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RAQUEL FERRARI MARCHESI
Anemia aplástica adquirida - avaliação da biópsia de
medula óssea na identificação de prognóstico desfavorável,
aferido pela evolução para SMD /LMA –
um estudo comparativo em crianças e adultos
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título
de Doutora em Ciências
Programa de Patologia
Orientadora: Profa. Dra. Maria Cláudia Nogueira
Zerbini
Coorientadora: Profa. Dra. Elvira Deolinda
Rodrigues Pereira Velloso
São Paulo
2017
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
reprodução autorizada pelo autor
Marchesi, Raquel Ferrari Anemia aplástica adquirida - avaliação da biópsia de medula óssea na identificação de prognóstico desfavorável, aferido pela evolução para smd /lma – um estudo comparativo em crianças e adultos / Raquel Ferrari Marchesi -- São Paulo, 2017.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Patologia.
Orientadora: Maria Claudia Nogueira Zerbini. Coorientadora: Elvira Deolinda Rodrigues Pereira Velloso..
Descritores: 1.Anemia aplástica adquirida 2.Aplasia medular 3.Síndrome
mielodisplásica 4.Citopenia refratária da infância 5.Leucemia mieloide aguda 6.Biópsia 7.Medula óssea 8.Imuno-histoquímica 9.Blastos 10. CD34
USP/FM/DBD-235/17
A meu marido Pedro
e
a meu filho Teodoro,
meus amores!
AGRADECIMENTOS
A meu amado marido Pedro Luiz Guimarães Costa e meu filho Teodoro Luiz
Marchesi Costa, por serem fontes inesgotáveis de amor, coragem e
inspiração.
A meus pais Luiz Marchesi Filho e Terezinha Ferrari Marchesi e meus irmãos
Luiz Marchesi Neto e Henrique Ferrari Marchesi, pela minha formação
pessoal.
A meu sogro Paulo Luiz Aguirre Costa, pelo apoio em muitos momentos.
A minha orientadora Professora Dra. Maria Claudia Nogueira Zerbini, por
quem tenho profunda admiração, pela confiança e dedicação dispensadas.
A minha coorientadora Dra Elvira Deolinda Rodrigues Pereira Velloso, a quem
tive o privilégio de conhecer durante a realização desta pesquisa, por toda
paciência, disposição e solicitude.
A Dra. Marlene Pereira Garanito que, gentilmente, cedeu dados dos pacientes
pediátricos.
Ao Professor Dr Raymundo Soares de Azevedo Neto, pela paciência ao
realizar conosco a análise estatística do estudo.
A Cristina Aiko Kumeda, pelo auxílio profissional na realização dos exames
de FISH.
A minha equipe de trabalho do Laboratório APC, pelo companheirismo e apoio
emocional.
A Dra. Sheila Aparecida Coelho Siqueira, pelo apoio profissional.
Ao pessoal da técnica do Laboratório de Histopatologia, em especial a Kelly,
e da técnica de Imuno-histoquímica, em especial a Ângela e a Cristina, pela
boa vontade.
Ao Thiago Rezende da pós-graduação, pelos esclarecimentos prestados.
Agradeço aos Pacientes.
“Tudo vale a pena
Se a alma não é pequena.”
Fernando Pessoa
Normalização adotada
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento
desta publicação:
Referências: adaptado de Internacional Committee of Medical Journals
Editors (Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Divisão de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria
F. Crestana, Marinalva de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria
Vilhena. 3ª ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed
in Index Medicus.
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Resumo
Summary
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................ 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................... 4
2.1 Anemia aplástica .................................................................................. 5
2.1.1 Definição .................................................................................. 5
2.1.2 Epidemiologia ........................................................................... 5
2.1.3 Fisiopatologia, diagnóstico e morfologia ................................... 5
2.1.4 Tratamento ............................................................................... 7
2.1.5 Alterações genéticas e evolução clonal .................................... 7
2.2 Síndrome mielodisplásica .................................................................... 9
2.2.1 Definição .................................................................................. 9
2.2.2 Epidemiologia ........................................................................... 9
2.2.3 Fisiopatologia, diagnóstico e morfologia ................................. 10
2.2.4 Alterações genéticas .............................................................. 11
2.2.5 Síndromes mielodisplásicas na infância ................................. 12
2.3 Considerações sobre o diagnóstico diferencial entre AAA e SND hipoplásica ...................................................................................... 14
3 OBJETIVOS .............................................................................................. 16
3.1 Objetivo principal ............................................................................... 17
3.2 Objetivos secundários ........................................................................ 17
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS ...................................................................... 18
4.1 Casuística .......................................................................................... 19
4.2 Métodos ............................................................................................. 20
4.2.1 Coleta de dados clínicos ........................................................ 20
4.2.2 Achados laboratoriais e morfológicos ..................................... 21
4.2.2.1 Hemograma .............................................................. 21
4.2.2.2 Mielograma ............................................................... 22
4.2.2.3 Biópsia de medula óssea .......................................... 22
4.2.2.3.1 Parâmetros morfológicos e imuni-histoquímicos analisados ........................ 23
4.2.2.3.2 Processamento do fragmento de biópsia de medula óssea ......................... 27
4.2.2.3.3 Exame imuno-histoquímico (IHQ) ............. 28
4.2.2.4 Citogenética .............................................................. 30
4.2.2.4.1 Citogenética convencional - cariótipo ........ 30
4.2.2.4.2 Citogenética molecular - hibridização “in situ” por fluorescência (FISH) ............. 30
4.2.3 Análise estatística ................................................................... 31
5 RESULTADOS .......................................................................................... 32
5.1 Análise da casuística ......................................................................... 33
5.2 Avaliação das amostras de biópsias de medula óssea ...................... 36
5.2.1 Qualidade das amostras ......................................................... 36
5.2.2 Parâmetros morfológicos / imuno-histoquímicos estudados ............................................................................. 40
5.2.2.1 Comparação dos achados morfológicos / imuno-histoquímicos em crianças e adultos ........................ 49
5.2.2.2 Comparação dos achados morfológicos / imuno-histoquímicos em pacientes que evoluíram e que não evoluíram para SMD/LMA ................................. 50
5.2.2.3 Comparação dos achados morfológicos / imuno-histoquímicos no grupo total, em adultos e crianças que evoluíram e que não evoluíram para SMD/LMA ................................................................. 51
5.2.3 Avaliação de critérios de Bennett e Orazi e de Baumann et al. aos grupos ....................................................................... 52
5.2.4 Avaliação do índice proliferativo (Ki-67) em relação à celularidade geral do grupo total ........................................... 55
5.3 Citogenética ....................................................................................... 58
5.4 Descrição dos 12 pacientes que evoluíram para SMD/LMA .............. 59
6 DISCUSSÃO ............................................................................................. 67
7 CONCLUSÕES ......................................................................................... 74
8 REFERÊNCIAS ......................................................................................... 76
9 ANEXOS ................................................................................................... 91
Anexo 1 - Análise dos pacientes previamente tratados ........................... 92
Anexo 2 - Avaliação de sobrevida livre de evento dos pacientes segundo faixa etária e gravidade da anemia aplástica ........... 93
