Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Ophthal. 177, 346--354 (1969)

Aminos~iurebestimmungen an Einzelaugen im Kammerwasser und GlaskSrper*

L. W~T,G~-Li~ss~N und W. O~E~MA~CN

Universit~ts-Augenklinik Marburg (Direktor: Prof. Dr. W. STRAYS)

Eingegangen am 18. M/~rz 1969

Determinations o/Amino Acids in Aqueous Humour and

Vitreous Body at Single Eyes

Summary. With reference to earlier automatic procedures quantitative deter- minations are possible in different compartments of a single eye by a micromethod, analysing amino acids by elution chromatography. A complete chromatographic analysis can be done with 0.1 g of vitreous body or 0.03 g of aqueous humour from rabbit or human eyes. There are significant differences of the amino acid content between vitreous and aqueous humour analogue to makromethods in rabbits. Cysteic acid and taurine in aqueous humour, glyeine, alanine and leucine in vitreous, aspartic acid, glutamic acid and phenylalanine in aqueous humour as well as in vitreous body show significant differences of concentration before and after hydro- lysis of the perchlorie extracts.

Zusammen/assu,ng. In Anlehnung an /~ltere automatisierte Verfahren kSnnen durch eine Mikromethode der elutionschromatographischen AS-Trennung in ver- sehiedenen Gewebs~eilen eines Auges Messungen vorgenommen werden. Es reichen dazu 0,1 g GlaskSrper bzw. 0,03 g Vorderkammerpunktat beim Kaninehen f/Jr ein Chromatogramm aus, das natfirlieh in analoger Weise auch beim Mensehenauge gesehrieben werden kann. Die statistische Auswertung der Befunde an Kaninchen- augen zeigt signifikante Unterschiede des AS-Gehaltes zwisehen Kammerwasser und Glask6rper in L~bereinstimmung mit ~akromethoden. Naeh Hydrolyse des mit 0,5 n HC10~ enteiweiBten Substrates treten sowohl im Kammerwasser als auch im GlaskSrper signifikante Untersehiede fiir Asparagins~ure, Glutamins/~ure und Phenylalanin auf, im Kammerwasser zusEtzlich fiir Cysteinsaure und Taurin, i m GlaskSrper ffir Glycin, Alanin und Leuein.

E ine a u t o m a t i s c h regis t r ie rende A p p a r a t u r , die Aminosi inren mi t te l s der I o n e n a u s t a u s e h e h r o m a t o g r a p h i e e x a k t bes t immt , wurde 1958 yon SPACx~A~r S~]~m und Moo~]~ besehr ieben: Das aus der Ionenaus tauscher - s/~ule t ropfende E l u a t b i lde t innerha lb eines Capi l lar rohres aus Teflon im s iedenden W a s s e r b a d bei k o n s t a n t e m Zuflug des Ninhydr in reagens eine F a r b r e a k t i o n , die kon t inu ie r l i eh pho tomet r i sch mi~tels e iner DurehfluB- kfivet~e registrier~ wurde. I tAN~IG stell~e eine/~hnlich a rbe i t ende Methode

* Der Deutsehen Forsehungsgemeinsehaft danken wit fiir die groBzfigig ge- wiihrte Sachbeihflfe.

Aminosauren im Kammerwasser und Gl~skSrper 347

vor. I n n e r h a l b yon 24 S td erm6gl ichten beide Verfahren q u a n t i t a t i v e Ana lysen eines Eiweil~hydrolysates . Rou t ine tmte r suchungen an Blu t - u n d H a r n p r o b e n b rach t en reproduz ie rbare Ergebnisse.

