Analyse von Makromolekülen mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Molekularen Medizin Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin

Analyse von MakromolekAnalyse von Makromolekülen mit der ülen mit der

MALDI-TOF-MassenspektrometrieMALDI-TOF-Massenspektrometrie

in der Molekularen Medizinin der Molekularen Medizin

Andreas HumenyLehrstuhl für Biochemie und Molekulare MedizinInstitut für BiochemieEmil-Fischer-ZentrumFriedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

DNA ProteinRNAGenomics ProteomicsTranscriptomics


Molekulare MedizinMolekulare Medizin

Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin

Diagnostik Therapie

Krankheit

Prävention

Bioanalytik Bioinformatik


MALDI-TOF MassenspektrometrieMALDI-TOF Massenspektrometrie

+++

Matrix

Assisted

Laser

Desorption

Ionization

Time

Of

Flight

Laser

Laser

Optik

Feldfreie Driftstrecke

Detektor

Beschleunigungsstrecke

Target

+ + +

Beschleunigungselektrode

Matrix-Biomolekül-Kokristalle



Matrizes für die MALDI-TOF-MSMatrizes für die MALDI-TOF-MS

OH

HC CCN

COOH

OH

COOH

HO

COOH

N

COOH

NOH

-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CCA):

- Peptide bis ca. 5 kDa

Trans-3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure, SA):

- Peptide ab ca. 3 kDa

- Proteine

2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB):

- Proteine

- Glykoproteine

- Kohlenhydrate

Pikolinsäure (PA):

- DNA

- RNA

OH

HC CH

COOH

CH3H3C OO3-Hydroxypikolinsäure (3-HPA):

- DNA

- RNA



Fulleren-Analyse mit MALDI-TOF-MSFulleren-Analyse mit MALDI-TOF-MSR

el.I

nt.

Re

l.In

t.

m/z1200 16001400

1356

.315

1800

Fulleren

monoisotopische Massen Isotopenauflösung

natürliche Isotopenverteilung: 12C 98,890 % 13C 1,110 %

14N 99,634 % 15N 0,366 %

16O 99,762 % 17O 0,038 % 18O 0,200 %

1H 99,985 % 2H 0,015 %

„Molekularer Fußball“:

Definiertes Regio-Isomer

C93H48O12 mit C60-Kern

monoisotopische Masse:

1356,3149 DaIsotopen-Signal

Theoretische

Verteilung [%]

Experimentelle

Signal-Höhen [%]

Experimentelle

Signal-Integrale [%]

0 94,99 92,81 93,75

1 100,00 100,00 100,00

2 54,41 55,23 53,12

3 20,34 21,25 20,47

4 5,86 6,94 6,78

0 12 3 4

m/z



Quantifizierung mit MALDI-TOF-MSQuantifizierung mit MALDI-TOF-MSGenerelle Aspekte:

- Kein direkter Vergleich zwischen einzelnen Signalen aus verschiedenen Spektren

- aber: Intraspektraler Vergleich relativer Signal-Höhen- bzw Signal-Integral-Verhältnisse

mit internen Standards (direkt aus biologischer Probe oder nach Zugabe)

- potentielle Probleme:

• Heterogene Verteilung der Biomoleküle im Kristall (“sweet-spots”)

• Verunreinigung der Probe (Adduktbildung z.B. mit Na+ oder K+)

• Inhomogene Desorptions- und Ionisations-Eigenschaften der Biomoleküle

• Definition des Hintergrunds und der Signale

- Lösungsansätze:

• Summation vieler Laserschüssen an unterschiedliche Positionen zur Mittelung

• standardisierte Probenvorbereitung und Präparation des Ko-Kristalls

• Mehrfachansätze jeder Einzelprobe (z.B. Triplikate) und statistische Analyse

• automatisierte Messung und Auswertung



Analyse mit MALDI-TOF-MSAnalyse mit MALDI-TOF-MSAnwendungen:

- DNA Level (Genomics): • SNP-Analytik

• Mikrosatelliten-Instabilität (MSI)

• Verlust der Heterozygotie (LOH)

• DNA-Methylierung

- RNA Level (Transcriptomics): • Expressions-Analytik

- Protein Level (Proteomics): • Protein-Identifizierung

• Protein-Modifizierung

• Protein-Quantifizierung

- Lipid Level (Lipidomics): • Lipid-Komposition



- Genomics- Genomics - -

MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der DNA-Analytikin der DNA-Analytik



Der Mensch ?Der Mensch ?



Die Menschen !Die Menschen !