Anexo 3 - Comparação dos achados morfológicos/imuno-histoquímicos em crianças com menos de 14 anos e grupo com 14 anos ou mais .................................................... 95
Anexo 4 - Resultados de estudos citogenéticos ...................................... 96
LISTAS
ABREVIATURAS
AA Anemia aplástica
AAA Anemia aplástica adquirida
ALIP do inglês: abnormally localized immature precursors
ASLX1 do inglês: additional sex combs like 1 gene
ATG do inglês: anti-thymocyte globulin
BCOR/BCORL1 do inglês: BCL6 corepressor/BCL6 corepressor like 1
BMO Biópsia de medula óssea
CRI Citopenia refratária da infância
CsA Ciclosporina A
CSMD1 do inglês: CUB and Sushi multiple domains 1 gene
DNMT3 do inglês: DNA methyltransferase 3 alpha gene
FISH do inglês: Fluorescent in situ hybridization
HE hematoxilina e eosina
HPN Hemoglobinúria paroxística noturna
IFNγ interferon gamma
IHQ Imuno-histoquímica
ISCN do inglês: International System for Human Cytogenetic Nomenclature
LMA Leucemia mieloide aguda
MO Medula óssea
MPO mieloperoxidase
OMS Organização Mundial da Saúde
PIGA do inglês: phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis class A
RUNX1 do inglês: runt related transcription factor 1 gene
SF3B1 do inglês: splicing factor 3b subunit 1
SMD Síndrome mielodisplásica
SMD-h Síndrome mielodisplásica hipocelular
SRSF2 do inglês: serine and arginine rich splicing factor 2 gene
TCR do inglês: T-cell receptor
TET2 do inglês: tet methylcytosine dioxygenase 2 gene
TNFα do inglês: tumor necrosis factor alpha
TP53 do inglês: tumor protein p53 gene
FIGURAS
Figura 1 - Artefato de descolamento (HE, 50x) ....................................... 36
Figura 2 - Artefato de hemorragia (HE, 100x) ......................................... 37
Figura 3 - Artefato de fragmentação (HE, 100x)...................................... 37
Figura 4 - Distribuição irregular do tecido hematopoético em paciente que não evoluiu para SMD/LMA, com área de maior celularidade ao lado de área com celularidade muito baixa (hematoxilina e eosina, 100x) ................................................. 41
Figura 5 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica ao HE (400x) em paciente de 18 anos que não evoluiu para SMD/LMA .................................................... 42
Figura 6 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica ao HE (400x) em paciente de 18 anos que não evoluiu para SMD/LMA .................................................... 42
Figura 7 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica em paciente de 18 anos que não evoluiu à marcação imuno-histoquímica para MPO (elementos granulocíticos em marrom, 400x) ............................................ 43
Figura 8 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica em paciente de 18 anos que não evoluiu para SMD/LMA, à marcação imuno-histoquímica para Glicoforina A (elementos eritroides em marrom e granulocíticos em azul) (glicoforina A, 200x) .......................... 43
Figura 9 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica ao HE (400x) em paciente de 16 anos que não evoluiu para SMD/LMA ........................................................... 44
Figura 10 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica ao HE (400x) em criança de 4 anos que evoluiu para SMD/LMA ....................................................................... 44
Figura 11 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica com formas jovens (seta) (Glicoforina A, 200x) ..... 45
Figura 12 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica ao HE (400x) com mitoses (setas) ........................ 45
Figura 13 - Megacariócitos em agregados (HE, 200x) .............................. 46
Figura 14 - Megacariócitos hipolobados (setas) (HE, 200x) ...................... 46
Figura 15 - Megacariócito binucleado (seta) (HE, 200x) ........................... 47
Figura 16 - Megacariócito multinucleado (seta) (HE, 200x) ...................... 47
Figura 17 - Blasto CD34-positivo entre dois vasos (seta) (CD34, 200x) ... 48
Figura 18 - Reticulogênese grau 2 (de 0 a 4) e grau 1 (de 0 a 3) (coloração para reticulina, 200x) ............................................. 48
Figura 19 - Sobrevida livre de eventos, conforme os critérios de Orazi .... 53
Figura 20 - Sobrevida livre de eventos, conforme os critérios de Baumann et al. ........................................................................ 54
Figura 21 - Índice proliferativo ao Ki-67 alto (90% das células nesse campo) no tecido hematopoético (Ki-67, 200x) ....................... 55
Figura 22 - Correlação positiva entre celularidade medular e índice proliferativo ............................................................................. 56
Figura 23 - Índice proliferativo ao Ki-67 alto (aproximadamente 100% das células nesse campo) no tecido hematopoético de amostra com baixa celularidade (Ki-67, 200x) ........................ 57
Figura 24 - Índice proliferativo ao Ki-67 baixo (cerca de 5% das células nesse campo) no tecido hematopoético de amostra com celularidade relativamente mais alta (Ki-67, 200x) ................. 57
Figura 25 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 1 (HE, 100x) ............................................................. 61
Figura 26 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 2 (HE, 100x) ............................................................. 61
Figura 27 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 3 (HE, 100x) ............................................................. 62
Figura 28 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 4 (HE, 100x) ............................................................. 62
Figura 29 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 5 (HE, 100x) ............................................................. 63
Figura 30 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 6 (HE, 100x) ............................................................. 63
Figura 31 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 7 (HE, 100x) ............................................................. 64
Figura 32 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 8 (HE, 100x) ............................................................. 64
Figura 33 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 9 (HE, 100x) ............................................................. 65
Figura 34 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 10 (HE, 100x) ........................................................... 65
Figura 35 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 11 (HE, 100x) ........................................................... 66
Figura 36 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 12 (HE, 100x) ........................................................... 66
TABELAS
Tabela 1 - Anticorpos utilizados ............................................................... 23
Tabela 2 - Descrição dos grupos total, adulto e pediátrico ...................... 34
Tabela 3 - Descrição do grupo total, que não evoluiu para SMD/LMA e que evoluiu para SMD/LMA ................................................. 35
Tabela 4 - Qualidade das BMO dos grupos total, adulto e pediátrico ...... 39
Tabela 5 - Qualidade das BMO do grupo total, que não evoluiu para SMD/LMA e que evoluiu para SMD/LMA ................................ 39
Tabela 6 - Análise comparativa dos parâmetros MI entre grupo adulto e pediátrico ............................................................................. 49
Tabela 7 - Análise comparativa dos parâmetros MI entre grupo que evoluiu e que não evoluiu para SMD/LMA .............................. 50
Tabela 8 - Análise comparativa dos parâmetros MI entre grupo total, adulto e pediátrico que evoluiu e que não evoluiu para SMD/LMA ................................................................................ 51
Tabela 9 - Correlação entre celularidade e índice proliferativo pelo teste Rô de Spearman ............................................................ 56
Tabela 10 - Resumo dos resultados de citogenética ................................. 58
Tabela 11 - Descrição morfológica resumida dos 12 pacientes que evoluíram para SMD/LMA ....................................................... 60
RESUMO
Marchesi RF. Anemia aplástica adquirida - avaliação da biópsia de medula óssea na identificação de prognóstico desfavorável, aferido pela evolução para SMD /LMA – um estudo comparativo em crianças e adultos [Tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2017.