Da die Anforderungen an Mel]methoden bei ger ingeren P robemengen (Biopsiemater ia l , kleine Organe) steigen, wurden die Makroverh~l tn isse yon KIRSTEN u n d DAI~D:ENNE trod KII~STEN a n d KII~STEN reduzier t . A n 100--200 mg Linsenfr i schgewicht konn te eine to ta le Ana lyse ausgef / ihr t werden, dabe i wurden 30 n ich tp ro te ingebundene Subs tanzen dttrch die N i n h y d r i n r e a k t i o n en tdeck t . Die Konzen t r a t i on der Aminoss z .B. fOr Glu taminss lag be i 1 - - 2 . 1 0 - S M o l / g Linsenfr ischgewicht , bei Asparag inss be i 10 -6 Mol/g. Kn~ST~N und K_mswv,~ beschr ieben aus- f i ihrl ich zwei Verfahren der quan t i t a t i ven Chromatographie , bei denen 25 Aminoss in der GrS$enordnung yon 2 .10 -9 Mol ident i f iz ier t werden kolmten . U m Messungen in p ro te in~rmeren Geweben, wie z .B . im GlaskSrper durchzufi ihren, in dem die Aminos/~uren nach REDDY u n d K_ms~Y u m 2 - - 3 Zehnerpotenzen geringer als im LinseneiweiB konzen- t r i e r t sind, wurde in Zusammena rbe i t m i t G ~ o x die Methode yon HAN- ~ m und SPACKMA~, STwI~ und M o o ~ im Pr inz ip maBstabgereeh t ver- k le iner t . I n Zusammena rbe i t m i t der F i r m a Labot ron-MeBteehnik , Wolf ra t shausen , b a u t e n wir eine wei tgehend au toma t i s ch regis t r ierende Apparatur auf.

i u f b a u des Registrierverfahrens

Ffilhmg yon Teflons~ulen (Innendurehmesser 2 ram, Aul]endurehmesser 4 mm) mit dem sauren Kunstharzkationenaustauscher Amberlite CG 120 3 5 ~ 5 ~ fiber eine Druckflasche. Regenerieren mit 0,2 n NaOH.

S~ulenl~nge zur Trennung saurer und neutraler Aminos~uren (AS) 160 cm, zur Trennung basischer AS 60 cm. Temperatur des senkrecht aufgestellten S~ulen- mantels bei der ersten S~ule konstant ~- 50 ~ C, bei der kurzen S~iule + 25 ~ C bis nach Erscheinen yon Histidin, anschlieBend TemperaturerhShung auf -[-50 ~ C. Vorschub des Elutionsmittels (Puffer pH 3,25 und 4,25 fiir die lange S~ule, Puffer 4,20 und 5,28 ffir die kurze S~iule) mit Kolbenpumpen, deren Vorschubgeschwindig- keit 3 ml/Std, bei Ninhydrin 1,5 ml/Std be~rug. Die Pumpaggrega~e warden mit den S~ulen fiber Teflonschl~iuche yon 0 , 5 ~ , 7 mm lichter Weite verbunden. Farbent- wicklung im siedenden Wasserbad w~hrend 20--30 rain Verweildauer, dann konti- nuierliche Messung der Extinktion in einer DurehfluBkiivette bei 578 m~ am Beck- m~n-DB-Photometer. Aus ~uBeren Griinden konnte Prolin mi~ einem Maximum bei 420 m~ nieht aufgezeichnet werden. Die Kurve eines Testgemisches wurde yon W~Laa-Lt)ss~ dargestellt.

Fehlerbreite der App~atur

S P ~ c x ~ , STEI~ und MOORE trugen 0,1--3,0 ~zM einer AS auf, die Analyse dauerte 24 Std, die Fehlerbreite be~rug 4- 3 %. Bei KI~STE~ und Kn~STE~ lag diese zwisehen =L 2 bis 4- 6 %. Bei uns Zeig~en 20 AS in einer Konzentration yon 1-10-SMol (Harnstoff 10 -7 Mol), gelSs~ in 0,1 ml 0,1n HC1, typische Verteilungskurven, deren Fl~cheninhalte mit einem Aristo-Planimeter planimetriert wurden. Der Fehler der

24a Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Oph~hal., Bd. 177

348 L. W:ELG:E-L~'SS:E~/" und W. OPPER1KAlq~ :

Tabelle 1. Anzahl der Ptanimetereinheiten p r o 10 -s Mol AminosSure mit %-Fehler- breite (Aristo-Planimeter Nr. 1130 L, 1 E ----10 mm ~)

M ~: am Mittlerer Fehler (%)