Ausprägung der IndividualitätAusprägung der Individualität

IndividualitätGene Umwelt



Risiko ManagementRisiko Management




Risiko



CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA

CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA







Risiko



Genetische HeterogenitätGenetische Heterogenität

chromosomale Veränderungen

Insertionen von Nukleotiden

Deletionen von Nukleotiden

Substitutionen von Nukleotiden (single nucleotide polymorphisms)

ACGTCGCTGAC

TGCAGCGACTG

ACGTCGCTGAC

TGCAGCGACTG

ACGTCGCTGAC

TGCAGCGACTG

ACGTCAGCTGAC

TGCAGTCGACTG

ACGTCCTGAC

TGCAGGACTG

ACGTCACTGAC

TGCAGTGACTG



Single nucleotide polymorphismsSingle nucleotide polymorphisms

SNP Definition: - SNPs sind Einzelbasensubstitution mit einer Häufigkeit von mindestens 1 % in der betrachteten Population.

bei weniger als 1 % Häufigkeit: Punktmutation

SNP-Frequenzen: - 90% der genetischen Heterogenität bedingt durch SNPs- ca. 1 / 1000- über 2 Millionen SNPs identifiziert

SNPs in den Genen: - SNPs in regulativen Regionen- ca. 60.000 SNPs in kodierenden Gen-Regionen- kodierende SNPs können zum Aminosäureaustausch führen

SNP Identifizierung: - bioanalytisch: direkte Sequenzierung ...- bioinformatisch: Algorithmen & Datenbanken („Data Mining“)



Single nucleotide polymorphismsSingle nucleotide polymorphisms

Positionsmarker

Kartierung neuer Genorte

Identitätsmarker

Vaterschaft Forensik Täter

Diagnostik

Risikoallele Krankheitsallele Pharmakogenomik

SNPs



Methoden zur GenotypisierungMethoden zur Genotypisierung

- Messung von sekundären Moleküleigenschaften:

z.B. elektrophoretische Mobilität, chromatographisches Verhalten, Hybridisierung:

- klassische und Kapillar-Sequenzierung

- denaturierende HPLC

- Chips

- Messung einer absoluten, intrinsischen Moleküleigenschaft:

Bestimmung der molekularen Masse mit MALDI-TOF Massenspektrometrie



Molekulare Massen der DNA-BausteineMolekulare Massen der DNA-Bausteine

O

O

O -

O PO

H

H

HH

H

N

N N

N

NH2

O

O

O -

O PO

H

H

HH

H

N

NH

O

O

H3C

O

O

O -

O PO

H

H

HH

H

N

N

O

NH2

Desoxyadenosin: 313 Da

Desoxythymidin: 304 Da

Desoxyguanosin: 329 Da

Desoxycytosin: 289 Da

16 Da

15 Da

40 D

a

9 D

a

2

5 D

a

24 Da

O

O

O -

O PO

H

H

HH

H

N N

NH

O

NH2

N



Das Risiko wiegen !Das Risiko wiegen !

Gen-Waage



MALDI-TOF MassenspektrometrieMALDI-TOF Massenspektrometrie

+++

Matrix

Assisted

Laser

Desorption

Ionization

Time

Of

Flight

Laser

Laser

Optik

Feldfreie Driftstrecke

Detektor

Beschleunigungsstrecke

Target

+ + +

Beschleunigungselektrode

Matrix-Biomolekül-Kokristalle



MALDI-TOF-MS: Probenpräparation MALDI-TOF-MS: Probenpräparation 7618 7848

7600 7800 m/z7700 7900

Magnetische Partikel

Reversed-PhaseChromatographie

Amorphe Silikate

Re

l. In

t.

Initiale Probleme bei der MALDI-TOF-MS Analytik :

- Komplexbildung der DNA mit Ionen (Natrium, Kalium ...)

- Abnehmende Sensitivität bei größeren Oligonukleotiden

- Fragmentierung der DNA

Lösungsansätze für die MALDI-TOF-MS Analytik :

- Optimierte Reinigung und Probenpräparation

- Optimiertes molekulares Design der Testsysteme

- Verwendung geeigneter Matrices und Probenträger



BlutgerinnungskaskadeBlutgerinnungskaskadeEndogenes

SystemExogones System

Faktor IXa Faktor VIIa

Faktor X Faktor Xa Faktor X

Faktor Va

Prothrombin Thrombin

Fibrinogen Fibrin



Faktor V Leiden-AllelFaktor V Leiden-Allel



Normal-Allel Leiden-Allel



Faktor V Leiden-AllelFaktor V Leiden-AllelNormal-Allel Leiden-Allel

Faktor V Faktor V

Thrombin

Faktor Va inaktiv Faktor Va inaktiv

Protein C

Faktor Va Faktor Va

X

Stopp der Blutgerinnung

Stopp der Blutgerinnung

X

AKTIVIERUNG„Gas“

INAKTIVIERUNG„Bremse“



Evolution beim Faktor V SNPEvolution beim Faktor V SNP Ethnie-Abhängigkeit: höchste Rate in Europa: G/A ca. 5 %

A/A ca. 1: 5000 selten bei Afrikanern und Asiaten

Auftreten ca. vor 20 000 - 30 000 Jahren nach der Trennung der Kaukasier von Afrikanern und Asiaten Überlebensvorteil in prä-moderner Zeit: Reduzierte Mortalität bei Geburt und Verletzungen durch erhöhte Blutgerinnung balancierter Polymorphismus

Und in heutiger Zeit ? Thromboserisiko !