Anemia aplástica adquirida (AAA) é doença rara e seu diagnóstico diferencial inclui a Síndrome mielodisplásica hipocelular (SMD-h). A evolução de AAA para SMD/LMA (Síndrome mielodisplásica/Leucemia mieloide aguda) ocorre em até 15% dos casos. Este estudo propõe-se a comparar parâmetros histológicos e imuno-histoquímicos de pacientes adultos e crianças com AAA que evoluíram e não para SMD/LMA. Seu objetivo é avaliar a ocorrência dos critérios morfológicos/imunofenotípicos nas biópsias de medula óssea do grupo pediátrico (<19 anos) com o grupo de adultos, comparar esses critérios associados à evolução para SMD/LMA nestes dois grupos e verificar se estes critérios superpõem-se àqueles descritos na literatura na SMD-hipocelular do adulto e, mais recentemente, na SMD pediátrica (Citopenia refratária da infância - CRI). Espera-se trazer uma contribuição para a discussão da intersecção entre essas entidades e a AAA, estudando essa “zona cinzenta” do ponto de vista dos pacientes com AAA, particularmente aqueles que progrediram para SMD/LMA. Foram analisadas, retrospectivamente, 118 biópsias de medula óssea ao diagnóstico de AAA, idiopática ou não, realizadas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo entre 1993 e 2012. O diagnóstico de AAA foi estabelecido de acordo com critérios clássicos. A evolução de AAA para SMD ou LMA foi considerada na presença de: disgranulopoese ou dismegacariopoese acentuadas, mais de 15% de sideroblastos em anel, blastos em sangue periférico ou mais de 5% de blastos na medula óssea ao mielograma e/ou à biópsia de medula óssea ou na presença de estudo citogenético (FISH ou cariótipo) da medula óssea, apresentando monossomia ou deleção do braço longo do cromossomo 7. Todas as biópsias foram submetidas à análise morfológica e imuno-histoquímica (MPO, Glicoforina A, Fator VIII, CD34, CD117 e Ki-67) por dois hematopatologistas sem conhecimento prévio da evolução dos pacientes. As variáveis qualitativas nominais foram analisadas pelo teste exato de Fisher para verificar se houve desproporção significativa entre os grupos. As variáveis qualitativas ordinais foram analisadas para a diferença entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney. O nível de significância adotado foi 5% (p=0,05). A correlação entre os valores de celularidade geral das amostras e seu índice proliferativo foi avaliada pelo teste não paramétrico Rô de Spearman. Setenta e um pacientes (60,2%) eram do gênero masculino com mediana de idade 24,4 anos (mínimo de 7 meses até 76 anos), 42 do grupo pediátrico e 76 adultos, e tempo de seguimento de 5,1 anos (de 1 mês a 22,1 anos). Doze (10,2%) (seis em cada grupo) pacientes evoluíram para SMD/LMA. Avaliação dos parâmetros
morfológicos e imuno-histoquímicos mostrou distribuição irregular do tecido hematopoético em 59 (50%) casos, mediana de celularidade geral de 10% (de 1% a 40%), distúrbio de maturação da série granulocítica (critério 1) em três (2,5%) casos, localização anormal da eritropoiese em 13 (11%) casos, agregados de pelo menos 20 precursores eritroides (critério 2), em 54 (45,7%) casos, presença de formas jovens eritroides (proeritroblastos) (critério 3) em 32 (27,1%) casos, aumento do número de mitoses dos elementos eritroides (critério 4) em 24 (20,3%) casos, displasia de megacariócitos (micromegacariócitos, megacariócitos bi ou multinucleados e elementos hipo ou monolobados) (critério 5) em 15 (12,7%) casos, localização anormal de megacariócitos em quatro (3,3%) casos, megacariócitos CD34-positivos não foram identificados, blastos CD34-positivos em 11 (9,3%) casos, reticulogênese discretamente aumentada (grau 1) em três (2,5%) casos e índice proliferativo (Ki-67) com mediana de 30 (de 0% a 90%). Critérios descritos por Bennett e Orazi sugestivos de SMD-h (critérios 1 e/ou 5) foram detectados em 16 (13,6%) casos. Critérios descritos por Baumann et al. sugestivos de SMD da infância (critérios 2 + 3 com ou sem 4) foram observados em 30 (25,4%) casos. Não houve diferença estatística nos achados morfológicos/imuno-histoquímicos entre a população total, adultos e crianças que evoluíram e que não evoluíram para SMD/LMA, incluindo a presença de critérios Bennett e Orazi para SMD-h do adulto. Houve diferença quanto aos critérios de Baumann et al. para CRI, e o grupo que não evoluiu para SMD/LMA apresentou com mais frequência os critérios do que o que evoluiu (p=0,036), ao contrário do previamente suposto. No entanto, ao testar esta hipótese no grupo adulto separado do pediátrico, a diferença estatística não foi comprovada. Houve uma correlação estatisticamente significante entre os valores da celularidade geral das amostras e seu índice proliferativo (p< 0,001). Pacientes adultos e pediátricos com AAA, incluindo os que evoluíram para SMD/LMA, têm características morfológicas/imuno-histoquímicas semelhantes. Algumas alterações descritas por Baumann et al. para SMD pediátrica são também encontradas em casos pediátricos e de adultos com AAA. Além disso, o índice proliferativo pode ser aumentado em casos de AAA, este dado não tem correlação com a evolução para SMD/LMA. Alterações morfológicas/imuno-histoquímicas em biópsias de medula óssea em AAA não identificaram um grupo com maior risco de progressão para SMD/LMA em nossa casuística.
