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UMR6553 ECOBIO
Université de Rennes 1
Analyse de la diversité fongique par
pyroséquençage dans des sols forestiers
Rapport de Stage de Master 2 Ecologie-Environnement
Parcours Ecologie Fonctionnelle, Comportementale et Evolutive
Présenté par Quentin Gautier
Encadrant du stage : Monsieur Philippe Vandenkoornhuyse
Année universitaire
2009-2010
Remerciements
Tout d’abord, je tiens à remercier très fortement Philippe Vandenkoornhuyse de m’avoir
permis de réaliser ce stage qui s’est avéré vraiment très intéressant et enrichissant. Je le remercie
également pour son aide, sa patience et son optimisme à tout épreuve (même lors des
contaminations d’amorces ou lorsque les amplifications d’ADN n’ont pas fonctionnées !). J’en
profite également pour remercier l’équipe « Interactions arbre-micro-organismes » de l’INRA de
Nancy pour m’avoir fournit leur jeu de données brutes sur les séquences ITS fongiques.
De même, Je tenais également à exprimer mes remerciements à toute l’équipe du labo
RBPE pour m’avoir aidé dans la réalisation de ce stage quelque soit leur niveau de participation.
J’ai donc une pensée en premier lieu pour Stéphane Mahé qui m’a énormément aidé pendant les
manips ou lorsque j’avais des questions bêtes à poser ! Je ne pouvais pas espérer mieux comme
thésarde, toujours prête à m’aider, pour pouvoir décompresser en parlant de tout et de rien et en
se payant des bonnes tranches de rigolade. Il y’a également Sophie Coudouel qui a été une
excellente formatrice pour l’initiation à la technique du pyroséquençage et qui est toujours de
bonne humeur. Ce qui fait toujours plaisir quand on n’a pas trop la tête à ça. Je remercie aussi
mes deux « camarades » de pyroséquençage Julia et Flavia pour l’entre aide et pour voir passer
de bons moments ensemble. Sans oublier, Alexis Dufresne qui m’a beaucoup aidé, notamment
dans l’analyse des données tout comme Delphine Naquin ainsi que Jean-Sébastien Pierre qui m’a
« sauvé » d’un départ bien mal embarqué dans la création de la matrice de données pour
EstimateS. Et enfin, les autres membres de l’équipe que j’ai pu côtoyer durant cette période et qui
ont apporté leur bonne humeur : Yvan, Cécile, Elodie, Gwen, Achim…
Et puis, il y a toutes ces personnes en dehors de l’équipe (ou dedans !) avec qui j’ai pu
beaucoup échanger durant ce stage que ce soit au niveau de la sphère professionnelle ou privée et
avec qui j’ai passé d’excellents moments : Mitch, Guillaume, Pauline, petite Pauline, Julia,
Natacha, Camille, Amaury, Benjamin, Boss, Aurélien, Julie, Philippe… et Stéphane et Stéphane
(merci pour cette blague mémorable sur les Inconnus) !
« Autant de sons nés du même instrument, autant de champignons né d’une même humidité… »
Zhuangzi (Tchouang-Tseu)
Acronymes
ACP : Analyse en Composantes Principales
ADNr : ADN ribosomal
ANR : Agence Nationale de Recherche
BLASTn : Basic Local Alignment Search Tool nucleotidic
CCD : Charge Coupled Device
ECM : Ectomycorhize
GS : Genome Sequencer
HASSIUM : HAplotypic Successive Separation and Identification User Manager
INRA : Institut National de la Recherche Agronomique
ITS : Internal Transcribed Spacer
MA : Mycorhize à Arbuscules
MP : Maximum de Parcimonie
NCBI : National Center for Biotechnology Information
OTU : Operational Taxonomic Unit
PCR : Polymerase Chain Reaction
TBR : Tree-Bisection-Reconnection
Sommaire
Introduction .............................................................................................. 1
Matériel et méthodes ............................................................................... 4
Préparation des amorces et amplification de l’ADN ribosomal ................................................... 5
Pyroséquençage de masse ............................................................................................................ 7
Outils de traitement bioinformatique ........................................................................................... 8
Résultats .................................................................................................. 10
Analyse des séquences par clustering d’OTUs .......................................................................... 10
Analyse de la diversité fongique ................................................................................................ 13
Richesse spécifique................................................................................................................. 13
Comparaison des communautés ............................................................................................. 14
Comparaison entre OTUs et séquences fongiques connues .................................................. 16
Discussion ................................................................................................ 18
Importance de la composition et de la diversité fongique dans la structure et le fonctionnement
des écosystèmes forestiers en milieu tempéré ............................................................................ 18
Caractérisation de la diversité fongique ................................................................................ 18
Composition et structure des communautés fongiques .......................................................... 18
Vers une approche intégrée du Règne fongique dans l’étude des écosystèmes naturels et/ou
anthropisés ................................................................................................................................. 20
Ecologie du paysage et changement d’usage des terres ........................................................ 20
L’Internal Transcribed Spacer (ITS), un marqueur fiable pour la diversité taxonomique
fongique ? ............................................................................................................................... 21
Conclusion ................................................................................................................................. 22
Bibliographie .......................................................................................... 23
Liste des figures
Figure 1: Phylogénie simplifiée des 5 clades majeurs des champignons basée sur 6 marqueurs
moléculaires (modifiée et simplifiée d’après James et al. 2006) ..................................................... 2
Figure 2 : Schéma du plan du site expérimental de l’étude de Breuil (modifié d’après INRA
Nancy) .............................................................................................................................................. 5
Figure 3 : Schéma du couple d’amorces fusionnées au sein de la région intergénique transcrite
(modifié d’après Roche et INRA Nancy) ........................................................................................ 6
Figure 4 : Principe du pyroséquençage : technique d’addition séquentielle de nucléotides en
temps réel (d’après Lamoril et al. 2008) à l’aide du pyroséquenceur GS-FLX (Roche) ................. 7
Figure 5 : Amplification clonale en émulsion (modifié d’après Roche) .......................................... 8
Figure 6 : Dépôt des billes portant la banque d’ADN sb (modifié d’après Roche) ......................... 8
Figure 7 : Estimation de la diversité maximale des champignons dicaryotes dans la parcelle de Q.
sessiflora ........................................................................................................................................ 11
Figure 8 : Estimation de la diversité maximale des champignons dicaryotes dans la parcelle de P.
abies ............................................................................................................................................... 12
Figure 9: Analyse en composantes principales (ACP) de la diversité fongique entre 6 essences
forestières distinctes ....................................................................................................................... 15
Figure 10 : Dendrogramme des espèces d'arbres réalisé à partir des points ACP ......................... 15
Figure 11 : Arbre phylogénétique non raciné basé sur la comparaison de la diversité fongique de
6 sols d’essence d’arbres distinctes ................................................................................................ 16
Figure 12 : Reconstruction phylogénétique non enraciné obtenue par maximum de parcimonie
(MP) des séquences ITS les plus abondantes (parcelle à Q. sessiflora) incluant les plus proches
séquences relatives aux OTUs (BLASTn et UNITE) .................................................................... 17
Figure 13 : Reconstruction phylogénétique non enraciné obtenue par maximum de parcimonie
(MP) des séquences ITS les plus abondantes (parcelles à F. sylvatica et P. nigra) incluant les plus
proches séquences relatives aux OTUs (BLASTn et UNITE) ....................................................... 17
Liste des tableaux
Tableau I : Nombre de séquences et d'OTUs avec ou sans singletons après filtrage et clustering à
99% ................................................................................................................................................ 11
Tableau II : Détermination taxonomique au niveau du genre et calculs d’abondance relative des
OTUs les plus fréquents dans chacun des types forestiers ............................................................. 13
Tableau III : Représentation de la diversité α au sein de chaque parcelle forestière ..................... 14
Tableau IV : Représentation de la diversité β par les calculs de diversité de Sørensen par paires de
communautés.................................................................................................................................. 14
1
Introduction
Les connaissances scientifiques portant sur le Règne fongique se sont fortement
accumulées et multipliées ces dernières années dans de nombreux domaines tant au niveau de
leur diversité (Fitter & Moyersoen 1996 ; Read & Perez-Moreno 2003 ; Selosse 2000 ; Smith &
Read 1997) qu’au niveau de leur fonctionnement et de leurs interactions au sein des écosystèmes
(Simon et al. 1993 ; van der Heijden et al. 1998 ; Vandenkoornhuyse et al. 2002a) ou bien encore
de leur physiologie et de leurs modes de vie (Blaudez 2000 ; Bouchet et al. 2005 ; Jennings &
Lysek 1996 ; Malloch et al. 1980 ; Selosse 2000). Malgré tout, il est important d’insister sur le
fait que, d’un point de vue global, le Règne fongique reste encore largement insondé
(Hawksworth 1991 ; Le Calvez et al. 2009) en dépit de son rôle essentiel pour le fonctionnement
des écosystèmes (Mueller & Schmit 2007). En effet, si le nombre d’espèces recensées à ce jour
avoisine les 100000, on estime qu’un total de 1,5 million d’espèces fongiques peuple notre
planète (Hawksworth 1991). Actuellement, l’organisation des champignons en phylum est
reconsidérée sur des bases phylogénétiques et l’application de techniques moléculaires pour
résoudre les relations taxonomiques entre ces organismes a permis de mieux comprendre les liens
évolutifs entre groupes fongiques (Hibbet et al. 2007 ; Lutzoni et al. 2004). Avec l’adoption
implicite du concept phylogénétique d’espèce, 5 phyla sont aujourd’hui acceptés selon une
analyse phylogénétique reposant sur 6 marqueurs moléculaires (les gènes codant les ARNr 18S,
ARNr 5.8S, ARNr 28S, le gène codant le facteur d’élongation EF1-α et les gènes rpb1 et rpb2
codant les sous unités de l’ARN polymérase II) et sur plus de 200 organismes provenant de tous
les clades majeurs des champignons (James et al. 2006 ; Fig. 1).
