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8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 1/9
ALTERATIONS
IN THE
PERMEABILITY
OF
NEUROSPORA
CRASSA
DUE
TO
POLYENE
ANTIBIOTICS
STEPHEN
C .
KINSKY
D e p a r t m e n t
o f P h a r m a c o l o g y ,
W a s h i n g t o n U n i v e r s i t y
S c h o o l
o f M e d i c i n e ,
S t .
L o u i s ,
M i s s o u r i
R e c e i v e d
f o r
p u b l i c a t i o n
J u n e
1 3 ,
1 9 6 1
A B S T R A C T
K I N S K Y ,
S T E P H E N
C ( W a s h i n g t o n
U n i v e r s i t y ,
S t .
L o u i s , M o . ) .
A l t e r a t i o n s
i n
t h e
p e r m e a b i l i t y
o f
N e u r o s p o r a
c r a s s a d u e t o
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s .
J . B a c t e r i o l . 8 2 : 8 8 9 - 8 9 7 .
1 9 6 1 .
- T h i r t y - t h r e e
a n t i b i o t i c s
a n d
s y n t h e t i c f u n g i c i d e s
w e r e
e x -
a m i n e d
f o r
t h e i r e f f e c t
o n
t h e
g r o w t h a n d
m o r -
p h o l o g y
o f
N e u r o s p o r a
c r a s s a .
O n l y
t h e
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s
( n y s t a t i n , a m p h o t e r i c i n
B ,
a n d
f i l i p i n )
c a u s e d
a d e c r e a s e
i n
t h e
d r y
w e i g h t
o f
m y c e l i a l
m a t s ,
w h i c h w a s
a c c o m p a n i e d b y
t h e
a p p e a r a n c e
o f
c y t o p l a s m i c
c o n s t i t u e n t s
i n
t h e
m e d i u m .
T h e
i n f l u e n c e
o f
p o l y e n e
c o n c e n t r a t i o n ,
i n c u b a t i o n
t i m e ,
m y c e l i a l
a g e ,
v a r i o u s m e t a b o l i c
i n h i b i t o r s ,
p H , a n d
m e d i a
c o m p o s i t i o n
o n t h i s
p h e n o m e n o n
a r e
d e s c r i b e d .
T h e
p r e s e n t
e v i d e n c e i n d i c a t e s
t h a t
t h e
p o l y e n e s
e x e r t
t h e i r
p r i m a r i l y f u n g i c i d a l
e f f e c t
b y
a n
a l t e r a t i o n o f
p e r m e a b i l i t y ,
p r o b a b l y
d u e
t o
d i r e c t
a c t i o n
o n t h e
m e m b r a n e o f s e n s i t i v e
o r g a n i s m s .
D u r i n g
t h e
c o u r s e o f a n i n v e s t i g a t i o n
o n
i n -
d u c e d
e n z y m e s y n t h e s i s
i n
N e u r o s p o r a
c r a s s a ,
a n
a t t e m p t
w a s
m a d e t o
p r e p a r e p r o t o p l a s t s
o f
t h i s o r g a n i s m b y
m e a n s o f a n t i b i o t i c s
a n d
s y n -
t h e t i c
f u n g i c i d e s .
I t w a s
t h o u g h t
t h a t s o m e o f
t h e s e
c o m p o u n d s m i g h t
i n t e r f e r e w i t h
f u n g a l
c e l l
w a l l
f o r m a t i o n
i n
a
manner
a n a l o g o u s
t o
t h e
a c t i o n
o f
p e n i c i l l i n
o n E s c h e r i c h i a
c o l i a n d
S t a p h y -
l o c o c c u s
a u r e u s
( L e d e r b e r g ,
1 9 5 6 ;
P a r k a n d
S t r o m i n g e r , 1 9 5 7 ) . A l t h o u g h
n o
g r o s s
m o r p h o l o g -
i c a l c h a n g e s
w h i c h
c o u l d
b e
i n t e r p r e t e d a s p r o -
t o p l a s t
p r o d u c t i o n
w e r e
a p p a r e n t ,
t h e a c t i o n
o f
s e v e r a l
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s
l e d
t o
t h e
c o n c l u s i o n
t h a t t h e s e
a g e n t s
a l t e r e d t h e
p e r m e a b i l i t y
o f
N e u r o s p o r a .
T h e
p r e s e n t
p a p e r ,
w h i c h
a m p l i f i e s
a
p r e l i m i n a r y
n o t e
( K i n s k y , 1 9 6 1 ) , p r o v i d e s
a d d i -
t i o n a l e v i d e n c e
i n
s u p p o r t
o f
t h i s
i d e a ,
a n d a l s o
i n c l u d e s
s o m e
o b s e r v a t i o n s
o b ta in e d w i t h
o t h e r
a n t i b i o t i c s
a n d
f u n g i c i d e s .
MATERIALS
AND
METHODS
C h e m i c a l s .
T h e
a n t i b i o t i c s a n d f u n g i c i d e s w h i c h
w e r e
e x a m i n e d
i n
t h i s
s t u d y
w e r e
g e n e r o u s l y
p r o v i d e d b y
t h e
i n d i v i d u a l s a n d
p h a r m a c e u t i c a l
c o m p a n i e s
c i t e d
i n
t h e
f o o t n o t e
t o
T a b l e 1 .
D i m e t h y l f o r m a m i d e
w a s o b t a i n e d
f r o m E a s t m a n
O r g a n i c C h e m i c a l s , R o c h e s t e r , N .
Y . ,
a n d
3 , 3 -
d i m e t h y l g l u t a r i c
a c i d w a s
p u r c h a s e d
f r o m
t h e
A l d r i c h C h e m i c a l C o m p a n y ,
I n c . ,
M i l w a u k e e ,
W i s .
A l l
c h e m i c a l s
w e r e
u s e d w i t h o u t f u r t h e r
p u r i f i c a t i o n .
G r o w t h
a n d
a n t i b i o t i c
s e n s i t i v i t y .
N .
c r a s s a
s t r a i n
5 2 9 7 a
w a s
e m p l o y e d
t h r o u g h o u t t h i s
i n v e s t i g a t i o n .
A n t i b i o t i c s e n s i t i v i t y w a s d e t e r -
m i n e d b y
t w o
m e t h o d s , u s i n g e i t h e r
a c o n i d i a l
s u s p e n s i o n
o r
m y c e l i a l
mat a s
i n o c u l u m . I n t h e
f i r s t
p r o c e d u r e ,
a p p r o p r i a t e
q u a n t i t i e s o f
a n t i -
b i o t i c ( s e e
R e s u l t s )
w e r e
a d d e d
t o
2 5
m l
o f
s t e r i l e
g r o w t h
m e d i u m
( N a s o n
a n d
E v a n s ,
1 9 5 3 ) i n
1 2 5 - m l
E r l e n m e y e r
f l a s k s , w h i c h
w e r e s u b s e -
q u e n t l y
i n o c u l a t e d
w i t h
a p p r o x i m a t e l y
0 . 2 m l
o f
a d e n s e
s p o r e
s u s p e n s i o n
o f
N e u r o s p o r a ( z e r o - h r
i n o c u l u m ) .
A f te r 4 8
h r
g r o w t h
a t
2 5
C
w i t h o u t
s h a k i n g
( s t a t i o n a r y
c u l t u r e s ) ,
t h e
m y c e l i a l
m a t s
w e r e
h a r v e s t e d b y
f i l t r a t i o n
i n
a
B u c h n e r
f u n n e l ,
c a r e f u l l y
f o l d e d
i n t o s m a l l
r e c t a n g l e s ,
a n d
d r i e d
o v e r p h o s p h o r o u s p e n t o x i d e
f o r 1 2 h r
i n
a n
e v a c u a t e d
d e s i c c a t o r .
D r y w e i g h t ,
w h i c h
w a s
u s e d a s
t h e i n d e x
o f
g r o w t h ,
w a s d e t e r m i n e d
w i t h
a
M e t t l e r
T y p e H16
b a l a n c e
( M e t t l e r
I n -
s t r u m e n t
C o r p . ,
H i g h t s t o w n ,
N .
J . ) .
I n
t h e s e c -
o n d
m e t h o d d e v i s e d
f o r
a s s a y i n g
r e s p o n s e t o
a n t i -
b i o t i c ,
a
4 8 - h r
i n o c u l u m
( i . e . ,
m y c e l i a l m a t )
w a s
e m p l o y e d . M y c e l i a l
m a t s
g r o w n
a s
a b o v e
i n
s t a n d i n g c u l t u r e s ,
b u t i n
t h e
a b s e n c e
o f
a n t i -
b i o t i c , w e r e
t r a n s f e r r e d t o
1 2 5 - m l
E r l e n m e y e r
f l a s k s
c o n t a i n i n g 2 5
m l o f
f r e s h
m e d i u m s u p p l e -
m e n t e d
w i t h t h e a n t i b i o t i c .