Descritores: anemia aplástica adquirida, aplasia medular, síndrome mielodisplásica, citopenia refratária da infância, leucemia mieloide aguda, biópsia, medula óssea, imuno-histoquímica, blastos, CD34.
SUMMARY
Marchesi RF. Acquired aplastic anemia – bone marrow histology complemented by immunohistochemistry in identifying unfavorable prognosis, defined by progression to MDS/AML – a comparison between children and adults [Thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2017.
Acquired Aplastic Anemia (AAA) is a rare disease which progresses to MDS / AML in up to 15% of cases. When this happens, hematopathologists are asked whether the diagnosis of hypocellular Myelodisplastic Syndrome (h-MDS) would not have been confused morphologically with aplastic anemia. This study aims to identify morphological/immunophenotypical findings that could predict this adverse prognosis in adults and children (<19y) diagnosed as AAA and verify if those criteria match with the ones described in literature in adult h-MDS and, more recently, in pediatric MDS (Refractory cytopenia of childhood - RCC), contributing to the discussion of this “grey zone”. We retrospectively analyzed 118 patients/bone marrow (BM) biopsies at the moment of AAA diagnosis at Clinical Hospital of São Paulo Medical School from 1993 to 2012. Diagnosis of AAA was carried out according to classical criteria. Evolution to MDS or AML was considered in the presence of at least one of the findings: significant dysgranulopoiesis or dysmegakaryocytopoiesis, more than 15% ring sideroblasts, blasts in peripheral blood or more than 5% blasts in bone marrow smear and/or biopsy, or in the presence of monosomy or deletion of the long arm of chromosome 7 by cytogenetic analysis (FISH or karyotype) of the BM. All biopsies were submitted to morphological and immunophenotypic (MPO, Glycophorin A, Factor VIII, CD34, CD117 and Ki67) evaluation by two hematopathologists without previous knowledge about the evolution of the patients. Nominal qualitative variables were analyzed by using Fisher's exact test to check significant disproportion between the groups. The ordinal qualitative variables were analyzed for differences between groups by Mann-Whitney test. The significance level was 5% (p = 0.05). The correlation between the overall cellularity values of the samples and their proliferative index was evaluated by nonparametric Spearman Rô test. Seventy-one (60,2%) were male, median age 24.4 years (7 months to 76 years old), 42 belongs to the pediatric group and 76 to the adults group. Median follow-up was 5.1y (range, 1 month to 22.1 years). Twelve patients (12%) (6 in each group) progressed to MDS/AML. Evaluation of morphological/immunohistochemical parameters showed irregular distribution of hematopoietic tissue in 59 (50%) cases, median BM overall cellularity of 10% (range, 1 to 40%), marrow dysgranulopoiesis (criteria 1) in 3 (2,5%) cases, abnormal localization of erythropoiesis in 13 (11%) cases, clusters of at least 20 erythroid precursors (criteria 2) in 54 (45.7%) cases, increased number of proerythroblasts (criteria 3) in 32 (27,1%) cases, increased number of mitoses of the erythroid elements (criteria 4) in 24 (20,3%) cases, marrow
dysplasia of megakaryocytes (micromegakaryocytes , two or more separeted nuclei, small round nuclei) (criteria 5) in 15 (12,7%) cases, abnormal localization of megakaryocytes in 4 (3,3%) cases, CD34-positive megakaryocytes were not identified, CD34-positive blast cells (criteria 6) in 11 (9,3%) cases, increment in reticulin fibers in 3 (2,5%) cases, and median proliferative index (Ki-67) 30 (range, 0 to 90%). Criteria described by Bennett and Orazi suggestive of h-SMD (criteria 1 and/or 5) were detected in 16 (13,6%) cases. Criteria described by Baumann et al suggestive of childhood MDS (criteria 2 + 3 with or without 4) were observed in 30 (25.4%) cases. There was no statistical difference in morphological/immunohistochemical findings among total population, adults and children who developed and did not develop MDS/AML, including the presence of Bennett and Orazi criteria for h-MDS. Regarding Baumann et al criteria were more frequently identified in the group that did not progress to MDS/AML than the one that did (p=0,036), the opposite of what was expected. But when the criteria were tested in pediatric and adults’ groups separately, the statistical significance was no longer observed. There was a statistical significant correlation between the overall cellularity values of the samples and their proliferative index (p=0,001). Adult and pediatric patients with AAA, including those that progress to MDS/AML, have similar morphological/immunohistochemical characteristics. Some changes described by Baumann et al for pediatric MDS are also found in pediatric and adults’ cases with AAA. In addition, the proliferative index may be increased in cases of AAA and this finding has no correlation with progression to MDS/AML. Morphological/immunohistochemical changes in bone marrow biopsies in AAA have failed to identify a group at higher risk for progression to MDS/AML in our series.
Descriptors: acquired aplastic anemia, bone marrow failure, myelodysplastic syndrome, refractory cytopenia of childhood, acute myeloid leukemia, biopsy, bone marrow, immunohistochemistry, blasts, CD34.
1 Introdução
Introdução 2
1 INTRODUÇÃO
Anemia aplástica (AA) ou aplasia medular, classificada como congênita
ou adquirida, é uma doença hematológica rara e heterogênea caracterizada
pela redução da produção de eritrócitos, granulócitos e plaquetas, resultando
em pancitopenia no sangue periférico, de gravidade variável e, mais
raramente, combinações de bicitopenias e monocitopenias podem ocorrer
nesta doença. Estas alterações são secundárias à falência da medula óssea,
que é substituída por tecido adiposo em grau variável, na ausência de células
neoplásicas e de fibrose medular 1. Até o momento, os mecanismos
etiopatogênicos propostos para explicar a insuficiência medular na anemia
aplástica adquirida (AAA) são a lesão direta das células primitivas da linhagem
hematopoética, a anormalidade subjacente das células hematopoéticas e o
mecanismo imunomediado - atualmente o mais aceito e conforme o qual,
ocorre agressão e apoptose imunomediada das células tronco e células
progenitoras da medula óssea (MO), a partir da produção descontrolada de
citocinas incluindo IFNγ e TNFα por células T ativadas 2. Na maioria dos
casos, como a determinação da causa da AAA não é possível, é classificada
como idiopática. A gravidade da aplasia é determinada pelo critério
internacional de Camitta e colaboradores 3; 4, que classifica a AA em grave,
muito grave e não grave, sendo que os pacientes portadores de AA grave e
muito grave são os de eleição para o tratamento. A AAA é, com mais
frequência, observada em crianças e seu diagnóstico diferencial inclui as
falências medulares congênitas e a Síndrome mielodisplásica (SMD), que
nessa faixa etária apresenta-se, frequentemente, hipocelular sob a forma de
Citopenia refratária da infância (CRI).