La présente étude porte sur 2 phylums monophylétiques du Règne des champignons, les
Ascomycota et les Basidiomycota, contenant la majorité des espèces de champignons décrites, en
l’occurrence 67000 espèces sur les 100000 environ recensées. Ces 2 phyla sont regroupés en un
sous-Règne, appelé les Dikarya, qui s’appuie sur la présence d’hyphes dicaryotes au cours du
cycle sexuel de ces organismes (Hibbet et al. 2007 ; James et al. 2006 ; Lutzoni et al. 2004).
Face à la contrainte majeure que constitue leur hétérotrophie vis-à-vis du carbone, les
champignons dicaryotes peuvent exister sous 3 modes de vie différents : le saprophytisme, le
parasitisme et la symbiose, largement répandus et participant tous au fonctionnement des milieux
naturels (Bouchet et al. 2005). Par exemple, les champignons saprophytes jouent un rôle
primordial dans le cycle de minéralisation de la matière organique tombée au sol (e.g. cycle du
carbone, de l’azote, du phosphore etc.). Au contraire, certains d’entre eux sont des pathogènes.
Ils pénètrent à l’intérieur de la plante et décomposent le tissu vivant provoquant ainsi un
2
affaiblissement, une déficience en nutriments voir même la mort du végétal (Bouchet et al. 2005).
Toutefois, l’étude se focalise principalement sur les champignons symbiotiques, même si les
autres types biologiques existant dans ce sous-Règne fongique sont aussi analysés, car on
considère aujourd’hui qu’ils jouent un rôle clé dans un grand nombre d’écosystèmes (Mueller &
Schmit 2007). En effet, certains champignons s’associent aux végétaux au niveau de leurs
racines, où ils forment des organes mixtes, appelés mycorhizes (du grec myco, champignon et
rhiza, racine - Smith & Read 1997). On peut classer cette symbiose mycorhizienne en deux types
majeurs. D’un côté, les endomycorhizes dont la plus commune est la mycorhization à arbuscules
(MA) (Fitter & Moyersoen 1996 ; Vandenkoornhuyse et al. 2002b) qui n’appartient pas au sous-
Règne des dicaryotes et de l’autre, les ectomycorhizes (ECM) qui appartiennent exclusivement à
ce sous-Règne (Taylor et al. 2004). Ainsi, chez les 45000 espèces d’Ascomycètes décrites
(Taylor et al. 2004), les familles les plus concernées sont les Elaphomycetaceae et les
Terfeziaceae. Quant aux 22000 espèces de Basidiomycètes décrites (Taylor et al. 2004),
beaucoup de familles présentent une ou plusieurs espèces de champignons ectomycorhiziens
(Agaricaceae, Amanitaceae, Boletaceae, Cortinariaceae). Ce type d’association implique au final
plus de 6000 espèces (Gardes et al. 2003 ; Molina et al. 1992) au sein des 2 phyla et il semble
que les racines des arbres puissent être exposées à un nombre important d’espèces
d’ectomycorhizes différentes (Dahlberg et al. 1997).
Figure 1: Phylogénie simplifiée des 5 clades majeurs des champignons basée sur 6 marqueurs moléculaires
(modifiée et simplifiée d’après James et al. 2006)
Cette ectomycorhize est contractée essentiellement avec la couverture ligneuse
(Gymnospermes ou Angiospermes) des forêts des régions tempérées, boréales, montagneuses et
tropicales (Jennings & Lysek 1996). Ils possèdent ainsi une relation très étroite avec les racines
de leurs hôtes, impliquant un développement spécialisé du champignon formant le réseau de
Hartig de la racine et d’une communication approfondie entre la plante et champignon (Martin et
al. 2001). Ce réseau de filaments mycéliens va être engagé dans les échanges d’éléments nutritifs
avec le végétal (sucres, acides aminés, éléments minéraux). Les champignons ECM stimulent
ainsi généralement la croissance et le développement de la plante-hôte, en particulier dans les sols
forestiers où la disponibilité en éléments minéraux (azote et phosphate principalement) est faible.
3
En retour, la plante fournit 30 à 40% du carbone total photosynthétisé (Selosse 2001). L’avantage
de la mycorhization, et plus particulièrement des ECM, est donc de permettre à l’arbre
d’augmenter sa capacité à puiser des ressources minérales en exploitant un volume de sol très
important, comparativement aux racines seules (Bouchet et al. 2005). De plus, les champignons
ECM contribuent également à une protection phytosanitaire par élicitation des mécanismes de
défense et en produisant des substances antibiotiques (e.g. mycorhize A) permettant de lutter
contre d’autres microorganismes pathogènes de la plante (Smith & Read 1997). L'association
mycorhizienne joue aussi un rôle dans la synthèse de composés complexes, comme les vitamines
et les phytohormones (Selosse et al. 2004). Ces phytohormones produites par le champignon sont
exportées vers la plante-hôte et affectent la croissance du système racinaire, du tronc, des tiges et
des feuilles. De même, certains champignons ECM améliorent la réponse des arbres au stress
hydrique (Guehl et al. 1992). Enfin, les champignons ectomycorhiziens jouent également un rôle
important dans l'absorption, le transfert ou l'immobilisation d'autres éléments minéraux du sol,
comme le cuivre, le fer, le zinc et le potassium (Blaudez 2000). La connaissance des populations
et des communautés fongique et plus particulièrement ectomycorhiziennes revêt donc une
importance cruciale dans les biocénoses forestières tempérées que ce soit au niveau des espèces
invasives (Collier & Bidartondo 2009) ou bien au niveau de la gestion rationnelle et durable des
écosystèmes naturels face au changement climatique globale ou face aux actions anthropiques.
Le travail réalisé ici s’attache à tester l’hypothèse selon laquelle les communautés
fongiques dans le sol sont dépendantes du contexte bioclimatique, c'est-à-dire de la localisation
géographique et de la nature des plantes qui s’y trouvent (facteurs confondants). Pour limiter le
nombre de paramètre pouvant potentiellement impacter les communautés fongiques, nous nous
intéressons à une seule unité géographique où 6 parcelles monospécifiques sylvicoles ont été
mises en place. L’hypothèse nulle (H0) pouvant être testé ici est que le type de plantation
forestière conduit à une différentiation des communautés fongiques au sol. Les champignons
dicaryotes présents dans ces sols forestiers sont ainsi étudiés par pyroséquençage de masse
(Margulies et al. 2005) à partir de l’analyse d’amplicons de l’ITS (Internal Transcribed Spacer)
de la région génique ribosomale nucléaire. Cette cible génétique est communément utilisée
comme « code-barre » des espèces d’Ascomycètes et Basidiomycètes (Seifert 2009). Il s’agira
alors tout d’abord de classer les séquences redondantes d’ADN ribosomiaux (ADNr) obtenues en
groupes de séquences nommés OTUs (Operational Taxonomic Units). Ainsi, les OTUs les plus
abondants sont déterminés au niveau du genre pour permettre de dresser un bilan relativement
fiable de la composition des communautés de champignons supérieurs. Puis, à l’aide de
techniques d’analyses appropriées comme les indices de diversité, les courbes de raréfactions,
4
l’Analyse en Composantes Principales (ACP) ou bien encore par la méthode du maximum de
parcimonie, la diversité et la structure de la communauté fongique sont également évaluées pour
chacune des plantations d’arbres. In fine, sur la base de tous ces éléments, nous discutons (i) :
l’importance que revêtent les écosystèmes fongiques comme rôle dans la structuration et le
fonctionnement des biocénoses forestières des milieux tempérés mais également de l’impact de
l’essence forestière sur la structuration même de la communauté fongique à des échelles locales.