Faktor V Leiden und ThromboserisikoFaktor V Leiden und Thromboserisiko

Klinische Ausprägung des Thromboserisikos beeinflußt durch

A.) Anzahl der Faktor V Leiden-Allele:- Heterozygotie (G/A): 5 bis 10 -fach erhöhtes Thromboserisiko- Homozygotie (A/A): 80 bis 100 -fach erhöhtes Thromboserisiko

B.) Anwesenheit von weiteren genetischen Heterogenitäten:- weitere Risikoerhöhung durch SNP G20210A im Prothrombin-Gen (Faktor II), ca. 3 % Prävalenz in Europa

C.) weitere Risikofaktoren: - Alter, Operationen, anhaltende Immobilisierung, Rauchen, orale Kontrazeptiva, Schwangerschaft ...


Faktor V Wildtyp5´-AGAGCAGATCCCTGGACAGGAGAGGAATACAGA-3´3´-TCTCGTCTAGGGACCTGTCCTCTCCTTATGTCT-3´

Faktor V Leiden5´-AGAGCAGATCCCTGGACAGGAAAGGAATACAGA-3´3´-TCTCGTCTAGGGACCTGTCCTTTCCTTATGTCT-3´

Extensionsprimer: CAGATCCCTGGACAGGA 5181 Da

Reaktion mit dGTP und ddATP:

Extensionsprodukt Faktor V Wildtyp CAGATCCCTGGACAGGAGA 5807 Da

Extensionsprodukt Faktor V Leiden CAGATCCCTGGACAGGAA 5478 Da


Faktor V Leiden GenotypisierungFaktor V Leiden Genotypisierung

m/z

Probe A

Probe B

5400 580056005200

Primer5181

A-Allel5478

G-Allel5807

Re

l.In

t.

Probe A + 10 % Probe B

Probe C

Wasserkontolle



Etablierte SNP Etablierte SNP TestsystemenTestsystemen

FV: 1 SNP TLR4: 1 SNP FII: 1 SNP TLR2: 1 SNP GLRA1: 16 SNPs ADRB1: 7 SNP PR: 3 SNPs GRIN2B: 2 SNP ACHE: 2 SNPs MYOC: 1 SNP PPP2R3L: 7 SNPs CYP2D6: 1 SNP HFE: 2 SNPs MDR1: 1 SNP MTHFR: 1 SNP TGFBRII: 1 SNP PRNP: 4 SNPs Prnp: 10 SNP APC: 2 SNPs APC: 4 Deletionen HBB: 10 SNPs HBB: 2 Deletionen + 1 Insertion … …



Genomics und AutomatisierungGenomics und Automatisierung

Map II Pure

Genopure

+

Puredisk

PrPrä-Analytikä-Analytik

Anker-Targets

Autoflex

AnalytikAnalytik

Genotools

Post-AnalytikPost-Analytik



DNA-Reinigung mit magnetischen BeadsDNA-Reinigung mit magnetischen Beads “Sass-to-Pure” Map II Pure Puredisk

“Mechanik” Zwei-Hand + Multipette 8-Nadel 96-Nadel

Probendurchsatz variabel: 1-96 rel. variabel: 32-96 fest: 96

Reinigungsleistung sehr gut sehr gut sehr gut

Zeitbedarf ca. 90 Minuten ca. 80 Minuten ca. 60 Minuten

Zuverlässigkeit prinzipiell hoch hoch hoch

Verbrauch-Limitierung Nerven, Sehnen, Muskeln Spitzen Binde- und Waschpuffer

Kosten Personal Anschaffung Anschaffung



Anker-TargetsAnker-TargetsVorteile gegenüber herkömmlichen Targets:

Hydrophobe Oberfläche mit hydrophilen Ankern

- definierte Positionen für automatische Messung

- Mikropräparation mit Makropipetten bzw. Robotik

- reduzierte Sweet-Spots

- homogenere Präparation

- 384 Probenpositionen

- erhöhte Sensitivität für Bioanalyte



Automatische AuswertungAutomatische Auswertung

Verlässlichkeit

grün hoch

gelb mittel

rot niedrig

grau n.d.

Genotypen

dunkelblau A / A

hellblau A / G

rot G / G

grau n.d.

Abnehmende Stringenz der Parameter der automatischen Auswertung

sehr hoch hoch mittel geringStringenz



Detektion somatischer MutationenDetektion somatischer MutationenMikrosatelliten-Instabilität:

• Verlust oder Einfügen repetitiver Einheiten in Mikrosatelliten

• Verursacht durch DNA-Polymerase Slippage und Defekte im MMR-System

• Schlüsselrolle in Genese und Progression von Tumoren

• Assoziation mit heriditärem nicht polypösem Kolonkarzinom (HNPCC) und in ca. 15 % aller sporadischen Tumore detektiert

• Detektion bisher über Gel-basierte Methoden (Bandenverschiebung)

• Bioinformatische Identifizierung von kodierenden Mikrosatelliten (> 17000/Genom)



