ANALİTİK KİMYA

LABORATUVAR FÖYÜ 3 Enstrümental Analizler

Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı

Analitik Kimya Laboratuvarı

1

İçindekiler SPEKTROFOTOMETRİ ........................................................................................................................ 1

KOLORİMETRİ ..................................................................................................................................... 4

FLORESANS SPEKTROSKOPİSİ ........................................................................................................ 7

POLARİMETRİ .................................................................................................................................... 12

REFRAKTOMETRİ ............................................................................................................................. 16

KROMATOGRAFİYE GİRİŞ .............................................................................................................. 20

KAĞIT KROMATOGRAFİSİ VE İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ ....................................... 24

YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ .................................................................. 31

VOLTAMETRİ VE POLAROGRAFİ .................................................................................................. 37

KONDÜKTOMETRİK TİTRASYON (İLETKENLİK TİTRASYONU) ............................................ 40

1

SPEKTROFOTOMETRİ

• Spektrofotometri, dalga boyunun bir fonksiyonu olarak bir maddenin transmittans

(geçirgenlik) / absorbans özelliklerini inceleyen bilim dalıdır.

• Işık enerjisinin absorbsiyonuna dayalı bir yöntemdir. Işık elektromanyetik bir

radyasyondur ve frekansı (v) veya dalga boyu (λ) ile karakterize edilir.

• Işık enerjisi; E = h.v veya E = h.c/ λ olarak verilir. Bu eşitliklerde, h (Planck sabiti) =

6,62×10-27 erg.s ve c = 3×1010 cm/s’dir.

• Işık; atom, iyon ve moleküller tarafından absorbe edilebilir. Absorbe edilen enerji,

elektronların düşük enerjili orbitallerden (temel hal) daha yüksek enerjili orbitallere

(uyarılmış hal) geçmesine neden olur. Bir enerjinin absorblanması için iki enerji

seviyesi arasındaki farka eşit olması gerekir.

Şekil 1. Işığın elektromanyetik spektrumu

• Hangi spektrum bölgesinde olursa olsun belli bir dalga boyundaki ışığın absorbsiyonu

enerjiyi absorbe etme kapasitesine sahip bir yapının varlığının göstergesidir.

Absorbsiyon miktarının dalga boyunun bir fonksiyonu olarak kaydedilmesi sonucunda

absorbsiyon spektrumu meydana gelir.

• UV ve görünür bölge (UV/GB) spektrumunda, absorbanslar dalga boyuna karşı

grafiğe geçirilir ve absorbsiyonun en yüksek olduğu dalga boyunda bir maksimum

görülür (λmax). İnfrared spektrumunda ise % transmittans’lar dalga boyuna karşı

grafiğe geçirilir ve absorbsiyonun en yüksek olduğu dalga boyunda bir minimum

görülür.

• Işık absorbsiyonu spektrofotometre ile ölçülür. Bu ölçüm atom, iyon veya molekül

üzerine gönderilen ışığın şiddeti (I0) ile geçen ışığın şiddeti (I) arasındaki farkın

ölçümü şeklindedir.

• % Geçirgenlik (T) = I/I0 Absorbans (A) = log (I0/I)

2

Lambert – Beer Yasası;

• Absorbans (A) ile derişim (C) ve ışığın numune içinde aldığı yol (l) arasındaki ilişkiyi

açıklar.

• A = k . l . C

• k absorbtiviteyi ifade etmektedir ve derişim g/L olarak verildiğinde kullanılır. Derişim

mol/L (M) cinsinden veriliyorsa, k katsayısı ε (molar absorbtivite) ile gösterilir. ε

maddenin cinsine ve dalga boyuna bağlıdır.

UV/GB Spektrofotometrisinde Cihaz Bilgisi:

• Işık kaynağı

• Monokromatör (Dalga boyu seçici)

• Numune kabı (küvet)

• Dedektör

• Kaydedici

Şekil 2. Spektrofotometre cihazının şematik gösterimi

Spektrofotometrinin kullanım alanları;

• Kalitatif analiz

• Kantitatif analiz

• Denge sabitinin tayini

• Molekül ağırlığının belirlenmesi

• Kinetik çalışmalar

• Fotometrik titrasyon

Numune

haznesi Işık Kaynağı

Ded

ektö

r

Dalga boyu seçici

Kaydedici

(Bilgisayar)

Prizma

3

Kantitatif analiz;

• Lambert – Beer yasasına dayanır.

• Derişimleri bilinen bir seri hazırlanarak absorbansları saptanır.

• Derişime karşı absorbans değerleri bir grafiğe geçirilerek bir doğru çizilir.

• y=mx+n formülü sayesinde bilinmeyen derişim bulunur.

Spektrofotometrik kafein tayini;

• Öncelikle 5 mg saf kafein tartılarak 50 mL su içerisinde çözülür. Elde edilen

çözeltinin derişimi 100 µg/mL’dir. Ardından bu çözeltiden gerekli seyreltmeler

yapılarak her biri 10 mL olacak şekilde 4.0, 8.0, 12, 16 ve 20 µg/mL kafein çözeltileri

hazırlanır (seyreltme hesaplamaları öğrenciler tarafından yapılacaktır).

Spektrofotometrede dalga boyu aralığı olarak 400-200 nm seçilir. Standart çözeltilerin

spektrumlarında en yüksek absorbansın gözlendiği 272 nm’deki absorbanslar

ölçülerek not alınır. Bu verilerden hareketle doğrusal regresyon denklemi elde edilir

ve bu denklem daha sonra derişimi bilinmeyen numunelerin tayini için kullanılır.

• Derişimi bilinmeyen kafein içeren numunenin absorbans değeri aynı cihaz

parametreleri kullanılarak ölçülür ve doğrusal regresyon denkleminden faydalanılarak

numunenin derişimi hesaplanır.

4

KOLORİMETRİ

Işığın dalga boyunun 400-800 nm aralığında olan bölgesi görünür bölge olarak tanımlanır.

İnsan gözü bu dalga boyuna sahip ışığı algılayabilir. Bu algı renk olarak ifade edilir ve göze

gelen ışığın içerdiği dalga boylarına göre değişir. Beyaz ışık bu aralıktaki bütün dalga

boylarını içermektedir. Bir nesne beyaz ışığın belirli dalga boylarını absorbladığında geriye

kalan dalga boyları o nesnenin rengini oluşturur. Örneğin 420-440 nm civarındaki ışığı

absorbe eden bir nesnenin rengi sarıdır. Görünür bölgedeki hiçbir dalga boyunu absorbe

etmeyen nesneler beyaz görünürken, bütün dalga boylarını absorbe eden nesneler ise siyah

görünürler. Maddelere gelen ışınlar ya absorblanırlar (ardından maddde floresans yapabilir),

ya maddeye çarparak saçılırlar ya da herhangi bir etkileşime girmeden maddenin içerisinden

geçerler. Maddenin absorblamadığı ışınlar (floresans durumunda emisyon yapılan ışınlar da

dahil edilir), maddenin rengini oluştururlar. Dolayısıyla maddelerin ışık absorbsiyonuyla rengi

arasında bir ilişki vardır. Aşağıdaki tabloda absorblanan dalga boyu aralığı ile renk arasındaki

ilişki verilmiştir. Buna göre bir maddenin rengine bakarak aşağı yukarı hangi dalga boylarını

absorblayabileceğini anlayabiliriz.

Tablo 1. Absorblanan ışık ile görünen renk arasındaki ilişki

Absorblanan ışık (nm) Absorblanan renk Görünen renk

380-420 Mor Sarı-yeşil

420-440 Mor-mavi Sarı

440-470 Mavi Turuncu

470-500 Mavi-yeşil Kırmızı

500-520 Yeşil Eflatun

520-550 Sarı-yeşil Mor

550-580 Sarı Mor-mavi

580-620 Turuncu Mavi

620-680 Kırmızı Mavi-yeşil

680-780 Eflatun Yeşil

Maddelerin renklerini kullanarak günlük hayatta çeşitli analizler yaparız. Örneğin bir gıdanın

bozulup bozulmadığını hatta lezzetli olup olmadığını anlamamızda renk bize fikir verebilir.

Çayın rengi bize çayın ne kadar demli olduğu dolayısıyla çaya tadını veren maddelerin hangi

miktarda olabileceği ile ilgili fikir verir. Maddelerin rengine bakarak nitel analiz

5

yapabileceğimiz gibi renk yoğunluğu kullanılarak nicel analiz de yapmak mümkündür. Çünkü

maddelerin renk yoğunluğu ile maddenin derişimi orantılıdır. Maddenin rengi kullanılarak

yapılan analize kolorimetri adı verilir.

Kolorimetrik ölçümler laboratuvarlarda genellikle spektrofotometreler kullanılarak absorbans

ölçümleri üzerinden dolaylı olarak yapılır. Ancak renk ölçümlerinin çok önemli olduğu

sektörlerde (giyim gibi) doğrudan renk şiddeti ölçen kolorimetre cihazları kullanılır. Ayrıca

görüntülerden renk şiddetlerini ölçebilen yazılımlar da mevcuttur ve bu sayede bilgisayar ve

cep telefonları kullanılarak kolayca kolorimetrik ölçümler yapılabilir.

Kolorimetrik Fe3+ Analizi

Bu deneyde bir Fe3+ numunesinin derişimini kabaca bulabilmek için gözle tayin yapılacaktır.

Bu yöntemde, tayini yapılacak örneğin derişimi belli standart çözeltileri hazırlanarak bunların

renk şiddetleri numuneninki ile karşılaştırılır. Karşılaştırma işlemlerinde örnek çözeltinin

renginin standart serideki çözeltilerin renkleriyle uyumu gözlenerek derişimi saptanır. Bu

yöntem çok hassas sonuçların gerekmediği ve basit analizlerin yeterli olacağı durumlarda

kullanılabilir.

Fe3+ içeren bir numunenin kolorimetrik analizi için,

Fe3+ standartları:

• 0.006 g FeCl3.6H2O bileşiği tartılarak üzerine 3 mL derişik HCl ilave edilir ve hacim

50 mililitreye saf su ile tamamlanarak standart Fe3+ çözeltisi hazırlanır.

• Bu çözeltiden 1’den 5’e kadar numaralandırılmış tüplere sırasıyla 1, 2, 3, 4 ve 5 mL

alınır ve saf su ile 10 mL’ye seyreltilir.

Fe3+ numunesi:

• 10 mL numune bir başka test tüpüne alınır.

K4[Fe(CN)6].3H2O çözeltisi:

• Fe3+ ile reaksiyona girerek renkli ürün oluşturacak olan potasyum ferrosiyanür

çözeltisinden 3,0 mM 10 mL hazırlanır.

