’aquesta manera CIN proporciona un mecanisme perquè

apareguin cèl·lules canceroses més ben adaptades als diferents ambients que

puguin trobar. I per això es postula que les inestabilitats cromosòmiques que es

troben en la majoria de tumors sòlids poden ser una de les causes que fan

fracassar les teràpies adjuvants en el tractament dels tumors.

Quan apareix la inestabilitat cromosòmica?

Alguns autors afirmen que la inestabilitat cromosòmica podria aparèixer en una

fase molt inicial del tumor, perquè en adenomes petits de menys de 2 mm un

90% dels casos tenen algun desequilibri al·lèlic a nivell de SNP (de l’anglès,

Single Nucleotide Polymorphism) (Shih et al., 2001). En aquest estudi els autors

equiparen la pèrdua d’heterozigositat d’un SNP amb la pèrdua d’un tros de

cromosoma. Idea una mica agosarada, perquè tot i que ens pot assenyalar

aquest fet, no és l’única possibilitat. La recombinació mitòtica també pot dur a

LOH (Tischfield, 1997).

El problema que hi ha és quina tècnica emprar per tal d’identificar un increment

de la taxa d’alteracions. La majoria d’estudis es fixen en els tumors en un

moment determinat, com una fotografia fixa del tumor en el moment de

l’extirpació. El que caldria és fer un estudi a diferents temps del mateix tumor per

veure l’acceleració en l’adquisició de desequilibris cromosòmics. Però això és

difícil de fer, i per tant la majoria d’estudis es basen en dades obtingudes en

línies cel·lulars (Lengauer et al., 1997).

- 32 - Introducció

Alternativament, alguns autors identifiquen l’heterogeneïtat intratumoral com a

signe de la inestabilitat genètica. En el cas del càncer colorectal s’han utilitzat

tècniques de FISH (Di Vinci et al., 1999), citometria de flux (Flyger et al., 1999), i

LOH (Baisse et al., 2001), entre d’altres, per veure les alteracions cromosòmiques

a diferents nivells. En qualsevol cas, l’heterogeneïtat espacial no és tampoc una

mesura directa de la inestabilitat cromosòmica.

Igual que en el cas de MSI, es postula que l’increment de la taxa de les

alteracions és la força que condueix a la formació dels tumors. I és de destacar el

fet que aquestes dues vies són alternatives. Així MSI, que explica entre un 6% i

11% dels tumors colorectals (Aaltonen et al., 1993), no presenta alteracions a

nivell cromosòmic. I en contrapartida, el 86% restant s’engloba dins del grup de

CIN. Perquè la majoria sí que presenten alteracions a nivell cromosòmic, però cal

destriar millor els casos i és ben segur que estem fent una calaix de sastre molt

gran. Primer de tot, cal detectar realment quins casos són els que presenten una

taxa elevada d’alteracions, i després fer subgrups segons les alteracions

cromosòmiques que presenta cada un. Perquè com veurem més endavant

existeixen diferents vies segons quines siguin les alteracions acumulades. I

després també s’han de tenir en compte aquells casos que no presenten ni MSI,

ni CIN, però que també moren de la malaltia. Són casos aparentment normals, i

amb poques mutacions que sorprenentment són tan o més agressius que els

casos inestables a nivell de cromosomes o microsatèl·lits.

La inestabilitat genètica és suficient com a motor de la tumorigènesi?

Sovint es qüestiona el paper de la inestabilitat en l’avenç dels tumors. Si bé, és

evident la seva existència, queda en entredit la seva importància com a motor de

la tumorigènesi. Per això s’ha d’entendre la seva participació en l’evolució dels

tumors comparant-ho amb la selecció natural descrita per Darwin (Cahill et al.,

1999; Hellman, 1997). Ja des dels inicis del segle XX Boveri va comparar l’avenç

dels tumors al concepte d’evolució somàtica (Boveri, 1914). Així, en l’evolució

clàssica, la variabilitat genètica és produïda principalment per les mutacions, i la

selecció actua sobre aquestes varietats per determinar un avantatge net de

supervivència dels fenotips (i genotips) que més bé s’adaptin a l’ambient. En el

cas del creixement dels tumors, contràriament, s’inicia per una o més mutacions

que donen a la cèl·lula un avantatge selectiu de creixement. Així aquell clon de

cèl·lules s’expandeix. Successives rondes de mutacions o canvis epigenètics

avantatjosos tenen lloc, i hi ha diverses ones d’expansió clonal (Figura 11).