T h e s e f l a s k s w e r e
t h e n
s h a k e n
a t
2 5 C
i n
a
G y r o t o r y
S h a k e r
( N e w
B r u n s w i c k S c i e n t i f i c
C o m p a n y ,
Ne w
B r u n s w i c k ,
N .
J . ) .
T h e
m a t s
w e r e
h a r v e s t e d
a f t e r
2
a n d
5 h r
i n c u b a t i o n
b y
B i i c h n e r f i l t r a t i o n ,
a n d
d r i e d
a n ( l
8 8 9
a t E
C OL E P
OL Y T E
C H N I Q
U E F E D E R A L E D E L A
U S A N N E
onA
u g u s t 3 0 ,2
0 0 9
j b . a
s m. or g
D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 2/9
KINSKY
w e i g h e d
a s
d e s c r i b e d
p r e v i o u s l y .
T h e
i n c r e a s e
i n
d r y w e i gh t
b e t w e e n
2
a n d 5 h r
was
u s e d
a s a
measure
o f g r o w t h .
A s
i n d i c a t e d
b e l o w ,
m y c e l i a l
m a t s
i n
c o n t r o l
f l a s k s ,
w h i c h
d i d
n o t
r e c e i v e
any
a n t i b i o t i c ,
g e n e r a l l y
g a i n e d
a p p r o x i m a t e l y
25
o f t h e
i n i t i a l
d r y
w e i g h t u n d e r
t h e s e c o n d i t i o n s .
V a r i a t i o n s
o f
t h i s
p r o c e d u r e w e r e
r o u t i n e l y
e m p l o y e d
i n
e x p e r i m e n t s
w i t h t h e
p o l y e n e a n t i -
b i o t i c s , a n d
a r e d e t a i l e d
i n
t h e
R e s u l t s .
S t o c k s o l u t i o n s
o f
w a t e r - i n s o l u b l e
a n t i b i o t i c s
a n d
f u n g i c i d e s
w e r e
p r e p a r e d
w i t h
e i t h e r
a b s o l u t e
e t h a n o l
or d i m e t h y l f o r m a m i d e
i m m e d i a t e l y
b e f o r e
use.
No
a t t e m p t
was
m a d e
t o
s t e r i l i z e
t h e s e s o l u t i o n s ,
s i n c e p e r i o d i c
e x a m i n a t i o n
o f t h e
m e d i u m c o n t a i n i n g
t h e s e a g e n t s
d i d n o t r e v e a l
any
b a c t e r i a l c o n t a m i n a t i o n
a f t e r
c o m p l e t i o n
o f
t h e e x p e r i m e n t .
C o n t r o l
f l a s k s
c o n t a i n e d
a
c o m p a r a b l e
amount o f s o l v e n t
w h e n necessary.
T A B L E
1 .
E f f e c t
o f a n t i b i o t i c s a n d
s y n t h e t i c
f u n g i c i d e s
o n
g r o w t h
o f N e u r o s p o r a
c r a s s a *
A n t i b i o t i c s
I n h i b i t i o n t
w i t h
1 0 0
p g / m l
S y n t h e t i c
f u n g i c i d e s
A n t i b a c t e r i a l
A n t i f u n g a l
A .
None
C h l o r t e t r a c y c l i n e e
C h l o r a m p h e n i c o l h
C y c l o s e r i n e f
E r y t h r o m y c i n f
N e o m y c i n k
P e n i c i l l i n f
P u r o m y c i n e
S t r e p t o m y c i n k
V a n c o m y c i n f
V i r i d o g r e s e i n h
B . P a r t i a l
B a c i t r a c i n f
G l a d i o l i c
a c i d d
a - D i c h l o r o a c e t a m i d o - 4 3 -
G r a m i c i d i n i
M y c o p h e n o l i c
a c i d d
h y d r o x y - p - n i t r o p r o -
N o v o b i o c i n k
G r i s e o f u l v i n i
p i o p h e n o n e h
P s i c o f u r a n i n e k
C .
C o m p l e t e
P o l y m i x i n
B b
A m p h o t e r i c i n
B i
A c r i z a n e a
C - 2 7 5 f
B e n z e t h o n i u M h
C y c l o h e x i m i d e k
C h l o r o d i m o r i n e a
E u l i c i n g F u r a s p o r c
F i l i p i n k
NF-6Ac
N y s t a t i n i
T r i d e c y l p y r i d i n e
o x i d e h
P i m a r i c i n e
U - 5 8 7 c
V i r i d i n d
*
The
f o l l o w i n g
c o m p a n i e s
a n d i n d i v i d u a l s g e i s e r o u s l y
p r o v i d e d
t h e
a n t i b i o t i c s
a n d
f u n g i c i d e s
w h i c h
m ad e t h i s i n v e s t i g a t i o n
p o s s i b l e :
a
A b b o t t
L a b o r a t o r i e s ,
N o r t h
C h i c a g o ,
I l l .
( W .
E .
G r u n d y ) .
b
B u r r o u g h s W e l l c o m e
a n d C o . ,
T u c k a h o e ,
N . Y . ( G .
H .
H i t c h i n g s ) .
c
Eaton L a b o r a t o r i e s ,
N o r w i c h ,
C o n n .
( A .
B .
N e i l l ) .
d
I m p e r i a l
C h e m i c a l I n d u s t r i e s ,
L t d . , W e l w y i n ,
H e r t s . ,
E n g l a n d
( P .
W. B r i a n ) .
e
L e d e r l e L a b o r a t o r i e s ,
P e a r l
R i v e r ,
N .
Y . ( B .
L .
H u t c h i n g s ) .
f
L i l l y
R e s e a r c h
L a b o r a t o r i e s ,
I n d i a n a p o l i s ,
I n d . ( E .
R . S h e p h a r d ) .
9
M e r ck S h a r p a n d
Dohme,
Rahway,
N .
J . ( F .
J .
W o l f f ) .
h
P a r k e ,
D a v i s a n d
C o . , D et ro i t,
M i c h . ( A .
L .
R a w l i n s ) .
S c h e r i n g
C o r p o r a t i o n ,
B l o o m f i e l d ,
N .
J .
( E .
J .
F o l e y ) .
i
S q u i b b
I n s t i t u t e f o r
M e d i c a l
R e s e a r c h ,
Ne w B r u n s w i c k ,
N . J . ( R .
E . B e n n e t t ) .
k
Th e
U p j o h n
C o m p a n y ,
K a l a m a z o o ,
M i c h .
( G .
M.
S a v a g e ) .
t
I n h i b i t i o n
w a s n o t e d
a s n o n e
when
mats f r o m
f l a s k s
c o n t a i n i n g
t h e a n t i b i o t i c
h a d a d r y
w e i g h t
w i t h i n
5
o f
t h e
w e i g h t
o f
c o n t r o l
m y c e l i a l
m a t s g r o w n
i n
t h e
a b s e n c e
o f
a n t i b i o t i c .
C o m p l e t e
i n -
h i b i t i o n
m e a n s
t h a t n o g r o w t h
wa s o b s e r v e d
a f t e r 4 8
h r
( s e e
t e x t ) .
8 9 0
[ V O L .
8 2
a t E
C OL E P
OL Y T E
C H N I Q
U E F E D E R A L E D E L A
U S A N N E
onA
u g u s t 3 0 ,2
0 0 9
j b . a
s m. or g
D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 3/9
POLYENE
ANTIBIOTICS
ON
NEUROSPORA
O p t i c a l
d e n s i t y
w a s
d e t e r m i n e d w i t h
e i t h e r a
Z e i s s
o r C a r y M o d e l 1 4 r e c o r d i n g
s p e c t r o p h o -
t o m e t e r .
RESULTS
R e s p o n s e
o f N e u r o s p o r a
t o v a r i o u s a n t i b i o t i c s
a n d
f u n g i c i d e s .
D u r i n g p r e l i m i n a r y
s c r e e n i n g
o f
a n t i b i o t i c s
a n d
f u n g i c i d e s ,
t h e s e c o m p o u n d s
w e r e
a r b i t r a r i l y
c l a s s i f i e d
a c c o r d i n g
t o t h e e x t e n t
o f
g r o w t h
i n h i b i t i o n
p r o d u c e d
a t a
c o n c e n t r a t i o n
o f
1 0 0
j , g
p e r
m l o f
m e d i u m
( c o m p l e t e ,
p a r t i a l ,
o r
n o i n h i b i t i o n ,
u s i n g a
z e r o - h r
i n o c u l u m
a s
d e -
s c r i b e d
u n d e r
M e t h o d s ) .
