Analyse microbiologique de l'eau à l'hopital

Analyses microbiologiquesde l'eau à l'hôpital

Dr. Dominique Blanc, MER, PDLaboratoire d'épidémiologieService de Médecine préventive hospitalière

L’eau à l’hôpital

Consommation par patient:

750 - 1000 litres par jour

Consommation domestique par personne:

150 – 200 litres par jour

Les différentes eaux et leur utilisations

• Eaux potables

• Eaux techniques

• Eaux stériles conditionnées

• Eaux bactériologiquement maîtrisées

Eaux potables (froide et chaude)

Types UtilisationEau du réseau d’adduction Alimentation humaine, hygiène

corporelle, lavage des mains,soins: douche préopératoire, lavage gastrique, lavement et goutte-à-goutte rectal, plâtre

Eaux conditionnées en bouteilles

Alimentation humaine

Eaux des fontaines réfrigérées Alimentation humaine

Eaux techniques

Type Utilisation

• eau pour la climatisation

• eau pour la production de glace

• Eau des tours de refroidissement

Humidification de l'air.

Glace alimentaire et non alimentaire

Refroidissement de l'air ou de système

Eaux stériles conditionnéesConforme à l’essai de stérilité (Pharmacopée)

Type Utilisation• eau purifiée (bidistillée) stérile Destinées aux soins et à la

production de médicaments non injectables

• eau stérile qualité injectable Préparation des médicaments injectables

• eau stérile pour préparation des injectables

Utilisée à la pharmacie

Eaux bactériologiquement maîtrisées

• Eau purifiée• Eau hautement purifiée• Eau de dialyse• Eau de rinçage des fibroscopes• Eau pour la stérilisation centrale

Eau purifiée

• Pharmacopée Européenne: eau utilisée pour la fabrication de médicaments non stériles

• Norme: <102 germes aérobies mésophiles revivifiables /ml

Eau hautement purifiée

• Pharmacopée Européenne: eau utilisée pour la fabrication de médicaments non stériles lorsqu'une eau de qualité élevée est nécessaire

• Norme: <10 germes aérobies mésophiles revivifiables / 100 ml

Eau pour dilution des solutions concentrées pour hémodialysePharmacopée Européenne (6.0)

• Nombre de germes aérobies viables totaux:

<102 microorganismes/ml

= eau purifiée !

European Best Practice Guidelines for Haemodialysis

Eau hautement purifiée• Recommandée pour:

– Hémodialyse conventionnelle– Hémodialyse conventionnelle à haut flux

• Obligatoire:– Hémofiltration en ligne

Nephrol Dial Transplant 2002, 17 (suppl 7):45-62

Eau de rinçage des L/D, norme 15883-1

• chap. 6.4.2.4:• Effectuer un dénombrement de la flore

bactérienne mésophile aérobie viable– Filtration sur membrane d’un échantillon de min. 100

ml d’eau de rinçage finale– Pas de quantité minimale admissible !!! – Le but est de suivre les tendances de la

biocontamination et de définir ses propres niveaux d'actions

Eau de rinçage final des L/D d’endoscopes thermolabiles - norme 15883-4

• chap. 4.9.2.3 et 6.3– <10 cfu/ 100 ml de bactéries mésophile aérobie

viable– Absence de Pseudomonas aeruginosa / 100 ml– Absence de Legionella / 100 ml– Absence de Mycobacteria / 100 ml

Surveillance microbiologique des eaux à l'hôpital

Type d'eau Recherche Normes

Eau purifiée Germes totaux Pha. Eur.

Eau hautement purifiée Germes totaux Pha. Eur.

Eaux pour dialyse conventionnelle Germes totaux

Pha. Eur.Euro. guideline

Eaux pour hémodiafiltration Germes totaux Euro. guideline

Eau de rinçage des L/D fibroscopes

Germes totaux, Pseudomonas, légionelles, mycobactéries Norme ISO 15883-4

Eau potable Légionelles Rec. OFSP

Eau des tours de refroidissement Légionelles Rec. OFSP

Comment mesurer le nombre de germes ?

Quelques notions de microbiologie…

Enumération des germes

Compte total

Compte viable

Compte cultivable ou revivifiable

Viable, cultivable

Viable, non cultivable

Morte

Méthodes de dénombrement

Microscopie

Colorations biochimiques

Culture : une particule donne naissance à une colonie: ufc (ou cfu)

Viable, cultivable

Viable, non cultivable

Morte

Germe viable non cultivable

• Métabolisme de la bactérie trop différent de celui qu’elle devrait utiliser dans le milieu de culture (stress)

• Pas de croissance sur le milieu de culture (manque

facteur de croissance)

• Pas de croissance dans les conditions de culture (T , air, durée …)Influence sur le dénombrement des germes!!!

Température et croissance bactérienne

• Psychrophiles: 10 C (-5 à 15 C)

• Psychrotrophes: 25 C (0-35 C)

• Mésophiles: 35 C (20 à 40 C)

• Thermophiles: 45-50 C

Effet du milieu, de la méthode d’ensemencement et de la durée d’incubation sur le dénombrement de germes totaux dans l’eau minérale

Korsholm et Sogaard, 1987, Zbl Bakt. Hyg. B. 185:112

Milieu R2A, méthode étalementMilieu R2A, méthode incorporationMilieu KAB, méthode incorporation

10

1'000

100

10'000 Incubation 2 versus 5 j:10 X

Milieux KAB versus R2A:100 X

Croissance des germes:fonction des conditions de culture

• Composition du milieu (pauvre, riche..)