Interne QuantifizierungInterne Quantifizierung

Molare Verhältnisse (-1 Deletion / Wt)

Sig

nal

-Int

egra

l Ver

häl

tnis

se (

-1 D

elet

ion

/ W

t)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,00,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Bestimmung der intern Signal-Integral Verhältnisse mit MALDI-TOF-MS

1.) Messung verschiedener molarer Verhältnisse zweier synthetischer Oligonukleotide:

2.) Bestimmung der Signal-Integral-Verhältnisse

Beispiel: Mikrosatellit im GART-Gen (Phosphoribosylglycinamid Formyltransferase-Gen)

Extensionsprodukte:

Mikrosatellit GART: Wt = 10 TAGCCACTCTGGCCTTTTTTTTTTC

Mikrosatellit GART: -1 Deletion = 9 TAGCCACTCTGGCCTTTTTTTTTC



Mikrosatelliten-Instabilität: GARTMikrosatelliten-Instabilität: GARTGART Wildtyp5´-TTTGAAAAAAAAAAGGCCAGAGTGGCTGTCTTA-3´3´-AAACTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGACAGAAT-3´

Extensionsprimer: TTTTTTTCCGGTCTCACCGA 6026 Da

Reaktion mit dTTP und ddCTP:

Extensionsprodukt GART Wildtyp CTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA 7211 Da

Extensionsprodukt GART -1 Deletion CTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA 6907 Da

Extensionsprodukt GART +1 Insertion CTTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA 7515 Da

Kontrolle

Zell-LinieKM12

Primer6026

-1 Del6907

Wt7211

m/z

Re

l.In

t.

6300 6800 7300

Patient 184Kontrollgewebe

Patient 184Tumorgewebe

Patient 218Kontrollgewebe

Patient 218Tumorgewebe

+1 Ins7515

!

!

!

! = MSI



Etablierte MSI TestsystemeEtablierte MSI Testsysteme

GART: A10 – Mikrosatellit Chromosom 21q22.1

AC1: T10 - Mikrosatellit Chromosom 4p16

TGFBRII: A10 - Mikrosatellit Chromosom 3p22

MSH3: A8 - Mikrosatellit Chromosom 5q11-q12

MSH6: C8 - Mikrosatellit Chromosom 2p16



Verlust der HeterozygotieVerlust der HeterozygotieZwei-Hit Modell der Tumorigenese:

1.) Keimbahn-Mutataion Heterozygotie

2.) Somatische Mutation Verlust der Heterozygotie (loss of heterozygosity, LOH) wichtig für Tumorsuppressor-Gene Verlust der Funktion (loss of function)

Detektion von LOH mit MALDI-TOF-MS:

- DNA Extraktion und PCR- Primerextensionsreaktion und MALDI-TOF-MS- relative Signalverhältnisse Vergleich von relativen Signalverhältnissen: Tumor- versus Kontrollgewebe

TS-Gen (functional)

TS-Gen (dysfunctional)

1. Hit

2. Hit



Verlust der HeterozygotieVerlust der HeterozygotieLOH-Analyse mit MALDI-TOF-MSPotentielles Tumorsuppressor-Gen PPP2R3B:

T/C SNP an Nukleotidposition 40678

Verlust des T-Allels bei Brustkrebs

Patient Gewebe Signal Integral

Verhältnis (T/C)

Signal Höhen

Verhältnis (T/C)

A Kontrolle 1.01 1.03

A Tumor 0.28 0.26

B Kontrolle 0.98 0.96

B Tumor 0.15 0.14

C Kontrolle 0.95 0.93

C Tumor 0.92 0.91

Rel

.Int.

6100 650063005900

5855 6128 6456

C-Allel T-AllelPrimer

m/z

Patient A: Kontrollgewebe

Patient A: Tumorgewebe

Patient B: Kontrollgewebe

Patient B: Tumorgewebe!

! = LOH

!

Patient C: Kontrollgewebe

Patient C: Tumorgewebe

Extension: dTTP, ddATP und ddCTP

Primer TGAAGCGCTGCAAGCTGGC 5855 Da

C-Allel TGAAGCGCTGCAAGCTGGCC 6128 Da

T-Allel TGAAGCGCTGCAAGCTGGCTA 6456 Da



Verlust der HeterozygotieVerlust der Heterozygotie

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Kontrolgewebe

Tumorgeweben=4

A B C D Patient

PPP2R3B:

SNP 40678 T/C

Sig

nal V

erhä

ltnis

(T

/C

)

kein LOHLOH !