T a b l e
1 ,
r o w s A
a n d
B ,
i n d i c a t e s t h a t t h e
m a j o r i t y
o f common a n t i -
b a c t e r i a l
a n t i b i o t i c s h a d n o
e f f e c t . C o m p l e t e
g r o w t h
i n h i b i t i o n
w a s
o b t a i n e d w i t h
t h e
c o m -
p o u n d s
l i s t e d
i n
r o w C .
T h e s e i n c l u d e d m o s t
o f
t h e a n t i f u n g a l
a n t i b i o t i c s
a n d
s y n t h e t i c
f u n g i c i d e s
w h i c h w e r e t e s t e d .
T o c o m p a r e t h e
r e l a t i v e
p o t e n c i e s
o f
t h e s e
a g e n t s ,
t h e
c o n c e n t r a t i o n
r e q u i r e d
t o
p r o d u c e
50
i n h i b i t i o n
a f t e r
4 8
h r
g r o w t h
w a s d e t e r m i n e d ( z e r o - h r i n o c u l u m ) ,
a n d
t h e
r e s u l t s
a r e
p r e s e n t e d
i n T a b l e
2 .
T h e a n t i -
f u n g a l
a n t i b i o t i c s
w e r e e f f e c t i v e
a t e x t r e m e l y
l o w
c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 - 6
t o
1 0 - 8 M ) ,
w h e r e a s
h i g h e r
l e v e l s
o f t h e
s y n t h e t i c
f u n g i c i d e s
w e r e
r e q u i r e d
t o
p r o d u c e
t h e
s a m e
d e g r e e
o f i n h i b i t i o n .
T h e
TABLE
2 . I n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n s
o f v a r i o u s
a n t i b i o t i c s
a n d
s y n t h e t i c
f u n g i c i d e s
o n
N e u r o s p o r a
c r a s s a
Compound
E u l i c i n
.......
C y c l o h e x i m i d e . .
A m p h o t e r i c i n
B .
A c r i z a n e . . . . . . . .
C - 2 7 5 . . . . . . . . . . .
V i r i d i n .........
F i l i p i n
.........
N y s t a t i n . .
B e n z e t h o n i u m .
P i m a r i c i n . . . . . . .
T r i d e c y l p y r i -
d i n e
o x i d e . . . .
U - 5 8 7 . . . . . . . . . . .
N F - 6 A .........
P o l y m i x i n
B . . . .
C h l o r o d i m o r i n e
.
F u r a s p o r
.......
50
I n h i b i t i o n , 0
h r
pg/mi
0 . 0 2 0
0 . 0 4 2
0 . 0 5 4
0 . 0 7 2
0 . 1 1
0 . 1 6
0 . 2 0
0 . 2 7
0 . 6 3
0 . 7 1
1 . 6 5
2 . 7 0
3 . 6 5
1 0 . 0
1 8 . 0
1 8 . 0
M
4 . 1 X 1 0 - 8
1 . 5
X
1 0 - 7
5 . 6
X
1 0 - 8
1.9
X
1 0 - 7
6 . 8 X 1 0 - 8
4 . 5 X
1 0 - 7
3 . 5 X
1 0 - 7
2 . 9
X 1 0 - 7
1 . 4 X
1 0 - 6
1 . 0
X
1 0 - 6
6 . 0
X
1 0 - 6
1.1
X
0- '
2 . 3 X 1 0 -
8 . 7
X
1 0 - 6
4 . 9
X 1 0 - 5
1 . 2 X
1 0 - 4
1 0 0
I n h i b i -
t i o n
( M I C )
0
h r 4 8 h r
p g / m l
pg/mi
1 . 5 1 . 5
0 . 3
0 . 3
0 . 5
3 . 0
1 . 0 >20
3 . 0 3 - 3 0
1 . 0
1 . 0
2 . 0
2 . 0
1 . 6 2 0 . 0
3 . 0 3 - 6
5 . 0
6 . 0
1 2
5 0
6 0
7 0
> 5
1 9 . 0
1 2 - 2 4
>50
>60
>70
I
1 6
0 1 )
4
I
0
C ,
3
( i )
8
(
1 6
( 2
0
L I d
U , )
4 L
d
c r
C.,
a d
A .
- 0 . 4
2 . 0
2
C O N C .
N Y S T A T I
N-
l m l
20
20
B .
N Y S .
( 2 0 . 0
5 / m l )
6
A M P H O .
B . ( 0 . 0 6
5 / m l )
1 2
N Y S .
( 0 . 4 l / m I )
8-
4-
IC
3
INCUBATION TIME-HOURS
F I G . 1 .
E f f e c t o f p o l y e n e
c o n c e n t r a t i o n a n d i n -
c u b a t i o n
t i m e o n d r y
w e i g h t o f
m y c e l i a l
m a t s .
A .
T h e
4 8 - h r - o l d
m y c e l i a l m a t s
w e r e t r a n s f e r r e d
t o
f r e s h
m e d i u m ,
b u f f e r e d
w i t h
0 . 0 2
M
d i m e t h y l g l u t a -
r a t e , p H 4 . 5 ,
c o n t a i n i n g
d i f f e r e n t
c o n c e n t r a t i o n s
o f
n y s t a t i n ,
a s
i n d i c a t e d
o n t h e
a b s c i s s a . A f t e r
3
h r
s h a k i n g ,
t h e m a t s w e r e
h a r v e s t e d ,
d r i e d ,
a n d w e i g h e d
( - y
d e n o t e s
, . g ) .
B .
T h e
4 8 - h r - o l d
m y c e l i a l
m a t s
w e r e
t r a n s f e r r e d
t o
f r e s h
m e d i u m , b u f f e r e d
w i t h
0 . 0 2
i r
d i m e t h y l g l u t a r a t e ,
p H
4 . 5 , c o n t a i n i n g
t h e
c o n c e n -
t r a t i o n s
o f m y s t a t i n
a n d
a m p h o t e r i c i n
B
i n d i c a t e d
i n
t h e
f i g u r e .
A f t e r
0 . 5 a n d
3
h r
s h a k i n g ,
t h e m a t s
w e r e h a r v e s t e d ,
d r i e d ,
a n d
w e i g h e d .
a c t u a l
a m o u n t
r e q u i r e d
f o r i n h i b i t i o n
m ay
b e
l e s s
t h a n t h e
v a l u e s c i t e d
i n
T a b l e
2 ,
s i n c e d a t a
c o n c e r n i n g
t h e
p u r i t y
o f
t h e a n t i b i o t i c s a n d
f u n g i c i d e s
w e r e
g e n e r a l l y
n o t o b t a i n a b l e . F o r
t h i s r e a s o n ,
t h e
f i n a l m o l a r
c o n c e n t r a t i o n
i n
t h i s
a n d
s u c c e e d i n g
e x p e r i m e n t s
a r e
o n l y a p p r o x i m a -
t i o n s
m a d e
o n t h e
a s s u m p t i o n
o f
1 0 0 p u r i t y .
T a b l e
2 a l s o i n d i c a t e s t h e
l e a s t a m o u n t o f
e a c h
c o m p o u n d
w h i c h
w i l l
p r o d u c e
c o m p l e t e
i n h i b i -
t i o n ,
a s
e s t i m a t e d f r o m t h e
g r o w t h - c o n c e n t r a t i o n
c u r v e ( z e r o - h r i n o c u l u m ) .
T h e s e
minimum
i n h i b i t o r y
c o n c e n t r a t i o n s ( M I C )
w e r e t h e n
t e s t e d
f o r t h e i r e f f e c t
o n
4 8 - h r
m y c e l i a l
m a t s
g r o w n
i n
t h e
a b s e n c e
o f
a n t i b i o t i c
b y
t h e
p r o c e -
d u r e d e s c r i b e d
a b o v e .
S i g n i f i c a n t l y
h i g h e r
l e v e l s
o f
a c r i z a n e ,
C - 2 7 5 ,
b e n z e t h o n i u m
c h l o r i d e ,
t r i d e c y l - p y r i d i n e o x i d e ,
U - 5 8 7 ,
p o l y m i x i n
B ,
c h l o r o d i m o r i n e ,
a n d
F u r a s p o r ,
w e r e
( o r
w o u l d
b e ) r e q u i r e d
t o
g i v e
c o m p l e t e g r o w t h
i n h i b i t i o n
1 9 6 1 ]
8 9 1
a t E
C OL E P
OL Y T E
C H N I Q
U E F E D E R A L E D E L A
U S A N N E
onA
u g u s t 3 0 ,2
0 0 9
j b . a
s m. or g
D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 4/9
f
4 8 - h r
m y c e l i a .