CysSeins/i, ure 74 5= 3,04 4,1 Taurin 64,33 • 4,26 6,6 Asparagins~ure 60,20 =k 2,11 3,5 Threonin 64,80• 4,54 7,0 Serin 90,40 =k 10,15 11,2 Glu~amins/iure 65,00 =J= 3,45 5,3 Citrullin 100,00 =k 2,8 2,8 Glyein 71,33 • 4,12 5,8 Alanin 80,33 =k 2,51 3,1 u-Aminobutters~ure 67,75 ~= 8,01 11,8 Cystin Spur Valin 58,00 ~ 1,61 2,8 Methionin 101,33 ~= 7,09 7,0 Isoleuein 92,33 ~= 3,74 4,0 Leucin 81,60 q- 2,16 2,6 Tyrosin 72,33 ~ 1,68 2,3 Phenylalanin 81,00 + 0,8 1,0 Ornithin 87,25 =k 2,56 2,9 Lysin 73,50 =k 2,21 3,0 His~idin 63,67 • 1,76 2,8 Arginin 71,00 :t: 2,3 3,2

Me~hode schwankte bei 6 L~ufen synthetischer AS-Gemisehe zwischen • 1% bis 11,2% (Tabelle 1) und war bei den einzelnen AS untersehiedlich groB. Der mitflere Fehler lag im Bereieh der oben angegebenen Streubreiten bei ~ 3 %,

mit der Ausnahme yon Serin und ~-Aminobutters~ure. Bei hSheren AS-Konzentra- tionen bestand eine lineare Abh~ngigkeit.

Durchfiihrung der Versuehe l~ach den Effahrungen yon R~DD:r and KI~cs~r, die ohne 24stfindige 1Yahrungs-

karenz bei Kaninchen stark schwankende AS-Spiegel fanden, tSteten wir unsere Versuchstiere, die mit Ovator-SolikanJn-Futter gehalten wurden, nach der gleichen Zeit mit einem Naekensehlag. Sofor~ anschlieBend innerhalb yon 15 rain wurden nach Enueleation die Vorderkammern mit der 20er l~adel punktiert. Die durch- schnittlich aspirierte iKenge yon 0,3 ml wurde mit doppelter Menge kalter 0,5n HCIO 4 enteiweiBt. Iqaeh ErSffnung der Sklera in ttShe des ~quators wurde ca. 1,0--1,1 m] GlaskSrper gleiehfalls mit doppeltem Volumen 0,5n HCIO 4 vermischt. Zentrffugieren bei + 4 ~ C, 2500 g (9,81 m/seeS), I0 rain. Naehextraktion des Rfick- standes mit 1 ml 0,5n HCIO 4. Mit 10n KOH Neutralisation der Extrakte und Ab- trennen des Perchlorates durch erneutes Zentrifugieren. Im Rotationsverdampfer (Firma Biichi) Einengen zur Trockene und LSsung in 2 ml 0,1 n HC1. Auf~ragen yon 0,2 ml, das entsprieht einem Kammerwassergewieht von durehsehnittlieh 0,03 bzw. 0,1 g Korpusgewebe. Die Hi~]ite der gelSsten Trockensubstanz, d.h. 1 ml, wurde mit 15 ml 6 n ItCl 6 Stdlang am RiickfluBkfihler bei + 110 ~ C hydrolysier~. AnsehlieBend Einengen and LSsen in gleieher Mengenelnheit (Abb. 1).

E 0,70 [

0,10[

0'70 f

0,50[

0,30[

0,10[

0'20 f

0,30[

0,10[

0,20[

Aminoss im Kammerwasser und GlaskSrper 349

Hemstoff

L

Gtu-NH2 Asp-NH2

I ~Ser / f x l --- freie AS

J\ freie+gebundene AS

l / ~

r

f \

Vat

Leu x Met Iteu / " X

Ornithin

His

Tyr Phe

Arg

Sdulenchromatische Trennung der freien und gebundenen AS im Kammerwasser des Kc~ninchens We, Op. ,'69