DNA-MethylierungDNA-MethylierungBedeutung der DNA-Methylierung:

Prokaryonten: • Abwehrreaktion gegen Bakteriophagen in Kombination mit Restriktionsendonukleasen

• Timing der DNA-Replikation und DNA-Reparatur

• Regulation der Gen-Expression

Eukaryonten:

• Repression der Gen-Expression:

• Entwicklungskontrolle, genomisches Imprinting, X-chromosomale Inaktivierung

Herkömmliche Techniken zur Analyse der in vitro-DNA-Methylierung:

• Einsatz radioaktiver Methylierungsreagenzien

• Protektion der Restriktionsendonuklease-Reaktion



DNA-MethylierungDNA-Methylierung

6000 7000 m/z

5793 5807

5750 5850 m/z

5793 7672

0 Min

1 Min

2 Min

5 Min

10 Min

20 Min

40 Min

60 Min

DNA-Methylierung erfolgt durch die Methyltransferasen (MTasen).

S-Adenosylmethionin (SAM) als Donor von aktivierten Methylgruppen.

Beispiel:

E. coli dam MTase erkennt Palindrom GATC:

5´-GCCCGGGGATCCGGCCGCG–3´ 5793 Da3´-CGGGCCCCTAGGCCGGCGC-(T)6-Biotin 7672 Da

CH3

Methylierung führt zu einem definierten Anstieg der molekularen Masse des Oligonukleotids von 14 Da.

Analyse mit MALDI-TOF-MS



DNA-MethylierungGenomische DNA-Methylierung geht bei PCR verloren.

keine direkte Analyse mit MALDI-TOF-MS möglich!

Chemische Reaktion mit Natrium-Bisulfit:

• unmethyliertes Cytosin Uracil (hydrolytische Deaminierung)

• methyliertes Cytosin resistent gegen Modifikation

Nach Bisulfit-Behandlung und PCR:

• PCR-Fragmente mit T statt unmethyliertes C

• PCR-Fragmente mit C statt methyliertes C

Virtueller C/T-SNP, der den positionsspezifischen Methylierungsstaus wiederspiegelt

Primerextension und MALDI-TOF-MS



- Transcriptomics -- Transcriptomics -

MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der RNA-Analytikin der RNA-Analytik



Expressions-AnalyseExpressions-AnalyseA B C D

m/z

PrimerZiel-Gen

PrimerHaushaltsGen

ProductProduktZiel-Gen Haushalts

Gen

Re

l.In

t.

Extension Extension

SteigendeMengenderZiel-GenmRNA

Ziel-Gen Haushalts-Gen

Quantifizierung

RNA Präparation

Gewebepräparation

RT-PCR

Ko-Reinigung

Primerextension

Ko-Reinigung

MALDI-TOF-MS

Signal-Verhältnisse



Expressions-AnalyseExpressions-AnalyseZiel-Gene

• Glycin Rezeptor -Untereinheit (glrb)

• GABA-A Rezeptor 2-Untereinheit (2)

• GABA-A Rezeptor -Untereinheit ()

Haushalts-Gene

• -Aktin

• Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl Transferase (HPRT)

Analyse-Level

• murines Modell (Gewebe)

• klonierte Fragmente (Plasmide)

• synthetische Templat-Oligonukleotide

Kontrollansätze

• TaqMan

• Light Cycler


Re

l.In

t.


Expressions-AnalyseExpressions-AnalyseglrbGACTATAGAGTTAACATTTTCTTGAGACAGAAATGGAATGACCCCAGACTCAAGCTACCTAGTGACTTCAGAGGCTCAGATGCACTGACAGTTGACCCCACCATGTATAAGTGCTTGTGGAAACCTGACTTATTCTTTGCAAATGAAAAAAGTGCCAATTTTCATGATGTGACCCAAGAAAATATCCTGTTGTTTATCTTTCGGGATGGAGACGTCCTTGTGAGC

Extension: ddGTPPrimer: ACAGTTGACCCCACCAT 5100 Da AProdukt ACAGTTGACCCCACCATG 5413 Da B

-AktinTGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACAGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGCTATGCTCTCCCTCACGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCC

Extension: ddGTPPrimer: TCCCTGTATGCCTCTGGTC 5723 Da CProdukt: TCCCTGTATGCCTCTGGTCG 6036 Da D

A B C D

m/z

5100 5723 6036

5200 5400 5600

5413

5800 6000

C57/BL6+/+

C3H/HeJ+/+

C57/BL6s/s

B6/C3Hs/s

Cortex von unterschiedlichen

Mäusen

(B/A) / (D/C) = relative Mengen des Ziel-GenTranskritps

(D/C) = Verhältnis des -Aktin-Produkts (haushalts-Gen)

(B/A) = Verhältnis des glrb-Produkts (Ziel-Gen)

(B/A) (D/C)

7.0

5.4

0.7

2.1



- Proteomics- Proteomics - -

MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der Protein-Analytikin der Protein-Analytik



Die Bausteine der ProteineDie Bausteine der ProteineMonoisotopische molekulare Massen von Aminosäuren (-H20) [Da] :