6

Deney:

• Her bir tüpe (standartlar ve numune) 1’er mL potasyum ferrosiyanür ilave edilerek

tüpler iyice çalkalanır.

• Standartların bulunduğu tüplerde mavinin değişik tonlarında koyulaşan renkli bir

kalibrasyon dizisi elde edilir. Fe3+ içeren numunenin renginin hangi standartlar arasına

karşılık geldiği belirlenir. Buna göre numune içerisindeki Fe3+ ün derişiminin hangi

aralıkta olduğu bulunur. (Molekül Ağırlıkları: K4[Fe(CN)6].3H2O = 422,39 g/mol,

FeCl3.6H2O=270,30 g/mol, Fe = 55,85 g/mol)

4 FeCl3 + 3 K4[Fe(CN)6] → Fe4[Fe(CN)6]3 + 12 KCl

Prusya mavisi

7

FLORESANS SPEKTROSKOPİSİ

Atomların veya moleküllerin en kararlı hallerinde, elektronlar farklı enerji seviyelerindeki

orbital bölgelerinden en düşük enerjili olanlarını doldururlar ve bu hale en düşük enerjili hal,

kararlı hal veya temel hal adı verilir. Temel haldeki bir türe dışarıdan bir enerji verildiğinde

elektronlar bu enerjiyi absorblayıp daha yüksek enerjili orbitallere geçiş yapabilirler. Bu

durumdaki türler kararsızdır ve bu hale uyarılmış hal adı verilir. Uyarılmış haldeki kararsız

türler absorbladıkları bu enerjiyi çeşitli yollarla vererek kararlı hale dönerler. İşte bu enerji

yayımının ışık şeklinde olmasına lüminesans denir ve bu ışığı inceleyen bilim alanına da

lüminesans spektroskopisi1 denir. Lüminesans, uyarılmış haldeki elektronun spinine bağlı

olarak farklı iki mekanizmayla gerçekleşir; floresans ve fosforesans. Eğer uyarılmış halde,

yüksek enerjili orbitallere geçiş yapmış elektronun spini temel seviyede bulunan elektronla

ters yönde ise bu hale singlet hal denir (Şekil 3). Tersi durumda, yani yüksek enerjili orbitale

geçiş yapmış elektronla temel seviyede bulunan elektronla aynı yönde ise bu hale triplet hal

adı verilir (Şekil 3).

Şekil 3. Temel hal ve uyarılmış haldeki elektronların alabileceği bazı durumların şematik

gösterimi

Moleküller veya atomlar uyarıldıklarında genellikle temel singlet halden uyarılmış singlet

hale geçiş yaparlar ve uyarılmış singlet haldeki bu tür enerjisini çok kısa bir sürede (~10

nanosaniye) ışık şeklinde yayar ve bu olaya floresans adı verilir. Floresans olayı günlük

hayatta floresan ve neon lambalarda, fosforlu kalemler gibi malzemelerde kullanıldığı gibi

bazı akrep, mercan ve mantar türlerinde de doğal olarak gözlemlenebilir.

Daha az görülen bir hal olan uyarılmış triplet halden temel hale dönüş görece daha uzun

sürede gerçekleşir (1 milisaniyeden 1 saniyeye kadar) ve bu olaya fosforesans adı verilir.

Bazı moleküllerin çok daha uzun sürelerde fosforesans yaptığı gözlemlenmiştir. Örneğin

karanlıkta parlayan oyuncaklar, lamba anahtarları gibi materyallerde uzun süreli fosforesans

1 Spektroskopi ışık ile maddenin etkileşimini inceleyen bilim dalıdır.

Temel

singlet hal

Uyarılmış

singlet hal

Uyarılmış

triplet hal

8

gözlemlenir. Ayrıca doğal olarak bazı deniz anası, yengeç, ahtapot türleri gibi deniz

canlılarında da fosforesans gözlenir.

Lüminesans olayında türlerin uyarılması için gerekli enerjinin sağlandığı kaynakla ilgili

lüminesans farklı isimler alabilir. Örneğin molekülleri uyarmak için ışık enerjisi

kullanıldığında fotolüminesans, elektrik enerjisi kullanıldığında elektrolüminesans, kimyasal

reaksiyon enerjisi kullanıldığında kemilüminesans, canlılardaki biyomoleküller

kullanıldığında biyolüminesans gibi isimler verilir.

Uyarılmış türler temel hale dönüş sırasında absorbladıkları enerjiyi ışımalı şekilde

kaybedebildikleri gibi (floresans ve fosforesans) ışıma yapmadan da kaybedebilecekleri çeşitli

mekanizmalar mevcuttur ve bu enerji kaybı genellikle ışımalı ve ışımasız çeşitli

mekanizmaların karışımı şeklinde gerçekleşir. Işımalı mekanizmalar ne kadar baskınsa o

kadar çok floresans veya fosforesans gözlemlenir. Tersi durumda ise floresans ve/veya

fosforesans gözlemlenmeyebilir. Işımasız durulma mekanizmalarında genellikle uyarılmış

elektron titreşimsel seviyeler arasındaki geçişleri kullanarak enerjisini ısı şeklinde kaybeder.

Floresans yayılımında moleküller, ışımasız durulmalar nedeniyle absorbladıkları enerjiden

daha düşük bir enerji yayarlar. Bu yüzden floresans spektroskopisinde moleküle yollanan

ışığın dalga boyundan daha uzun dalga boylarında floresans gözlemlenir2. Bu daha yüksek

dalga boylarına kayma olayına Stokes kayması adı verilir.

2 Fotonun enerjisi ile ilgili Planck eşitliği: E = hc/λ

burada E fotonun enerjisi, h Planck sabiti, c ışığın hızı ve λ ışığın dalga boyudur. Eşitlikten de anlaşılacağı gibi

ışığın dalga boyuyla enerjisi ters orantılıdır yani daha yüksek dalga boylarında ışık daha az enerjiye sahiptir.

İnsan gözü 400-800 nm arasındaki “görünür bölge” olarak adlandırılan ışığı görebilir. Bu bölgeden daha kısa

dalga boylarına sahip olan sırasıyla ultraviyole, X-ışınları ve gama ışınları bölgeleri giderek artan enerjiye

sahiptirler. Öte yandan görünür bölgeden daha uzun dalga boylarına sahip sırasıyla kızılötesi, mikrodalga ve

radyo dalgaları bölgeleri giderek azalan enerjiye sahiptirler.

9

Floresansı belirleyen temel faktör moleküler yapıdır ve bir molekülün floresans emisyonu

yaptığı ışığın dalga boyundan yararlanarak o maddenin ne olduğuyla ilgili fikir edinmek

mümkün olabilir. Dolayısıyla floresans spektroskopisi kalitatif analizlerde bilgi sağlayabilir.

Floresansı belirleyen temel şey moleküler yapı olsa da kullanılan çözücü, sıcaklık, pH,

çözünmüş oksijen gibi dış faktörler de floresans şiddetini etkilerler. Seyreltik çözeltilerde bir

molekülün derişimi ile floresans şiddeti arasında doğru orantı kurulabilir:

F = k C

Burada F floresans şiddeti, k floresans sabiti ve C maddenin derişimidir. Bu eşitlik bize

seyreltik çözeltilerde floresans şiddeti ölçümlerinden yararlanarak kantitatif analiz

yapılabileceğini göstermektedir.

Floresans spektroskopisinde kullanılan cihazlar, UV-görünür bölge absorbsiyon

spektroskopisinde kullanılan cihazlara benzemekle birlikte bazı farklar mevcuttur. Öncelikle

absorbsiyon spektrofotometrelerinde maddeye gönderilen ışığın absorblanmadan geçen kısmı

ölçüldüğü için ışık kaynağı, numune ve dedektör aynı doğrultuda yerleştirilirler. Floresans

spektrofotometrelerinde ise numunenin absorbladığı ışınları daha sonra yayması ölçülmek

istendiği için dedektör numune haznesine 90o açıyla yerleştirilir. Böylece ışık kaynağından

çıkan ve numune tarafından absorblanmayan ışınlar detektöre ulaşmaz, sadece numune

tarafından yayılan floresans ölçülür. Numuneye gidecek ışığın ve numuneden yayılan ışığın

dalga boylarını seçmesi için hem numuneden önce hem de numuneden sonra bir dalga boyu

seçici (genellikle monokromatör) kullanılır.

10

Bir floresans spektrofotometresinin şematik gösterimi aşağıdaki gibidir:

Şekil 4. Floresans spektrofotometresinin şematik gösterimi

SPEKTRTROFLORİMETRİK RİBOFLAVİN (B2 VİTAMİNİ) TAYİNİ

Öncelikle 2,5 mg saf riboflavin tartılarak 50 mL asetik asit çözeltisi (0,02 M) içerisinde

çözülür (Çözünme uzun sürebilir ve ısıtarak veya ultrasonik banyo kullanılarak çözünme

işlemi hızlandırılabilir, ısıtılacaksa ısıtmaya uygun bir cam malzeme kullanılmalıdır!). Elde

edilen çözeltinin derişimi 50 µg/mL’dir. Ardından bu çözeltiden gerekli seyreltmeler

yapılarak her biri 10 mL olacak şekilde 0,2; 0,5; 1,0; 1,5 ve 2,0 µg/mL riboflavin çözeltileri

hazırlanır (seyreltme hesaplamaları öğrenciler tarafından yapılacaktır). Floresans

spektrofotometresi cihazında uyarma dalga boyu olarak 450 nm ve emisyon aralığı olarak ise

90o

Numune haznesi Işık Kaynağı

Dedektör

Dalga boyu seçici

Dalga boyu seçici

Kaydedici

(Bilgisayar)

Prizma

11

460 - 800 nm aralığı seçilir. Slit aralıkları 5 nm ve fotoçoğaltıcı tüp voltajı olarak ise 700 V

seçilecektir. Standart çözeltilerin floresans emisyonu spektrumlarında en yüksek floresans

şiddetleri olan 526 nm’deki şiddet ölçülerek not alınacaktır. Bu verilerden hareketle doğrusal

regresyon denklemi elde edilecek ve bu denklem daha sonra derişimi bilinmeyen numunelerin

tayini için kullanılacaktır.

Derişimi bilinmeyen riboflavin içeren numunenin (multivitamin tabletleri, enerji içecekleri

vs) floresans şiddeti aynı cihaz parametreleri kullanılarak ölçülür ve doğrusal regresyon

denkleminden faydalanılarak numunenin derişimi hesaplanır.

12

POLARİMETRİ

Polarize ışık düzlemini sağa veya sola çeviren maddelere optikçe aktif maddeler denir.

Bunlardan polarize ışık düzlemini sağa çevirenlere dekstrojir, sola çevirenlere ise levojir

denir. Sağa çevirenlerin önüne (+), sola çevirenlerin önüneyse (-) konur.