(ii) : l’intérêt d’accroître les connaissances scientifiques sur les communautés fongiques et la
nécessité d’avoir une estimation stable et fiable de la diversité fongique pour aborder, avec des
perspectives nouvelles les questions essentielles, notamment celle de la conservation de la
biodiversité. (iii) : de l’approche de la diversité fongique par pyroséquençage et de son
application sur les régions ITS.
Matériel et méthodes
Remarque préliminaire : Initialement, l’objet de ce stage de recherche de Master 2 consistait à reconsidérer
l’hypothèse de préférence d’hôte chez les champignons mycorhiziens à arbuscules MA (Vandenkoornhuyse et al.
2002b ; Vandenkoornhuyse et al. 2003). Un élargissement de son champ d’application pouvait être alors envisagé
aujourd’hui par l’étude des ADNs anciens (fossiles d’écosystèmes passés) en reliant la diversité des plantes
(Willerslev et al. 2007) à celle des communautés de champignons MA. Si l’hypothèse de travail s’était avérée juste,
une modification concomitante de la diversité des champignons MA avec la diversité végétale était attendue grâce à
une analyse de séquençage de masse (pyroséquençage 454) sur les amplicons obtenus. Malheureusement, l'approche
n’a pas pu aboutir car l’amplification de l’ADN ancien n’a pas fonctionné et cette approche évolutive très originale
de compréhension de milieux passés par l’utilisation d’ADNs anciens a été mise de coté et une réorientation a été
opérée (hypothèses de travail présentées en introduction).
Objet et site d’étude
Les prélèvements ont été effectués sur six sols forestiers d’un même dispositif
expérimental (ORE Breuil-Chenue, Morvan, France, latitude 47°18’10’’, longitude 4°4’44’’) et
correspondant à six plantations d’essences différentes (Fig. 2 ; Buée et al. 2009). Ces plantations
comprennent 2 espèces de la famille des Fagaceae : le chêne (Quercus sessiflora) et le hêtre
(Fagus sylvatica) et 4 espèces de Pinaceae : le douglas (Pseudotsuga menziesii), l’épicéa
commun (Picea abies), le pin laricio de Corse (Pinus nigra) et le sapin de Nordmann (Abies
nordmanniana). Pour chacune de ces plantations, 8 prélèvements de sol (1 x 1 x 5 cm de
profondeur) ont été échantillonnés indépendamment les uns des autres. Après l’enlèvement de la
5
litière forestière, les 48 prélèvements de sol sont échantillonnés dans l’horizon organique
(profondeur 0-5 cm). Ils sont ensuite homogénéisés indépendamment et les débris de bois et de
racines (>2 mm) sont éliminés. Pour l’extraction d’ADN, 500 mg sont utilisés pour chaque
prélèvement de sol. Cet ADN est extrait par kit d’extraction de sol (Mobio) afin de déterminer la
diversité fongique présente dans les racines de ces six espèces d’arbres par la technique du
pyroséquençage de masse (454 Life Science/Roche).
Figure 2 : Schéma du plan du site expérimental de l’étude de Breuil (modifié d’après INRA Nancy)
Préparation des amorces et amplification de l’ADN ribosomal
Dans le cadre de l’exploration de la diversité des champignons dicaryotes et de
l’identification des taxa grâce à l’amplification génétique, le choix s’est porté sur la région ITS
de l'unité ribosomale nucléaire des symbiontes fongiques conformément à ce qui était prévu dans
le projet ANR. Il est admis que ces régions sont des marqueurs d’espèce intéressant compte tenu
de leur variabilité (Gardes et al. 1991 ; Gardes & Bruns 1993 et 1996). L’usage de l’ITS comme
code-barre ADN pour l’identification de nombreuses espèces fongiques se développe (Seifert
2009). L’étude se focalise plus précisément sur la zone ITS1, située entre l’ADNr 18S et l’ADNr
5,8S (Fig.3). Les deux amorces choisies ici, ont déjà été testées et utilisées dans diverses
publications (Gardes et al. 1991 ; Martin & Rygiewicz 2005). Il s’agit de l’amorce sens ITS1F
(5’-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3’) spécifique aux champignons (Gardes & Bruns
1993) et de l’amorce anti-sens ITS2 (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’) qui est, par contre,
universelle (White et al. 1990). Ce couple d’amorces présente deux avantages majeurs pour cette
étude : (1) il est compatible avec l’ADNr de la grande majorité des champignons Ascomycètes et
6
Basidiomycètes et (2) il permet la synthèse d’un fragment court d’ADN d’environ 250 pairs de
base (pb), appelé amplicon, séquençable par séquençage de masse 454 GS FLX.
Figure 3 : Schéma du couple d’amorces fusionnées au sein de la région intergénique transcrite (modifié
d’après Roche et INRA Nancy)
Afin de réaliser ce séquençage de masse d’un demi-run à 6 amplicons (avec 8 échantillons
pour chaque amplicon), il est nécessaire, tout d’abord, de reconnaître ces amplicons les uns des
autres. Pour cela, chacun d’entre eux ont été 'taggués', c’est à dire qu’ils possèdent une clé (ou 'tag')
permettant de les différencier. De plus, les amorces ITS1F et ITS2 doivent être précédées chacune
d’un adaptateur directionnel A ou B (Lib-A Chemistry permettant de réaliser un séquençage
d’amplicons bidirectionnel) pour que le pyroséquençage puisse débuter. Au final, l’association de ces
trois parties forment ce que l’on nomme communément les amorces fusionnées (Fig. 3) qui seront
utilisées telles quelles lors du pyroséquençage. Néanmoins, il est essentiel de vérifier que les amorces
fusionnées ne forment pas de structures secondaires (niveau d’énergie fixé inférieur à 3 Kcal/mol), à
l’aide d’un logiciel d’analyse de structure (e.g. EMBOSS sur le site Bioweb.Pasteur). En outre, il est
important de réaliser un BLASTn sur NCBI (National Center for Biotechnology Information) pour
vérifier la compatibilité des amorces aux cibles potentielles en accrochant uniquement les
champignons dicaryotes. Après l’obtention des amorces fusionnées, les 8 échantillons de sol vont être
amplifiés par PCR indépendamment pour chaque traitement avant de passer à l’étape proprement dite
du pyroséquençage. Ces réactions d’amplification de l’ADNr cible ont été réalisées à l’INRA de
Nancy. Pour le jeu d’amorces ITS1F (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’) / ITS2rev (5’-
GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’), le mélange réactionnel d’amplification était le suivant : 0,5 μg
d’ADN environnemental extrait, 5 μl de tampon de PCR 1X (contenant 15 mM de MgCl2), 4 μl de
déxoxyribonucléotides-triphosphate (dNTP à 1,25 mM, composé de dATP, dCTP, dGTP et dTTP), 1
μM d’amorce sens, 1 μM d’amorce anti-sens et 0.5 μl de Taq Gold-ADN polymérase (5 U/μl) et 50 μl
qsp d’eau ultra pure, Le cycle d’amplification consiste en une première étape de dénaturation de
l’ADN à 94°C pendant 2 minutes, suivi d’un cycle de 30 secondes à 94°C, 45 secondes à 53°C et 45
7
secondes à 72°C. Ce cycle est répété 30 fois. Une étape d’élongation finale de 5 min à 72°C achève
l’amplification par PCR. Les amplicons sont ensuite purifiés (High Pure PCR product, Roche), puis
dosés et mélangés pour être pyroséquencés.
Pyroséquençage de masse
Le principe de base de la méthode consiste à lier une amorce à l’ADN cible de taille
inférieure à 500 pb, puis à ajouter séquentiellement et dans l’ordre une base à partir de l’extrémité
de l’amorce (Shapiro, 2008). La séquence est ainsi déduite en fonction de l’ordre d’incorporation
des nucléotides sur l’ADN complémentaire de la cible néosynthétisée (Fig. 4). Quatre enzymes
sont nécessaires pour la réaction : une ADN polymérase, une ATP sulfurase, une luciférase et une
apyrase. Dans le cadre de ce stage, c’est le système Genome Sequencer FLX (GS-FLX) de chez
Roche (Fig. 4), séquenceur d’ADN à très haut débit de deuxième génération, qui est utilisé pour
séquencer des fragments de brins d’ADN. Un demi-run a été effectué au Génoscope en juin
(chimie flx). Cette méthode de séquençage permet ainsi de réduire les coûts de manière
significative tout en augmentant le débit et en conservant une haute qualité de résultat. La
méthode suivie et le matériel utilisé sont ceux préconisés par la société Roche.