T h e s e
r e s u l t s
c o u l d
b e e x p l a i n e d
t h e p r e s e n c e
o f e x c e s s a n t i b i o t i c .
T h i s
v a l u e
y
l a c k o f
p e n e t r a t i o n
i n t o
o l d e r m y c e l i a
o r
r e p r e s e n t e d
a
25
d e c r e a s e
i n
d ry w e i g h t
o f
i e t a b o l i c
t r a n s f o r m a t i o n ( i n a c t i v a t i o n ) .
4 8 - h r
m y c e l i a l m a t s
( r a n g e :
7 0 t o 8 5
m g ) .
E f f e c t s
o f
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s .
Among
t h e m o s t C h a n g e s
a c c o m p a n y i n g
m y c e l i a l a t r o p h y .
T h e
c t i v e
a g e n t s
t e s t e d
w e r e
t h e
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s ,
p o l y e n e - i n d u c e d
w e i g h t
l o s s w a s a c c o m p a n i e d
b y
y s t a t i n ,
a m p h o t e r i c i n
B ,
a n d f i l i p i n .
T h e s e
t h e a p p e a r a n c e
i n
t h e m e d i u m
o f
c o m p o u n d s
n t i b i o t i c s
w e r e
e x a m i n e d
i n
s o m e d e t a i l
b e c a u s e a b s o r b i n g
a t 2 6 0
m , u . T h i s i s s h o w n
i n F i g .
2
f o r
wa s o b s e r v e d
t h a t a d d i t i o n
o f
t h e M IC
n o t a m p h o t e r i c i n
B
a n d
f i l i p i n .
B o t h t h e
r a t e
a n d
n l y
p r o d u c e d
c o m p l e t e
g r o w t h
c e s s a t i o n
w h e n e x t e n t
o f o p t i c a l d e n s i t y
i n c r e a s e i n
c o n t r o l
s t e d on
4 8 - h r
m y c e l i a l
m a t s , b u t
a c t u a l l y
f l a s k s
w a s
v e r y
much
s m a l l e r
t h a n i n
e x p e r i m e n t a l
s u l t e d
i n
a
s i g n i f i c a n t
d e c r e a s e
i n
d r y w e i g h t .
f l a s k s s u p p l e m e n t e d
w i t h
t h e
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s .
i g u r e
1A
s h o w s
t h e
l o s s
o f d ry w e i g h t
p r o - I t
s h o u l d
b e n o t e d
t h a t a p p r e c i a b l e
g r o w t h
u c e d
b y
i n c r e a s i n g
c o n c e n t r a t i o n s
o f
n y s t a t i n
( i . e . ,
i n c r e a s e i n d r y w e i g h t )
w a s o b s e r v e d
i n
t h e
f t e r
3
h r
i n c u b a t i o n .
T h e
t i m e
c o u r s e d e s c r i b e d
a b s e n c e
o f e i t h e r a m p h o t e r i c i n
B o r
f i l i p i n
a f t e r
F i g .
1B
i n d i c a t e s
t h a t
t h i s
w e i g h t
l o s s
b e g a n
a l a g
p e r i o d
o f
1
t o
2
h r .
n m e d i a t e l y
a n d ,
a t
l o w
l e v e l s
o f
n y s t a t i n
( a l s o
T h e a c t i o n
o f
n y s t a t i n
w a s e x a m i n e d
o v e r
a
m p h o t e r i c i n
B ) ,
p r o c e e d e d
l i n e a r l y .
T h e a v e r a g e
l o n g e r
p e r i o d
o f t i m e
( F i g . 3 ) . I n a d d i t i o n
t o
2 6 0
e i g h t
l o s s ,
o b t a i n e d
i n
1 5
e x p e r i m e n t s ,
w a s
2 0
m , i
a b s o r b i n g
m a t e r i a l
( F i g . 3 B ) ,
t h e r e
a l s o
L g ( r a n g e :
1 9
t o
3 1 m g )
a f t e r
5
h r i n c u b a t i o n
i n
a p p e a r e d
i n
t h e m e d i u m
c o m p o u n d ( s )
a b s o r b i n g
a t 2 8 0
m , .
T h e
r a t i o
o f o p t i c a l d e n s i t i e s
a t
2 8 0
2 0 A M P H O T E R I C I N
A
FLIPIN
F
and
260
mA
remained
essentially
constant
1 8
t h r o u g h o u t
t h e
e x p e r i m e n t
( F i g .
3 C ) .
M a t e r i a l
2 6 0 ( + F )
w h i c h
g a v e
a
p o s i t i v e
r e a c t i o n w i t h
t h e
F o l i n
1 6
D . W .
( - A )
2 4
p r o t e i n
r e a g e n t
w a s a l s o
d e t e c t e d i n
t h e
m e d i u m
1 4
1 6
, ,
/
*
( F i g .
3 D ) .
T h e
a p p e a r a n c e
o f
t h i s
m a t e r i a l
i s
o
o
o
1 6
p l o t t e d
a s
p r o t e i n
( u s i n g
c r y s t a l l i n e
b o v i n e
1 2
_
8
g
serum
a l b u m i n
a s
a
s t a n d a r d ) ,
a l t h o u g h
a
- .
/
/
,
f
O
s i g n i f i c a n t ,
b u t
v a r i a b l e ,
f r a c t i o n
w a s
d i a l y z a b l e .
1 0
DW260 +A
D W ( - F )
° 0
T h i s
may
b e
d u e t o
t r y p t o p h a n ,
t y r o s i n e ,
s m a l l
8 1
/
D W
( + A )
D . W . ( + F )
8
=
p e p t i d e s , g u a n i n e ,
a n d o t h e r b a s e s
( s e e
b e l o w ) ,
/
Cs
>
s s
w h i c h
a r e
k n o w n
t o i n t e r f e r e
w i t h
t h i s
m e t h o d
6
6
- _ _ *------6
f
p r o t e i n
d e t e r m i n a t i o n
( L o w r y
e t a l . , 1 9 5 1 ) .
/
-)o-
A f t e r
4 t o
5
h r ,
t h e
m y c e l i a l
m a t s
n o
l o n g e r
4
260
- A )
26 0
( - F )
2 4
l o s t
w e i g h t ,
b u t
b e g a n
g r o w i n g ( F i g . 3 A ) .
U n d e r
0
d e n t i c a l
c o n d i t i o n s ,
t h e
d i s a p p e a r a n c e
o f
t h e
/
c h a r a c t e r i s t i c
a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f
n y s t a t i n
4
2 3
i
c o u l d
b e
d e m o n s t r a t e d
i n
g r o w t h
m e d i u m a l o n e .
I N C U B A T I O N
T I M E -
H O U R S
T h e s e
r e s u l t s
s u g g e s t e d
t h a t
r e g r o w t h
o f
t h e
m y c e l i u m
wa s
p r o b a b l y
a
c o n s e q u e n c e
o f
a n t i -
F I G .
2 .
E f f e c t
o f
a m p h o t e r i c i n
B
a n d
f i l i p i n .
T h e
m y c e
s
p r o b y
a h o n s e q u e n
o f a n t i -
i o t i c
d e s t r u c t i o n
b y
p h o t o - o x i d a t i o n
( V a n d e -
- h r - o l d
m y c e l i a l
m a t s w e r e
t r a n s f e r r e d
t o
f r e s h
p u t t e ,
W a s h t e l ,
a n d
S t i l l e r ,
1 9 5 6 )
a n d
n o t
c a u s e d
e d i u m ,
b u f f e r e d
w i t h
0 . 0 2
M
d i m e t h y l g l u t a r a t e ,
t
i
4 . 7 ,
c o n t a i n i n g
a m p h o t e r i c i n
B , 0 . 3
l A g / m l
b y
t h e d e v e l o p m e n t
o f
r e s i s t a n c e
( e . g .
i n d u c t i o n
a .
3 . 2
X
1 0 - 7
M ) ,
o r
f i l i p i n ,
3 . 0
, A g / m l
( c a .
5 . 3
X
o f a n
e n z y m e
w h i c h
i n a c t i v a t e d
n y s t a t i n ) .
T h i s
- 7
M ) .
C o n t r o l
f l a s k s
d i d
n o t
c o n t a i n
a n t i b i o t i c . c o n c l u s i o n
wa s
s u p p o r t e d
b y
t h e
e x p e r i m e n t s
f t e r
s h a k i n g
f o r
v a r y i n g
i n t e r v a l s ,
t h e
m a t s
f r o m
r e p r e s e n t e d
i n F i g .