Optikçe aktif bileşikler, biri diğerinin ayna görüntüsü olan iki tür molekül oluştururlar. Ayna

simetrisinde olan bu iki molekül birbiri üzerine çakışmaz. Bu şekilde birbirinin ayna

görüntüsü olan moleküllere optik izomer adı verilir. Bir maddenin optik izomerisinin olması

için asimetrik karbon atomunun olması gerekir.

D (dekstrojir)-gliseraldehitte -OH grubu sağda, L(levojir)-gliseraldehitte ise -OH grubu

soldadır.

POLARİMETRE

Polarize ışık düzleminin döndürme açısını ölçmek için kullanılan cihazlara polarimetre denir.

Polarimetre, molekül boyutları ile derişim miktarı tayininde ve gıda maddelerinin

kontrollerinde kullanılır.

Polarimetre, biri sabit diğeri düşey bir düzlemde dönebilen iki kutuplayıcıdan meydana gelir.

Kutuplayıcı olarak kullanılan Kalsit kristallerinden sabit olana polarizör, dönebilene ise

analizör denir. (Polarizör, tanımlanmamış elektromanyetik dalgalardan oluşan bir ışın

demetini tanımlanmış bir polarizasyona sokan bir alettir).

Işık, polarizörden girip kutuplanarak analizör üzerine düşer. Analizörden ışık geçtiğinde araya

konan madde ışığın kutuplanma düzlemini çevirir. Çevirme miktarı, analizörü tekrar ışık

geçmeyecek şekilde döndürerek bulunur. Böylece maddelere ait değişik çevirme açıları

bulunabilir. Bu açılar optikçe aktifliğin miktarını gösterir.

13

Şekil 5. Polarimetrenin şematik gösterimi

ÇEVİRME AÇISINA ETKİ EDEN FAKTÖRLER;

• Sıcaklık

• Kullanılan ışığın dalga boyu (dalga boyu ne kadar küçükse çevirme açısı o kadar

büyük olur).

• Işığın içinden geçtiği yolun uzunluğu

• Maddenin yapısı

• Maddenin derişimi

Polarimetride metodun amacı ölçülen çevirme açısından yararlanarak derişim tayin etmek

olduğuna göre, yapılacak iş derişim dışındaki faktörleri sabit tutup derişimle çevirme açısı

arasında bir bağlantı kurmaktır.

Asimetrik karbon atomuna bağlı bileşik aynı zamanda optikçe aktiftir.

Optikçe aktiflik, bir cismin polarize ışığı kendi düzleminden saptırma kabiliyetidir.

Düzlemsel polarize ışık ile asimetrik organik veya inorganik bileşikler etkileştiği zaman ,

polarize ışığın düzlemi açısı değiştirir.

Açı değişimi sonucu polarize ışığın düzlemi saat yönünde yani sağa çevrilmişse bu

çevrilmeye dekstro (+), tersine çevrilmişse levo (-) çevrilme denir.

14

Optikçe aktif maddelerin polarize ışığın yönünü sağa ve sola çevirenlerin her birisine

birbirinin enantiyomeri denir.

POLARİMETRE İLE YAPILAN TAYİNLER

• Molekül boyutlarının tayini,

• Madde derişiminin tayini,

• Gıda maddelerinin kontrolleri,

• Bilimsel araştırmalarda üretilen maddelerin saflık tayini,

POLARİMETRENİN KULLANIM ALANLARI

• Eczacılık; Üretilen ilaçların içindeki optikçe aktif bazı bileşiklerin derişimini ölçmek

için kullanılır.

• Kozmetik Sanayi; Kullanılan esansların ve aromatik yağların denetlenmesinde ve

kalite kontrolünde kullanılır.

• Gıda Sanayi; Üretilen gıdaların kalite kontrolünde ve katkı maddelerinin alt ve üst

sınırlarının belirlenmesinde kullanılır. Genellikle şeker bulunduran gıdalarda

maddelerin optik aktifliğinden yararlanılır.

GLUKOZ MONOHİDRAT TAYİNİ

• 1 M stok çözelti hazırlanır. (19,817 g glukoz monohidrat tartılıp suda çözülür ve 100

mL’lik balon jojede 100 mL’ye tamamlanır)

• Bu stok çözeltiden hareketle 0,1 M, 0,15 M, 0,20 M, 0,25 M ve 0,50 M standart

çözeltiler hazırlanır.

• Derişimi bilinmeyen numune size sorumlu asistanınız tarafından verilecektir.

• Küçük tüp hava kabarcığı kalmayacak şekilde saf su ile doldurulur ve cihazın okuma

bölmesinin tam ortasına yerleştirilip kapak kapatılır. Cihazın mikroskop deliğinden

bakılarak çift bölmelerin rengi eşitlenir. Eğer sağ taraftaki bölme koyu ise renk

eşitleninceye kadar LEFT tuşuna, sol taraftaki bölme daha koyu ise renk eşitleninceye

kadar RIGHT tuşuna basılır. Yani R ve L tuşlarına basılarak ayarlanır. Renkler

eşitlendiği anda ZERO SET tuşuna basılır. Ekranda kırmızı renkli sıfır sayısı çıkar.

Daha sonra okutulacak numuneler tüpte hava kabarcığı kalmayacak şekilde okuma

15

bölmesine konulur. Mikroskop camından bakılarak çift bölmenin renkleri eşitlenir ve

ekranda görülen kırmızı sayılar kaydedilir.

• Kaydedilen değerler derişime karşı grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafiği oluşturulur

ve regresyon denklemi hesaplanır. (Excel programından yararlanılabilir)

• Verilen numune de aynı şekilde ölçülür ve elde edilen değer regresyon denkleminde

yerine konarak numunenin derişimi hesaplanır.

16

REFRAKTOMETRİ

Refraktometri, maddelerin ışığı kırma(refraction) özelliğinden yararlanılan enstrümantal

analiz yöntemlerinden biridir. Kırılma indisinin tayininde kullanılan aletlere refraktometre

denir.

Kırılma indisi (refraktif indeksi), maddenin kaynama noktası, erime noktası, yoğunluğu gibi

fiziksel özelliklerinden birisidir ve her maddeye özgü bir kırılma indisi vardır.

Bu özellikten yararlanılarak maddelerin tanınması ve kırılma indisi ile konsantrasyon

arasındaki ilişkiden yararlanılarak hem kalititatif hem de kantitatif analiz yapılabilmektedir.

Kırılma İndisi:

Bir maddenin kırılma indisi, bir ortamdan diğerine geçen paralel ışın demetinin yönündeki değişikliğin

(kırılma) saptanmasıyla tayin edilir.

Bir maddenin kırılma indisi, kullanılan ışımanın dalga boyuna, sıcaklığa ve derişime ve basınca

bağlıdır.

Kırılma indisi genellikle saydam cisimlerde ölçülür. Örneğin, organik sıvıların kırılma indisi 1.25 ile

1.80 arasında değişirken, katılarda bu değer 1.3 ile 2.5 arasındadır.

Işının geliş açısı, ışının hızı ve kırılma indisi ile orantılıdır. Işının geliş ve yansıma açılarının bilinmesi

durumunda, iki ortamın kırılma indislerinin oranları bulunabilir. Ya da bir ortamın kırılma indisini

biliniyorsa, diğer ortamın indisini de bu bağıntı sayesinde hesaplanabilir.

r

i

Gelen Işın

Kırılan Işın

1. ortam

2. ortam

17

Snell Yasasına göre;

Işının bir ortama geliş açısı i, yansıma açısı r dersek eğer,

𝑠𝑖𝑛 i

𝑠𝑖𝑛r=

𝑣1

𝑣2=

𝑛2

𝑛1

v1: Işının 1. ortamdaki hızı

v2: Işının 2. ortamdaki hızı

n1: 1. ortamın kırılma indisi

n2: 2. ortamın kırılma indisi

Kırılma indisleri farklı olan bölgelerde ışının hareketi şu şekilde gerçekleşir:

• Işın, az yoğun ortamdan çok yoğun ortama geçerken hangi açı ile gelirse gelsin normale

yaklaşarak kırılır ve ikinci ortama geçer.

• Işınlar çok yoğun ortamdan az yoğun ortama geçerken ışının, normalle yaptığı açı büyür. Geliş

açısını yavaş yavaş arttırdığımızda, kırılma açısı da buna paralel olarak yavaş yavaş büyür.

• Açı arttırma işlemine devam edildiğinde, öyle bir noktaya gelinir ki, artık gelen ışınlar, iki

ortamı ayıran yüzeye paralel olarak yoluna devam eder. Yani kırılma açısı 90 °olur. Böylece,

gelme açısına sınır açısı(kritik açı) denir.

• Snell yasasından yararlanarak şöyle bir bağıntı yazabiliriz:

• 𝑠𝑖𝑛𝜃𝑐 =𝑛2

𝑛1

• Işının kritik açıdan daha küçük bir değerle gelmesi halinde, yansıma sonucu aydınlık bölge

oluşur.

• Eğer ışın sınır açısından daha büyük açıyla gelirse ikinci ortama geçemez ve geldiği ortama

normalle eşit açı yaparak geri döner. Buna da tam yansıma denir.

• Burada sınır açısının oluştuğu yerden itibaren kuvvetli (karanlık) bir bölge oluşur. Aydınlık ve

18

karanlık bölgeyi ayıran çizgeye göre kırılma indisi hesaplanır.

Abbe Refraktometresi

Abbe refraktometresi en uygun ve en çok kullanılan refraktometredir. Abbe refraktometresinde iki

prizmanın arasına kırılma indisini tayin edilecek maddeyi sıvı film olarak yerleştirilir.

Refraktometri cihazının içerisinde prizmalar kullanılır. Gönderdiğimiz ışın örnekten geçip

prizmaya değişik açılarla gelir.

Gelen açı kritik açıdan küçükse aydınlık bölge oluşur. Gelen açı kritik açıdan büyükse

karanlık bölge oluşur. Karanlık ve aydınlık bölgenin sınırı kritik açıya karşılık gelir.

Kırılma İndisi Ölçümünün Kullanıldığı Yerler

• Kırılma indisi E.N ve K.N. gibi bir kimyasal türün belirlenmesinde kullanılan sabitlerdendir.

• Endüstride saflık kontrolünde kullanılır. Kırılma indisleri ile derişim arasındaki ilişkiden

derişim tayini yapılabilir.

• Şeker tayininde, camda SiO2 tayininde ve petrolde aromatik hidrokarbonların analizinde de

kırılma indisinden faydalanılmaktadır.