A relação entre a AAA e a CRI, e como consequência o diagnóstico
diferencial entre elas, vem sendo motivo de controvérsia e de dificuldades
diagnósticas, clínica e morfologicamente. É fato bem documentado a
ocorrência de evolução clonal, incluindo a Hemoglobinúria paroxística noturna
(HPN), a SMD e a LMA, em cerca de 10%-20% dos pacientes com o
Introdução 3
diagnóstico de AAA nos 10 anos seguintes ao diagnóstico 5. A frequente
escassez de material representativo nos esfregaços das punções de MO,
determinada pela sua hipocelularidade, faz com que a biópsia de medula
óssea (BMO) torne-se material valioso para a abordagem diagnóstica nessas
condições. Poucos dados da literatura vêm abordando esse aspecto de forma
sistemática e com casuística representativa, e têm referido de maneira geral
a contribuição da BMO no diagnóstico diferencial entre pacientes com
diagnóstico de AAA grave nas crianças e CRI 6; 7; 8, ou AAA e SMD /LMA
hipocelulares nos adultos 9; 10; 11.
Este projeto propôs-se a analisar de forma sistemática uma coorte de
pacientes pediátricos com diagnóstico de AAA, identificando possíveis
parâmetros ao exame histológico complementado com o exame imuno-
histoquímico que possam identificar os pacientes com evolução para
SMD/LMA. Os resultados observados foram comparados com uma coorte de
pacientes adultos com diagnóstico de AAA, no sentido de se verificar se existe
um comportamento similar dos achados histológicos/imunofenotípicos
discriminantes da evolução dessa doença nas duas faixas etárias.
2 Revisão da Literatura
Revisão da Literatura 5
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 ANEMIA APLÁSTICA
2.1.1 Definição
Anemia aplástica é definida como citopenia múltipla com hipoplasia das
três linhagens da MO na ausência de neoplasia e aumento das fibras
reticulínicas, indicando uma falha básica em produzir elementos
hematopoéticos normais. Ela pode ser constitucional/congênita ou adquirida,
sendo esta última a mais comum e tipicamente caracterizada por uma
destruição autoimune de células progenitoras, que pode ser desencadeada
por fatores ambientais/exógenos identificáveis (secundária) ou não ter causa
óbvia (idiopática). É classificada conforme sua gravidade em não grave, grave
e muito grave e pode se apresentar associada ou não à HPN 12.
2.1.2 Epidemiologia
Trata-se de doença rara cuja incidência varia de dois casos por milhão
por ano dentre os americanos 13, 2-3 na Europa 14, 5,16 na Coréia 15 e 1,6 na
América Latina 16. Tem distribuição bifásica com picos entre 10-25 anos e
acima dos 60 14. Esta incidência é ainda menor na população pediátrica de 0
a 18 anos 17.
2.1.3 Fisiopatologia, diagnóstico e morfologia
A AAA pode ser idiopática ou secundária. Na forma idiopática e,
provavelmente, em algumas secundárias, as células-tronco parecem sofrer
um ataque autoimune mediado por células T ativadas, limitando sua
habilidade de manter a hematopoese 12. Ocorre uma acentuada diminuição
do número de células-tronco, chegando a menos de 1% da população original.
Revisão da Literatura 6
A fração de células-tronco CD34+ está diminuída na doença e relaciona-se ao
grau de severidade. Em especial, é conhecido o papel das células T CD8+, e
o das células T CD4+ é menos conhecido, mas, todas parecem ter algum grau
de clonalidade com restrição de sequências de TCR 17.
A AAA secundária pode estar relacionada com uma lista exaustiva de
causas, dentre elas, hepatites virais, vírus Epstein-Barr, HIV, enterovírus,
produtos químicos (solventes orgânicos, inseticidas, agrotóxicos) e drogas
terapêuticas (anticonvulsivantes e anti-inflamatórias).
O primeiro elemento diagnóstico refere-se à quantificação das
citopenias, assim definidas como, pelo menos, duas das seguintes: (i)
hemoglobina abaixo de 10 g/dL; (ii) leucopenia menor que 3.500/mm³ (ou
neutropenia abaixo de 1.500/mm³) e (iii) plaquetopenia menor que
50.000/mm³. A morfologia avaliada por meio da biópsia de MO mostra
redução da celularidade a 25% do valor normal para a idade ou redução
significativa da hematopoese (menos de 30% de tecido hematopoético,
incluindo as três linhagens) em contexto de hipocelularidade (menos de 50%
do normal para a idade) 12. Dosagens de vitamina B12, folato e perfil de
autoanticorpos devem ser realizadas. O segundo elemento diagnóstico
importante refere-se à exclusão de AA constitucional (anemia de Fanconi,
entre outras) e de neoplasias substituindo as linhagens hematopoéticas na
MO (tricoleucemia, LMA e leucemias linfoblásticas agudas), uma vez que
todas podem se apresentar com hipocelularidade da MO. O terceiro elemento
envolve a tentativa de identificação de causa desencadeante. E, finalmente,
verificar a presença do clone de HPN por citometria de fluxo, que prediz boa
resposta ao tratamento imunossupressor 12.
Morfologicamente, observa-se aplasia das três linhagens celulares.
Grupamentos de células eritroides com número aumentado de eritroblastos
imaturos, particularmente, proeritroblastos e micromegacariócitos estão
caracteristicamente ausentes. Linfócitos, plasmócitos e mastócitos podem
estar focalmente aumentados ou dispersos e após terapia imunossupressora,
o quadro histológico pode mimetizar o da CRI 6.
Revisão da Literatura 7
2.1.4 Tratamento
No grupo etário pediátrico, a indicação do tratamento depende da
classificação da AAA. Os pacientes com AAA grave e muito grave têm
terapêutica bem definida. Nos casos em que o paciente dispõe de doador
compatível, o transplante de células tronco hematopoéticas é o tratamento de
escolha, especialmente ao grupo de pacientes jovens. Para os indivíduos sem
doador compatível, aplica-se a terapia imunossupressora com imunoglobulina
antitimocítica (ATG) associada à Ciclosporina A (CsA) que, até o momento, é
a terapia de escolha e resulta em taxa de resposta entre 60% e 80%.