• Température d’incubation

• Atmosphère d’incubation

• Durée d’incubation

Enumération des germes

• Aucune méthode ne permet de définir une mesure absolue

• Cette mesure relative est un indicateur • Comme tout indicateur, c'est sa variation au

cours du temps qu'il faut suivre• Nécessite que le laboratoire utilise toujours la

même méthode

BiofilmAssemblage d'organismes microscopiques (bactéries, algues, protozoaires…) attachés à une surface, dans une matrice de polymères produite par l'organisme lui-même.Formation de biofilm: sur n'importe quelle surface qui est exposée à un liquide non stérile (environnement, industrie, médecine...)

Répartition des germes dans un volume d'eau

Culture de laboratoire Prélèvement d'environnement

Charge faible en microorganismes: Filtration sur membrane

• Volume: 10 ml – 1000 ml• Déposez la membrane sur la surface d’une plaque

gélosée• Dénombrez les colonies qui se sont développées

Pharmacopée Européenne

Charge moyenne en microorganismes: Dénombrement sur plaques par étalement en surface

– Volume: 0.1 – 0.2 ml– étalez l’échantillon sur le milieu gélosé – Si nécessaire, diluez l’échantillon afin d’obtenir un

nombre présumé <300 colonies.

Pharmacopée Européenne

Quel volume d'eau analyser ?

Volume

0.005 0.05 0.1 0.5 1 2 5 10 20 100 1000

1 10 20 100 200 400

1 2 10 20 100 200 400

1 2 4 20 200

cfu/ml

cfu/

plaq

ue

SeuilsCHUV

SeuilPha Eur

Eau purifiée

SeuilPha Eur

Eau hautement purifiée

200 μl

20 ml

200 ml

1 10 100 500100 ml

EN ISO 19458 Qualité de l’eau:Echantillonnage pour analyse microbiologique

• Plan et points de prélèvements– Représentatifs de toute la variation géographique et

temporelle– L’hétérogénéité du système doit être prise en

considération• Ex. les point d’un réseau ne sont pas équivalents car il peut

exister des culs-de-sac et des sections où le débit est réduit

Quelle eau analyser ?

Traitement(osmose

inverse, filtration etc.)

Eau de ville(100 cfu/ml) Eau purifiée

Concentré

Dialysat frais

Dialysat utilisé

Patient

Filtre

Dia

lyse

ur

Technique de prélèvement

• Formation du personnel effectuant les prélèvements

• Flacons de prélèvements: propres et stériles (si réutilisé: attention à ce que le processus de lavage/désinfection ne laisse pas des résidus de désinfectants)

EN ISO 19458 Qualité de l’eau: Échantillonnage pour analyse microbiologique


• Prélèvement à un robinet:Type d’eau Retirer les accessoires

et les insertsDésinfecter Rincer

Eau dans le réseau principal Oui Oui Oui

Eau telle qu’elle parvient au robinet Oui Oui Non

(bref)

Eau telle qu’elle est utilisée Non Non Non

Désinfection: flambage, solution alcoolique ou chloréeRinçage: abondant (???) ou bref pour annuler les effets de la désinfection du robinet



• Prélèvement à un robinet:– Veiller à ce que les échantillons soient prélevés de façon

aseptique avec des mains propres ou en utilisant des gants stériles (désinfection des mains et port de gants non stérile),en protégeant l’échantillon contre les courants d’air et les éclaboussures

– Pendant le remplissage, le bouchon du flacon ne doit pas entrer en contact avec aucun élément (doigts, sol, poche, dents)

– Laisser un volume d’air dans le flacon de sorte à permettre l’agitation appropriée avant l’analyse

– Fermer le flacon immédiatement. Ne pas utiliser cet échantillon d’eau pour la mesure de la T ou autre paramètre mesuré sur site


Formulaire de prélèvement

• Identifier et étiqueter le flacon de manière unique• Remplir le formulaire de prélèvement avant ou

immédiatement après le prélèvement– Nom et adresse du client– Liste des paramètres à analyser– Date, heure et site du prélèvement– Nom de la personne ayant prélevé l’échantillon– Nature de l’échantillon– Objectif de l’analyse (choix des méthodes)– Autres si nécessaires (T , …)


Transport et conservation

• Transport– Protéger les prélèvements contre les rayonnements solaires

(effet de stérilisation…)– Réfrigérer les échantillons (mais pas les congeler! ->mort de

>99% des cellules)• Si la microflore se multiplie: la vitesse de multiplication est

d’autant plus grande que la T est élevée• Si la microflore est en train de mourir, la réaction est accélérée

lorsque la T augmente

• Délai– Plus le délai est long entre le prélèvement et l’analyse en

laboratoire, plus la fiabilité des résultats est diminuée– < 8h. (le jour même)


Fréquence des testsEx. Qualité de l’eau de rinçage final des L/D d’endoscopes thermolabiles (ISO 15883-4)

• Bactéries mésophiles aérobies viables:– Avant la mise en production– Régulièrement après la mise en production:

• Chaque semaine jusqu’à ce qu’il ait été établi que la qualité de l’eau est régulière, puis à des intervalles plus étendus

• P.aeruginosa, Legionella et mycobacteria– Avant la mise en production– Au moins annuellement

Documents

Analyse microbiologique de l'eau à l'hopital