Deneyin Yapılışı:

• %1, %2, %3, %4, %5 lik glukoz çözeltilerinden abbe refraktometresine sırayla %1 lik glukoz

çözeltisinden birkaç damla prizma üzerine damlatılır ve diğer prizma kapatılır. Yayılan

glukoz çözeltisi mercekten bakılır ve karanlık ve aydınlık bölgeler görülür. Karanlık ve

aydınlık bölgeyi ayıran saç teli çarpı işaretinin tam ortasına getirilince, kırma indisi okunur.

19

• Diğer çözeltilerin kırma indisini ölçmeden önce prizmalar distile su ile iyice silinir ve %2lik

çözeltiden 2 damla prizma üzerine damlatılarak ölçüm yapılır. Bu işlem diğer çözeltiler içinde

tekrarlanarak kırma indisleri kaydedilir.

• Glukoz çözeltilerinin kırma indisleri değerleri tabloya geçirilerek kalibrasyon denklemi

bulunur. Bu denklemde konsantrasyonu bilinmeyen glukoz çözeltisinin konsantrasyonu tayin

edilir.

20

KROMATOGRAFİYE GİRİŞ

Ayırma Teknikleri

Analizi yapılması gereken numuneler büyük çoğunlukla farklı maddelerin karışımı halinde

bulunurlar. Karışım halinde bulunan bu maddelerin verdikleri analitik sinyaller genellikle

birbirlerini etkiler, yani girişim yapar. Bu yüzden, bu tip numunelerin kalitatif ya da kantitatif

analizinden önce numunenin içeriğinde bulunan maddelerin birbirinden ayrılması gerekir.

Örneğin bir farmasötik preparatta bulunan yardımcı maddenin analitik sinyali etken maddenin

sinyali ile karışıyorsa, yardımcı maddenin ortamdan uzaklaştırılması bu problemi ortadan

kaldırabilir. Ya da A ve B olmak üzere iki etken madde içeren bir farmasötik preparatta A ve

B etken maddeleri birbirlerinin analitik sinyallerini etkiliyor olabilir. Bu durumda A maddesi

ile B maddesi birbirlerinden ayrılıp, saf halde iken analizleri gerçekleştirilebilir. Böylece

herhangi bir girişim söz konusu olmaz.

Başka bir örnek ise katyon analizlerinden verilebilir. Alev deneyi yapılan numunede baryum

ve kalsiyum katyonları varsa, baryumun aleve verdiği yeşil renk nedeniyle kalsiyumun aleve

verdiği kiremit kırmızısı renk seçilemeyebilir. Bu yüzden sistematik analiz basamakları

uygulanarak, ortama asetik asit ve potasyum kromat eklenerek baryum kromatın çökmesi,

kalsiyum katyonunun ise çözeltide kalması sağlanır. Santrifüj işleminden sonra elde edilen

supernatant (süzüntü) baryum içermeyecektir ve alevde sadece kiremit kırmızısı görülecektir.

Çökelek ise kalsiyum içermeyeceğinden asitte çözülerek alev deneyi yapıldığında sadece yeşil

alev görülecektir. Böylece bu katyonların analizi numunede bulunan diğer katyonun

sinyalinden (alev renginden) etkilenmeden gerçekleştirilmiş olur.

Karışım halinde bulunan numunelerin analizleri için sıklıkla ayırma tekniklerinden

yararlanılır. Çöktürme, süzme, kristalizasyon, ekstraksiyon, distilasyon, kromatografi en çok

kullanılan ayırma tekniklerindendir.

Kromatografi

Karışımlardaki çeşitli maddeleri birbirinden ayırmaya ve böylece kalitatif ve kantitatif analize

olanak veren ayırma tekniklerinden biri de kromatografidir.

Tüm kromatografik uygulamalarda "sabit faz" ve "hareketli faz" adı verilen ve birbiriyle

karışmayan iki ayrı faz (ortam) bulunur. Sabit faz, düzenekte sabit olarak durur, hareketli faz

(mobil faz) ise sabit faz üzerinde hareket halindedir. Ayrım, karışım içindeki maddelerin sabit

21

faz ve hareketli faz ile etkileşimi doğrultusunda gerçekleşir. Sabit fazın amacı maddeleri

üzerinde tutarak alıkoymak, hareketli fazın amacı ise maddeleri kendi ile birlikte sürükleyerek

hareket ettirmektir. Yani kromatografide birbirinin tersi amaçlarla çalışan iki bileşen

mevcuttur.

Hareketli faz maddeleri sürüklerken, sabit faz ise maddeleri kendi üzerinde tutmaya çalışır.

Karışımdaki maddelerin her biri sabit faz ve hareketli fazla farklı oranlarda etkileşime girerler

ve bu nedenle farklı hızlarla sürüklenirler. Sabit faza ilgisi en çok olan madde en yavaş

ilerleyecek ve en fazla alıkonulan madde olacaktır. Hareketli faza ilgisi en yüksek olan madde

ise en hızlı sürüklenen, dolayısıyla en az alıkonulan madde olacaktır. Maddelerin göç etme

hızlarının farklı olması, her bir maddenin moleküllerinin sabit faz üzerinde gruplaşarak

ilerlemesine neden olur. Böylece karışım içindeki maddeler birbirinden ayrılırlar.

Kromatografi ilk kez 1906 yılında Rus botanikçi Mikhail Tswett tarafından kullanılmıştır.

Tswett, cam bir boruyu (kolon) kalsiyum karbonatla doldurmuş ve dikey olarak

yerleştirmiştir. Bu düzenekte, cam kolonun içinden petrol eteri içinde hazırladığı yaprak

ektresini dökmüş, daha sonra sadece petrol eteri dökmeye devam ederek ekstrenin kolon

içinde aşağı doğru ilerlemesini sağlamıştır. Ekstre en başta sadece tek bir yeşil tonuna sahip

olduğu halde, kolonda ilerledikçe birbirinden farklı tonlarda yeşil ve sarı renklere ayrılmaya

başlamıştır. Bunun nedeni, yaprak ekstresinin bileşiminde bulunan ve birbirlerinden farklı

renklere sahip α-ksantofil, β-ksantofil, α-klorofil ve β-klorofil gibi moleküllerin kendi

içlerinde renkli gruplar oluşturarak kolon içinde farklı hızlarda ilerlemeleridir. Tswett, bu

yönteme renkli (chroma) yazmak (graphein) anlamına gelen kromatografi (chroma-to-

graphy) adını vermiştir. Kolondan çıkan her farklı renkli bileşik ayrı bir beherde toplanarak

kalitatif ve kantitatif tayin yapmak mümkün olmuştur.

Tswett’in kuruduğu düzeneği oluşturan bileşenler aşağıdaki gibidir.

• Sabit faz : kalsiyum karbonat

• Hareketli faz : petrol eteri (aynı zamanda numune çözücüsü)

• Numune : yaprak pigmentlerini içeren ekstre

• Analitler : α-ksantofil, β-ksantofil, α-klorofil ve β-klorofil

22

Kromatografide ayrım mekanizmaları

Kromatografi yöntemleri, gerçekleştirilen ayrımın kimyasal mekanizmasına göre adsorbsiyon,

partisyon, iyon değişim, moleküler eleme veya afinite kromatografisi olarak gruplandırılabilir.

Bu ayrım mekanizmalarından en önemlileri adsorpsiyon ve partisyondur.

Adsorbsiyon, maddelerin katı yüzeylere tutunma olayıdır. Sabit fazın bir katı olduğu

kromatografik sistemlerde ayrılma prensibi adsorbsiyondur. Bu sistemlerde, sabit faz bir

adsorban görevi görür. Hareketli faz ile birlikte sabit fazın üzerinden geçen maddeler farklı

güçlerle sabit faz üzerine adsorbe olurlar. Güçlü adsorbe olan maddeler yavaş

sürüklenirlerken, daha zayıf adsorbe olan maddeler hareketli fazın etkisi ile daha hızlı

sürüklenirler. Böylece adsorbana ilgileri (adsorpsiyon güçleri) farklı olan maddeler

birbirlerinden ayrılmış olurlar.

Partisyon, çözünmüş bir maddenin birbiriyle karışmayan iki akışkan arasında dağılma

olayıdır. Partisyon, denge halinde bulunan ve birbiriyle karışmayan iki sıvıda çözünmüş halde

bulunan bir maddenin bu fazlardaki derişimleri/miktarları hakkında bilgi verir. Örneğin 100

birim A maddesi, oktanol ve su karışımında çözüldükten sonra sistemin dengeye gelmesi

beklendiğinde, 80 birim A maddesi oktanolde, 20 birim A maddesi suda bulunuyorsa, bu A

maddesinin % 80’inin oktanolde dağılmış olduğu anlamına gelir. Her maddenin partisyon

oranı her sıvı çifti için farklıdır. Bu oran, söz konusu maddenin hangi sıvı fazına ilgisinin

yüksek olduğu hakkında da bilgi verir. Bu örnekte A maddesinin oktanole olan ilgisi daha

fazladır.

Partisyon mekanizmasına dayanan kromatografi sistemlerinde sabit faz sıvı, hareketli faz ise

sıvı veya gazdır. Bu sistemlerde sabit faz olarak çoğunlukla katı bir yüzeye film şeklinde

kaplanmış sıvı tabakası kullanılır. Numunede bulunan maddeler her iki fazda da çözünürler,

fakat dağılma oranları birbirinden farklı olduğu için sabit faz üzerinde farklı hızlarla

ilerleyerek birbirlerinden ayrılırlar. Örneğin hareketli fazdaki partisyonu yüksek olan bir

madde hareketli fazla birlikte daha hızlı ilerleyecek, sabit fazdaki partisyonu yüksek olan

madde ise daha uzun süre alıkonulacaktır.

Kromatografik yöntemlerin sınıflandırılması

Ayrım mekanizmasına göre (Sabit faz tipine göre)

1. Adsorbsiyon kromatografisi (Sabit faz:katı)

23

a) Sıvı-katı kromatografisi (hareketli faz:sıvı)

b) Gaz-katı kromatografisi (hareketli faz:gaz)

2. Partisyon (dağılma) kromatografisi (Sabit faz:sıvı)

a) Sıvı-sıvı kromatografisi (hareketli faz:sıvı)

b) Gaz-sıvı kromatografisi (hareketli faz:gaz)

3. İyon değişim kromatografisi

4. Moleküler eleme kromatografisi

5. Afinite kromatografisi

Uygulama biçimine göre

1. Düzlemsel

a) Kağıt kromatografisi

b) İnce tabaka kromatografisi

2. Kolon

a) Kolon kromatografisi

b) Gaz kromatografisi

c) Yüksek performanslı sıvı kromatografisi

24

KAĞIT KROMATOGRAFİSİ VE İNCE TABAKA

KROMATOGRAFİSİ

En basit ve en eski kromatografi yöntemlerinden biri kağıt kromatografisidir. Kromatografi

kağıdı, bir tür süzgeç kağıdı olup sabit faz olarak görev yapar. Hareketli faz olarak ise farklı

çözücüler ve bunların karışımı kullanılabilir.