Figure 4 : Principe du pyroséquençage : technique d’addition séquentielle de nucléotides en temps réel
(d’après Lamoril et al. 2008) à l’aide du pyroséquenceur GS-FLX (Roche)
On procède tout d’abord à l’amplification clonale des molécules d’ADN sb par l’usage de
microbilles. Elles permettent de fixer une molécule d’ADN sb à la fois avec en surface des
amorces complémentaires à un des adaptateurs. Les microbilles porteuses des brins d’ADN sb
sont mises en émulsion en présence des réactifs pour PCR. Chaque goûte (microréacteurs)
englobe une microbille et donc une molécule d’ADN, ce qui permet une amplification clonale de
chaque fragments (Fig. 5). Les ADN sb proviennent directement des amplicons produits après
amplification des ADNs extraits des sols. Les amplicons produits par l’INRA ont été mélangés
pour un type de forêt donné.
8
Figure 5 : Amplification clonale en émulsion (modifié d’après Roche)
Après amplification, les microgouttelettes (microréacteurs) sont dissociées et enrichies
puis déposées sur une plaque en fibre optique 1,6 million de puits. Les puits possèdent un
diamètre qui assure le dépôt d’une microbille par puits (Fig. 6). Avec ce système, 200000
réactions de séquençage peuvent se faire en parallèle pour un demi-run en version FLX. Le
séquençage se fait selon le principe de pyroséquençage décris ci-dessus. Une caméra CCD
(Charge Coupled Device) permet de capturer les images après addition de chaque nucléotide.
Figure 6 : Dépôt des billes portant la banque d’ADN sb (modifié d’après Roche)
Outils de traitement bioinformatique
L’analyse de données issues du pyroséquençage nécessite une puissance informatique
considérable. Ceci est principalement lié à la quantité de séquences générées par le
pyroséquençage. Dans notre travail, ce sont 166349 lectures qui sont analysées. Ces séquences
sont soumises à un nettoyage avec plusieurs niveaux de filtres (motifs répétés, au moins 1 base
indéterminée, taille comprise entre 50 et 600 pb). Au final, 158297 séquences ont passé les filtres.
Elles sont ensuite traitées par échantillon avant d’être traitées par le logiciel Hassium
(HAplotypic Successive Separation and Identification User Manager), développé par l’équipe
B@sic de l’Université de Rennes 1 (Nicolas 2009). Ce logiciel a permis de ne garder que les
séquences qui étaient bornées par le couple d’amorces ITS1F/ITS2rev (en enlevant les erreurs de
séquençage) et de regrouper ces dernières en groupe de séquences redondantes (voir annexe 1)
par clusterisation avec un taux d’homologie à 99% pour avoir un « cut off » stringent
comparativement à d’autres études (e.g. Nilsson et al. 2008). Toutes les séquences non
redondantes (les singletons) ont été mises de côté car elles présentent le risque de correspondre à
9
des séquences artificielles. A partir de ce jeu de données obtenu, plusieurs analyses ont été
effectuées.
A l’aide du logiciel statistique EstimateS (Colwell et al. 2004), des courbes de raréfaction
(basées sur des échantillons dans la terminologie de Gotelli & Colwell 2001) avec des intervalles
de confiances de 95% ainsi que des courbes de bootstrap (tirage avec remise) ont été construites
en utilisant les formules analytiques de Colwell et al. (2004). La fonction de la richesse attendue
est appelée « Mao Tau » dans EstimateS et se base sur les estimateurs Chao1 et Chao2
développés par Chao (1984, 1987). Ces courbes ont ainsi été réalisées à partir des données
initiales pour évaluer la redondance des OTUs. Par ailleurs, les séquences ITS possédant les
groupes de redondance les plus importants dans chacun des 6 sols forestiers, ont été comparées
aux séquences contenues dans la banque de gènes internationale par analyse BLASTn sur les sites
NCBI (Altschul et al. 1997) et UNITE (Abarenkov et al. 2010 ; Kõljalg et al. 2005) dans le but
d’obtenir des séquences consensus représentant chacun des genres présents dans les échantillons
étudiés. Ces genres ont été regroupés dans un même tableau et plusieurs calculs d’abondance ont
été réalisés afin d’avoir une estimation de la représentativité des genres obtenus sur l’ensemble
des données et au sein de chaque sol forestier. Enfin, des calculs de diversité alpha et bêta ont été
réalisés pour compléter ces résultats. La diversité α, c’est à dire la richesse en espèces au sein
d’un écosystème local, a été calculée conjointement à partir des indices de diversité de Shannon
(1948) accompagné de l’indice d’équitabilité de Piélou (1966) ainsi que de l’indice de diversité
de Simpson (1949) afin d’extraire un maximum d’informations et de mieux comprendre la
structure des communautés :
D : Indice de diversité de Simpson
H’: Indice de diversité de Shannon
- D = 1 - ∑ Ni (Ni - 1) / N (N - 1) J : Equitabilité de Piélou
- H’ = - ∑ ((Ni / N) x Log2 (Ni / N) Ni : Nombre d’individus d’une espèce
- J = H’ / Log S donnée, i allant de 1 à S
N : Nombre total d’individus
S : Nombre total d’espèces
La diversité β, c'est-à-dire la comparaison de la diversité des espèces entre écosystèmes, a été
calculée à partir de l’indice de Sørensen (1948) et basée sur les OTUs les plus fréquents :
C : Nombre d’espèces communes aux 2 communautés
- β = 2c / (S1 + S2) S1 : Nombre total d’espèces enregistrées dans la première communauté
S2 : Nombre total d’espèces enregistrées dans la seconde communauté
D’autre part, les séquences connues et obtenues sur les sites NCBI et UNITE ont été
alignées avec les séquences principales de chaque espèce d’arbre sous Clustal X 2.0 (Thompson
10
et al. 1997), selon le principe d’alignement multiple global, afin de procéder à une comparaison
deux à deux des espèces végétales avec une homologie inférieure à 2% contenant les différents
phylotypes fongiques par calcul de distances euclidiennes. Ce pourcentage d’homologie a été
choisi car les calculs de distances entre séquences connues de la même espèce (sur le site UNITE)
ont montré une variation ≤ 5%. A partir de ces résultats, une matrice de présence/absence a été
constituée afin de produire une ACP (Analyse en Composantes Principales) pour comparer les
communiés fongiques des différents sols étudiés via le logiciel statistique R 2.8.0 (voir annexe 2).
De même, un dendrogramme est construit grâce aux données de l’ACP pour illustrer
l'arrangement de groupes générés par un regroupement ascendant hiérarchique. Un second type
de comparaison de communautés est réalisé par analyse de parcimonie maximale (MP), à l’aide
du logiciel PAUP 4.0 β 10 (expliqué ci-dessous). L’alignement Clustal X a permis de créer une
matrice pour l’analyse de clusters des champignons dicaryotes. L’approche utilisée est également
l’analyse MP. Pour toutes les reconstructions par MP, une analyse heuristique a été effectuée où
50 réplicats d'addition aléatoire de séquences sont réalisés et couplés avec l’algorithme TBR
(Tree-Bisection-Reconnection) cassant l’arbre en deux sous-arbres qui sont ensuite reconnectés à
partir d’une de leurs arêtes (Goëffon et al. 2005). Cette méthode vise ainsi à retrouver la
phylogénie qui minimise le nombre d’évènements évolutifs (substitutions nucléotidiques)
nécessaires pour expliquer les différences observées entre OTUs. Il est important de souligner
que cette approche telle qu'elle est utilisée ici ne sert pas à réaliser des arbres phylogénétiques
mais à réaliser une clusterisation des taxons. De surcroît, cette nouvelle approche servira d’un
côté à analyser le degré de proximité entre les OTUs et les séquences types connues et d’un autre
côté, à réaliser à nouveau des comparaisons deux à deux (entre espèces d’arbre) mais cette fois-ci
en intégrant également les séquences connues des différents genres fongiques présents.
Résultats
Analyse des séquences par clustering d’OTUs
Nombre d’OTUs et courbes de raréfaction
Après filtration des 166349 séquences (réparties équitablement entre les essences
forestières), le nombre de séquences par échantillon est compris entre 5010 et 11957 si l’on ne
tient pas compte des singletons (Tableau I). En ce qui concerne le nombre d’OTUs (groupes de
séquences de redondance), nous mettons en évidence de 315 à 502 OTUs sans singletons. On
remarque donc des variations dans le nombre d’OTUs en fonction du type de forêt sans relation
nécessaire avec le nombre de séquences (Tableau I). Toutes les analyses qui suivent sont faites
11
sans les singletons afin d’éviter au maximum le risque d’avoir des séquences artificielles (justifié
dans la section matériel et méthodes).