Abb. l . Ss Trennung der freien und gebundenen .AS im Kammer- wasser des Kaninchens. E Ex~inktion bei 578 m~. • Bisher nicht identifizierte

ninhydrinposi~ive Substanzen

Ergebnisse und Bespreehung

Beriehte fiber AS-Messungen an Einzelaugen liegen bisher nich~ vor. WooTo~, YO~-NG und W~L~MS untersuehten den GlaskSrper einer Reihe yon Rinderaugen. BITO faBte beim Hund die korrespondierenden Mengen des vorderen und hin~eren Glask6rpers beider Augen zusammen. R~DDy und KI~S~Y bestimmten an 40Albinokaninchenaugen das Spektrum, indem die entsprechenden Flfissigkei~smengen vereinigt wurden. Bei den genannten Schwankungen des AS-Spiegels erschien es uns deshalb inCeressan$, die Ergebnisse yon 9 Einzelaugen statis~isch auszuwerten und mit Resultaten der genannten Autoren zu vergleichen. Dabei hatten wir den Vorteil, die gewiinschten Proben nich$ innerhalb yon 2 Std (REDDY und KI~S~y), sondern in 15 rain zu gewinnen. Es ist denkbar, da$ ein Teil der unterschiedlichen Ergebnisse darau~ beruhen mag. Abb. 2 un4 Tabelle 2a und b zeigen die Mittelwerte yon 18 AS aus 8 Kammerwasserpunkta~en und 9 GlaskSrpern vor und naeh saurer

24b Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Ophthal., Bd. 177

10 - 8 Mo[ AS/g GK KW 65 r

60

55

112,8

H

1 Mittetwerte des A S - Gehal tes im GK und KW vom Kaninchen

50

45

~0

35

30

25

20

15

10

' GKKW GKKW GKKW GKKW GKRW GKKW GKKW G~W GKKW GKKW GKKW GKKW GKKW GKKW GRRW G~.IgN GRKW GKKW Cysteins&ure Teur Asp Thr Ser Gtu Gly Vat Met l ieu Leu Tyr Phe Orn Lys His Arg

Abb. 2

L. W]ZLGE-LffsSE:~ und W. OPP~,~MA~r Aminos~urebestimmungen 351

Tabelte 2a. Aminosiiurekonzentrationen im Kammerwasser ( K W ) und GlaskSrper (GK) bei Kaninchen. MitteIwert und Streuung des Mittelwertes vor und nach saurer

Hydrolyse des enteiwei/3ten K W und GK. Einheiten in 10 -s Mol/g

Cysteins~iure Taurin Asparagins~ure Threonin Serin Glutamins~ure Citrullin Glycin Alanin Cystin Valin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Ornithin Lysin ttistidin Arginin

8 KW-Punktate

vor nach Hydrolyse Hydrolyse (M 4. sin) (M ~ sin)

3,40 4. 0,73 7,66 4. 1,18 7,46 4. 0,89 14,97 4.1,07 6,01 4. 0,53 22,07 4. 2,27

23,15 4. 1,56 56,31 4. 4,25

23,64 • 2,05 112,78 ~ 3,07 Spur 35,18 :[: 4,69 55,77 ~: 6,11 52,41 4. 3,33 62,33 • 2,60 Spur 23,42 4. t,86 29,59 4.1,52 14,95 :j:: 2,91 12,154. 2,26 12,50 • 1,39 13,80 • 1,03 17,34 ~ 0,76 21,64 :J: 1,67 13,09 4.1,36 15,28 :t: 1,37 10,23 • 0,74 14,63 • 0,57 11,48 t: 2,26 13,12 :[: 0,91 32,45 4. 3,18 40,93 ::j: 3,28 8,61 • 0,61 9,60 • 0,71

27,41 4.1,95 33,10 4. 1,55

9 GK

v o r Yt~tch

ttydrolyse tty&'olyse (!V[ -~ sm) (IV[ 4. sin)

1,42 4. 0,16 2,37 4. 0,60 12,38 4. 1,93 16,59 4. 2,45 1,25 ~ 0,18 7,64 4. 0,89

4,37 :[: 0,45 9,82 • 0,81

5,19 ::t: 1,00 41,73 :J: 1,78

4,15 i 0,51 11,18 • 0,78 5,26 i 0,45 8,38 -{- 0,99

3,24 4. 0,25 4,68 4. 0,54 3,904.0,78 3,894.0,83 2,44 -4- 0,33 3,30 4. 0,41 2,47 4. 0,22 4,75 ::t= 0,57 1,90 4. 0,16 4,15 4.1,22 1,25 4. 0,13 3,53 i 0,79 2,34 :J= 0,43 2,92 • 0,40 5,31 ~0,97 8,624-0,92 1,11 • 1,78• 4,24 4. 0,33 5,50 =~ 0,61