İnce tabaka kromatografisinin (İTK) kağıt kromatografisinden tek farkı sabit faz olarak

düzgün bir yüzeye ince bir tabaka halinde kaplanmış silika, alumina gibi bir adsorbanın

kullanılmasıdır. Bu sabit faz düzeneği İTK plakası olarak adlandırılır. İTK için farklı boyut ve

kalınlıklarda, gerçekleştirilecek analize uygun olarak istenen polaritede farklı maddelerle

kaplama yapılmış ticari plakalar bulunmaktadır.

Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde numuneler kağıdın/plakanın üzerine, bir ucuna yakın

olacak biçimde küçük hacimlerde tatbik edilir ve numune çözücülerinin kuruması beklenir.

Sonrasında kağıt/plaka, örneklerin tatbik edildiği seviyeden daha düşük bir seviyeye kadar

hareketli fazın içine daldırılır. Hareketli fazdaki sıvı molekülleri adhezyon kuvveti (kapiller

etki) ile yukarı doğru, yani kağıdın/plakanın üst ucuna doğru hareket etmeye başlarlar.

Hareketli faz molekülleri, numunelerin tatbik edildikleri noktalara ulaştıklarında numune

moleküllerini çözüp kendileri ile sürüklerler. Numunelerdeki farklı maddelerin sabit ve

hareketli fazlara ilgisi farklı olacağı için farklı hızlarda sürüklenerek birbirlerinden ayrılırlar.

Hareketli faza ilgisi yüksek olan maddeler daha hızlı ilerleyerek üst kısımlara ulaşırlar. Sabit

faza ilgisi yüksek olan maddeler ise daha yavaş ilerler ve kağıdın/plakanın daha alt

kısımlarında bulunurlar.

Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde yürütme tankı olarak adlandırılan kapalı cam

malzemeye yaklaşık 0.5 cm yüksekliğe kadar hareketli faz konulduktan sonra kapağı

kapatılarak tankın içindeki tüm hacmin hareketli fazla dengeye gelmesi sağlanır.

Kağıdın/plakanın alt ucundan 1.5 cm üstüne bir çizgi çizilerek bu çizgi üzerinde standartların

ve numunelerin tatbik edileceği yer işaretlenir. Numuneler ve referans maddeler bu çizgi

üzerine tatbik edilir ve kodları işaretlenir. Kromatografik kağıda ve plakaya hiç bir zaman

tükenmez kalemle bir işaretleme yapılmaz, kurşun kalem kullanılır. Daha sonra kağıt/plaka

tankın içine yerleştirilir ve tankın kapağı kapatılır. Hareketli faz kağıt/plaka üzerinde belli bir

yüksekliğe geldiğinde, tanktan çıkarılarak hareketli fazın ulaştığı çizgi seviyesi de işaretlenir.

Analiz edilen numunede bulunan maddelerin bıraktıkları lekelerin dış sınırları da kurşun

kalemle işaretlenir. Eğer analiz edilen maddeler renkli ise ulaştıkları nokta rahatça

25

görülecektir. Renksiz maddelerin ne kadar ilerlediklerini tespit etmek için kağıda/plakaya bir

reaktif püskürtülmesi, ya da UV ışığın altında bakılması gerekebilir.

Bu işlemler sonucunda elde edilen kağıt/plaka artık bir kromatogramdır. Bu kromatograma

bakılarak hangi maddelerin hangi faza ilgisinin daha yüksek olduğu, bir numunenin saf olup

olmadığı (saf numuneler tek bir leke verirken karışım halindeki numuneler birden fazla leke

oluşturacaktır), iki farklı numunenin aynı kaynaktan gelip gelmediği (benzer numunelerin

verdikleri kromatogram desenleri benzer olacaktır), tespit edilebilir. Aynı zamanda

numunenin verdiği lekeler standartların lekeleri ile karşılaştırılarak bir numunenin hangi

maddeleri içerdiği tespit edilebilir. Bu gibi analizler için en objektif yaklaşım alıkonma

faktörlerinin karşılaştırılmasıdır.

Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde bir maddenin alıkonma faktörü (Rf), maddenin

katettiği mesafenin hareketli fazın başlangıç çizgisinden itibaren katettiği mesafeye oranıdır.

Örneğin yandaki şekilde

ideal bir kromatogram

verilmiştir. (Gerçekte

lekeler daha asimetrik

ya da kuyruklu

olabilirler.) Bu örnekteki

maddelerin sabit faza

ilgileri küçükten büyüğe

doğru A, B ve C

şeklindedir.

A maddesinin alıkonma faktörü şöyle hesaplanır:

𝑅𝑓𝐴=

𝑅𝐴 (𝑐𝑚)

𝑀 (𝑐𝑚)

Kağıt ve ince tabaka kromatografisinde maddelerin alıkonma faktörleri karşılaştırılarak bu

maddelerin aynı maddeler olup olmadıkları tespit edilebilir. Örneğin yukarıdaki

kromatogramda D numunesinin verdiği iki leke vardır. Bu lekelerin alıkonma faktörleri A ve

26

C maddelerinin alıkonma faktörleri ile aynı veya çok yakın olduğuna göre, D numunesinin A

ve C maddelerini içerdiğini söyleyebiliriz.

Bir maddenin alıkonma faktörü maddenin fizikokimyasal özelliklerine, kullanılan sabit faza,

sabit fazın kalınlığına, kullanılan hareketli faza, ortam sıcaklığına, tankın doygun olup

olmamasına bağlıdır. Maddenin kağıt/plakada katettiği mesafe ise hareketli fazın tanktaki

seviyesine, kağıdın/plakanın tankta geçirdiği zamana ve dolayısıyla hareketli fazın katettiği

mesafeye bağlıdır. Bu yüzden kağıt ve ince tabaka kromatografisinde bilinmeyen numuneler

ve referanslar karşılaştırılacaksa aynı anda, aynı düzenekte deney yapılması tercih edilir.

Kağıt ve İnce Tabaka Kromatografisi Uygulaması : Olay Yeri İnceleme

Using Paper Chromatography, Oregon State University, Environmental Health Sciences

Center (blogs.oregonstate.edu/hydroville/files/2014/06/paper_chrom1.doc) ve Drug Analysis

Using Thin-Layer Chromatography, Annina Carter,

(http://www.terrificscience.org/lessonpdfs/DrugAnalysis.pdf)’tan uyarlanmıştır.

Senaryo : Bir intihar vakasında maktulün başucunda bir mektup ve yastığında tablet

parçaları bulunmuştur. Polis olayın intihar değil cinayet olduğundan şüphelenmektedir. Polis,

size incelemeniz için bu tablet parçalarını, mektuptaki mürekkep lekesini ve üç şüphelinin

üzerinde bulunan siyah mürekkepli kalemleri göndermiştir. Savcılığa vermeniz gereken

raporda mektuptaki mürekkebin hangi şüphelinin üzerinde bulunan kaleme ait olduğunu,

parçalanmış olarak bulunan tablet parçalarında hangi etken maddelerin bulunduğunu ve bu

karara nasıl vardığınızı açıklamanız gerekmektedir.

27

Üçer kişilik gruplar halinde çalışılacaktır. Öğrenciler laboratuvara kişisel korunma

malzemeleri (önlük, gözlük, eldiven) ile geleceklerdir.

İzlenecek Adımlar:

• Biri İTK biri kağıt kromatografisi için çözücü tankı olarak kullanacağınız iki behere

sıvı seviyesi 0.5 cm olacak kadar etanol koyduktan sonra üzerini bir saat camıyla

kapatınız.

Mürekkep analizi : Kağıt kromatografisi

• Kromatografi kağıdı olarak başlangıç çizgisi ve olay yerinde bulunan mürekkep lekesi

(X) bulunan bir süzgeç kağıdı teslim alacaksınız. Bu kağıdı kenarlarından tutup

olabildiğince yüzeyine değmemeye çalışınız.

• Başlangıç çizgisinde A, B ve C olarak işaretli olan kısımlara, A, B ve C kodlu

şüphelilerden alınan kalemlerle mürekkep lekesini oluşturunuz. Oluşturacağınız

lekelerin, X kodlu leke ile aynı şekil, kalınlık ve uzunlukta olmasına dikkat ediniz.

• Kağıdı yavaşça çözücü tankına (behere) yerleştiriniz. Beherdeki etanol çalkalanır

haldeyken yerleştirirseniz hareketli fazınız plakada aynı seviyede ilerlemeyecektir.

(DİKKAT! Tanktaki etanol seviyesi kağıdın alt ucunu ıslatacak kadar yüksek,

oluşturduğunuz lekelere değmeyecek kadar alçak olmalıdır. Bu yüzden 0.5 cm

yükseklikte olduğunu kontrol ediniz.) Beherin ağzını saat camıyla kapatınız.

• Hareketli fazın kağıdın yaklaşık 4/5’ine kadar çıkmasını bekleyiniz.

• Kağıdı beherden çıkarıp hareketli fazın ulaştığı seviyeyi (bitiş çizgisi) kurşun kalemle

işaretleyiniz.

• Kağıdın kurumasını bekleyiniz.

• Kromatografi kağıdınızı rapor sayfanızda belirtilen yere bantlayınız. (Gruptaki diğer

öğrenciler kromatografi kağıdını ve oluşan lekeleri rapor sayfasına temsili olarak

çizeceklerdir.)

• Rapor sayfasındaki soruları yanıtlayınız.

28

İlaç analizi : İnce Tabaka Kromatografisi

• Size verilen İTK plakasına alt kenarın 1.5 cm üzerinde olacak biçimde bir başlangıç

çizgisi çiziniz. (Kurşun kalem ile!)

• Standart madde olarak plakaya uygulayacağınız üç etken madde bir bilinmeyen

numune olacaktır. Bu yüzden başlangıç çizgisine kenarlardan ve birbirinden eşit

uzaklıkta 4 küçük işaretleme yaparak altlarına örneklerin kodlarını yazınız. (Plakaları

kenarlarından tutup olabildiğince yüzeyine değmemeye çalışınız.)

• Standart madde ve numune çözeltilerini plaka üzerinde belirlediğiniz noktalara

uygulamak için cam kılcal borular (kapiler) kullanacaksınız. Her biri için aynı

hacimde çözelti almaya dikkat ediniz, bunun için kapileri çözeltiye daldırdığınızda

çözeltinin kapilerde nereye kadar çıktığına, ve plakaya uygularken nereye kadar

indiğine dikkat etmeniz gerekir.

• Lekelerin kurumasını yani numunelerin çözücülerinin buharlaşmasını bekleyiniz.