Tableau I : Nombre de séquences et d'OTUs avec ou sans singletons après filtrage et clustering à 99%
Espèces Sans singletons Avec singletons
Nombre d'OTUs Nombre de séquences Nombre d'OTUs Nombre de séquences
Q, sessiflora 315 5010 551 5246
P. menziesii 384 8777 678 9071
P. abies 502 11957 914 12369
F. sylvatica 381 10104 694 10417
P. nigra 479 9920 839 10280
A. nordmanniana 478 10546 850 10918
Les courbes de raréfaction calculées avec le logiciel EstimateS (Colwell, 2004) tendent
asymptotiquement vers un plateau, indiquant que l’effort d’échantillonnage est satisfaisant pour
décrire la diversité des champignons dicaryotes dans les parcelles respectives de Q. sessiflora, de
P. menziesii, de P. abies, de F. sylvatica, de P. nigra et de A. nordmanniana (Fig. 7 et 8). La
courbe de bootstrap tend aussi vers une valeur maximale avec une saturation plus rapide que la
courbe Sobs (Fig. 7 et 8).
Figure 7 : Estimation de la diversité maximale des champignons dicaryotes dans la parcelle de Q. sessiflora
On peut noter que les plateaux des différentes courbes de raréfaction ne se situent pas à la
même hauteur. La diversité maximale de champignons dicaryotes dans la chênaie (Q. sessiflora)
semble tendre vers 320 OTUs (Fig. 7). Celle des champignons dicaryotes de la pinède (P.
menziesii) et de la hêtraie (F. sylvatica) atteignent 400 OTUs tandis que celle des pinèdes (P.
nigra et A. nordmanniana) atteignent près de 500 OTUs (résultats non présentés). C’est au niveau
de la parcelle à P. abies que la diversité maximale des dicaryotes semble être la plus forte avec
12
près de 520 OTUs (Fig. 8). Il semblerait donc que les parcelles à conifères soient associées à une
diversité fongique plus importante que dans les 2 autres parcelles à Fagaceae.
Figure 8 : Estimation de la diversité maximale des champignons dicaryotes dans la parcelle de P. abies
Distribution des OTUs et composition des communautés fongiques
Parmi cette diversité fongique, les OTUs présentant le plus grand nombre de séquences
(entre 23 et 27 OTUs correspondant à 71,92% des séquences totales) ont été analysées finement
(Tableau II). Ainsi, on dénombre au total 8 genres appartenant au phylum des Ascomycètes et
ayant tous un mode de vie saprophyte. Les genres les plus fréquents sont respectivement
Crocicrea (2,83 OTUs en moyenne) et Trichopezizella (1,83 OTUs en moyenne), tous les deux
membres de l’ordre des Leotiales. Le phylum des Basidiomycètes se voit attribué 7 genres de
champignons qui sont tous des ectomycorhizes Les genres les plus fréquents sont respectivement
Cortinarius (4,83 OTUs en moyenne), Serpula (4,67 OTUs en moyenne) et Suillus (4,17 OTUs
en moyenne), provenant tous les 3 de l’ordre des Boletales. A un niveau hiérarchique supérieur,
on observe un fort déséquilibre en abondance entre les 2 phyla. En effet, parmi les 71,92% des
séquences les plus abondantes, les Ascomycètes ne représentent que 15,62% des séquences
contre 84,38% de Basidiomycètes. On peut noter également que l’abondance des Ascomycètes
est peu variable entre les essences forestières (entre 12,46% pour la parcelle à P. nigra et 19,93%
pour la parcelle à Q. sessiflora) tout comme celle des Basidiomycètes (entre 63,97% pour la
parcelle à Q. sessiflora et 77,56% pour la parcelle à P. nigra). Enfin, même si l’abondance des
Basidiomycètes est beaucoup plus élevée que celle des Ascomycètes pour toutes les parcelles
forestières, on observe des différences dans la composition en genre de champignons. Il est à
noter que les amorces utilisées n'ont pas de biais d'amplification connu entre Ascomycetes et
Basiodiomycetes. Certains genres ne sont pas présents partout, par exemple le genre Tylospora
13
(Basidiomycète) qui n’est présent que dans le sol forestier à P. abies ou bien le genre
Cenangiopsis qui n’est présent que dans la parcelle à P. menziesii. De même, certains genres sont
présents partout (Tableau II). A un grain grossier, on s’aperçoit donc qu’il existe des différences
au niveau de la composition des communautés de chacune des espèces d’arbres (diversité α) et au
niveau de la diversité des genres entres les espèces d’arbres (diversité β) qui peuvent être
intéressantes à analyser.
Tableau II : Détermination taxonomique au niveau du genre et calculs d’abondance relative des OTUs les plus
fréquents dans chacun des types forestiers
Phylum Règne Types forestiers
Moyenne Chêne Douglas Epicéa Hêtre Pin Sapin
Nombre total d'OTUs 27 24 23 24 23 26 24,5
Abondance totale des séquences
au sein de la communauté 63,97% 74,58% 69,59% 77,56% 72,74% 73,05% 71,92%
Basidiomycota
Cortinarius 3 3 5 8 5 5 4,83
Amanita 1 1 1 1 4 1 1,50
Boletus 1 0 1 0 2 1 0,83
Tomentella 0 1 1 1 0 1 0,67
Serpula 4 5 8 4 4 3 4,67
Suillus 3 6 1 5 4 6 4,17
Tylospora 0 0 1 0 0 0 0,17
Abondance relative des séquences
au sein de la communauté 80,07% 87,09% 81.79% 84,84% 87,54% 85,00% 84,38%
Ascomycota
Lachnum 1 0 0 0 0 1 0,33
Crocicrea 4 4 2 3 2 2 2,83
Hypomyces 2 0 0 1 1 0 0,67
Cladobotryum 4 1 0 0 0 2 1,17
Allophylaria 1 0 0 0 0 0 0,17
Belonopsis 0 1 1 0 0 1 0,5
Cenangiopsis 0 1 0 0 0 0 0,17
Trichopezizella 3 1 2 1 1 3 1,83
Abondance relative des séquences
au sein de la communauté 19,93% 12,91% 18,21% 15,16% 12,46% 15,00% 15,62%
Analyse de la diversité fongique
Richesse spécifique
En termes de diversité α (Tableau III), l’indice de diversité synthétique de Shannon
indique que les espèces Q. sessiflora (H’= 4,40) et P. abies (H’= 4,07) sont celles qui présentent
l’indice le plus élevé et la répartition des espèces la plus uniforme (J = 0,76 pour Q. sessiflora et J
= 0,65 pour P. abies). C’est par contre F. sylvatica (H’= 3,43) qui présente la répartition la moins
équitable entre espèces (J = 0,58). L’indice de diversité de Simpson, quant à lui, montre de très
fortes valeurs proche de 1 (D compris ente 0,87 et 0,96) notamment Q. sessiflora (D= 0,96) et P.
14
abies (D= 0,93), ce qui indique que la diversité fongique est extrêmement élevée. Cela s’explique
par le fait que beaucoup de séquences de redondance faible forment des OTUs différents.
Tableau III : Représentation de la diversité α au sein de chaque parcelle forestière
Espèces Indice de diversité de
Shannon (H’)
Indice de diversité de
Simpson (D) Indice d'équitabilité (J)
Q. sessiflora 4.40 0.96 0.76
P. menziesii 3.52 0.87 0.59
P. abies 4.07 0.93 0.65
F. sylvatica 3.43 0.87 0.58
P. nigra 3.71 0.89 0.60
A. nordmanniana 3.81 0.90 0.61
Comparaison des communautés
En ce qui concerne la diversité β, les calculs d’indices de diversité de Sørensen ont été
réalisés à partir des OTUs les plus fréquentes représentant 71,92% en moyenne de l'ensemble des
séquences. Les résultats obtenus (Tableau IV), semblent indiquer que les communautés les plus
proches soient F. Sylvatica et A. Nordmanniana (β = 0,68) ainsi que F. Sylvatica et P. nigra (β =
0,64). De plus, F. Sylvatica semble avoir une communauté assez proche de P. menziesii et de P.
abies où plus de 50% des genres seraient communs. Il en a va de même entre P. nigra et A.
Nordmanniana (β = 0,51). Par ailleurs, Q. sessiflora semble avoir la communauté la plus distincte
des autres avec des indices de diversité de Sørensen compris entre 0,35 et 0,38.
Tableau IV : Représentation de la diversité β par les calculs de diversité de Sørensen par paires de
communautés
Espèces Q. sessiflora P. menziesii P. abies F. sylvatica P. nigra A. nordmanniana
Q. sessiflora —
P. menziesii 0,35 —
P. abies 0,36 0,43 —
F. sylvatica 0,35 0,54 0,5 —
P. nigra 0,36 0,47 0,4 0,64 —
A. nordmanniana 0,38 0,48 0,45 0,68 0,51 —
Pour aller plus loin, des analyses statistiques ont été menées afin d’obtenir une meilleure
vision de la diversité fongique entre sols forestiers. L’ACP permet de mieux représenter les
données dans un espace vectoriel (Fig. 10). On obtient 2 axes qui expliquent 51,99% de la
variance. L’axe 1 permet d’expliquer 30,29% de l’inertie générale. C’est la communauté
fongique de la parcelle à Q. sessiflora qui contribue essentiellement à cet axe (66,06%). L’axe 2
qui possède une inertie de 21,70% est principalement du à la contribution de la communauté
fongique de la parcelle à P. menziesii (63,07%).