Aproximadamente 20% a 40% dos pacientes são refratários a esse tratamento
e requerem nova terapêutica imunossupressora ou transplante de MO, que
promove maior sobrevida livre de transformação clonal. A complicação mais
grave do uso crônico de imunossupressores é o desenvolvimento de doença
clonal. Esta condição, provavelmente, está relacionada ao aumento da
sobrevida decorrente do uso de imunossupressores, que favoreceria a
aquisição de anormalidades cromossômicas e o desenvolvimento de SMD e
expansão de clones da
HPN 5.
Pela citometria de fluxo, é possível detectar células de HPN nos
pacientes com AAA e os que apresentam baixo percentual de populações
clonais têm melhor resposta aos imunossupressores 18. Ao longo da evolução
da doença, 2,1% a 19% dos casos podem evoluir com expansão deste clone
e hemólise, mas a razão disso permanece desconhecida 5.
2.1.5 Alterações genéticas e evolução clonal
As anormalidades citogenéticas mais comumente detectadas incluem
trissomia do cromossomo 8, trissomia do 6, deleção do 5q e anormalidades
do cromossomo 13. Atenção especial deve ser dada à presença de
monossomia do cromossomo 7, particularmente em crianças, que deve alertar
para o diagnóstico de SMD, dado que estas possuem prognóstico reservado
Revisão da Literatura 8
e quadro clínico caracterizado por CRI ou LMA 19. A questão que permanece
é se essa evolução é resultado de um defeito preexistente em uma célula-
tronco ou de uma imprecisão morfológica no diagnóstico inicial da doença 20.
Geralmente, o clone encontrado na AAA é pequeno, sendo visualizado em
uma pequena porcentagem das metáfases e pode ser transitório. Na trissomia
do cromossomo 8, há alterações imunológicas que se assemelham às da AAA
e estes pacientes respondem ao tratamento imunossupressor 19.
Anormalidades genéticas somáticas clonais vêm sendo detectadas em vários
trabalhos. A teoria mais aceita para explicar esse fenômeno tem sido a do
“gargalo de garrafa”, em que as células-tronco mais resistentes ao ataque dos
linfócitos T têm uma vantagem proliferativa e, durante a recuperação da
hematopoese após intervenção com imunossupressores, aumentam sua
replicação levando à expansão do clone mutante resistente 21. A frequência
dessas mutações varia, alguns trabalhos mostram 4% a 11% dos casos de
AA 22; 23, outros de um terço até 67% dos pacientes com mutações somáticas,
que costumam ocorrer precocemente no curso da doença, aumentam de
frequência conforme a idade e que, geralmente, ocorrem como mecanismo de
escapar à resposta imune e aumentar a taxa de proliferação hematopoética,
sem necessariamente se correlacionar com prognóstico 24; 25. A hematopoese
clonal pode ocorrer mesmo em pacientes que não desenvolvem doença clonal
maligna, isso vem sendo denominado hematopoese clonal de potencial
indeterminado 22; 26; 27. Mutações dos genes PIGA e BCOR/BCORL1 são
estáveis ao longo do curso da doença. No entanto, há trabalhos que mostram
que cerca de 19% dos casos de AA apresentam mutações somáticas
“desfavoráveis”, incluindo mutações nos genes ASXL1, RUNX1, CSMD1 e
DNMT3A, que predispõem a uma evolução mais rápida para SMD, pior
sobrevida e pior resposta a imunossupressores 22; 23; 28; 29. O encurtamento
telomérico é observado, com frequência, em granulócitos e linfócitos
periféricos dos pacientes com AAA e parece ter relação com pior resposta ao
tratamento e maior risco de progressão para SMD 30; 31. Acima de tudo, o
contexto clínico em que os clones “desfavoráveis” surgem parece ser
Revisão da Literatura 9
importante e as alterações genéticas atualmente identificadas por NGS (next
generation sequencing) precisam ser interpretadas com cautela 32.
2.2 SÍNDROME MIELODISPLÁSICA
2.2.1 Definição
As Síndromes Mielodisplásicas são um grupo heterogêneo de
neoplasias clonais hematopoéticas, caracterizadas por hematopoiese
inefetiva que se manifestam com citopenia(s), displasia morfológica de 1 ou
mais linhagens hematopoéticas e propensão à progressão para LMA 33.
Clinicamente, os pacientes apresentam-se com citopenia(s) persistente(s)
(mais de 6 meses) sem causa definida, já que outras doenças sistêmicas
podem estar associadas à citopenia(s) e displasia, como as doenças
autoimunes, neoplasias, falência renal ou hepática e infecções sistêmicas.
Mais de 80% dos pacientes apresentam anemia e cerca de 15%, pancitopenia
34.
2.2.2 Epidemiologia
Na população geral, sua incidência é 4,9 por 100.000 pessoas por ano
em adultos 35; em homens idosos (acima de 70 anos) aumenta para até 59,8.
Além disso, é 5.000 vezes maior em adultos em relação às crianças nos
Estados Unidos da América 36. Há diferença das características da neoplasia
em relação a etnia. Recentemente, um estudo latino-americano de 1.080
pacientes com SMD de novo mostrou que os brasileiros apresentam maior
porcentagem da SMD com excesso de blastos (antiga anemia refratária com
excesso de blastos), mas não houve diferença quanto à estratificação de risco
citogenético entre brasileiros, argentinos e chilenos 37.
Revisão da Literatura 10
2.2.3 Fisiopatologia, diagnóstico e morfologia
A patogênese da doença é extremamente complexa e heterogênea,
envolve fatores ambientais, incluindo tratamentos medicamentosos e história
familiar. Atualmente, com sequenciamento genético de última geração,
numerosas mutações vêm sendo relacionadas à doença 38.
O diagnóstico envolve avaliação morfológica do esfregaço de sangue
periférico bem como do aspirado de MO e da BMO em contexto clínico
compatível, além de dados laboratoriais e citogenéticos/moleculares. São pré-
requisitos citopenia periférica persistente em uma ou mais das três linhagens
e exclusão de outras doenças hematopoéticas ou não hematopoéticas como
causa primária da citopenia, a menos que haja excesso de blastos ou
alterações genéticas compatíveis com o
diagnóstico 39.