• Plakayı yavaşça çözücü tankına (behere) yerleştiriniz. Beherdeki etanol çalkalanır

haldeyken yerleştirirseniz hareketli fazınız plakada aynı seviyede ilerlemeyecektir.

(DİKKAT! Tanktaki etanol seviyesi plakanın alt ucunu ıslatacak kadar yüksek,

oluşturduğunuz lekelere değmeyecek kadar alçak olmalıdır.)

• Beherin ağzını saat camıyla kapatarak hareketli fazın plakanın yaklaşık 4/5’ine kadar

çıkmasını bekleyiniz.

• Plakayı beherden çıkarıp hareketli fazın ulaştığı seviyeyi (bitiş çizgisi) kurşun kalemle

işaretleyiniz.

• Plakanın kurumasını bekleyiniz.

• Kuruyan plakayı UV lambası altına yerleştirip oluşan lekelerin sınırlarını kurşun

kalemle çiziniz.

• Plakanızı rapor sayfanızda belirtilen yere bantlayınız. (Gruptaki diğer öğrenciler İTK

plakasını ve oluşan lekeleri rapor sayfasına temsili olarak çizeceklerdir.)

• Rapor sayfasındaki soruları yanıtlayınız.

29

Kağıt Kromatografisi Deney Raporu

Ad, Soyad: Grup adı:

Öğrenci No: Grup üyelerinin numaraları:

1. Olay yerinde bulunan mektup hangi kalemle yazılmış olabilir? Veya hangi kalemle

yazılmış olamaz?

2. Savcılığa vereceğiniz raporda yukarıdaki cevabınıza nasıl karar verdiğinizi belirtmeniz

gerekmektedir. Kromatografinin mantığından da bahsederek kararınızı savcılığa açıklayınız.

3. X kodlu numunedeki mürekkebi oluşturan renkleri hareketli faza ilgilerine göre büyükten

küçüğe sıralayınız.

30

İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) Deney Raporu

Ad, Soyad: Grup adı:

Öğrenci No: Grup üyelerinin numaraları:

1. Her bir leke, yani her bir etken madde

için Rf değerlerini hesaplayınız.

2. Olay yerinde bulunan tablet parçalarında hangi etken madde/maddeler vardır?

3. Bu sonuca nasıl karar verdiniz? Kromatografinin mantığından ve bulduğunuz Rf

değerlerinin ne anlama geldiğinden bahsederek açıklayınız.

4. Etken maddeleri sabit faza ilgilerine göre büyükten küçüğe sıralayınız.

5. Etken maddeleri hareketli faza ilgilerine göre büyükten küçüğe sıralayınız.

6. Etken maddeleri alıkonma faktörlerine göre büyükten küçüğe sıralayınız.

7. Alıkonma faktörü ile fazlara ilgi arasında bir ilişki var mıdır? Açıklayınız.

31

YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK veya HPLC), karışım halindeki maddeleri

birbirinden ayırmak, teşhis etmek ve miktar tayinini yapmak için kullanılan modern bir cihaz

ve bu cihazın kullanıldığı yönteme verilen addır. YPSK, kolon kromatografisinin otomatik bir

cihazda gerçekleştirilmesini ve analitik olarak ölçümü sağlar.

Farmasötik preparatlardaki ilaç etken maddeleri, farmasötik preparatlardaki bozunma ürünleri

ve safsızlıklar, kandaki ilaç molekülleri ve bu moleküllerin metabolitleri, drogların içerdikleri

etkili bileşikler, gıdaların kimyasal bileşimi, organizmadaki enzimler, aminoasitler, proteinler,

polisakkaritler, vb. pek çok analitin miktar tayini için sıklıkla kullanılır. YPSK, pek çok

endüstri için kalite kontrol laboratuvarlarındaki en önemli cihazdır.

Yüksek performanslı sıvı kromatografisinde, paslanmaz çelikten bir kolon, yüzeyi sıvı bir

tabaka ile kaplanmış çok küçük partiküllerle doldurulmuştur. Bu yüzden YPSK partisyon

prensibine göre çalışan bir sıvı-sıvı kromatografi sistemidir. Sabit fazın kolonda ilerlemesi bir

pompa sistemiyle sağlanır. Numune içindeki bileşenler hareketli faz ile birlikte sabit fazın

üzerinden geçerken sabit fazda ve hareketli fazda farklı oranlarla dağılırlar. Sabit fazda

dağılma oranı düşük (sabit faza ilgisi düşük) olan maddeler kolonu çabuk terk ederken, sabit

fazda yüksek oranda dağılan maddeler kolonu daha geç terk ederler. Analitik YPSK

cihazlarında kolondan çıkan maddeler uygun bir dedektörle izlenerek kolondan çıkış

zamanları ve miktarları tespit edilir. Preparatif YPSK adı verilen cihazlarda ise maddeler

dedektörden çıktıktan sonra farklı kaplarda biriktirilerek fiziksel ayrım sağlanmış olur.

32

Şekil 7. Numunelerin kolon içerisinde ayırımı

Örneğin yukarıdaki şekilde A ve B maddelerini içeren ve M ortamında çözünmüş bir numune

YPSK sistemine t0 anında enjekte edilmiştir. t1 anında sabit fazda hiç tutunmayan M

çözücüsünün hareketli faz ile aynı hızda ilerlediği görülmektedir. B maddesi kolonda daha

hızlı, A maddesi ise daha yavaş hareket ettiği için t2 anında görüldüğü gibi A ve B maddeleri

birbirlerinden ayrılmıştır. Maddelerin göç hızlarının farklı olması, her bir maddenin sabit faz

üzerinde gruplaşarak ilerlemesine neden olur. Maddenin oluşturduğu bu gruplar bant olarak

adlandırılır. Maddelerin sabit faz üzerinde geçirdikleri zaman aralığı yani enjeksiyon anından

kolonu terk ettiği ana kadar geçen süre alıkonma zamanı olarak adlandırılır ve tR olarak

kısaltılır. Bu örnekte kolondan çıkıp dedektöre ulaşan ilk madde B maddesidir, yani

sürüklenme hızı yüksek, alıkonma zamanı kısadır. A maddesinin ise sürüklenme hızı yavaş,

alıkonma zamanı ise daha uzundur.

33

Şekil 8. YPSK cihazının şematik gösterimi

YPSK genel olarak 5 kısımdan oluşur:

• Pompa : Hareketli fazın bulunduğu kaptan alınarak sisteme verilmesini, kolon boyunca

yüksek basınçla ilerlemesini, dedektöre ve son olarak atık tankına ulaşmasını sağlayan

hareketi sağlar. İkili veya dörtlü pompa sistemleri kullanılarak farklı kaplarda bulunan

hareketli faz bileşenleri (su, tampon, metanol gibi) istenen oranlarda karıştırılarak

kullanılabilir.

• Enjektör : Numunenin hareketli fazla karıştırılarak kolona verilmesini sağlar. Otomatik

enjektörler kullanıldığında pek çok numunenin enjeksiyonu bilgisayar kontrollü olarak

istenen zamanda ve istenen şartlarda gerçekleştirilir. YPSK’da çoğunlukla 1-10 µL kadar

numune hacmi analiz için yeterlidir.

• Kolon : Ayrımın gerçekleştiği kısımdır. Genelde 10-30 cm boyuna ve 4-10 mm çapına

sahip paslanmaz çelikten bir kolonun küçük partiküllerle doldurulması ile üretilir. Bu

partiküllerin dışı sıvı bir film ile kaplıdır. Kolonun bulunduğu bölme genellikle sıcaklık

kontrollüdür.

• Dedektör : Kolondan çıkan maddelerin sinyallerini algılayan kısımdır.

• Kaydedici : Dedektörün ölçtüğü analitik sinyali sayısal verilere çevirir ve zamana karşı

grafiğe geçirerek kromatogram olarak kaydeder.

YPSK’da en sık kullanılan dedektörlerden biri ultraviyole / görünür bölge (UV/GB)

dedektörüdür. Bunun dışında floresans, kızılötesi, kırılma indisi, elektrokimyasal ve kütle

spektroskopi dedektörleri de kullanılmaktadır.

Örneğin UV/GB dedektörü kullanılan bir YPSK’da, kolonu terk eden tüm sıvı analiz boyunca

bir ışık kaynağının önünden geçer. Işık kaynağının karşısında bulunan dedektör ise ışığın

yoğunluğunu ölçmekle görevlidir. Işık geçişindeki azalma, kolondan çıkan sıvıda bu ışığı

34

absorblayan moleküllerin olduğu anlamına gelir. Dedektöre ulaşan ışık şiddetindeki azalma

dedektörde bir cevap oluşturur ve pik olarak kaydedilir. Örneğin kolondan sadece hareketli

faz çıkıyorsa tüm ışık dedektöre ulaşır ve sinyal sıfır olarak kaydedilir. Ama analiz edilen

maddelerden biri kolondan çıkarken, bu madde ışığı absorblayacağı için dedektöre ulaşan ışın

yoğunluğu azalır ve sinyal artar. Işığın madde tarafından absorblanması, madde miktarı ile

orantılıdır. Örneğin madde miktarını iki katına çıkarırsak, madde iki kat daha fazla ışığı

absorblayacak ve ölçülen sinyal iki katına çıkacak demektir.

Kolondan çıkan her maddenin derişim profili, pik olarak adlandırılır. Piklerin oluşturduğu

grafiğe kromatogram adı verilir. Kromatogram dedektör cevabının zamana karşı grafiğe

geçirilmesi ile elde edilir. Bir maddenin derişiminin artması, bu maddenin pik yüksekliğinin

ve pik alanının artmasına neden olur. YPSK yönteminde miktar tayini yapılırken çoğunlukla

pik alanları ile bilinen derişimler arasında bir ilişki kurulur. Bu ilişkiden yararlanarak ve

bilinmeyen derişimdeki maddenin pik alanı tespit edilerek bilinmeyen derişim hesaplanır.

Maddelerin kolondan çıkış zamanları alıkonma zamanı olarak adlandırılır ve maddeler

hakkında kalitatif bilgi verir. Bir maddenin alıkonma zamanı kromatogramda o maddenin

pikinin en yüksek noktasına karşılık gelen zamandır. Bir madde aynı hareketli ve sabit fazlar

kullanıldığında aynı alıkonma zamanına sahip olur. Farklı maddelerin alıkonma zamanları

karşılaştırılarak polarlıkları ya da apolarlıkları hakkında bilgi sahibi olunabilir.

Önceki şekilde kolonda ilerleyişleri gösterilen A ve B maddelerinin kromatogramı aşağıda

verilmiştir. Kromatogramlarda X ekseni zamanı, Y ekseni ise dedektörden alınan sinyali

gösterir. X ekseninde zamanın 0 olduğu nokta enjeksiyonun yapıldığı andır.