4 .
C o n t i n u e d
a d d i t i o n
o f
p l i c a t e
f l a s k s
w e r e h a r v e s t e d ,
d r i e d ,
a n d
w e i g h e d .
n y s t a t i n a f t e r
4 h r p r e v e n t e d s u b s e q u e n t
g r o w t h
k e
a v e r a g e
c h a n g e s
i n
d r y
w e i g h t
( i n c r e a s e
o r d e -
o f t h e m y c e l i a l m a t s a n d ,
i n
f a c t , i n d u c e d
f u r t h e r
e a s e )
r e l a t i v e
t o t h e
w e i g h t
o f
m a t s
a t
t h e
b e g i n n i n g
l o s s i n d r y
w e i g h t ( F i g .
4 A ) .
F i g u r e 4B
s h o w s
t h e
e x p e r i m e n t s
a r e
s h o w n
o n
t h e
r i g h t
o r d i n a t e .
z e
a v e r a g e
i n c r e a s e i n a b s o r p t i o n
o f
t h e m e d i u m
a s
o
i n d t e
i n s t h e
p r e c e d i n g
e x p e r i n
2 6 0
m , u
( e x p r e s s e d
a s
o p t i c a l
d e n s i t y
u n i t s
p e r
t h a t ,
i n
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w e i g h t
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m y c e l i a were
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j b . a
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D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 5/9
POLYENE
ANTIBIOTICS
ON
NEUROSPORA
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0
20
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X
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1 2
24
INCUBATION
TIME-
HOURS
F I G . 3 .
C h a n g e s
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n y s t a t i n - i n d u c e d
w e i g h t l o s s .
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m y c e l i a l
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w e r e
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0 . 0 2
M
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4 . 5 ,
c o n t a i n i n g
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8 . 5
X
1 0 - v
M ) .
A f t e r
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v a r y i n g
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d r i e d ,
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w e i g h e d .
T h e
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2 8 0
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S e e
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d e t a i l s .
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s e n s i t i v e t o
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a n t i b i o t i c .
T h i s
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s h o w n
b y
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m a r k e d
d e c r e a s e
i n
w e i g h t
p r o d u c e d
b y
n y s t a t i n
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h r , a t w h i c h
t i m e
t h e
m a t s
a c t u a l l y
w e i g h e d
m o r e t h a n
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s t a r t o f
t h e
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R e q u i r e m e n t s
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w e i g h t
l o s s
i n d u c e d
b y
p o l y e n e
a n t i o b i o t i c s .
M y c e l i a l m a t s
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t o
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m e d i u m
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b e g i n n i n g
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c u l t u r e s .
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3
i n d i c a t e s
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( n y s t a t i n
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t h i s
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t h e
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m y c e l i u m
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s i n c e
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c a u s e d
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s a m e
p e r c e n t a g e
w e i g h t
l o s s
a f t e r
3
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c a s e s .
B e c a u s e
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m a t s
m i g h t b e
e x p e c t e d
t o
g r o w
m o r e
r a p i d l y
t h a n
o l d e r
o n e s ,
t h i s
w o u l d
s u g g e s t
t h a t
t h e
p o l y e n e - i n d u c e d
w e i g h t l o s s w a s
n o t
a
f u n c t i o n
o f t h e
r a t e
o f
g r o w t h .
To
d e c i d e
w h e t h e r
m y c e l i a l
g r o w t h w a s
e s s e n t i a l ,
t h e
e f f e c t o f s e v e r a l
m e t a b o l i c
i n h i b i t o r s
o n
t h e a c t i o n
o f
n y s t a t i n
w a s
d e t e r m i n e d .
F i g u r e
5
s h o w s t h a t
a d d i t i o n
o f
n y s t a t i n
t o
m a t s ,
w h o s e
g r o w t h
h a d
b e e n
c o m p l e t e l y
i n h i b i t e d
b y
i o d o a c e t a m i d e ,
p - f l u o r o p h e n y l a l a n i n e ,
s o d i u m
a z i d e ,
s u c r o s e
o m i s s i o n ,
c y c l o h e x i m i d e , o r
v i r i d i n ,
p r o d u c e d
a
w e i g h t
l o s s
w h i c h
w a s
q u a l i t a t i v e l y
a n d
q u a n t i t a t i v e l y
i d e n t i c a l
t o
t h e
d e c r e a s e
i n d u c e d
b y
t h e
a n t i b i o t i c
i n i t i a l l y
i n
t h e
a b s e n c e
o f
a n y
i n h i b i t o r . I t
m u s t
a l s o
b e
e m p h a s i z e d
t h a t ,
i n t h i s
e x p e r i m e n t ,
o n l y g r o w t h i n h i b i t i o n
d u e
t o
t h e
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s
w a s a t t e n d e d
b y
a
d e c r e a s e
i n
d r y
w e i g h t ,
a n d
t h a t
n o n e
o f
t h e
o t h e r
a g e n t s
o r
a n t i b i o t i c s
i n h i b i t o r y
f o r
N e u r o -
s p o r a p r o d u c e d
t h i s
e f f e c t .
I n f l u e n c e
o f pH
a n d
m e d i a
c o m p o s i t i o n .
S u b s e -
q u e n t
e x p e r i m e n t s
h a v e
s h o w n
t h a t t h e
p o l y e n e -
i n d u c e d
w e i g h t
l o s s
o c c u r r e d
a t
n e a r l y
i d e n t i c a l
r a t e s
a t
pH
4 . 5 a n d
7 . 1 .
M y c e l i a l
a t r o p h y
c o u l d
b e
d e m o n s t r a t e d
n o t
o n l y i n t h e
m i n i m a l
m e d i u m
e m p l o y e d
i n
t h e
p r e s e n t
i n v e s t i g a t i o n ,
b u t
a l s o
w h e n
4 8 - h r - o l d
m a t s
f r o m
s t a t i o n a r y
c u l t u r e s
w e r e
t r a n s f e r r e d
e i t h e r
t o
20
s u c r o s e ,
u s e d
a s
a
s t a b i l i z i n g
medium
f o r
t h e
p r e p a r a t i o n
o f
N e u r o s p o r a
p r o t o p l a s t s
( B a c h m a n n
a n d
B o n n e r ,
1 9 5 9 ) ,
o r
d i s t i l l e d
w a t e r .
1 9 B 1
8 9 3
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C OL E P
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C H N I Q
U E F E D E R A L E D E L A
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onA
u g u s t 3 0 ,2
0 0 9
j b . a
s m. or g
D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 6/9
KINSKY
A d d i t i o n a l
c h a r a c t e r i z a t i o n
o f m l a t e r i a l s
a p p e a r -
i n g
i n t h e
m e d i u m .
T h e occurrence
o f t h e
w e i g h t
l o s s
i n
d i s t i l l e d
w v a t e r
a t n e u t r a l
p H
h a s
f a c i l i t a t e d
a c c u m u l a t i o n
o f
m a t e r i a l s l i b e r a t e d
i n
t h e
p r e s e n c e
o f
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s .
P r e l i m i n a r y
c h r o m a t o g r a p h i c
e x p e r i m e n t s
h a v e
d e m o n s t r a t e d
t h e f o l l o w i n g
i n
t h e medium
a f t e r
o n l y
3 0 m i n
i n c u b a t i o n
i n t h e
pr es e nc e
o f s a t u r a t i n g l e v e l s
o f
n y s t a t i n : n u c l e o t i d e s ,
a m n i n o
a c i d s
or
p e p t i d e s ,
p h o s p h o r y l a t e d
sugars,
f r e e
s u g a r s ,
i n o r g a n i c
p h o s p h a t e ,
a n d
p u r i n e
or
p y r i m i d i n e
b a s e s .
Thus
f a r ,
i n s u f f i c i e n t q u a n t i t i e s
h a v e b e e n
i s o l a t e d
t o
p e r m i t
d e f i n i t i v e
c h e m i c a l
c h a r a c t e r i z a t i o n
o f
t h e s e c o m p o n e n t s .