Os critérios-chave para o diagnóstico são a contagem de blastos e a
displasia, também utilizados para a subclassificação da doença. Critérios
decisivos incluem a) pelo menos 10% das células de, pelo menos, uma
linhagem deve ser displástica, sendo a eritroide a mais frequente; b) 15% ou
mais sideroblastos em anel ou 5% ou mais na presença de mutação do
SF3B1; c) contagem de blastos de 5% a 19% e/ou alterações genéticas
típicas, d) presença de anormalidades citogenéticas clonais definidoras de
SMD (del(5q), monossomia do 7, del(7q) e outras) 39; 40; 41 O valor da BMO é
bem estabelecido e permite a avaliação acurada da celularidade, linhagem
predominante, alterações estromais, dismegacariocitopoese e alterações na
distribuição arquitetural dos elementos das três linhagens hematopoiéticas.
Esta última inclui a observação de ALIPs (abnormally localized immature
precursors - precursores mieloides imaturos anormalmente localizados),
relacionados a um subtipo de SMD mais agressivo, com maior incidência de
progressão para LMA 42.
A técnica imuno-histoquímica (IHQ) é um recurso complementar
importante utilizado em biópsias; ajuda não só a definir as alterações
displásicas e arquiteturais das diferentes linhagens celulares, assim como a
Revisão da Literatura 11
proporção e distribuição dos blastos CD34 positivos 43; 44; 45. O uso do antígeno
CD34 é muito útil na marcação e, consequentemente, a estimativa da
proporção de blastos na identificação dos ALIPs, bem como na marcação de
megacariócitos alterados, expressando de forma anômala este marcador no
citoplasma 42. Além disso, a presença de agregados celulares CD34 positivos
(>2 células) é um fator de risco independente para progressão para LMA 46.
Nos casos em que os blastos mieloides são CD34 negativos, o CD117 pode
ser aplicado como marcador alternativo, devendo, entretanto, ser levada em
consideração sua expressão adicional em mastócitos e precursores da série
eritroide. O painel imuno-histoquímico mínimo inclui CD34, CD117 e
marcadores de megacariócitos, como CD61, CD42 e FVIII, e para mastócitos,
como a triptase de mastócitos. Marcadores para as diferentes linhagens e
para excluir doenças na MO não relacionadas à SMD, como os linfomas,
também são úteis 43. O exame IHQ como técnica de avaliação complementar
ao exame morfológico tem assumido importância crescente na avaliação
diagnóstica das doenças que acometem a MO, levando, mais recentemente,
os pesquisadores a desenvolver grupos de trabalho com a finalidade de
padronização e controle externo de
qualidade 47.
2.2.4 Alterações genéticas
Em 50% dos casos são detectadas anormalidades cromossômicas,
nenhuma específica da doença; sendo as mais frequentes a deleção dos
braços longos dos cromossomos 5, 7 e 20, monossomia do cromossomo 7,
trissomia do 8 e cariótipos complexos que podem ser analisadas por estudo
de cariótipo convencional (banda G) e por FISH (fluorescent in situ
hybridization) 35; 48; 49; 50. As mesmas alterações ocorrem em pacientes com
SMD-h. Anormalidades cromossômicas numéricas dos cromossomos 7 e 8
(monossomia do 7 e trissomia do 8) 51 e cariótipos complexos estão
associados a maior risco de transformação leucêmica 52; 53; 54. A monossomia
do cromossomo 7 é a anormalidade citogenética com mais frequência
Revisão da Literatura 12
observada na evolução clonal (para SMD ou LMA) a partir da AA 5; 55.
Atualmente, com o advento do sequenciamento genético de última geração,
observou-se que quase 90% dos pacientes com SMD apresentam, pelo
menos, uma mutação somática dentre os 40 grupos de genes mais
frequentemente mutados em neoplasias mieloides, dentre eles, os genes
TET2, DNMT3A, ASLX1, TP53, SRSF2, SF3B1 e RUNX1, e isso pode estar
relacionado a prognóstico 56. Uma nova proposta de estratificação de risco foi
proposta com base nas novas descobertas da relação entre mutações
genéticas e prognóstico. O modelo baseado apenas no perfil dos genes
mutados foi similarmente efetivo ao IPSS-R em estratificar risco, mas, quando
combinado ao perfil clínico dos pacientes (com idade, gênero, citopenias,
contagem de blastos e citogenética), foi superior em termos de eficiência em
relação ao IPSS-R isolado 57.
2.2.5 Síndromes Mielodisplásicas na infância
As SMD são muito incomuns na infância. Sua incidência anual por
milhão é de 1-2 em crianças contra 40 nos adultos 58, correspondendo a
menos de 5% de todas as neoplasias hematopoiéticas em pacientes com
menos de 14 anos 10. A maioria dos casos é idiopática/de novo, 23,9% estão
associadas à doença constitucional/herdada e 7,4%, à terapia. Muitas das
características morfológicas, imunofenotípicas e genéticas observadas nas
SMD dos adultos também o são em crianças, mas há algumas diferenças
significativas 58; 59.
Muitos fatores podem dificultar o diagnóstico em crianças como: idade
do indivíduo, quanto mais jovem, menos pronunciadas são as características
displásticas; anemia isolada, que é a principal manifestação no adulto, é
incomum na criança, que se apresenta com maior frequência com neutropenia
e trombocitopenia; hipocelularidade é mais comumente observada em
crianças, variando de 11% a 60% dos casos e podendo exceder 70% nos de
baixo grau. Este fator pode levar à confusão diagnóstica com AA ou outras
doenças que cursem com falência de MO em crianças. Anormalidades no
Revisão da Literatura 13
cromossomo 7 são vistas com maior frequência nas crianças, cerca de 30%-
40% dos casos contra 10% dos adultos 58; 59. Em uma análise retrospectiva
sobre SMD em 67 crianças, 32 apresentaram monossomia do cromossomo 7
e 15 progrediram para uma forma avançada de SMD 60. A presença de
cariótipos estruturalmente complexos (três ou mais aberrações
cromossômicas, incluindo, pelo menos, uma aberração estrutural) é fator de
risco independente para predizer pior prognóstico em crianças com SMD
avançada 61.
Citopenia refratária da infância (CRI) é uma SMD caracterizada por
citopenia persistente com menos de 5% de blastos na MO e menos de 2% no
sangue periférico. Apesar de ser necessária a displasia morfológica para o
diagnóstico, isto é apenas um dos aspectos. A avaliação de uma amostra
adequada de MO é indispensável e cerca de 75% das crianças apresentam
hipocelularidade da MO. Esta é uma entidade provisória pela Organização
Mundial da Saúde (OMS) de 2008 e continua sendo pela OMS de 2016 41. É
o tipo mais comum de SMD da infância, correspondendo a 50% dos
casos 6; 7.