35

Şekil 9. Örnek kromatogram

tR1 : İlk maddenin (B) alıkonma zamanı

tR2 : İkinci maddenin (A) alıkonma zamanı

t0 : Ölü zaman (Numune çözücüsünün kolondan çıkma zamanı)

w1, w2 : Madde piklerinin taban genişliği

Pik yüksekliği : Pikin tepe noktası ile taban çizgisi arasındaki mesafedir. Maddenin derişimi

arttıkça, pik yüksekliği de artar.

Pik alanı : Piki oluşturan eğri ile taban çizgisi arasında kalan alandır. Maddenin derişimi ile

doğru orantılıdır.

YPSK uygulamalarında sabit ve hareketli fazın polarlıklarına göre iki farklı teknikten söz

edilebilir.

Normal faz Sabit faz : Polar

Hareketli faz : Apolar (hekzan, oktanol vb)

Ters faz Sabit faz : Apolar (alkil zincirleri bağlı partiküller)

Hareketli faz : Polar (su, tampon, metanol, asetonitril vb)

Normal faz tekniğinde sabit faz polar, hareketli faz ise apolardır. Kromatografinin ilk

uygulamaları da normal faz kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Tswett). Normal faz YPSK

tekniğinde en polar olan analit, kendisi gibi polar olan sabit fazla daha çok etkileşeceği için

daha çok alıkonulur ve kolondan en son çıkar. Daha az polar (apolara daha yakın) olan

36

analitler, sabit fazda daha az dağılacakları için hareketli fazla birlikte daha hızlı sürüklenirler,

alıkonma zamanları kısadır ve kolonu daha erken terk ederler. En apolar analit ise alıkonma

zamanı en kısa olan, dolayısı ile kolonu ilk terk eden olacaktır.

Ters faz tekniği ise, normal faza bir alternatif olarak sonradan geliştirilmiştir. Apolar bir sabit

faz ve polar bir hareketli faz kullanılır. Ters faz tekniğinde en polar analit, sabit faz ile en az

etkileşime giren molekül olacağı için hızlı biçimde sürüklenerek kısa sürede kolondan çıkar

ve alıkonma zamanı düşüktür. En apolar analit ise sabit fazla güçlü bir etkileşime gireceği için

daha yavaş sürüklenir, kolondan en son çıkar ve alıkonma zamanı yüksektir. YPSK

uygulamalarının büyük bir kısmında ters faz tekniği kullanılmaktadır. Bunun nedeni hareketli

faz olarak seçilen su, metanol, asetonitril gibi polar çözücülerin daha çok çeşitli olması, pek

çok farklı karışım yapılarak geniş bir polarite skalasına ulaşılabilmesi, tamponlar kullanılarak

istenen pH’ın sağlanabilmesi ve daha ucuz olmalarıdır.

37

VOLTAMETRİ VE POLAROGRAFİ

Akımın, elektroda uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak ölçülmesine dayanan

elektrokimyasal yönteme voltametri denir. Voltametrik deneyler bir elektrokimyasal hücrede

gerçekleştirilir ve genellikle üç elektrotlu bir sistemler kullanılır. Bu elektrotlar, çalışma

elektrodu, referans elektrot ve yardımcı (karşıt) elektrottur. Voltametri yönteminde çalışma

elektrodu ile referans elektrot arasına değeri zamanla değişen bir potansiyel uygulanır ve

çalışma elektrodu ile karşıt elektrot arasındaki akım ölçülür. Uygulanan potansiyelin ölçülen

akım değerine karşı grafiğine voltamogram denir. Voltametride herhangi bir maddenin

elektrokimyasal davranışını incelemek üzere uygulanabilecek potansiyel aralığı, çalışma

elektrodu, çözücü ve elektrolit türüne bağlıdır.

Voltametrik yöntemlerin ilki olan polarografi, 1922 yılında Çek kimyacı Jaroslav Heyrovsky

tarafından bulunmuştur ve bu buluşundan ötürü 1959 yılında Nobel Kimya Ödülü’nü

kazanmıştır. Elektrokimyanın önemli bir dalı olan polarografide, voltametriden farklı şekilde,

çalışma elektrodu olarak damlayan civa elektrot kullanılmaktadır. Bu yöntemde uygulanan

potansiyelin ölçülen akım değerine karşı grafiğine polarogram denir.

Şekil 9. Polarogram ve voltamogram

Analizi yapılacak maddenin elektrotla reaksiyona girmeye başlamasından sonra, potansiyelde

oluşabilecek en küçük değişikliğe karşı akımdaki artış hızlı olacaktır. Akımın büyüklüğü

elektroaktif maddenin elektrot yüzeyine ulaşma hızı ile sınırlanır ve bu sebepten dolayı belli

potansiyel değerinden sonra artış görülmez. Artışın görülmediği bu bölgedeki akım

büyüklüğüne sınır akımı (C-D) denir.

38

Elektroaktif maddenin elektrot ile reaksiyona girmesinden önce küçük bir akım

gözlenmektedir. Elektriksel çift tabakanın yüklenmesi ve çözeltideki safsızlıklar gibi nedenler

dolayısıyla oluşan bu akım büyüklüğüne artık akım (A-B) denir.

Şekildeki B-C bölgesinde potansiyeldeki küçük bir artışla akım büyük oranda artış

göstermektedir. Bu bölgedeki akımın büyüklüğüne difüzyon akım (id) denir. Difüzyon

akımının yarısına karşılık gelen potansiyele yarı dalga potansiyeli (E1/2) denir.

Voltamogram ve polarogramlar maddenin hem kalitatif (nitel) hem de kantitatif (nicel)

analizini yapmamıza imkan verir:

1) Her madde için belirli koşullar altında belirli bir yarı dalga potansiyeli vardır. Yarı

dalga potansiyelleri, elektroaktif maddeler için karakteristik olduklarından kalitatif

analizde kullanılırlar.

2) Difüzyon akımının derişimle orantılı olması özelliğinden yararlanılarak kantitatif

analizde kullanılırlar. Bu ilişki İlkoviç denklemi ile verilir:

id = 605 n D1/2 C m2/3 t 1/6

id: difüzyon akımı

n: elektrot reaksiyonunda yer alan elektron sayısı

D: çözünen maddenin difüzyon katsayısı

C: çözünen maddenin derişimi

m: civa kütlesi mg/s olarak

t: s olarak damlama zamanı

605: damlanın geometrisi ve Faraday sabitini içeren bir sayı

İlkoviç denkleminde kullanılan elektrot ve madde için diğer parametreler sabit iken id değeri

ile C arasında doğrusal bir ilişki vardır (id = k × C). Bundan yararlanılarak farklı

derişimlerdeki standart maddelerin ölçülen akım değerleri ile elde edilen kalibrasyon

denkleminden hareketle bilinmeyen numunedeki madde miktarı hesaplanabilir.

Kantitatif analizde ayrıca bilinen ve bilinmeyen derişimdeki çözeltiler için okunan id değerleri

oranlanarak da miktar tayinleri yapılabilir:

39

𝑖dstandart

𝑖dnumune

=𝐶standart

𝐶numune

Voltametrik Yöntemle İlaç Analizi

Bu deneyde verilen ilaç çözeltisinin derişimi voltametrik yöntemle tayin edilecektir. Bunun

için öncelikle ilaç etken maddesinin stok çözeltisinden hareketle beş farklı derişimde

çözeltiler hazırlanarak akım değerleri ölçülecek ve derişime karşı akım doğrusu elde

edilecektir.

İlaç numunesinin içerdiği etken madde standardının stok çözeltisi hazırlanacaktır (1×10-3 M).

Bu stok çözeltiden hareketle 2×10-5 M, 4×10-5 M, 6×10-5 M, 8×10-5 M ve 1×10-4 M

derişiminde analiz çözeltileri H2SO4 destek elektroliti ortamında hazırlanacaktır. Her birinin

ölçülen akım değeri derişim değerlerine karşı grafiğe geçirilerek doğru denklemi elde

edilecektir. Verilen numunenin (derişimi bilinmeyen) ölçülen akım değeri bu doğru

denkleminde yerine yazılarak numunenin derişimi hesaplanacaktır.

40

KONDÜKTOMETRİK TİTRASYON (İLETKENLİK

TİTRASYONU)

İletkenlik (C) maddenin elektrik akımını iletebilmesinin ölçüsüdür. C= 1/R’dir. Yani direncin

(R) tersidir. Birimi S.m-1’dir. (Siemens birimi Alman bilim insanı ve mucit Werner von

Siemens’e ithafen verilmiştir)

Bilindiği gibi saf su elektrik akımını iletmez, teorik olarak iyon içermediği için iletkenliği

yoktur denir. Ancak pratikte saf suda çok çok az da olsa iyon kalacağı içen mikrosiemens

(µS) civarında bir iletkenlik okunur. Bir suyun saf olup olmadığı iletkenlik değerine bakılarak

anlaşılır. Örneğin ultrasaf suyun iletkenliği 0,055 µS/cm, distile suyun iletkenliği 0,5 µS/cm

civarındayken deniz suyunda bu değer 56000 µS/cm civarındadır.

İyonların çözücüye kazandırdığı iletkenlik çözücünün viskozite gibi özelliklerine, çözünen

iyonun sayısına, büyüklüğüne ve yüküne göre değişir.

Çözeltideki iletkenlik değişimlerine dayanarak yapılan analiz yöntemine iletkenlik ölçme

(kondüktometri) denir. İletkenlik ölçmede kullanılan araçlara kondüktometre denir.

Kondüktometreler bir elektrik kaynağı, analiz çözeltisinin bulunduğu iletkenlik hücresi ve bir

direnç ölçerden oluşur. Cihazın en duyarlı bölgesi olan iletkenlik hücresinde genellikle üzeri

platin siyahı ile kaplanmış platin elektrotlar kullanılır.

Derişimi bilinmeyen numunenin (analitin) derişimi bilinen titrant ile reaksiyonu sırasında

iletkenlikteki değişimlerden yararlanılarak dönüm noktasının belirlendiği titrasyona

kondüktometrik titrasyon denir. Kondüktometrik titrasyon yöntemi, koyu renkli veya berrak

olmayan çözeltilerin analizinde ve çökelme tepkimelerinde çok kullanılan oldukça uygun

yöntemlerden biridir.

Kuvvetli Bir Asidin Kuvvetli Bir Bazla Titrasyonu

Kuvvetli bir asidin kuvvetli bir bazla titrasyonunda HCl ve NaOH çözeltileri kullanılabilir.

Hazırlanan analit (kuvvetli asit (HCl)) çözeltisinden 50 mL alınır ve kondüktometrenin

iletkenlik hücresine konur. Başlangıçtaki iletkenlik ölçülür. Manyetik karıştırıcı çalıştırılır.

