1

Analyse d'un fragment d'ADN mitochondrial

Patrick DESCOMBES patrick.descombes@frontiers-in-genetics.org

Plate forme génomique NCCR Frontiers in Genetics

Université de Genève http://genomics.frontiers-in-genetics.org

1

La cellule

2

C’est l’unité de base des organismes vivants, composées • d’un noyau qui renferme les chromosomes • cytoplasme délimité par une membrane.

Chez l’homme • 23 paires de chromosomes

noyau

cytoplasme

membrane

Transcription et traduction

Transcription

Traduction

Note: la notion d’épissage des ARM messagers est volontairement omise par soucis de simplification

3

Extraction ADN

4

+ tampon de lyse protéinase K

2

PCR Principe:

•  amplification exponentielle d’un fragment court et défini d’ADN

1.  Dénaturation de l’ADN 2.  Annealing des amorces (spécifiques pour la région à amplifier) 3.  Elongation par la Taq polymérase (dNTP, Mg, enzyme)

Ces 3 étapes sont répétées entre 25 et 50 fois

Quantité de matériel obtenue: Xn = X0 x 2n (n = nombre de cycles)

1 2

3 1

Nbr de cycles

DN

A

5

Instruments

Tubes, plaques 96 et 384 puits Thermocycleurs

1 bloc 96 puits 4 blocs 96 ou 384 puits

2 blocs 384 ou 1 bloc 384 puits

6

Produit amplifié

7

100

200 300 400 500 600

Analyse par électrophorèse sur gel

Séquençage •  Méthode «!classique!»: Sanger (dideoxy sequencing) (Nobel 1980)

–  Séquençage par réaction enzymatique –  Extension d’ADN simple brin à partir d’une amorce –  Mélange de deoxy- et dideoxynucléotides comme substrat de la

polymérase –  Terminaison de l’élongation suite à adjonction d’un dideoxy

dATP ddATP

8

3

Réaction de séquençage Le mélange de dNTP contient par exemple 5% de ddTTP et pour 95% de dTTP Donc la polymérase s’arrête en moyenne à 1 T sur 20 T)

9

Marquage et séparation des produits 1 •  Marquage radioactif et résolution par électrophorèse sur gel d’acrylamide dans des

conditions dénaturantes (Urée et chaleur) •  1 échantillon; 4 réactions indépendantes (pour chaque base dideoxy); 4 puits; env

300-500 bp/ run/ échantillon •  Lecture manuelle !!!!!!!!!!!!!

Séquence: CCCCCTACACGACGTTCCGCTAATT……. G A T C +

-

10

Marquage et séparation des produits 2

•  Marquage fluorescent (une couleur pour chaque base dideoxy) •  1 échantillon; 1 réaction, 1 puits; •  Résolution par électrophorèse sur gel d’acrylamide •  env 400-600 bp/ run/ échantillon •  Détection par système optique UV-visible

11

Séparation des produits 3

Réactions en plaques 96 puits Résolution par électrophorèse capillaire:

Les fragments courts sortent plus vite que les fragments longs Un laser et une caméra permettent de mesurer la fluorescence à la sortie du capillaire

Four

Capillaires

Laser-détection

Plaque (échantillons)

Marquage fluorescent (une couleur pour chaque base) et résolution par électrophorèse capillaire (systèmes avec 1, 16 ou 96 capillaires) (16 sur la photo)

12

4

Séquençage capillaire

•  Résultats: environs 500 à 1000 bases lues par run (donc par réaction de séquençage) •  Donc une plaque 96 puits avec une appareil comprenant 96 capillaires

permettra de lire environ 50’000 à 100’000 bases

13

Analyse des résultats

14

Analyse de la séquence obtenue par comparaison (alignement avec les séquences obtenus dans une base de données publiques)

ND2

F

ND1

I QM

W

A NC

COII

COIII

D K

ATPase8

ATPase6

ND4L

ND4

G

RND3

HSL

ND5

E

Cyt b

P

TOH

PH

PL

D-Loop

OL

LHON 11778A

NARP 8993G/C

5 kb deletionKSS

0 / 16569

DEAF 1555G

LHON 14484CLHON 14459A

MELAS 3243G

LHON 3460A

Complex I genes(NADHdehydrogenase)

Complex IV genes(cytochrome coxidase )

Complex III genes(ubiquinol :cytochrome coxidoreductase)

Complex V genes(ATP synthase) Ribosomal RNA genes

Transfer RNA genes

12srRNA

ND6

MERRF 8344G

Y

SCOI

V

L

16srRNA

http://www.mitomap.org/MITOMAP/mitomapgenome.pdfCopyright 2002 @ Mitomap.org

F

G

H,T,U,V,W,X

I,J,K12,000-15,000

15,000

26,000-34,000

7,000-9,000

130,000-170,000

60,000-70,000

40,000-50,000

+/-+/+

-/-+/-

A*A

BB

X

B

A,C,DA*

M

A,C,D

L3L1L2

C+D

N

70,000

Mutation rate = 2.2 - 2.9 % / MYRTime estimates are YBP

+/-, +/+, or -/- = Dde I 10394 / Alu I 10397* = Rsa I 16329

Human mtDNA Migrationshttp://w w w.mitomap.org/pub/MITOMAP/MitomapFigures/WorldMigrations.pdf

Copyright 2002 © Mitomap.org

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L = 100bp LadderB1 = Buccalyse sample 1B2 = Buccalyse sample 2B3 = Buccalyse sample 3A1 = Alternative sample 1A2 = Alternative sample 2A3 = Alternative sample 3

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