Hydrolyse. Bei einer grSl]eren statistisch ausgewerteten Anzahl yon Untersuchungen linden wir eine weitgehende Ubereinstimmung mit den Ergebnissen yon REDDY und K~swY irn GlaskSrper und in der Vorder- kammer. Beim Vergleich der Konzentrationen f/illt auf, dab die ffeien AS Asparaginsi~ure, Glutaminss Methionin, Isoleucin und Orni~hin um 1/4--1/5, Leucin, Tyrosin, Phcnylal~nin, Lysin, ttistidin, Arginin und Valin um I/7 und Glycin und Alanin um 1/~ 0 niedriger im GlaskSrper als in der Vorderkammer konzentriert sind. Lediglich Taurin macht eine Ausnahme. Diese Differenzen sind statistisch eindeutig signifikant. Bei den gesamten AS, unter denen die freien und durch Hydrolyse Irei- gesetzten, ursprfinglich gebundenen AS verstanden werden, weisen Threonin und Serin um 1/5 niedrigere Konzentrationen im GlaskSrper als im Kammerw~sser auf. Beim nichthydrolysierten Ex t rak t werden

Abb. 2. Mittelwerte des AS-Gehaltes im GlaskSrper (GK) und Kammerwasser (KW) yore Kaninchen. Schw~rzer S~ulenantefl: freie Aminos/~uren. WeiBer S~ulenanteil:

gebundene Aminos~uren

24c Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. Ophthal. , Bd. 177

352 L. W~.LG~-L~ss~ und W. O ~ N ~ :

Tabelle 2b. Irrtumswahrscheinlichkeit (in %) ]i~r die Unterschiede der AminosSure. konzentrationen

KW vor GK vor KW vor KW nach ttydrolyse l~ydrolyse Hydrolyse Hydrolyse KW nach GK nach GK vor GK nach I-Iydrolyse I~ydrolyse Hydrolyse ~ydrolyse

Cysteinsi~ure 0,5 i0 20 2,0 <0,1 Taurin < 0,1 5--10 5,0 50 Asparagins~ure < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Threonin ~ 0,1 Serin ~ 0,! Glutamins~ure < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Glycin 1--2 0,1 < 0,1 < 0,1 Alanin 2,5--5 1 < 0,1 ~0,1 Valin 2 2,5 < 0,1 ~ 0,1 Methionin 50 50 0,5--0,1 0,5--0,1 Isoleucin 50 10 < 0,1 ~ 0,1 Leucin 2,5 0,5 < 0,1 < 0,1 Tyrosin 30 10 < 0,1 < 0,1 Phenyla]anin 0,1 1 < 0,1 < 0,1 Ornithin 50 30--40 < 0,1 < 0,1 Lysin 10 2,5 < 0,1 < 0,1 Histidin 30 2,5 < 0,1 < 0,1 Arginin 5 10 < 0,1 ~ 0,1

Glutamin, Asparagin, Serin und Threonin gemeinsam yon der Saule eluierb. Naeh t tydrolyse erfolgt eine Umwandlung der S/~ureamide in die entsprechenden Monoaminodicarbons~uren, so dal~ eine Auftrennung yon Threonin und Serin mSglich ist (Gv,~ox). Ziehen ~_r wieder die Makromethode yon I~DDY und K~sv , r zum Vergleich heran, so betrag~ der Glutaminsi~urequotient GlaskSrper/Ka.mmerwasser (GK/KW) bei uns :/4, bei den genannten Autoren 1/2 i_rffolge dreifach hSherer Konzen- trat ionen im GlaskSrper. Bei s/~mtliehen welter untersuehten AS sind die Verh/~ltnisse weitgehend mit unseren kongruent. Aueh die Gesamt-AS zeigen eindeutig signifikan~e Untersehiede im Konzentrationsgehatt des Kammerwassers und der GlaskSrperfliissigkeit ~uf, mit der Ausnahme yon Taurin. Dies mag z.T. Folge der schwierigen Identi / ikation sein, da beim Anstieg yon I tarnstoff sieh beide Kurvengipfel fiberlagern kSnnen.