Aquest model s’ha pogut comprovar en diversos estudis (Fearon i Vogelstein,

1990; Lijovic i Frauman, 2003)

- 33 -Introducció-

El problema de la inestabilitat com a principal causa de la tumorigènesi el tenim

si ens preguntem quin és l’ordre d’adquisició de les mutacions. En els casos de

tumors esporàdics que presenten MSI, podem pensar que un dels primers

successos a tenir lloc és la inactivació de les dues còpies d’algun gen del sistema

de MMR. Però està clar, que la probabilitat que es muti un d’aquests gens és la

mateixa que afecti a qualsevol altre gen supressor de tumors del genoma. O

encara és més fàcil que afecti a un oncogèn. I per tant, sovint l’inici del tumor

serà degut a un increment del creixement, i amb la taxa de mutació normal.

Posteriorment es pot mutar algun gen relacionat amb la inestabilitat, però ja com

a conseqüència del tumor en augment, no com a causa.

Així i tot no es descarta que en algun cas la mutació de gens MMR o gens

responsables de CIN succeeixi primer, o que sigui dominant, i amb un sol

esdeveniment n’hi hagi prou per iniciar el tumor. Però no hi ha gaires casos que

ho demostrin així. Principalment perquè és difícil d’estudiar, i sovint no sabem

quina és la primera mutació. I en els casos on s’han trobat gens dominants in

vitro (Bardelli et al., 2001), el ja anomenat BUB1, després no s’ha pogut

demostrar in vivo (Cahill et al., 1998) que siguin la primera mutació a aparèixer,

ni tampoc la seva rellevància, com ja s’ha dit anteriorment .

barreres selectives

a) sense inestabilitat

b) inestabilitat justa

c) massa inestabilitat

barreres selectives

a) sense inestabilitat

b) inestabilitat justa

c) massa inestabilitat

Figura 11. Model de la superació de barreres selectives en la cursa de la tumorigènesi (Cahill et al., 1999).

- 34 – Introducció

Un altre dels arguments en contra és el cost que la hipermutabilitat pot tenir per

la cèl·lula. Encara que potencialment pot accelerar l’adaptació i l’evolució en

ambients nous, també pot ser una arma de doble tall, i provocar mutacions que

alterin vies de senyalització essencials per la supervivència i que condueixin a la

cèl·lula a aturar el cicle cel·lular i en últim terme a apoptosi. Aquí la possible

solució és que la cèl·lula ja tingui els punts de control del cicle cel·lular o de

detecció de dany al DNA alterats, i que per tant estigui en un estadi més avançat.

Però llavors perd força l’argument de ser el motor que dirigeix l’avenç del càncer.

I només podria actuar un cop passat cert temps.

Per tant, s’ha d’arribar a un compromís, o punt d’equilibri. És a dir, l’existència

d’una taxa de mutació intermitja que provoqui alteracions en un grau menor.

Però llavors, tampoc es pot parlar de la força conductora, sinó d’un fet més que

ajuda la progressió dels tumors.

Resumint, no es pot negar la importància de la inestabilitat, ja sigui MSI, CIN, o

qualsevol altra forma, perquè és una manera de proporcionar al tumor la

possibilitat d’evolucionar més ràpidament a través dels diferents estadis de la

tumorigènesi. El que no queda clar és la necessitat de la inestabilitat en el procés

tumoral (Tomlinson i Bodmer, 1999). I segurament no és una característica

universal de tots els tumors, però s’ha de veure quin paper hi juga exactament.