T e n t a t i v e e v i d e n c e
f o r t h e
e x i s t e n c e
o f
t h e s e
m a t e r i a l s
i n
t h e
m ed iu m
was
b a s e d
on
t h e
f o l l o w i n g
c r i t e r i a :
n u e l e o t i d e s -
c o r r e s p o n d e n c e
o f
u l t r a v i o l e t - a b s o r b i n g
and
a c i d - l a b i l e
p h o s p h a t e - c o n t a i n i n g
a r e a s i n
s e v e r a l
s o l v e n t
s y s t e m s ;
a m i n o
a c i d s or s m a l l
l ) e l ) t i d e s -
s p o t s
d e t e c t e d
w i t h
n i n h y d r i n ; p h o s p h o r y l a t e d
s u g a r s - c o r r e s p o n d e n c e
o f
a r e a s
c o n t a i n i n g
a c i d - l a b i l e p h o s p h a t e ,
a n d
r e v e a l e d
w i t h
s i l v e r
n i t r a t e
or
a c i d
a n i l i n e - d i p h e n y l a m i n e
s p r a y
i n
s e v e r a l
s o l v e n t
s y s t e m s ;
r e d u c i n g s u g a r s - s i l v e r
n i t r a t e a n d a c i d a n i l i n e - d i p h e n y l a m i n e
spray;
m
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3 . 1
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0
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2
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INCUBATION
TIME- HOURS
FIG. 4 .
E f f e c t
o f
n y s t a t i n
a d d i t i o n a t
d i f f e r e n t
t i m e s . S i x t e e n
m y c e l i a l
m a t s
were
grown
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s t a t i o n a r y
c u l t u r e s
a n d t h e n t r a n s f e r r e d t o
f r e s h
m e d i u n m ,
b u f f e r e d
w i t h
0 . 0 2
. 1
d i m e t h y l g l u t a -
r a t e , p H
4 . 5 .
A
s i n g l e
m y c e l i a l
n m a t was h a r v e s t e d
a f t e r
s h a k i n g
f o r v a r y i n g
i n t e r v a l s ,
a s
i n d i c a t e d
on
t h e a b s c i s a .
T h e a r r o w s d e n o t e t h e t i m e s
a t w h i c h
0 . 0 2 n m l o f s t o c k n y s t a t i n s o l u t i o n
( 1 n t g
per
ml o f
d i m e t h y l f o r m a m i d e )
was
a d d e d t o t h e
r
e n m a i n i n g
f l a s k s
( f i n a l
c o n c e n t r a t i o n :
0 . 8
A g / I n l ,
c a . 8 . 5
X 1 0 - 7
M ) .
T h e
c h a n g e s i n d r y
w e i g h t
( i n c r e a s e
or d e c r e a s e )
r e l a t i v e
t o
t h e
w e i g h t
o f n m a t s
a t t h e b e g i n n i n g
o f
t h e
e x p e r i m e n t
a r e
i n d i c a t e d
on
t h e o r d i n a t e .
S e e t e x t
f o r -
a d d i t i o n a l d e t a i l s .
T A B L E
3 .
E f f e c t
o f a g e
o f N e u r o s p o r a
m y c e l i u m i t i
o n
n y s t a t i n - i n d u c e d
a t r o p h y
A g e o f
c u l t u r e
( h r )
3 6
5 9
8 4
I n i t i a l
w e i g h t
( i n g ) . . . . . . . 4 6 . 7 7
8 9 . 5 0
1 0 7 . 8 8
F i n a l
w e i g h t * ( m g ) . . . . . .
.
3 7 . 9 9
7 9 5 3
9 3 . 2 4
W e i g h t
l o s s
( i m g ) . . . . . . .
8 . 7 8
9 . 9 7 1 4 6 4
W e i g h t l o s s
( )
. . . . . . . . . .
1 8 . 8
1 1 . 1
1 3 . 6
*
A f t e r
3
h o t u r s
s h a k i n g
i n
f r e s h
m e d i u m ,
b u f -
f e r e d
a t
p H
4 . 5 w i t h 0 . 0 2
M
d i m e t h y l g l u t a r a t e
a n d
c o n t a i n i n g
0 . 4 2 , u g n y s t a t i n
p e r
m l
( c a .
4 . 5
X
1 0 - 7
M ) .
W e i g h t s r e c o r d e d
a r e
t h e a v e r a g e
o f
m y c e l i a l
m a t s h a r v e s t e d
f r o m d u p l i c a t e
f l a s k s .
p u r i n e
o r
p y r i m i d i n e b a s e s - u l t r a v i o l e t
a l b s o r l ) -
t i o n .
I t
s h o u l d
b c n o te d
t h a t
s i m i l a r c o m p o u n d s ,
a l t h o u g h
i n
m u c h
s m a l l e r
a m o u n t s ,
h a v e
b e e n
d e t e c t e d
i n
z e r o - t i m e
c o n t r o l
f l a s k s
a n d
f l a s k s
s h a k e n
f o r
3 0 m i n
i n
t h e
a b s e n c e
o f a n y
a n t i -
b i o t i c s .
T h e s e r e s u l t s
p r o b a b l y r e f l e c t
t h e
i n -
a b i l i t y
t o w a s h
4 8 - h r
m y c e l i a l
m a t s
c o m p l e t e l y
f r e e o f b o u n d
m a t e r i a l
b e f o r e t r a n s f e r
t o f r e s h
m e d i u m .
T h i s
e x p l a n a t i o n
m a y
a l s o
a c c o u n t
f o r
t h e
s l o w
i n c r e a s e
i n
2 6 0
m , u
a b s o r p t i o n
o b s e r v e d
d u r i n g g r o w
t h
i n
t h e a b s e n c e
o f
a n t i b i o t i c
( F i g .
2 ) .
DISCUSSION
B e f o r e
d i s c u s s i n g t h e e f f e c t s
o f t h e
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s ,
a n
e x a m i n a t i o n
o f t h e
r e s u l t s
o b -
t a i n e d
w i t h o t h e r
c o m l ) o u n d s m i g h t
b e
a l ) l ) r o -
p r i a t e .
T h e
a b s e n c e o f
g r o w t h i n h i b i t i o n
b y
p e n i c i l l i n
a n d
c y c l o s e r i n e
w a s n o t
s u r p r i s i n g ,
i n
v i e w v
o f
t h e
e x v i d e n c e
t h a t
t h e s e
a g e n t s
i n t e r f e r e
w i t h
t h e s y n t h e s i s
o f
a s p e c i f i c c o m p o n e n t
o f
t h e
b a c t e r i a l
c e l l
w a l l
( S t r o m i n g e r ,
1 9 6 0 ) .
H o w e v e r ,
t h e
i n e f f e c t i v e n e s s
o f
c h l o r a m p h e n i c o l
a n d
p u r -
o m y c i n
c a n
n o t
b e
r e a d i l y
e x p l a i n e d ,
s i n c e
t h e s e
a n t i b i o t i c s
a r e
g e n e r a l l y
r e g a r d e d
a s
i n h i b i -
t o r s
o f
) r o t e i n
s y n t h e s i s .
R e c e n t e v i d e n c e
s u g -
g e s t s
t h a t t h i s
i n h i b i t i o n
i s
c a u s e d
b y
i n t e r -
f e r e n c e
w i t h t h e t r a n s f e r
o f
a m i n o a c i d s
f r o m
s o l u b l e r i b o n u c l e i c
a c i d
t o m i c r o s o m e s
( Y a r -
m o l i n s k y a n d l
De
L a H a b a ,
1 9 5 9 ; L a c k s
a n d
G r o s ,
1 9 5 9 ) .
A l t h o u g h
t h e r e s u l t s
o b t a i n e d w i t h
N e u r o s p o r a
m a y
r e f l e c t
e i t h e r
l a c k
o f
p e n e t r a t i o n
o r
m e t a b o l i c i n a c t i v a t i o n
o f
c h l o r a m p h e n i c o l
a n d
p u r o m y c i n ,
t h e
p o s s i b i l i t y
t h a t t h i s m o l d p o s -
s e s s e s
a m o d e
o f
p r o t e i n
s y n t h e s i s
w h i c h i s
[ V O L .
8 2
8 9 4
a t E
C OL E P
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C H N I Q
U E F E D E R A L E D E L A
U S A N N E
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0 0 9
j b . a
s m. or g
D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 7/9
POLYENE
ANTIBIOTICS
ON NEU'ROSPORA
A
NA
I<
N
+
I O D O A C E T A M I D E
- N
N
1 0 - 3
M )
-
IODOACETAMIDE
----
----
N ' - - - l
I
-F-N
L A N
p - F O l A L A N I N E
B
+
p-F0ALANINE
1 0 - 3 M )
I
C
+
N o
N 3
+ N
- N o N 3
-
( 1 0 - 3 M )
+N ~ ~ ~ + N
801
_
-N_.
-
D
7 0
-
S
UCROSE
t +
+
N \ - . , , -
6 0
-
+SUCROSE
( 2 )
E
+
CYCLOHEXIMIDE
( I O - 5
M)
V
(9
F
+ N
F (
1 0 5 M )
N
I R I D I N
- V I R
I D I N
I
3
4
5
2 3 4
5
INCUBATION TIME
-
HOURS
INCUBATION
TIME-
HOURS
FIG. 5 . E f f e c t
o f
v a r i o u s
i n h i b i t o r s
on
n y s t a t i n - i n d u c e d
w e i g h t l o s s .