Gly (G) 57,0215 Asp (D) 115,0269

Ala (A) 71,0371 Gln (Q) 128,0586

Ser (S) 87,0320 Lys (K) 128,0950

Pro (P) 97,0528 Glu (E) 129,0426

Val (V) 99,0684 Met (M) 131,0405

Thr (T) 101,0477 His (H) 137,0589

Cys (C) 103.0092 Phe (P) 147,0684

Leu (L) 114,0841 Arg (R) 156,1011

Ile (I) 114,0841 Tyr (Y) 163,0633

Asn (N) 115,0269 Trp (W) 186,0793

isobar

m = 0,0364



Modifizierungen der ProteineModifizierungen der ProteineVeränderungen der monoisotopische molekularen Massen [Da]:

Met Homoserin (CNBr-Abbau) - 29,9928 Glykosylierung (N-Acextylglucosamin) + 203,0794

Gln Pyroglutaminsäure - 17,0265 Liponsäure ( NH-Lys) + 188,0330

Bildung von Disulfidbrücken - 2,0157 Farnesylierung + 204,1878

C-terminale Amidbildung - 0,9840 Myristoylierung + 210,1984

Methylester + 14,0157 Biotinylierung + 226,0776

Hydroxylierung / Met-Oxidation + 15,9959 Addition Pyridoxalphosphat + 231,0297

Formylierung + 27,9949 Palmitoylierung + 238,2297

Acetylierung + 42,0106 Steaorylierung + 266,2610

Carboxylierung + 43,9898 Geranylgeranylierung + 272,2504

Phosphorylierung + 79,9663 Addition N-Acetylneuraminsäure + 291,0954

Sulfatierung + 79,9568 Addition Glutathion + 305,0682

Glykosylierung (Pentose) + 132,0423 Adenosylierung + 329,0525

Glykosylierung (Hexosamin) + 161,0688 Addition Phosphopantethein + 339,0780

Glykosylierung (Hexose) + 162,0528 ADP-Ribosylierung + 541,0611



ProteinProtein Leitersequenzierung LeitersequenzierungSpaltungen mit Carboxypeptidasen

Detektion verkürzter Peptide mit MALDI-TOF-MS

Massendifferenzen liefern Seqeunzinformation

- Vorteile: - C-terminale Sequenzinformation

- repetitive Sequenzen analysierbar

- Detektion von Modifizierungen

- Nachteile : - relativ kurze “sequence tags”

- Leucine und Isoleucin: isobar

Beispiel:Amyloid Peptide

1100 1500 m/z1900

G Y E V H H Q K L/I V



Post Source Decay (PSD)Post Source Decay (PSD)Fragmentierung metastabiler Analyten in feldfreier Driftstrecke nach der Beschleunigung:

Pm+ F+ + Fn

Fragmentierung metastabiler Peptide meistens im Proteinrückgrat:

N-term. Ladung: a-, b-, c- Serien C-term. Ladung: x-, y-, z- Serien

Example:Adrenocorticotrope Hormone (ACTH)

adapted from “Bioanaltyik”, F.Lottspeich and H. Zorbas Spektrum Verlag (1998)



Massen-Finger-PrintsMassen-Finger-Prints

2D-Gel-Elektrophorese

In-Gel-Verdaueinzelner Spots

MALDI-TOF-MS Datenbanksuche mitMassen-Finger-Prints -Actin

no match

CyclophillinA



NR2B im neonatalen HerzNR2B im neonatalen Herz

E xtraze llu lä r

In traze llu lä r

N R 1N R 2X

A nkerp ro te in

C x H erz

E14kD

116

adultP21

P12P5P0

E18P12

205

NMDA-Rezeptor:

- Excitatorischer Neurotransmitter-Rezeptor

Ligand: Glutamat

Ionenkanal Permeabilität für Na+ und Ca2+

- Hetero-Tetramer aus einer oligatorischer NR1- und

variablen NR2 a-d -Untereinheiten

- klassische Lokalisation: Nervensystem

NR2B: RT-PCR-Analyse im neonatalen Rattenherz:

NR2B: Westernblot-Analyse im neonatalen Rattenherz:

Cx Herz

E18

NR2B

HO2ad

ultP21P12P5

P0P12

-Aktin

M

Primer

Primer

1380

635

517

1125

1380

6351125



NR2B: Molekularer InteraktionspartnerNR2B: Molekularer Interaktionspartner

BSA-Kontrolle

180 kD-Protein

10004000

30002000>205 kD-Protein

m/z

97,4

kD

205

116

Sol IP

205

kD Ryanodin-Rezeptor

A

IP-Rezeptor3

205

Sol IPkD

B

molekularer Interaktionspartner der NR2B-Untereinheitim neonatalen Rattenherz Ryanodin-Rezeptor

Konfokale Laserscan-Mikroskopie:

Immunpräzipitation und Westernblot-Analyse:Immunpräzipitation vonMembranfraktionen mitAnti-NR2B-Antikörper SDS-PAGE Proteinfärbung

?NR2B ?