Encara que el que sembla més sòlid és pensar que en el procés tumoral, es donen

fenòmens equivalents a l’evolució darwiniana des de l’inici fins a les etapes més

avançades (Cahill et al., 1999; Hellman, 1997).

Amplificacions de DNA

Les amplificacions són una característica específica dels tumors, en cèl·lules

normals mai s’han descrit. I d’entre els tumors, sembla que apareixen en una

fase avançada, és a dir, que es tracta d’un succés tardà dins del procés tumoral

(Brison, 1993). Sigui quin sigui el mecanisme, el que queda clar és que les

amplificacions són una manifestació de la inestabilitat.

El número de còpies de les amplificacions van de 5 a 500 en neuroblastomes

(Schwab, 1998). I el tros de DNA amplificat és més gran que no pas la unitat

transcripcional, sovint pot implicar de centenars de kb fins a 20 Mb (Schwab,

1998).

Hi ha dos tipus principals d’amplificacions: les que se situen dins del cromosoma

en forma de homogeneously staining regions (HSR), o bé les que trobem fora

dels cromosomes com a double minutes (DM).

HSR: Un exemple de l’intracromosòmic és l’amplificació de 11q13, que sempre

s’estén unes quantes Mb de parelles de nucleòtids. Per tant sembla que

Introducció - 35 -

s’iniciaria l’amplificació mitjançant la recombinació entre cromosomes,

permetent l’amplificació en tàndem d’un tros gran de cromosoma. A

continuació es poden succeir fenòmens d’intercanvis no homòlegs entre

cromàtides acompanyades per reorganitzacions secundàries de l’amplificació.

Això explicaria les discontinuïtats que es troben sovint en amplificacions grans.

Una altra manera de formar amplificacions in situ és mitjançant la fusió dels

telòmers, seguida de cicles de breakage-fusion-bridge (BFB) que resulten en

estructures amplificades invertides.

DM: en aquest cas l’amplificació té lloc lluny de la regió on es troba el gen. Un

exemple és el cas de MYCN que només afecta uns centenars de kb. La

reparació mitjançant replicació pot conduir a la duplicació del gen, que després

pot ser transposat a un altre cromosoma, on s’amplifica. Els intermediaris

d’aquest mecanisme d’amplificació poden trobar-se extracromosòmicament en

forma de DM.

També s’ha de dir que l’amplificació d’un gen no sempre duu a la sobreexpressió

d’aquest (Kanda et al., 1994), ni que la no amplificació negui la possible

sobreexpressió mitjançant altres mecanismes. En un estudi fet amb una sèrie de

53 pacients de càncer de pulmó no de cèl·lula petita, troben que 8 casos

presenten amplificació de CCND1 (15%) dels quals tots més altres 17 casos (25,

47%) presenten nivells elevats de la proteïna (Betticher et al., 1996).

Amplificacions i TP53

Degut a la capacitat del gen TP53 de vetllar per la integritat del genoma, la seva

actuació s’estén al control de la reparació associada als processos d’amplificació.

Experiments amb fibroblasts demostren que si introduïm TP53 salvatge en línies

que no tenen aquest gen es veu una reducció del nombre d’amplificacions (Yin et

al., 1992). Però també s’han descrit gliomes que no tenen TP53 mutat i

presenten amplificació del gen MDM2 (Reifenberger et al., 1993). Per tant, la

mutació del gen TP53 és un dels camins, però no l’únic. Existeixen altres vies

alternatives per poder amplificar.

Progressió tumoral

Com acabem de veure, cal un equilibri entre el grau d’adquisició de noves

mutacions i la selecció perquè un tumor pugui progressar, i vagi superant les

diverses barreres selectives. Aquestes poden ser els diferents microambients que

troben els tumors, com els períodes d’anòxia, la falta de nutrients, les

fluctuacions hormonals i l’atac del sistema immune.