15
Figure 9: Analyse en composantes principales (ACP) de la diversité fongique entre 6 essences forestières
distinctes
Ces résultats semblent indiquer que Q. sessiflora possède une diversité fongique
relativement différentes des autres espèces tout comme P. menziesii. Quant à P. abies, F.
sylvatica, P. nigra et A. nordmanniana, l’ACP les place dans la même zone ce qui pourrait sous-
tendre une diversité fongique plus commune. C’est d’ailleurs ce que suggère le dendrogramme
associé avec cette ACP qui indique une diversité fongique assez proche entre F. sylvatica, P.
nigra et A. nordmanniana et dans une moindre mesure P. abies (Fig.10). Il montre par ailleurs
que ce serait la diversité fongique de P. menziesii qui se rapprocherait le plus de Q. sessiflora. Un
second type de construction a également été utilisé à partir de cette matrice présence/absence,
l’analyse MP, afin de renforcer l’analyse de la diversité au sein des racines des espèces d’arbres
forestières (Fig. 11). Les résultats indiquent que seules F. sylvatica et A. nordmanniana possèdent
une diversité fongique relativement commune (score de 77) et que l’on ne peut pas être sûr pour
les autres espèces. Lors des calculs de diversité de Sørensen, c’était également la valeur la plus
élevée (β= 0,68).
Figure 10 : Dendrogramme des espèces d'arbres réalisé à partir des points ACP
16
Figure 11 : Arbre phylogénétique non raciné basé
sur la comparaison de la diversité fongique de 6
sols d’essence d’arbres distinctes. Il est construit à
partir de la méthode du maximum de parcimonie
par l’utilisation de l’algorithme TBR (Tree-
Bisection-Reconnection) pour un nombre de 50
réplicats
Comparaison entre OTUs et séquences fongiques connues
La composition de la diversité fongique, au sein des communautés des différents sols
forestiers, peut être comparée avec des séquences fongiques connues. La création d’arbres non
enracinés par la méthode MP permet ainsi d’analyser le degré de proximité de ces séquences types
avec les OTUs présents. Sur le nombre total de réarrangements testés (1185546), 3 arbres
équiprobables pour les séquences issues de la parcelle à Q. sessiflora (Fig. 12). Cet arbre non enraciné
est plutôt robuste car la majorité des embranchements ont des valeurs de bootstrap > 70% (29 sur 35).
Ensuite, on s’aperçoit que toutes les séquences connues des genres fongiques Basidiomycètes sont
regroupées ensembles (score de 75) sans OTUs de la parcelle à Q. sessiflora. Par opposition, les
séquences connues des genres fongiques Ascomycètes sont dispersées, ce qui indique une proximité
plus importante avec certaines des séquences environnementales. Par exemple, un OTU est affilié au
genre Lachnum (score de 100) et on observe la même chose pour le genre Allophylaria. Les autres
arbres réalisés pour les 5 autres essences de plantation indiquent des résultats similaires (résultats non
présentés). On peut donc en déduire que la plupart des OTUs dans les Basidiomycètes sont inconnus
(Fig. 12).
Le même type de travail peut-être réalisé en mélangeant les séquences de communauté
différentes. La reconstruction (Fig. 12) compare les séquences de parcelles de F. sylvatica et P.
nigra. On retrouve des groupes d’OTUs spécifiques à F. sylvatica ou à P. nigra (boostrap > 95) mais
aussi des regroupements d’OTUs communs aux 2 parcelles. Il existe donc bien des familles voir des
genres de champignons Ascomycètes présents dans des essences forestières distinctes. On retrouve
également dans ces groupes d’OTUs des séquences types appartenant soit à P. nigra (Cenangiopsis)
ou à F. Sylvatica (Trichopezizella). Par ailleurs, les séquences types de Basidiomycètes sont à
nouveau regroupées (Figure 13). Enfin, des résultats similaires ont été observés lors de la
comparaison des communautés fongiques entre Q. sessiflora et P. menziesii (résultats non présentés).
17
Figure 12 : Reconstruction phylogénétique non enraciné obtenue par maximum de parcimonie (MP) des
séquences ITS les plus abondantes (parcelle à Q. sessiflora) incluant les plus proches séquences relatives aux
OTUs (BLASTn et UNITE). Méthode MP (Bootstraps calculés à partir de 200 pseudo-réplicats) par
utilisation de l’algorithme TBR (Tree-Bisection-Reconnection) pour 50 réplicats aléatoires de séquences.
Figure 13 : Reconstruction phylogénétique non enraciné obtenue par maximum de parcimonie (MP) des
séquences ITS les plus abondantes (parcelles à F. sylvatica et P. nigra) incluant les plus proches séquences
relatives aux OTUs (BLASTn et UNITE). Méthode MP (Bootstraps calculés à partir de 200 pseudo-réplicats)
par utilisation de l’algorithme TBR (Tree-Bisection-Reconnection) pour 50 réplicats d'addition aléatoire de
séquences. Les lettres P indiquent que les OTUs sont des séquences de la parcelle de pin (P. nigra) et les H
celles de la parcelle du Hêtre (F. sylvatica). En rouge sont indiquées les séquences communes aux 2 parcelles,
en vert uniquement pour P. nigra et en bleu uniquement pour F. sylvatica
18
Discussion
Importance de la composition et de la diversité fongique dans la structure et le
fonctionnement des écosystèmes forestiers en milieu tempéré
Caractérisation de la diversité fongique
A travers cette étude, nous avons tenté de décrire et d’évaluer la diversité fongique au sein
de différents écosystèmes forestiers par la méthode du pyroséquençage. Les résultats impliquent
donc deux observations principales. Tout d’abord, la diversité fongique est très élevée dans les
écosystèmes forestiers (Indice de Simpson très proche de 1) et en accord avec d’autres travaux
(Jumpponen & Jones 2009 ; Jumpponen et al. 2010). Bien que la diversité fongique soit très
élevée, elle n’est pas la même selon l’essence forestière. Il semblerait que les espèces d’arbres de
la famille des Fagaceae telles Q. sessiflora ou F. sylvatica interagissent avec une diversité
fongique plus faible que les espèces d’arbres de la famille des Pinaceae telles que P. menziesii,
P. abies, P. nigra ou encore A. nordmanniana. La communauté fongique semblerait donc être
fortement structurée par l’essence forestière. L’hypothèse de travail H0 selon laquelle le type de
plantation forestière conduit à une différentiation des communautés fongiques au sol ne peut pas
être rejetée. Par ailleurs, une étude similaire menée par Buée et al. (2009) conduite sur le même
site affiche des résultats différents. Les courbes de raréfaction obtenues, avec chacune des 6
essences de plantations, n’accèdent pas à un plateau même après plus de 25000 séquences. Ce qui
a pour incidence première que le run de pyroséquençage n’a pas permis de tendre vers la diversité
fongique totale attendue. Cette différence dans les résultats s’explique par les conditions de
filtrage des données. Ici, nous n’utilisons que des séquences bornées par les amorces utilisées
(séquences complètes) qui satisfont aux algorithmes de clusterisation développés aujourd’hui.
Doit-on également garder les singletons dans l’analyse sachant qu’ils sont des risques possibles
d’erreurs de séquençage (fiable à 99,9%, soit une erreur environ tous les kb) ? Le degré de
restriction apportée aux données peut aboutir à des conclusions et interprétations différentes
surtout lorsque les études en question cherchent à déterminer précisément la diversité spécifique
totale. En effet, les algorithmes sont basés en premier lieu sur la composition physique des
séquences. Une erreur dans un homopolymère induit de façon erronée le dénombrement d’un
OTU additionnel. Pour notre part, le choix d’une stringence élevée permet de se prémunir d’une
surestimation profonde de la diversité fongique.
Composition et structure des communautés fongiques
Quelque soit le type de parcelle, ce sont les OTUs proches des champignons
basidiomycètes ECM qui sont les plus fréquents (abondance comprise au moins entre 80,07 et
19
87,54% selon l’essence forestière) avec Cortinarius, Serpula et Suillus provenant tous de l’ordre
des Boletales. En accord avec ce résultat, un faible nombre de taxons de champignons ECM ont
une abondance très élevée (> 50%) et sont largement répandus alors que la majorité des espèces
ne sont que rarement rencontrées (Dahlberg et al. 1997 ; Gehring et al. 1998 ; Jonsson et al.