In-Gel-Verdau MALDI-TOF-MS Massenfingerprints

Datenbank-suche

BSA

NR2B

RyanodinRezeptor

NR2B Ryanodin-R. Überlagerung



Modifikationen vonModifikationen von--TThymosinhymosinenen

m/z

Re

l.In

t.

ohne Modifikation

einfache Modifikation

doppelte Modifikation

5000 6000

- Peptid Mapping: nur Glutamine 23 und 36 modifiziert (Reaktivität, Vergänglichkeit)

- Detektion intramolekulare Isopeptidbindungen zwischen spezifischen Lysinen und Gluatminen in vitro und in vivo

ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES

- Substrate für Transglutaminasen

Reaction mit Aminogruppen

- 3 Glutaminreste (Q) an Positionen 23, 36 und 39:

- -Thymosine: Familile von 5 kDa Peptiden

- Funktion:

intrazellulär: Sequestrierung von G-Aktin

Regulation des Cytoskeletts

extrazellulär: Blutgerinnung und Wundheilung



Glykierung von ProteinenGlykierung von ProteinenBei der nicht-enzymatischen Glykierung werden im Unterschied zur enzymatischen Glykosylierung die Aminosäureseitenketten von Lysin und Arginin modifiziert !

1.) Reaktion von reduzierenden Zuckern (z. B. Glucose) mit Aminogruppen eines Proteins unter Ausbildung von Schiff‘schen Basen (reversibel)

2.) Amadori-Umlagerung (reversibel)

3.) Nachgeschaltete Abbaureaktionen führen zu „Advanced Glycation Endproducts“

(irreversibel)

Bedeutung: - Medizin: Diabetes mellitus mit diversen Folgeschäden z.B. Retinopathie, renale Dysfunktion

- Lebensmittelchemie: Bräunungsreaktionen (Maillard-Reaktion)



Advanced Glycation EndproductsAdvanced Glycation Endproducts

m 58 Da

m 72 Da

m 144 Da

m 54 Da

Carboxymethyl-Lysin (CML)

Carboxyethyl-Lysin (CEL)

Imidazolon A

Methylimidazolon

Lysin spezifische Produkte Arginin spezifische Produkte



Glykierung intakter ProteineGlykierung intakter Proteine

13000 15000 17000 m/z

natives Lysozym

CML-Lysozym

CEL-Lysozym

3-Desoxyglucoson-Lysozym

Methylglyoxal-Lysozym

glykiertes Lysozym

Re

l.In

t.14313



Glykierung und PeptideGlykierung und Peptide

Glukose Glu-C-Spaltung

MALDI-TOF-MS

Lysozym AGE-Lysozym

838 896 1000

m/z m/z

1202 1346

NH2

K V FG R C E

838

N H

K V FG R C E

CH2O

CH2

O H

OH

OH

OH

H

H

H

1000

NH

K V FG R C E

CH2

O OH

896V Q A W I R G C R L

N H

N N H

O C4 O3H9

V Q A W I R G C R L

N H

NH N H2

1202 1346

Amadori CML Imidazolon



Quantifizierung der GlykierungQuantifizierung der Glykierung

m/z850 900 950 1000

838 1000896 CML Amadori

Re

l.In

t.

ohne Glukose

1 Woche Glukose

4 Woche Glukose

8 Woche Glukose

16 Woche Glukose

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Inkubationsdauer [Wochen]

% d

es

tota

len

In

teg

rals

unmodifiziert

CML

Amadori



Re

l.In

t.

m/z2000 60004000 10000

Poly-L-Lysin

8000

Molekulare Heterogenität: Poly-L-LysinMolekulare Heterogenität: Poly-L-Lysin



Zusammenfassung ProteinanalytikZusammenfassung ProteinanalytikBiologisches Material

2D-Gel- Elektrophorese Protein-Reinigung

Crosslink

In-Gel-Verdau Protein-Verdau Exoproteasen

MALDI - TOF Massenspektrometrie

Massen-Finger-Print

Datenbanken

Peptid-Leiter

Masse desintakten Proteins

Sequenz-Information(1o-Struktur)

Identifizierungbekannter Proteine

Detektionunbekannter

Proteine

Analyse von Protein-

Modifizierungen

Analyse von3o- und 4o-Strukturen



Protein Separation & Clinical ProteomicsProtein Separation & Clinical Proteomics

Chemische Oberflächen – Protein Expressions Profiling:

Hydrophob Anionisch IMAC Normael PhaseKationisch

aktivierte Oberflächen AK-AG Rezeptor - Ligand DNA - Protein

Biologische Oberflächen – Protein Interaktions Assays:

SELDI-TOF-MS

(adapted from Ciphergen)

MALDI-TOF-MS

Magnetische BeadsProteinChips

(adapted from Villanueva et al. 2004)

Bead Suspension Bindung: Waschen:

Beads

Serum

Waschen und Sammeln: Elution: MALDI-Probenpräparation:

Puffer Matrix

Eluat

MALDITarget



ProteinChips und SELDI-TOF-MSProteinChips und SELDI-TOF-MS

…ISEVXXDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA…

1 - 40 peptide

1 - 42 peptide

Analysis von Amyloid Varianten:

NTA4 mAb

1 - 17 peptide

0

20

40

2000 3000 4000 5000

4514.41 - 42 Peptid

Biomarker Profiling: 1.) ProteinChip: Ionenaustausch Chromatographie

2 biologische Proben (A und B): pH 10, 8, 6 und 4

2.) SELDI-TOF-MS Analyse:

pH Probe

10 A

10 B

8 A

8 B

6 A

6 B

4 A

4 B

7000 7250 7500

7000 7250 7500

7000 7250 7500

7000 7250 7500

7000 7250 7500

7000 7250 7500

7000 7250 7500

7000 7250 7500



ProteinChips und SELDI-TOF-MSProteinChips und SELDI-TOF-MS

Flad et al. 2002

DermcidinAnalyse von Schweiss

ProteinChips und SELDI-TOF-MS

Insulin



MALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsMALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsVergleich von chromatografischen Beads- Mischung von 7 Peptiden (1 kDa - 3 kDa)

- Chromatographie auf magn. Beads (HIC, IMAC, WAX, WCX)

- MALDI-TOF-MS Analyse (linearer Modus), Matrix HCCA

m/z

WCX

WAX

HIC

IMAC

1400 2400

An

gio

ten

sin

II

AC

TH

(1-

17)

So

mat

ost

atin

28

Re

l.In

t.

3400

An

gio

ten

sin

IS

ub

stan

ce P

Bo

mb

esin

AC

TH

(18

-39)

Vergleich von chromatografischen Beads- menschliches Serum

- Chromatographie auf magn. Beads (HIC, IMAC, WAX, WCX)

- MALDI-TOF-MS Analyse (linearer Modus), Matrix HCCA

Re

l.In

t.

m/z2000 4000 6000 8000

WCX

WAX

HIC

IMAC


Zellkulturüberstand

m/z

Kontrolle

Kontrolle

Kontrolle

24h BBTx

24h BBTx

24h BBTx

2000 4000 6000 8000

Re

l.In

t.

Zellkulturüberstand- Gift einer Taiwanesischen Giftschlange

(banded krait Bungarus multicinctus):

Beta-Bungarotoxin (BBTx)

- BBTx induziert neuronale Apoptose (hippocampale Kulturen):

- Bindung an spannungsabhängige K+ Kanäle

- Internalisierung

- Anstieg von intrazellulärem Ca2+

- Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)

- Modifizierung von Proteinen und Lipiden

- Apoptose


MALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsMALDI-TOF-MS & Clinical ProteomicsZellkulturüberstand

m/z

Kontrolle

Kontrolle

Kontrolle

24h BBTx

24h BBTx

24h BBTx

2000 2500 3000

Re

l.In

t.



- Lipidomics- Lipidomics - -

MALDI-TOF-MS MALDI-TOF-MSin der Lipid-Analytikin der Lipid-Analytik



Lipid-Analyse mit MALDI-TOF-MSLipid-Analyse mit MALDI-TOF-MS

770 810790750 m/z

Phosphatidyl-cholin

Re

l.In

t.

m/z760

Re

l.In

t.

m/z810

Re

l.In

t.

m/z790

Re

l.In

t.

780

A B C Signalbereiche A

B

C

1 2 3 4

12345 6789

34 5 6

1 PC 16:0 / 18:2 oder

PC 16:1 / 18:1 oderPC 16:2 / 18:0

3 PC 16:0 / 18:1 oderPC 16:1 / 18:0

5 PC 16:0 / 18:0

1 PC 16:0 / 22:6 oder ...3-6Na+ -Shifts von B6-B9 ?3 PC 18:1 / 20:4 oder ...5 PC 18:0 / 20:4 oder ...

1-5Na+ -Shifts von A1-A5 ?3 PC 16:0 / 20:46 PC 18:0 / 18:2 oder ...

PC 18:1 / 18:18 PC 18:0 / 18:1

5

1 2



MALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS

MALDITOFMS

Auflösung

Sensitivität

Genauigkeit Quantifizierung Geschwindigkeit

Automatisierung

Hochdurchsatz

Reproduzierbarkeit Poolen & Multiplex Kosteneffizienz



DanksagungDanksagungInstitut für Biochemie (Universität Erlangen-Nürnberg)

Cord-Michael Becker Kristina Becker Katrin SchiebelSilke Seeber Daniela Gockenhammer Andre Reuland Thomas Bonk Julia Brill Nadine BalbusClaudia Sass Thomas Kislinger

Klinik für Frauenheilkunde (Universität Erlangen-Nürnberg)

Mattias Beckmann Reiner Strick Pamela StrisselLudwig Wildt Alexander Berkholz Michael Bauer

Insitut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (Universität Erlangen-Nürnberg)

Monika Pischetsrieder Carlo Peich Jasmin Meltretter

Molekulare Diagnostik (Universität Heidelberg)

Magnus von Knebel-Döberitz Johannes Gebbert Christian Sutter

Bruker Daltonik GmbH (Bremen und Leipzig)

Jochen Franzen Uwe Rapp Markus Kostrzewa


Documents

Analyse von Makromolekülen mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Molekularen Medizin Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin