Caracterização de citocromo P450 monoxigenase CYP154H1 de bactéria termófila de solo Thermobifida fusca

Ana Carolina Pereira Rocha

As citocromo monooxigenases P450 pertencem à uma superfamília de hemeproteínas, encontradas em bactérias, archaeas e em eucariotos. Estas proteínas, utilizam compostos, tanto endógenos como exógenos, em reações enzimáticas próprias, enquanto substratos. Estas monoxigenases, cujo grupo heme é capaz de receber elétrons, oriundos de um cofator durante a catálise, são classificadas em grupos específicos. a depender do cofator que as doa estes elétrons. Esta família, em geral, é conservada e atua na degradação de fármacos pela hidroxilação, epoxidação de duplas ligações, pela oxidação de heteroátomos e desalquilações. Podendo assim, ser utilizada na biodegradação de alcanos cíclicos e lineares, na remediação de xenobióticos e metabólitos secundários. Na natureza, estas moléculas exercem um papel na assimilação de fontes de carbono, na desintoxicação de xenobióticos, ou ainda, na síntese de metabólitos secundários. Neste trabalho foi realizada a expressão da proteína recombinante, a purificação e caracterização da monoxigenase CYP154H1 de T. fusca. Esta enzima foi escolhida pela sua similaridade (46%) com a proteína IFM 10152 de N. farcinica (hidroxiladora de testosterona) e pela sua identidade (de 52%) com a proteína CYP154H1 (cuja estrutura tridimensional é conhecida), e ainda pela sua origem termoestável. O gene CYP154H1 foi extraído de T. Fusca por protocolo específico, e amplificado por PCR. Os genes Cam A e Cam B que codificam Pdr e Pdx respectivamente, também foram extraídos da espécie P. putida e amplificados por PCR (Pdr e Pdx são doadores de elétrons que aqui tem sua atividade testada quando da sua expressão em conjunto com CYP1541). Estes genes foram inseridos em vetores com auxílio de enzimas de restrição específicas, e posteriormente utilizados na transformação de E. coli para a expressão proteica. Após a incubação de E. coli e produção das proteínas, foi feita a extração de CYP154H1, Pdr e Pdx em metodologia específica. Para a maior eficiência na produção e purificação de CYP154H1, este gene foi subclonado em vetor de expressão contendo uma cauda de histidina. Assim, quando da expressão da proteína referente ao gene, expressou-se em sua cadeia uma cauda de histidina, a qual promoveu a afinidade da molécula à coluna de afinidade para histidina, possibilitando uma maior eficiência em sua purificação. Para a purificação foi utilizada a cromatografia gasosa e a cromatografia gasosa acoplada à espectometria de massas e HPLC. Após a extração, a concentração destas proteínas foi aferida, e sua atividade foi testada em diversos ensaios enzimáticos, incluindo o ensaio da redução do citocromo C. Foram executados ensaios enzimáticos para diversos substratos, como N-acetilindol e 3 acetilindol, além de ter sido testada ainda a oxidação de compostos sulfatados. Para os estudos cinéticos e da eficiência do acoplamento enzima-substrato, foram utilizados os substratos etilbenzeno e estireno; a medida da eficiência da reação foi dada pela aferência da formação de produto, e da oxidação do fator NADH utilizado nestas reações. A termoestabilidade e o ponto de fusão foram determinados pela atividade residual da enzima após o aquecimento, dada pela taxa de oxidação de NADH em diferentes temperaturas. Com o auxílio de doadores de elétrons (Pdx e PdR), a atividade e especificidade desta enzima frente a diversos substratos foi testada. A enzima foi capaz de converter substratos alifáticos em seus produtos quirais específicos porém foi incapaz de atuar em esteróides ou em grandes compostos aromáticos. Este resultado parece estar relacionado à incompatibilidade entre estes compostos e o sítio ativo desta molécula. CYP154H1 foi capaz de oxidar diversos sulfetos orgânicos aos sulfóxidos correspondentes de forma enantiosseletiva. Estes sulfóxidos atuam como auxiliares quirais em síntese orgânica e ainda são utilizados na confecção de fármacos pela indústria farmacêutica. CYP154H1 foi capaz de sintetizar outro composto importante utilizado como intermediário na síntese de inibidores da fosfodiesterase, ainda como bloqueador de canais de

cálcio e inibidores do HIV, o 3-oxo-N-acetilindol, produzido a partir de N-acetilindol. Para esta molécula, foi determinada a temperatura de fusão de 65 ºC, resultado foi esperado devido à origem termófila desta molécula. Após o aquecimento a esta temperatura por 10 minutos, a enzima ainda preservou 54% da sua atividade inicial. Esta enzima é mais estável quando comparada aos citocromos monoxigenases oriundos de organismos mesofílicos. Foi constatada uma grande diferença entre as taxas de formação de produto e as taxas de oxidação de NADH medidas para etilbenzeno e estireno, a qual pode estar associada à transferência de elétrons de Pdx para P450, uma vez que as monooxigenases que naturalmente agem em conjunto com Pdx e Pdr tem compartilham apenas 26% de identidade com P450. Os substratos utilizados também podem ser a causa do acoplamento inadequado, uma vez que não são originais da enzima. Assim, pode-se dizer que a enzima CYP154H1 de T. fusca constitui uma nova monooxigenase P450 de característica moderadamente termoestável, facilmente expressa em E. coli com elevado rendimento. Esta enzima pode ser considerada um promissor biocatalisador para reações oxidativas, capaz de produzir diversos componentes importantes industrialmente. Ainda, a estereoseletividade é um ponto a ser estudado nesta enzima, e para este fim podem ser empregados estudos de engenharia de proteínas ou métodos de evolução dirigida.