T h e 4 8 - h r - o l d
m y c e l i a l
mats ( e x c e p t
e x p e r i m e n t
C )
were
t r a n s f e r r e d
t o
f r e s h
m e d i u m , b u f f e r e d
w i t h 0 . 0 2
M
d i m e t h y l g l u t a r a t e ,
p H
4 . 5 ,
c o n t a i n i n g
no i n h i b i t o r
( s o l i d c u r v e )
or i n h i b i t o r
( d a s h e d
c u r v e ) a t
t h e
c o n c e n t r a t i o n s
c i t e d i n t h e
f i g u r e .
I n e x p e r i m e n t
C ,
3 9 - h r - o l d
mats
w e r e
e m p l o y e d ;
d i m e t h y l g l u t a r a t e
was
o m i t t e d
f r o m
t h e m e d i u m ,
a n d
t h e
p H was
m a i n -
t a i n e d
a t 6 . 9
w i t h
0 . 0 2
m
o t a s s i u m
p h o s p h a t e .
I n
e x p e r i m e n t
D ,
t h e mats
were
w a s h e d e x t e n s i v e l y
w i t h
d i s -
t i l l e d
w a t e r
a n d
s u c r o s e - f r e e
m e d i u t m ,
a n d
t h e
i n h i b i t e d
m at s were
a d d e d
t o
f l a s k s
w h i c h
d i d n o t c o n t a i n
sucrose
n o r m a l l y
p r e s e n t
i n t h e
g r o w t h
m e d i u m .
N y s t a t i n
(+N)
was a d d e d
t o
f l a s k s
a t t h e
t i m e s i n d i c a t e d
b y
t h e
a r r o w s
( f i n a l
c o n c e n t r a t i o n : 0 . 8 , u g / m l ,
ca .
8 . 5 X
1 0 - 7
M i - ) .
A f t e r
s h a k i n g
f o r
v a r y i n g
i n t e r v a l s ,
t h e
a v e r a g e
d r y w e i g h t
o f
m y c e l i a l
mats
f r o m
d u p l i c a t e
f l a s k s
was
d e t e r m i n e d .
8 C
7 0
6 C
i n s e n s i t i v e
t o t h e s e
a n t i b i o t i c s
m u s t s t i l l
b e
c o n s i d e r e d .
1 \ I y c e l i a l
m a t s f o r m e d
a f t e r
4 8
h r g r o w t h
i n
t h e
p r e s e n c e
o f
n o v o b i o c i n
( 1 0 0
, i g p e r
m l
m e d i u m )
n o t
o n l y
w e i g h e d
l e s s
t h a n c o n t r o l
m a t s ,
b u t w e r e
a l s o c h a r a c t e r i z e d
b y
a p r o f u s e
f o r m a t i o n
o f
a e r i a l
h y p h a e
a n d c o n i d i a .
( T h e
m y c e l i a l
m a t s
i n
c o n t r o l
f l a s k s a f t e r
4 8
h r
s t a -
t i o n a r y
i n c u b a t i o n
w e r e
s t i l l
s u b m e r g e d ,
w i t h
no
i n d i c a t i o n
o f
s p o r u l a t i o n . )
N o v o b i o c i n - i n d u c e d
f i l a m e n t a t i o n
a n d
h y p h a l p r o d u c t i o n
h a s b e e n
p r e v i o u s l y
d e s c r i b e d
i n
b a c t e r i a ;
m a g n e s i u m
i o n
was r e p o r t e d
t o
a n t a g o n i z e
t h i s
e f f e c t ( B r o c k ,
1 9 5 6 ) .
I n
t h e
p r e s e n t
i n v e s t i g a t i o n ,
an
a t t e m p t
was
made
t o o b t a i n
c o m p l e t e
g r o w t h
i n h i b i t i o n
o f
A l e u r o s p o r a b y
l o w e r i n g
t h e
m a g n e s i u m
s u l f a t e
c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 0 5 )
o f t h e
b a s a l
g r o w t h
m e d i u m . I n s t e a d ,
i t was
o b s e r v e d t h a t d e c r e a s i n g
l e v e l s
o f
MgSO4
a c t u a l l y
r e d u c e d
t h e
d e g r e e
o f
i n h i b i t i o n
p r o d u c e d
b y
n o v o b i o c i n .
The
poor
i n h i b i t i o n
c a u s e d
b y
g r i s e o f u l v i n
( 2 0
t o
50
w i t h
1 0 0
M u g
p e r
m l
o f
m e d i u m )
was
u n e x p e c t e d ,
b e c a u s e
e a r l i e r s t u d i e s
have
s u g -
g e s t e d
t h a t
t h i s
a g e n t
was
p r i m a r i l y
a c t i v e
a g a i n s t
f u n g i
c o n t a i n i n g
c h i t i n
( B r i a n ,
1 9 6 0 ) .
N e u r o s p o r a
i s known
t o c o n t a i n
c h i t i n o u s
m a t e r i a l
i n
i t s
c e l l w a l l ,
a n d
an enzyme
s y s t e m
w h i c h
s y n t h e s i z e s
c h i t i n
h a s
b e e n d e s c r i b e d
i n
t h i s
o r g a n i s m
( G l a s e r
a n d
B r o w n ,
1 9 5 7 ) .
L a c k o f
i n h i b i t i o n was
p r o b a b l y
n o t
d u e t o
i n a c t i v a t i o n
o f t h e a n t i b i o t i c ,
s i n c e p r e l i m i n a r y
e x p e r i m e n t s
h a v e
n o t
s h o w n any
c h a n g e
i n t h e a b s o r p t i o n
s p e c t r u m
o f
g r i s e o f u l v i n
when
i t
was
i n c u b a t e d
w i t h 7 2 - h r
m y c e l i a l
m a t s .
P o l y e n e
a n t i b i o t i c s .
T h i s
i n v e s t i g a t i o n
h a s
s h o w n
t h a t
a l l
o f
t h e
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s
t e s t e d
( n y s t a t i n ,
a m p h o t e r i c i n
B ,
f i l i p i n )
c a u s e d
a
m a r k e d d e c r e a s e
i n
d r y w e i g h t
o f N e u r o s p o r a
m y c e l i a l
m a t s ,
w h i c h ,
a t e x t r e m e l y
l o w
a n t i -
b i o t i c c o n c e n t r a t i o n ,
b e g a n
i m m e d i a t e l y ,
pro-
c e e d e d
a t a c o n s t a n t r a t e ,
a n d
was
a c c o m p a n i e d
b y
t h e
a p p e a r a n c e
o f
v a r i o u s
c y t o p l a s m i c
c o n s t i t u e n t s
i n
t h e
m e d i u m . F u r t h e r m o r e , d r y
w e i g h t
l o s s
was s p e c i f i c a l l y
o b s e r v e d
w i t h t h e
p o l y e n e s
a n d was
n o t o b ta i ne d
w i t h
a n y
o t h e r
a g e n t
or
a n t i b i o t i c
( c y c l o h e x i m i d e ,
v i r i d i n )
i n h i b i t o r y
f o r N e u r o s p o r a .
S u c h
r e s u l t s
s u g g e s t
t h a t
t h e s e
c l i n i c a l l y
i m p o r t a n t
a g e n t s
p r o d u c e
80
70
60
t I -
I
w
3
85
7 5
6 5 [
6 0
50
40
8 9 5 '
9 6 1 1 ]
a t E
C OL E P
OL Y T E
C H N I Q
U E F E D E R A L E D E L A
U S A N N E
onA
u g u s t 3 0 ,2
0 0 9
j b . a
s m. or g
D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 8/9
KINSKY
t h e i r
f u n g i c i d a l e f f e c t s b y a l t e r a t i o n
o f
c e l l u l a r
p e r m e a b i l i t y ,
a n d
t h at u l t i ma t e d e a t h
o f
t h e
o r g a n i s m
i s
c a u s e d b y
l e a k a g e o f s o m e e s s e n t i a l
c o m p o n e n t ( s )
( K i n s k y ,
1 9 6 1 ) .
M a r i n i ,
A r n o w ,
a n d Lampen ( 1 9 6 1 ) s i m u l -
t a n e o u s l y
a r r i ve d a t
t h e
s a m e
c o n c l u s i o n
w h i l e
s t u d y i n g
t h e e f f e c t s
o f
s o d i u m
a n d
p o t a s s i u m
i o n s
o n
n y s t a t i n
i n h i b i t i o n o f
S a c c h a r o m y c e s
c e r e v i s i a e .