- 36 – Introducció

Vies de progressió basades en dades moleculars

Fins ara s’han descrit dues vies preferents de progressió del càncer colorectal: la

via d’inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) i la via de la inestabilitat cromosòmica

(CIN). Tot i que estan ben diferenciades i descrites a nivell fenotípic o genotípic,

es pot comprovar a més que diferents tipus d’inestabilitat poden conduir a

diferents tipus d’inactivació dels mateixos gens.

No sempre és fàcil veure aquestes diferències, degut a la convergència evolutiva.

És a dir, les vies de senyalització que es veuen alterades seran sovint les

mateixes, però hi ha exemples que demostren que segons quin sigui el camí

escollit, el tipus de mutació o el gen inactivat d’una via és diferent. Així, un dels

casos més paradigmàtics és el de la via de senyalització de WNT, és a dir, el

binomi APC/β-catenina. Si comparem tumors que han seguit el camí de MSI amb

d’altres que presenten CIN veiem que:

1) sovint els tumors amb CIN tenen una mutació intragènica d’un al·lel d’APC,

juntament amb la pèrdua del cromosoma 5 on hi ha l’al·lel salvatge (Ichii

et al., 1992; Levy et al., 1994). Només un percentatge petit presenten β-

catenina mutada (Morin et al., 1997).

2) en canvi els tumors amb MSI sovint presenten mutacions en els dos al·lels

d’APC, preferentment a una zona de seqüència repetida que són més

sensibles a mutar per la deficiència del sistema de reparació MMR (Huang

et al., 1996). I almenys un terç dels tumors presenten mutat el gen de la

β-catenina (Sparks et al., 1998).

Així veiem com independentment del tipus d’inestabilitat que condueix a la

mutació en aquests càncers, s’aconsegueix el mateix resultat, una via del control

del creixement és activada, donant un avantatge proliferatiu a les cèl·lules que

presenten aquesta mutació.

Vies de progressió basades en dades citogenètiques

Els tumors epitelials es caracteritzen per tenir un major nombre d’alteracions

cromosòmiques que els tumors limfàtics. Però cap d’elles és específica d’un tipus

de tumor, encara que sabem que no ocorren a l’atzar. S’ha vist que segons el

tipus de tumor la taxa de reorganitzacions cromosòmiques és diferent, essent

molt gran en càncer de mama, i molt més baixa en el càncer d’endometri, per

posar dos exemples extrems.

L’existència de diferents camins d’evolució cromosòmica va ser descrita per

primera vegada per Muleris, a partir d’una sèrie de 100 tumors de càncer

colorectal (Muleris et al., 1988). Així va descriure tres vies diferents en funció de

Introducció - 37 -

les alteracions observades. Les característiques d’aquests tres grups són les

següents (segons la revisió de Dutrillaux, 1995):

Monosòmics

A la sèrie de Muleris representen un 70% dels casos. Es caracteritzen per

presentar reorganitzacions cromosòmiques estructurals, que duen a desequilibris

en el contingut del DNA. Principalment delecions de determinats braços de

cromosomes, com són –17p, –1p, –8p, –5q, –4q, i –9q. També tenen lloc

pèrdues de cromosomes sencers com el –18, –14, –15, –21, i –22. Així i tot,

també es troben guanys dels cromosomes +X, +13, +20, i +7.

El mot de monosomia prové pel fet que sovint trobem cromosomes monosòmics.

I en molts casos (65 - 70% dels tumors), aquestes cèl·lules hipodiploides

tendeixen a fer endoreduplicacions. És a dir, dupliquen tot el seu contingut

genètic mitjançant replicació del DNA sense citocinesi. Llavors les cèl·lules

tetraploides perden cromosomes fins a estabilitzar-se al voltant d’un nombre

modal triploide. Així trobem que en ocasions conviuen les dues poblacions

hipodiploides i hipotetraploides (en el 40% dels casos), i en d’altres només

queden clons hipotetraploides (60% dels casos).