1999). Parmi les Ascomycètes, ce sont les genres Crocicrea et Trichopezizella tous les deux
membres de l’ordre des Leotiales qui sont les plus représentés. La richesse spécifique de ces
décomposeurs met en relief le rôle essentiel de ces organismes dans le cycle de minéralisation de
la matière organique par la formation des tissus mycéliens très denses (Deacon et al. 2006).
Néanmoins, il est assez unanimement reconnu que les champignons mycorhiziens sont plus
étroitement dépendants de la nature de leur environnement biotique que les champignons
saprophytes, à plus grande amplitude trophique et relativement tolérants (Guinberteau &
Courtecuisse 1997). Même si des spécificités étroites existent également, ces derniers pourront
s’adapter et coloniser souvent plusieurs sources de substratums, d’origine forestière parfois très
différente (Guinberteau & Courtecuisse 1997).
Les calculs d’indices de diversité β (Fig. 9 à 11) indiquent qu’il existe des différences
entre communautés avec notamment une forte différenciation de la communauté fongique de la
parcelle à Q. sessiflora. En revanche les communautés les plus proches seraient celles de la
parcelle à F. sylvatica et à P. nigra alors que ces deux espèces ne font pas partie de la même
famille (Fagaceae et F. sylvatica). De plus, la plupart des Basidiomycètes reconnus (malgré les
limites intrinsèques de l'ITS, voir ci-après) sont retrouvés associés à 4 des 6 essences de
plantations. La spécificité d'hôte étroite, qu’on peut retrouver chez les champignons ECM, peut
être parfois élargie à plusieurs hôtes s’il s’agit d’un peuplement mixte ou mélangé (Molina et al.
1992). Par exemple, Horton et Bruns (1998) ont montré que les champignons ECM avaient
tendance à être des individus multi-hôtes lorsqu’ils étaient dans des forêts mélangés d’espèces de
la famille des Pinaceae. Nous avons travailler ici sur le sol de 6 parcelles sylvicoles différentes. Il
ne peut pas être exclus que les mélanges observés correspondent à une exploration large du sol en
terme de distance à partir de l'arbre mycorhizé aboutissant à ce mélange apparent. Néanmoins,
nos résultats indiquent que les espèces d'arbres hôtes sont des déterminants majeurs de la
composition des communautés d'asco-basidiomycetes du sol en accord avec Ishida et al. (2002)
et Molina et al. (1992). Ce résultat pourrait être obtenu par « chance » car une hétérogénéité
locale ne peux pas être exclue. Cet élément n’a pu être évalué en raison du plan d’expérience
choisi. Il aurait été intéressant de traiter séparément les 8 échantillons prélevés d’une parcelle
forestière donnée. En effet, concernant les écosystèmes forestiers de résineux, Gardes et Bruns
(1996) ont montré que la variation spatiale des champignons ECM était très élevée et que la
plupart des espèces montrait des distributions agrégées. Une étude sur Pinus edulis montre
20
d’ailleurs qu’un ou quelques taxons fongiques ECM sont dominants parmi les arbres isolés mais
que l’espèce dominante variait entre les arbres (Gehring et al. 1998). Par ailleurs, nous n’avons
pas d’éléments sur la variabilité temporelle de la composition des communautés fongiques du sol.
Les communautés fongiques dans le sol doivent être dépendantes de facteurs confondants
dépendant du contexte bioclimatique. Il aurait alors été intéressant d’intégrer dans le plan
d’expérience la saisonnalité, par exemple, en effectuant des prélèvements à différents moments
de l’année. En effet, Jumpponen et al. (2010) ont montré qu’il existe des tendances saisonnales
dans la composition et la diversité fongique avec notamment un remplacement des champignons
saprophytes par des champignons ECM au cours de la saison printanière. De même, des analyses
sur 2 sites spécialement distants mais possédant la même essence forestière auraient pu être
réalisées pour apprécier la localisation géographique comme facteur confondant. Jumpponen &
Jones (2009), ont montré que des communautés fongiques présentes dans des sites distincts mais
avec la même essence sylvicole (Quercus macrocarpa) différaient en richesse et diversité. Ce
manque d’informations sur cette variabilité spatio-temporelle est d’autant plus dommageable
qu’elle peut être mise en corrélation avec des facteurs édaphiques, liés notamment aux
modifications du climat, des saisons, de l’hétérogénéité du sol, de sol et de la qualité de la litière
(Erland & Taylor 2002 ; Gehring et al. 1998 ; Koide et al. 2007). Ainsi, et comme c'est le cas
pour d'autres espèces de champignons (saprophytes pour cette étude), la composition de la
communauté ECM est affectée à la fois par des facteurs biotiques et abiotiques. De fortes
modifications de ces facteurs par contraintes environnementales et/ou anthropiques (ici la
sylviculture monospécifique) pourraient fragiliser plus ou moins durablement l’équilibre des
écosystèmes forestiers.
Vers une approche intégrée du Règne fongique dans l’étude des écosystèmes
naturels et/ou anthropisés
Ecologie du paysage et changement d’usage des terres
La conservation de la biodiversité est devenue un enjeu majeur et un défi planétaire
notamment en écologie du paysage et dans le changement d’usage des terres (Dobson et al.
1997). Les champignons et plus particulièrement les champignons mycorhiziens font partie
intégrante de l’écosystème forestier et a fortiori dans de nombreux autres écosystèmes (Smith &
Read 1997). Plusieurs critères existent pour déterminer le potentiel des symbioses
mycorhiziennes dans le but de contraindre ou faciliter ces processus, particulièrement lorsque le
végétal introduit requiert un champignon mycorhizien (Pringle et al. 2009). Malheureusement,
peu de documentations existent sur ce sujet et un critère simple comme les taux et seuils pour les
invasions fongiques dans des environnements naturels sont largement inconnus (Collier &
21
Bidartondo 2009). En conséquence, le rôle clé potentiel des champignons mycorhiziens dans le
processus de colonisation et le processus d'invasion repose essentiellement sur des spéculations
(Richardson et al. 2000). Reads (1991) montre qu’un type d’hôte symbiotique entrant dans un
écosystème dominé par un autre symbionte pourrait dans certains cas avoir des effets profonds
sur l’écosystème car les champignons mycorhiziens structurent certains processus
écosystèmiques. Par exemple, Collier et Bidartondo (2009) ont montré que la perte des habitats
de landes en Angleterre, qui revêt une grande importance dans la mise en œuvre de politique de
conservation, est principalement due à l’invasion du pin et du bouleau par l’intermédiaire des
champignons ECM. En effet, une fois le champignon ECM introduit avec succès dans son nouvel
habitat, il permet de faciliter l’invasion des arbres grâce à ses capacités symbiotiques et d’être
capable de modifier à terme son environnement par le biais des processus écosystèmiques. Pour
influer sur ces processus, Rillig (2004) dénombre 4 voies différentes : des effets du mycélium
(e.g. agrégation du sol), des effets sur les plantes-hôtes à différentes échelles de l’écosystème (e.
g. les cycles des nutriments), des effets sur les communautés microbiennes du sol et des effets sur
la composition des communautés végétales (e. g. production primaire). Cette capacité de
restructuration des écosystèmes via les champignons mycorhiziens a stimulé des travaux ces
dernières années, notamment dans la restauration des habitats et à la gestion rationnelle et durable
des écosystèmes naturels (Pringle et al. 2009), avec en filigrane des connaissances de plus en plus
sophistiquées de la Biologie et l'Ecologie de ces groupes d’organismes du sol. Par ailleurs, il ne
faut pas oublier également le rôle important des champignons saprophytes décomposeurs de
matière organique (Deacon et al. 2006 ; Setälä & McLean 2004). En effet, quelle serait la
variabilité de ces écosystèmes, forestiers notamment, si certaines de ces espèces n'assuraient plus
ce rôle ? Il est admis que de la diversité de ces décomposeurs dépend la complémentarité
fonctionnelle du processus de décomposition. Une altération de cette diversité induirait une
baisse du cyclage des nutriments donc une baisse de production primaire nette (Wardle et al.
2005).
L’Internal Transcribed Spacer (ITS), un marqueur fiable pour la diversité taxonomique
fongique ?
Cette étude a donc utilisé la technique de pyroséquençage pour évaluer la diversité
fongique des sols de 6 parcelles forestières d’essences différentes. La méthode a été appliquée sur
une région ITS particulière, ITS1, de l'unité ribosomale nucléaire des symbiontes fongiques.