T h e s e
w o r k e r s
i n i t i a l l y
s h o w e d t h a t
n y s t a t i n
i n h i b i t e d b o t h
g r o w t h
a n d g l y c o l y s i s
a t a c i d
p H ,
a n d s u g g e s t e d
t h a t t h e a n t i b i o t i c a c t e d
d i r e c t l y
o n
e n z y m e s
o f
t h e
E m b d e n - M e y e r h o f f p a t h w a y .
S u b s e q u e n t i n v e s t i g a t i o n f a i l e d , h o w e v e r ,
t o
d e m o n s t r a t e
a n y
i n v i t r o
e f f e c t o f
n y s t a t i n
o n
g l y c o l y t i c
e n z y m e s
o f
s e n s i t i v e
y e a s t s .
M o r e o v e r ,
a t p H
7 ,
n y s t a t i n
i n h i b i t e d
g r o w t h
b u t
h a d n o
e f f e c t
o n
g l y c o l y s i s .
T h i s
a p p ) a r e n t
d i s c r e p a n c y
h a s
s i n c e b e e n
s h o w n
t o b e
i n f l u e n c e d
b y
t h e
n a t u r e
o f t h e c a t i o n s l ) r e s e n t . I f t h e
p o t a s s i u m
p h o s p h a t e - c i t r a t e
b u f f e r u s e d
i n
t h e
o r i g i n a l
e x p e r i m e n t s
w e r e
r e l ) l a c e d b y
s o d i u m
p h o s p h a t e -
c i t r a t e ,
t h e n i n h i b i t i o n
o f b o t h
g r o w t h
a n d
g l y c o l y s i s
c o u l d b e d e m o ns tr at ed
a t
pH
7 .
A t
n e u t r a l i t y
t h e
g l y c o l y t i c
i n h i b i t i o n
p r o d u c e d
b y
l o w
c o n c e n t r a t i o n s
o f
n y s t a t i n
c o u l d b e
r e v e r s e d
b y
a d d i t i o n
o f
p o t a s s i u m
i o n s .
W i t h
h i g h e r
c o n c e n t r a t i o n s
o f
n y s t a t i n ,
r e v e r s a l
wa s n o t
o b t a i n e d
w i t h
p o t a s s i u m
a l o n e ,
b u t
r e q u i r e d
a l s o
t h e
a d d i t i o n
o f
s o l u b l e
g l y c o l y t i c
c o f a c t o r s
( a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e ,
d i p h o s p h o p y r i d i n e
n u -
c l e o t i d e ,
t h i a m i n e
p y r o p h o s p h a t e )
( L a m p e n ,
p e r s o n a l
c o m m u n i c a t i o n ) .
I n e i t h e r
c a s e ,
r e v e r s a l
o f
g l y c o l y s i s
d i d n o t
p r e v e n t
t h e a l m o s t
c o m p l e t e
l o s s
o f
v i a b i l i t y
i n d u c e d
b y
n y s t a t i n .
T h e s e
o b s e r v a t i o n s
l o g i c a l l y
l e d
t o
t h e c o n c l u s i o n t h a t
n y s t a t i n
p r o d u c e d
a n a l t e r a t i o n
i n
t h e
p e r m e a -
b i l i t y
o f
S .
c e r e v i s i a e ,
a s i n d i c a t e d
b y
t h e r e v e r s a l
o f
g l y c o l y t i c
i n h i b i t i o n
b y
t h o s e
e s s e n t i a l
c o m -
p o n e n t s
w h i c h l e a k e d o u t o f
t h e
c e l l . T h e
i r r e v e r s -
i b l e
l o s s
o f
v i a b i l i t y
w a s
c a u s e d
b y
a d d i t i o n a l
l o s s
o f
m a t e r i a l
n o t
n e c e s s a r y
t o m a i n t a i n
g l y c o l y s i s .
T h e
s t r u c t u r a l u n i t
p ) r i n c i p a l l y
r e s p o n s i b l e
f o r
m a i n t e n a n c e
o f
s e l e c t i v e
p e r m e a b i l i t y
i s t h e
c e l l
m e m b r a n e ,
a n d
i t
w o u l d
b e p l a u s i b l e
t o
a s s u m e
t h a t t h i s
m i g h t
b e
t h e
l ) r i n c i p a l
s i t e
o f
p o l y e n e
a c t i o n .
( R e c e n t
e v i d e n c e
i n d i c a t e s t h a t t h e
a n t i b a c t e r i a l a n t i b i o t i c s
p o l y m i x i n
B
( N e w t o n ,
1 9 5 6 )
a n d
s t r e p t o m y c i n ( A n a n d
a n d
D a v i s , 1 9 6 0 )
a l s o
a c t
o n t h e
c e l l
m e m b r a n e a n d a l t e r
c e l l u l a r
p e r m e a b i l i t y . )
T h e
s e l e c t i v e
t o x i c i t y
o f t h e
p o l y e n e s
f o r
f u n g i
a n d
s o m e
a l g a e
w o u l d
c o n s e -
q u e n t l y
b e
d u e t o
a u n i q u e
c o m p o n e n t i n t h e
m e m b r a n e
o f
t h e s e o r g a n i s m s
w h i c h
s p e c i f i c a l l y
c o m b i n e s w i t h
t h e
p o l y e n e
a n t i b i o t i c s . I n t h e
p r e s e n t
i n v e s t i g a t i o n ,
g r o w t h
o f
N e u r o s p o r a
c o u l d b e
c o m p ) l e t e l y
i n h i b i t e d
b y
a
v a r i e t y
o f
a g e n t s w i t h o u t a l t e r i n g t h e
r e s p o n s e o f
i m y c e l i a l
m a t s t o
n y s t a t i n .
T h i s
i n d i c a t e s
t h a t d e n o v o
m e m b r a n e s y n t h e s i s i s
p r o b a b l y
n o t
i n h i b i t e d
b y
t h e
l ) o l y e n e
a n t i b i o t i c s . D i r e c t
a c t i o n o f
n v s t a t i i i
o n t h e
m e m b r a n e i s f u r t h e r
s u g g e s t e d
b y e x p e r i -
m e n t s w h i c h s h o w a r a p i d
e n l a r g e m e n t o f
i N e u r o s p o r a
l p r o t o p l a s t s
u p o n
t h e a d d i t i o n o f t h e
a n t i b i o t i c
( K i n s k y ,
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p r e s s ) .
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T h i s
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RNA-amino
a c i d
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c h e r i c h i a
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J . M o l .
B i o l . 1 : 3 0 1 - 3 2 0 .
L E D E R B E R G , J . 1 9 5 6 . B a c t e r i a l
p r o t o p l a s t s i n -
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b y p e n i c i l l i n .
P r o c .
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4 2 : 5 7 4 - 5 7 7 .
LOWRY,
0 .
H . , N.
J .
R O S E B R O I J G H ,
A . L .
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1 9 5 1 . P r o t e i n
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r e a g e r n t . J . B i o l .
Chem. 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .
A I A R I N I , F . ,
P .
A R N O W ,
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J . 0 .
LAMPEN. 1 9 ( 6 1 .
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n y s t a t i n .
J . G e n .
M i c r o b i o l .
2 4 : 5 1 - 6 2 .
N A S O N , A . ,
AND
H .
J . E V A N S . 1 9 5 3 .
T r i p h o s p h o -
p y r i d i n e - n u c l e o t i d e - n i t r a t e r e d u c t a s e i n
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c r a s s a .
J .
B i o l .
Chem.
2 0 2 : 6 5 5 - 6 7 3 .
NEWTON,
B . A .
1 9 5 6 . The
p r o p e r t i e s a n d m o d e
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p o l y m i x i n s .
B a c t e r i o l . R t e v s .
2 0 : 1 4 - 2 7 .
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D ownl o
a d e d f r om
8/10/2019 Alterations in the Permeability Of
http://slidepdf.com/reader/full/alterations-in-the-permeability-of 9/9
POLYENE ANTIBIOTICS
ON
NEUtROSPORA
P A R K , J . T . ,
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1 9 5 7 .
Mode
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a c t i o n
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B i o l o g y
o f
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L i t t l e ,
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VANDEPUTTE,
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T . S T I L -
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1 9 5 6 . A m p h o t e r i c i n s
A a n d B , a n t i f u n g a l
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II.
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N a t l . Acad
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1 9 6 1 ]
8 9 7
a t E
C OL E P
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C H N I Q
U E F E D E R A L E D E L A
U S A N N E
onA
u g u s t 3 0 ,2
0 0 9
j b . a
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D ownl o
a d e d f r om