Trisòmics

A la sèrie de Muleris representen un 20-25% dels casos. Es caracteritzen perquè

tenen poques reorganitzacions estructurals, i tendeixen a guanyar cromosomes,

tenint una fórmula cariotípica entre 47 i 58 cromosomes. Les alteracions més

recurrents en ordre decreixent són +7, +13, +20, +12, +X, i +8q. El nom prové

del fet que sovint trobem trisomies de diferents cromosomes, que són l’alteració

més freqüent.

Normals

A la sèrie de Muleris representen entre un 5-7% dels casos. Es caracteritzen

perquè tenen un cariotip normal. Es pot pensar que és degut a la contaminació

amb teixit normal, però en aquest estudi es va comprovar per citometria de flux

que l’índex de DNA era 1, i per tant que totes les cèl·lules eren diploides. Perquè

s’ha comprovat que hi ha una bona correlació entre el cariotip i l’índex de DNA

(Remvikos et al., 1988). Essent proper a 1 quan el cariotip és diploide.

Vies de progressió basades en dades d’expressió

Gràcies a la tècnica de les microarrays (vegeu l’apartat de Materials i mètodes) es

poden classificar sèries de tumors relativament grans en funció dels patrons

d’expressió de molts gens. Això ens permet definir diferents subgrups que podem

equiparar a diferents vies de progressió. Suposem així que l’estat de l’expressió

dels gens en un determinat moment és conseqüència d’una via de progressió

- 38 – Introducció

concreta, i diferent per cada grup que es pugui definir. D’aquesta manera s’han

pogut identificar subtipus específics en una gran varietat de càncers, com en

limfomes (Alizadeh et al., 2000), melanomes (Bittner et al., 2000), i càncer de

mama (Perou et al., 2000).

En l’estudi fet amb DLBCL (de l’anglès, diffuse large B-cell lymphoma) pel grup de

Louis M. Staudt, es van estudiar 40 limfomes mitjançant un xip que contenia

18.000 gens, la majoria dels quals s’expressaven en limfòcits normals i malignes

(Alizadeh et al., 2000). L’anomenaren limfoxip, degut a l’enriquiment per gens

característics d’aquest teixit. La novetat dels resultats és que van poder

identificar dos subgrups de pacients en funció de l’expressió de determinats gens.

Així podien classificar dos grups que expressaven:

a) gens que són activats en les cèl·lules B a la melsa i nòduls limfàtics quan hi

a una resposta immune.

b) gens que són activats quan les cèl·lules B són estimulades a dividir-se

enfront d’un antigen.

Per tant, podem afirmar que estem davant de dues malalties, que tenen un

fenotip semblant, però que són discernibles a nivell molecular. I a més presenten

una supervivència ben diferent. Així el grup de casos que expressa els gens

característics de les cèl·lules B a la melsa i nòduls tenen més bon pronòstic, i un

75% eren vius després de 5 anys. En canvi, a l’altre grup el 75% havia mort

passat el mateix temps.

Aquests resultats són molt esperançadors de cara a un canvi en el seguiment

d’aquests pacients, ja que el grup de més alt risc es podrien enviar directament a

trasplantament del moll de l’os sense passar per un tractament amb

quimioteràpia que pot debilitar el pacient. Però aquestes conjectures són encara

ciència ficció ja que, degut al cost, un anàlisi així a més gran escala encara no és

plausible. I cal tenir en compte, que són uns resultats molt preliminars i caldrà

confirmar-los en un futur.

Paral·lelament, en un altre estudi fet a partir de 31 melanomes també van poder

diferenciar dos grups en funció dels seus perfils d’expressió. En aquest cas, però,

no van trobar diferències en la supervivència dels pacients (Bittner et al., 2000).