Büretten akıtılan titrant (NaOH) çözeltisinden damlatılarak titrasyona başlanır. Her 0,1 – 0,2

mL titrant eklendikten sonra iletkenlik ölçülür. İletkenlik değerleri koordinat düzleminin Y

eksenine ve mL olarak titrant hacimleri koordinat düzleminin X eksenine olacak şekilde

grafiğe yazılır.

41

Kuvvetli bir asit ile kuvvetli bir bazın titrasyonunda NaOH eklendikçe hidrojen iyonu

derişimi azalacağından eşdeğerlik noktasına kadar iletkenlik hızla azalır. Eşdeğerlik

noktasından sonra ise ortamda fazla hidroksil iyonları bulunacağından iletkenlik tekrar hızla

artar.

Grafikten elde edilen eşdeğerlik noktasındaki NaOH miktarı kullanılarak analiz edilen asidin

derişimi bulunur.

Hesaplamalar

Eşdeğerlik noktasının tayini için elde edilen bu değerler “Microsoft Excel” veya “Open Office

Calc” gibi bir veri işleme programına yüklenir. Veriler iletkenliğin azaldığı ve arttığı parçalar

olmak üzere iki parçaya ayrılır. Bu iki ayrı veri grubunun doğru denklemleri çıkarılır ve bu iki

doğrunun kesim noktasını bulmak için denklemler birbirine eşitlenir. Bulunan x değeri

eşdeğerlik noktasıdır. Örneğin;

y =150x + 47.6 ve y = -150x + 211.2 şeklinde bulunan iki doğru denklemi birbirine

eşitlendiğinde:

150x + 47.6 = -150x + 211.2

300x = 163.6

x =0.545 olarak bulunur.

NOT: Bu işlemler bilimsel hesap makinelerinin lineer regresyon fonksiyonları kullanılarak da

yapılabilir.

42

POTANSİYOMETRİ

Bir karşılaştırma(referans) elektrodu ve uygun bir çalışma(indikatör) elektrot ile oluşturulan

elektrokimyasal hücrede ölçülen gerilim değerleri kullanılarak hücrenin çözeltisindeki iyonların nicel

analizine potansiyometri denir.

Elektrokimyasal hücreler; redoks reaksiyonlarının oluştuğu hücrelerdir. Bu hücrelerde potansiyel

oluşması için redoks reaksiyonlarına yani elektron aktarımına gereksinim vardır. Elektrot

potansiyelleri mutlak olarak ölçülemez ancak referans elektrodun potansiyeli ile karşılaştırılarak

aradaki potansiyel fark ölçülür.

Potansiyometrik Yöntemin Üstünlükleri,

• Uygun bir renkli indikatörün mümkün olmadığı durumda,

• Koyu renkli veya çok seyreltik çözeltilerde

• İki veya daha fazla bileşenin analizinde kullanılabilir.

Potansiyometride potansiyel ölçümleri esas olduğu için elektrotlar önemlidir. Bir potansiyel

ölçümünde; referans elektrot, indikatör elektrot kullanılır.

Referans Elektrotlar:

Referans elektrodun potansiyeli sabit olup, uygulanan dış potansiyelden etkilenmez.

İdeal bir referans elektrot;

1. Tersinir olmaslı ve Nerst eşitliğine uygun olmalı

2. Ufak bir akıma maruz kaldıktan sonra orjinal potansiyeline dönebilmeli

3. Sıcaklık değişiminden etkilenmemelidir.

• Kalomel ve Ag/AgCl elektrotlar en çok kullanılan referans elektrotlardır.

Şekil 1. Kalomel elektrodun şeması Şekil 2. Ag/AgCl elektrodun şeması

43

İndikatör Elektrot (Çalışma Elektrodu):

Potansiyeli çözelti bileşimine bağlı olarak değişen elektrotlardır ve referans elektrotla beraber

kullanılır. Elektrodun potansiyeli, uygulanan dış potansiyelden etkilenir ve değişir. Membran

elektrotlar (cam elektrot, iyon seçici elektrotlar v.b) ve metal elektrotlar bu sınıfa örnektir.

• Metal Elektrotlar:

o I. Sınıf Elektrotlar: Çözeltide kendi iyonları ile dengede olan metal elektrotlardır.

▪ Zn2+ iyonlarını içeren bir çözeltiye daldırılmış Zn metali

▪ Ag+ iyonlarını içeren bir çözeltiye daldırılmış Ag metali

▪ Cu2+ çözeltisine daldırılmış Cu metali

o II. Sınıf Elektrotlar: Az çözünen bir tuzun doygun çözeltisi ile dengede olan metal

elektrotlardır.

▪ AgCl’ün doygun çözeltisi ile dengede bulunan Ag metali

▪ Hg2Cl2’ün doygun çözeltisi ile dengede bulunan Hg metali

o III. Sınıf Elektrotlar: Aynı anyona sahip iki az çözünen tuzun doygun çözeltisi ile ya

da aynı liganda sahip iki kompleks iyonu içeren çözelti ile dengede olan metaller

▪ Hg2C2O4 tuzlarının doygun çözeltisi

▪ CaC2O4 tuzlarının doygun çözeltisi

▪ Hg metali

• Membran Elektrotlar:

Belli iyonlara karşı duyarlı olan elektrotlardır. Bunlardan en önemlisi cam elektrottur. Cam elektrot;

H+ iyonlarına duyarlı elektrottur ve pH ölçümünde kullanılır.

Günümüzde pHmetrelerde cam elektrotlar kalomel elektrot ile kombine edilmiş olarak

kullanılmaktadır.

Özel bir camdan yapılmış baloncuğun içerisinde konsantrasyonu belli ve genellikle 0.1 M HCl

çözeltisi bulunur ve buna Ag/AgCl elektrot daldırılmıştır. Bu elektrot çözeltiye daldırılır. Bu anda iki

çözelti arasındaki konsantrasyon farkından dolayı bir potansiyel doğar. Bu potansiyel referans

elektroda karşı okunur. Oluşan potansiyel farkı çözeltinin pH’sına bağlıdır.

44

Şekil 3. Cam elektrot şeması

Bu elektrotta oluşan emk kuvveti: E=𝑒𝐴𝑔, +𝑒𝑐𝑎𝑚 + 𝑒𝑘𝑎𝑙𝑜𝑚𝑒𝑙

Bu eşitlikte 𝑒𝐴𝑔, 𝑒𝑐𝑎𝑚 sabit olduğu için potansiyel doğrudan 𝑒𝑐𝑎𝑚 ‘a bağlıdır. 𝑒𝑐𝑎𝑚 değerini

hesaplayarak pH tayini yapmak mümkündür.

Bu ilişki,

𝑒𝑐𝑎𝑚 = 𝑒𝑐𝑎𝑚0 − 0.0591 log 𝑎𝐻+ = 𝑒𝑐𝑎𝑚

0 + 0.0591𝑝𝐻(25°𝐶)

Cam elektrot en iyi pH 0-10 arasında çalışır.

Cam elektrotta:

pH<1 => ASİT HATASI (Cam elektrodun cam yüzeyindeki merkezlerin doldurulması ve artık H+

değişikliğine cevap vermemesi olduğu düşünülmektedir)

pH>1 => ALKALİ HATASI (Alkali ortamlarda elektrot H+ yanında camın yapısında bulunan alkali

metal iyonlarının değişimini de cevap vermeye başlar)

Potansiyometrik Titrasyon:

Potansiyometri aynı zamanda titrasyon işlemlerinde de kullanılan elektroanalitik bir yöntemdir. Bu

yöntemde indikatör kullanmadan titrasyon işlemi yapılmaktadır. Çünkü bazı maddelerin titrasyonu

için uygun indikatör bulunmamakta yada indikatör bulunduğu ortamda bozunabilmektedir. Asit baz

tepkimelerinde kullanılan iyon seçici elektrot, cam elektrottur.

45

Bu nicel analiz yönteminde her titrant eklenmesinden sonra ölçülen pH ya da gerilim değeri eklenen

titrant hacmine karşılık grafiğe geçirilerek Potansiyometrik titrasyon eğrisi oluşturulur.

Şekil 4. Potansiyometrik Titrasyon Şeması

Eşdeğerlik noktasının daha net belirlenebilmesi için titrasyon eğrisinin birinci ve ikinci türevleri

hesaplanır.

1.türev eğrisinde meydana gelen pikin maksimumu, 2. türev eğrisinde ise meydana gelen eğrinin x

eksenini kestiği nokta eşdeğerlik noktasına kadar harcanan titre edici hacmini göstermektedir.

Şekil 5. Potansiyometrik titrasyon eğrisi

Yapılan deneyin sonucunda öncellikle titre edilen her mL NaOH hacmine karşılık okunan pH değeri

grafiğe geçirilir. Ama bu grafikten dönüm noktası hassas olarak okunamaz. Bu nedenle grafik

yöntemle türevi alınır.¶

△𝑝𝐻

△𝑣=

𝑝𝐻2−𝑝𝐻1

𝑉2−𝑉1’e karşı kullanılan NaOH hacim(V) grafiğidir.

46

Şekil 6. Potansiyometrik titrasyon eğrisinin birinci türevi

Bu grafikten de eşdeğerlik noktası yine net olarak belirlenemeyebilir. Bazen dik bir eğri yerine daha

yayvan bir eğri de elde edilebilir ve dönüm noktası yine saptanamaz. Bu nedenle 2. bir defa daha türev

alınması gerekir:

△𝑝𝐻/△𝑉

△𝑉=

△2𝑝𝐻

△𝑉2’e karşı kullanılan NaOH hacim(V) grafiğidir.

Şekil 7. Potansiyometrik titrasyon eğrisinin ikinci türevi

Deneyin Yapılışı:

Deneye başlamadan önce pHmetre bir bazik bir de asidik tampon çözeltilerle kalibre edilmelidir.

Behere, titre edilecek asit (10 mL HCl) aktarılır ve 30 mL distile su eklenir. Manyetik karıştırıcı

yardımıyla belli bir süre karıştırılır. İlk olarak çözeltiye cam elektrot daldırılarak pH’ı pHmetre

yardımıyla okunur. Bürete ayarlı NaOH çözeltisi ile doldurulur. Sonra üzerine eşit kısımlar halinde

NaOH damlatılarak her ilaveden sonra pH okunur ve ilave edilen titre edici hacmine karşılık grafiğe

geçirilir. pH daki ani artış eşdeğerlik noktasını gösterir. Bütün değerler okunduktan sonra titrasyon

eğrisi elde edilir ve HCl’ın molaritesi bulunur. Eğrinin dönüm noktasını kesin bir şekilde

saptayabilmek için birinci ve ikinci türev eğrileri çizilir.

47