Naeh 6stfindiger t tydrolyse des enteiweiB~en Kammerwassers und GlaskSrpers finder sich, indem eine Irrtumswahrseheinliehkeit bis 1% verlangt wurde, ein signffikanter Anstieg yon Asparaginsihtre, Glutamin- s~ure und Phenylalanin, im Kammerwasser aul~erdem yon Cysteins~ure und Tattrin, im GlaskSrper yon Glycin, Alanin und Leucin gegeniiber diesen AS vor tIydrolyse. Bei den weiteren AS iindern sich die Konzen-

Aminos~uren im Kammerwasser und GlaskSrper 353

trationen dureh Hydrolyse nieht eindeutig. Bei der Veri~nderung der AS-Konzentrationen naeh Hydrolyse ist nach CH~IST~NSW~ und L~-~c~ die Enteiweil~ung mit verschiedenen Eiweil~fiillungsmit~eln wesentlieh. Nach Wolframsi~ure, Pikrin- und Triehloressigsi~uref~llung waren im Plasma die AS-Konzentrationen untersehiedlich. Mit unserer Perehlor- s~ureenteiwei~ung werden naeh H ] ~ s ] ~ G und LA~G Peptone nur unvoll- sti~ndig, Mueopolysaecharide jedoeh nieht ausgefiillt. Angaben fiber die Fi~llung yon Di- und Tripeptiden liegen nieht vor.

Die yon G ~ o K im enteiweil~ten Menschenserum ebenfMls erwi~hnten signifikanten Steigerungen yon Asparagins~ure und Glutamins~ure, Glyein und Phenylalanin stimmen also bis auf Glycin im Kammerwasser (p = 1--2 %) mit unseren Ergebnissen vSllig iiberein. Die Asparagin- und Glutamins~urevermehrung erkl~rt sich am glaubhaftesten dutch die hydrolytische Spaltung des Glutamins und Asparagins. Die Hippursiiure, aus Benzoes~ure nnd Glycin aufgebaut und im tierisehen Organismus weir verbreitet, kann in ihre Einzelkomponenten gespMten werden. Phenylalanin mag fiber die Oxydation zu Tyrosin und Dop~ und damit in Zusammenhang mit der Pigmentbfldung stehen. Die Cysteins~ure und Taurin sind Abbauprodukte des Cysteins, das durch Hydrolyse des Glutathions entstehen kann, sowie des Disulfides Cystin, das wir aller- dings bei unserem geringen Untersuehungsmaterial und ansehliei]ender Aufbewahrung im Tiefkfihlfach bei - -25 ~ nieht naehweisen konnten. Bei - - 2 0 ~ fanden aueh ST~IN und M o o ~ einen deutliehen Cystin- verlust iron Serum. Die Alanin- und Leucinvermehrung li~l~t sieh mSglicher: weise dureh eine SpMtung yon reaktionsfi~higen Gruppen des Hyaluron- s~uremolekfils deuten. Gemeinsam ist beiden AS naeh Transaminierung zu einer ~-Ketos~ure die oxydative Deearboxylierung zu aktivierten Fett- sauren. Angesichts der kleinen fiir die Untersuehung erforderliehen Mengen an K W und GK ist es selbstversti~ndlieh nunmehr aueh mSglieh, entspreehende Untersuehungen am Mensehenauge durchzaffihren. Wir sind dabei, solehe Bestimmungen in Zusammenhang mit best immten klinischen Veri~nderungen vorzunehmen.

Herrn Diplom-Mathematiker U. ScHuLz, Institut fiir Medizinische Statistik (Direktor Prof. Dr. P. I~M), sind wir ffir die Hilfe bei der statistischen Berechnung sehr verbunden.

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Dr. L. WnT,Gv,-L~ss~- Universit~ts-Augenklinik 3550 Marburg a.d. Lahn Robert Koch- StraBe