1.3. Estudis moleculars a gran escala

En l’estudi del càncer en general, i com hem vist fins ara, s’han descrit un gran

nombre d’alteracions en oncogens, gens supressors de tumors, i gens

responsables de l’estabilitat del genoma. Així i tot, estudis a gran escala

suggereixen que el nombre de gens afectats és molt més gran, i que encara en

queden molts per descobrir. Trobem que un 30% de mitjana del genoma dels

Introducció - 39 -

tumors sòlids presenten un número de còpies aberrant (Iwabuchi et al., 1995), i

que el número de mutacions per tumor és d’entre 103 i 105 (Loeb i Christians,

1996). És clar, que part d’aquestes alteracions són el soroll de fons que reflecteix

l’acumulació de les aberracions en forma d’inestabilitat a mesura que el tumor

avança. El repte és poder distingir les alteracions genòmiques importants de les

del soroll, identificar els diferents gens i veure quin és el seu paper en la

tumorigènesi, progressió i resposta a la teràpia.

Si fem un repàs crític dels estudis adreçats a caracteritzar els perfils moleculars

dels tumors en general i el càncer colorectal en particular veiem la gran varietat

de tècniques i aproximacions utilitzades. Bàsicament podem parlar de dos tipus

d’estratègies: l’estudi de marcadors específics i l’anàlisi de perfils globals.

Anàlisi d’alteracions simples en gens o loci concrets.

Es tracta de variables categòriques de les quals estudiem la presència o absència

de mutació. Per tant, són alteracions emmarcades en un context determinat, i

que complementen les classificacions ja fetes, per la qual cosa poden servir per

millorar-les, però mai són la base de la classificació. Per tant, aquests mètodes

d’estudi d’un o pocs gens o loci no són adients per entendre la complexitat del

càncer. Les alteracions descrites una a una s’han de correlacionar amb altres

característiques, ja siguin clíniques com moleculars, per tal de fer-nos una idea

del seu pes en el procés tumoral. En resum, aquesta estratègia és un

reduccionisme pràctic per a descobrir marcadors genètics que ens poden ajudar a

identificar factors moleculars rellevants en el procés tumoral.

Circumstancialment, l’estudi d’aquests marcadors també pot tenir un valor

pronòstic o diagnòstic en entitats molt concretes, si bé en càncer colorectal és

especialment difícil.

Perfils globals.

En els últims anys s’han introduït noves tècniques que fan un abordatge massiu

de múltiples marcadors. Són les tècniques anomenades en anglès de high-

throghput, o de l’era –omics (fent referència als mots genomics i proteomics).

Algunes de les més utilitzades se citen a la Taula 8. Es tracta de mirar milers de

variables alhora, ja sigui a nivell d’expressió (RNA), d’alteracions genòmiques

(DNA), o de proteïnes. Fins ara la principal limitació d’aquests estudis és la

manca de sistemes estàndards que fan inviable la comparació entre experiments

duts a terme en diferents laboratoris. És d’esperar que amb el temps, aquests

estudis ens permetin el disseny d’estratègies més simples i fàcilment

transportable a la rutina clínica.

a) A nivell d’RNA. Les microarrays d’expressió són una plataforma

excel·lent per estudiar diferents tipus de tumors. Els detalls de la tècnica estan a

- 40 – Introducció

bastament explicats a l’apartat de Materials i mètodes. Però a títol introductori és

de destacar el fet que gràcies a les microarrays, es pot mesurar de manera

relativament fàcil l’expressió de molts gens alhora en diferents ambients. A nivell

teòric podem estudiar l’expressió de tot el genoma sota estímuls ben diversos.

Això, evidentment, és més fàcil quan treballem amb cultius cel·lulars o altres

models animals, que no pas amb mostres humanes. La limitació de la quantitat

de mostra, i la falta d’identificació de molts gens del genoma humà, fan que

encara sigui una utopia pensar que estem treballant amb tot el transcriptoma.