Cette région est le locus le plus populaire pour l’identification des espèces et l’inférence
phylogénétique dans la recherche basée sur les séquences mycologiques (Nilsson et al. 2008). En
effet, l’utilisation de primers ITS a été appliquée avec succès dans de nombreuses publications
22
(Gardes & Bruns 1993 ; Martin & Rygiewicz 2005) à tel point que les régions ITS sont
maintenant largement utilisées comme 'barcode' ADN pour l’identification de nombreuses
espèces fongiques (Seifert 2009). Le système UNITE rassemble ces séquences ITS provenant des
Ascomycètes et Basidiomycètes (Abarenkov et al. 2010 ; Kõljalg et al. 2005). Cependant, lors de
cette étude les résultats ont montré des choses étonnantes. Il a ainsi été difficile de caractériser les
séquences taxonomiques obtenues. Ces dernières n’ont pas pu être déterminées au niveau de
l’espèce mais au niveau du genre. Les arbres non enracinés générés par MP ont montré peu de
degré de proximité entre les OTUs et les séquences types les plus proches introduites dans
l’analyse. Ceci indique que la plupart des séquences environnementales générées proviennent
d’espèces ou de genres inconnus. Une difficulté rencontrée dans l’usage de ce type de séquences
est la variabilité très importante y compris à l’intérieur d’une espèce. Cela implique également
que les séquences ITS contiennent un niveau d’information phylogénétique pauvre en raison
d’une accumulation d’évènements d’homoplasie et la fréquence élevée d’évènements de délétions
ou d’insertions (D’Auria et al. 2006).
Plusieurs auteurs se sont interrogés sur la différence existant entre la variabilité
infraspécifique et la variabilité interspécifique de l’ITS (Aanen et al. 2000 ; Horton 2002).
Certains ont suggéré que les divergences entre ITS pourraient ne pas être pleinement corrélées
avec les espèces biologiques si les séquences divergent seulement après un isolement génétique,
comme cela a été proposé pour le champignon ECM Hebeloma (Aanen et al. 2000). Cependant,
d’autres auteurs comme Nilsson et al. (2008) ont montré que la variabilité intraspécifique
inférieure à 3% (limite seuil) prévalait pour 75% des ITS1 et 77% des ITS2. Une meilleure
résolution des séquences environnementales pourrait être rendue possible par l’utilisation du gène
codant pour l’ARNr 18S (Le Calvez et al. 2009 ; Vandenkoornhuyse et al. 2002a).
Conclusion
Le travail réalisé ouvre la voie à de nombreuses questions dans des contextes scientifiques
variés. Il semble clair que les connaissances doivent être approfondies à différentes échelles de
temps et d’espace que ce soit au niveau de l’écologie du paysage (Frost et al. 2001) ou au niveau
d’autres domaines, non discutés dans cette étude, comme la biologie évolutive via l’interprétation
de patterns biogéographiques (Halling et al. 2008). Une perte ou une diminution de la
biodiversité fongique pourrait avoir des conséquences imprévisibles sur le fonctionnement des
écosystèmes et leur capacité de production (Guinberteau & Courtecuisse 1997). Il ne faut pas
perdre de vue la fragilité de l’équilibre des écosystèmes, notamment forestiers, qui sont plus que
jamais soumis à des contraintes environnementales et anthropiques, en particulier face au
changement climatique.
23
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Annexes
Annexe 1 : Traitement des données par le logiciel Hassium
Après filtrage des d’amplicons obtenus par pyroséquençage, les séquences d’ITS sont
regroupées par essence de plantation. Chacune de ces parcelles forestières est traitée indépendamment
par le logiciel Hassium (Nicolas 2009) en plusieurs étapes successives. L’exemple pris ci-dessous est
pour la parcelle à Pinus abies (épicéa) qui totalise un nombre de 30829 séquences brutes.
- Etape 1 : amplicons triés en fonction de la présence ou non des amorces sens et/ou anti-sens pour
les séquences de la parcelle à P. abies. Seules les séquences bornées par les 2 amorces sont gardées
(en violet dans le graphique ci-dessus).
- Etape 2 : bornage de la taille des amplicons compris entre 50 et 300 pb. Puis, vérification sur le
graphique ci-dessous.
- Etape 3 : Regroupement des séquences bornées en groupes de séquences redondantes nommés
OTUs (Operational Taxonomic Units).
Label Number Truncated
Sequences
Number Raw Sequences
P. abies 929 12369
Annexe 2 : Analyse en Composantes Principales (ACP) à partir du logiciel R
Pour comparer les communiés fongiques des différents sols étudiés, une ACP a été réalisée
via le logiciel statistique R 2.8.0. Pour effectuer cette analyse multivariée, les packages « ade4 »et
« stats » ont été chargés dans le logiciel. Puis, le script suivant a été rentré :
(1) Lecture de la matrice de donnée
X = ACP
read.table(matrice_acp,header=T)
(2) Réalisation de l’ACP
acp=dudi.pca (X)
- Choix du nombre d’axes à l’aide du graphique : x
- Division de la fenêtre graphique en 4 : par(mfrow=c(2,2))
- Réalisation de l’histogramme des valeurs propres : barplot(APC$eig)
- Réalisation du cercle des corrélations : s.corcircle(APC$co,clab=?)
- Réalisation de la projection des lignes :s.label(APC$li,label=row.names(X))
(3) Récupération des contributions absolues et relatives des variables
inertia.dudi(ACP,col.inertia=T)
(4) réalisation d’une classification ascendante hiérarchique (CAH) : méthode Ward
- Calcul de la matrice de distance : distACP=dist.quant(ACP$li,1)
- Regroupement hiérarchique selon la méthode Ward : dendACP=hclust(distACP,ward )
- Sélection du nombre de groupements (x) : cutACP = cutree(dendACP,x)
- Représentation graphique de la CAH : s.class(ACP$li,as.factor(cutACP))
- Projection des relevés dans le plan factoriel : s.label(ACP$li)
- Superposition avec le graphique de la CAH : s.class(ACP$li,as.factor(cutACP),add.p=T)
(5) Exportation du fichier
Résumé
Les connaissances concernant la diversité dans le Règne fongique reste encore largement
insondé en dépit du rôle essentiel qu'exercent les champignons dans le fonctionnement des
écosystèmes. Le travail réalisé ici s’est attaché à décrire et à évaluer la diversité fongique au sein
de différents écosystèmes forestiers en milieu tempéré en un lieu donné, l'’hypothèse testée étant
que le type de plantation forestière conduit à une différentiation des communautés fongiques du
sol. Ainsi durant cette étude, des champignons dicaryotes (Asomycetes+Basidiomycetes) présents
dans six sols d’essences forestières distinctes ont été analysés par pyroséquençage de masse à
partir de l’analyse d’amplicons de l’ITS de la région génique ribosomale nucléaire. Les résultats
obtenus ont montré trois observations principales : (1) la diversité fongique est très élevée dans
les écosystèmes forestiers avec près de 420 OTUs en moyenne dans 4g de sol pour chacune des
parcelles soit approximativement 100 OTUs par gramme de sol. (2) en moyenne, 85% de la
diversité fongique rencontrée correspond à des champignons impliqués dans une relation
ectomycorhizienne (3) le type d'arbre cultivé influe profondément sur la composition des
communautés fongiques du sol. Le travail réalisé ouvre, par ailleurs, la voie à de nombreuses
questions dans des contextes scientifiques variés comme celui de l’écologie fonctionnelle et
l'écologie de la restauration ou de la conservation. Une perte ou une diminution de la biodiversité
fongique du sol, même si elle est peu documentée, pourrait avoir des conséquences importantes
sur le fonctionnement des écosystèmes terrestres et leur capacité de production.
Mots-clés : diversité fongique ; ectomycorhize ; pyroséquençage ; ITS ; sol forestier
Abstract
The knowledge about the diversity of the fungal kingdom remains deeply untaped despite
their critical functions displayed in ecosystems. The work done in this study has sought to
describe and assess the fungal diversity in different temperate forest ecosystems at a given
location. The tested hypothesis was the possibility of a soil fungal community differentiation
according to the species tree grown in the different plots. In this study, the dicaryotic fungi
(Asomycetes+Basidiomycetes) were targeted in six soils of distinct forest plots. To do so,
amplicons of the nuclear ribosomal gene region’s ITS were analyzed by pyrosequencing. From
the results three main observations should be highlighted (1) fungal diversity is very high in soils
of forest ecosystems with nearly 420 OTUs thus approximately 100 per gram of soil. (2) in
average, 85% of this diversity is closely related to fungi involved in ectomycorrhiza (3) the tree
species grown impact the fungal community composition deeply. This study open the way to a
variety of questions in different scientific contexts as among others the field of functional
ecology, conservation ecology. A loss or a decrease in the fungal biodiversity, even if poorly
documented, may induce important casualties on terrestrial ecosystems functioning and net
primary production capacity.
Key-words : fungal diversity ; ectomycorrhiza ; pyrosequencing ; ITS ; forest soil