Taula 8. Tècniques emprades per a fer estudis a gran escala.

estudis a nivell de DNA estudis a nivell d’RNA estudis a nivell de

proteïna

- AP-PCR (Arbitrarily primed PCR) - pintat de cromosomes - CGH (Comparative Genomic Hybridization) - RDA (Representational Difference Analysis) - RLGS (Restriction Landmark Genome Scanning) - estudis de LOH a gran escala - microarrays de CGH (de DNA)

- DD (Differential Display), i altres tècniques relacionades com la RAP-PCR (RNA Arbitrarily Primed PCR)

- SAGE, Serial Analysis of Gene Expression - Nucleic Acid Substraction - microarrays d’expressió (de cDNA)

- gels bidimensionals (2D-PAGE) - microarrays de teixits

Així i tot, s’estan fent molts esforços per tal d’identificar i poder posar el màxim

de gens en un sol xip (suport de vidre on s’ordenen tots els gens formant una

matriu). I per altra banda, també hi ha diferents tècniques d’amplificació de l’RNA

de la mostra d’estudi (vegeu l’apartat de Materials i mètodes) que intenten

aconseguir que aquesta sigui il·limitada. En el cas del càncer, l’aparició d’aquesta

tècnica ha revolucionat el camp. Ara disposem d’una aplicació que ens permet

distingir les diferències a nivell d’expressió entre diverses mostres dins d’una

mateixa classe de càncer.

La majoria d’estudis se centren en la identificació de pautes d’expressió dels

teixits per tal de poder identificar grups de tumors que a nivell clinicopatològic no

es poden distingir. Per tant es busca una classificació més acurada i precisa. La

utilitat d’aquestes tècniques s’ha confirmat en diferents tipus de tumors, que

inclouen limfomes (Alizadeh et al., 2000), mama (Perou et al., 2000), pàncrees

(Iacobuzio-Donahue et al., 2003), gàstric (Tay et al., 2003) i naturalment

colorectals (Bertucci et al., 2004; Kitahara et al., 2001; Koehler et al., 2004;

Selaru et al., 2002; Zou et al., 2002).

Introducció - 41 -

b) A nivell de DNA. Des de la descripció de la hibridació genòmica

comparada (CGH) fa més de 10 anys (Kallioniemi et al., 1993) són molts els

treballs que han utilitzat aquesta tècnica per obtenir cariotips moleculars de

diferents tipus de càncers. La CGH ens dóna informació dels guanys o pèrdues de

trossos de cromosomes més grans de 10 Mb (vegeu l’apartat de Material i

mètodes). És fàcil d’aplicar i de gran utilitat per la quantitat de marcadors que

s’estan mirant alhora. També es busca correlacionar aquestes alteracions amb la

malignitat dels tumors i poder-los classificar millor (Al-Mulla et al., 1999; De

Angelis et al., 1999; Georgiades et al., 1999; Ried et al., 1996).

Després de l’aparició de les microarrays d’expressió es va aprofitar la mateixa

plataforma per dissenyar arrays que contenen seqüències genòmiques; ja siguin

BACs, cromosomes artificials derivats de P1, o còsmids. La precisió de la

informació generada depèn de la qualitat dels mapes genòmics i la densitat de les

seqüències de cada regió cromosòmica dins el xip. Actualment, amb aquesta

tècnica es treballa a una resolució que oscil·la entre 1 i 10 Mb (Fiegler et al.,

2003). Encara són pocs els treballs realitzats amb aquesta metodologia (Fritz et

al., 2002; Nakao et al., 2004; Pinkel et al., 1998; Pollack et al., 1999; Tay et al.,

2003), però és d’esperar que acabi per substituir la CGH convencional.

c) A nivell de proteïna. La proteòmica integra una sèrie d'eines per a la

separació i anàlisi de proteïnes en mostres biològiques. L’electroforesi

bidimensional (2D-PAGE, de l’anglès two-dimensional polyacrylamide gel

electrophoresis) i la cromatografia en combinació amb l’espectrometria de masses

ha permès la identificació de diversos marcadors, així com la definició de perfils

moleculars en diferents tipus de càncer. En l’actualitat l’electroforesi

bidimensional és l’alternativa equivalent a les microarrays genòmiques i

d’expressió pels estudis de proteïna a nivell global. Malgrat el seu extraordinari

potencial, la complexitat de l’anàlisi i la interpretació de les dades fa que encara

sigui difícil obtenir patrons comparables entre experiments fets en diferents

laboratoris (Fels et al., 2003; Steinert et al., 2002).