O quadro clínico inclui astenia, sangramentos, febre e infecções.
Hepatoesplenomegalia não é uma manifestação característica. Mais de 20%
dos pacientes não mostram sinais ou sintomas. Três quartos dos pacientes
apresentam trombocitopenia; metade, anemia e um quarto, leucopenia.
Macrocitose (hemácias) é encontrada na maioria dos pacientes 7.
Critérios morfológicos mínimos para o diagnóstico ao aspirado de MO
incluem alterações displásicas em, pelo menos, 10% dos precursores
eritroides e granulocíticos/neutrófilos, bem como micromegacariócitos
inequívocos ou núcleos hipolobados ou multinucleação de megacariócitos. À
BMO, alguns agregados de, pelo menos, 20 precursores eritroides devem ser
identificados, bem como número aumentado de proeritroblastos e de mitoses;
não há critérios mínimos para a série granulocítica. Em geral, os
megacariócitos encontram-se reduzidos em número ou mesmo ausentes,
sendo difícil identificar as características displásticas acima descritas. Vale
ressaltar que a ausência de megacariócitos não exclui o diagnóstico de CRI.
Revisão da Literatura 14
Aumento no número de células CD34-positivas, assim como na AA não é
observado. O grande diferencial morfológico entre CRI e AA na infância é que,
nesta última, a série eritroide está ausente ou apresenta apenas pequenos
focos de até 10 precursores com maturação preservada e os megacariócitos
não mostram qualquer característica displástica 7.
A presença de anormalidade genética é importante na confirmação
diagnóstica da CRI. Em amostras com celularidade normal ou aumentada, o
número de pacientes com monossomia do cromossomo 7 e sem resultados
avaliáveis é 19% e 8%, respectivamente. Quando a amostra é hipocelular, o
que ocorre em cerca de 80% das CRI, a identificação de monossomia do
cromossomo 7 cai para 9% e o número de casos inconclusivos sobe para 16%
6.
Diagnósticos diferenciais incluem uma série de doenças, como
infecções, sobretudo as virais, deficiência de vitamina B12 e folato, HPN,
doenças autoimunes, doenças geneticamente herdadas de falência da MO,
como anemia de Fanconi, disqueratose congênita e outras 7.
Morfologicamente, o diagnóstico de CRI é indistinguível dessas doenças, por
isso, a correlação com a clínica é essencial. O tratamento consiste em
transplante de MO, que é a única terapia curativa, mas agentes
imunossupressores também podem ser utilizados.
2.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ENTRE
AAA E SMD HIPOPLÁSICA
A incidência de transição de AAA para LMA é discutida há muitos anos
e isso, parcialmente, se explicou quando foi reconhecida uma forma
hipocelular da SMD (SMD-h). Como a AAA é muito heterogênea em termos
de etiologia, é possível admitir que haja uma via patogenética no sentido da
evolução para LMA; no entanto, a SMD é, reconhecidamente, uma doença
clonal neoplásica, com maior risco de se transformar 62. Bennett e Orazi 11
estudaram critérios diagnósticos para distinguir LMA e SMD-h da AAA em
Revisão da Literatura 15
adultos e relatam que as dificuldades variam desde a definição de
“hipocelularidade” até a real distinção entre essas entidades. Eles
estabeleceram um limite mínimo de 5% de blastos na MO, na ausência de
displasia significativa, para o diagnóstico de SMD e menos que 1% de blastos
na AAA. A presença de megacariócitos facilmente identificáveis em uma MO
desorganizada e a detecção de aumento da reticulogênese favorecem SMD,
bem como a identificação dos ALIPs, importante contribuição da biópsia
nesses casos. Ainda assim, critérios diagnósticos não estão bem
estabelecidos. Clinicamente, os pacientes com SMD-h têm pior evolução que
a AAA, mesmo que o grau de citopenia da AAA seja maior. O tratamento
utilizado vem sendo semelhante para as duas doenças e os pacientes com
SMD-h recebem-no com menos frequência que os com AAA, provavelmente,
pelo menor grau de citopenia. No entanto, a evolução da SMD-h sugere que
algum tratamento seja ministrado a esses pacientes independente da
citopenia e no sentido de prevenir a conversão para leucemia, utilizando
agentes hipometilantes ou transplante de MO, considerando-se o risco a longo
prazo de conversão de SMD para LMA com o uso de imunossupressores. Há
casos em que o diagnóstico inicial de SMD-h é alterado para AAA e, vice-
versa, durante a evolução e apenas pesquisa e experiência podem mudar
essa realidade 63. Em crianças, este diferencial é ainda mais desafiador,
considerando-se que metade dos casos de SMD são hipocelulares,
correspondendo à CRI 20; 33. Atualmente, discute-se a possibilidade de
considerar, como SMD-h, os casos de AAA com mutações genéticas
consideradas desfavoráveis 23.
3 Objetivos
Objetivos 17
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO PRINCIPAL
1. Avaliar parâmetros morfológicos/imuno-histoquímicos em BMO de
portadores de AAA que possam predizer evolução clínica para SMD
e/ou LMA.
3.2 OBJETIVOS SECUNDÁRIOS
1. Comparar a ocorrência dos critérios morfológicos/imuno-histoquímicos
nas BMO do grupo pediátrico (<19 anos) com o grupo de adultos.
2. Comparar o comportamento de critérios morfológicos/imuno-
histoquímicos associados à evolução para SMD/LMA no grupo etário
pediátrico com o grupo de adultos.
3. Verificar se esses critérios superpõem-se àqueles descritos na
literatura na SMD-h do adulto e, mais recentemente, na SMD pediátrica
(CRI), contribuindo para a discussão da interface entre essas entidades
e a AAA.
4. Verificar se existem evidências de proliferação celular avaliada por
meio do Ki-67 nos casos de AAA em crianças e adultos.
5. Verificar se estão presentes blastos CD34-positivos nos casos de AAA
em crianças e adultos.
4 Casuística e Métodos
Casuística e Métodos 19
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS
4 1 CASUÍSTICA
Para este estudo, foram selecionados, inicialmente, 180 pacientes
diagnosticados com Anemia Aplástica Adquirida (AAA) referidos no Instituto
da Criança da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e no
Serviço de Hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo entre 1993 e 2012.
Foram excluídos os pacientes com falências medulares constitucionais
e síndromes que se relacionam com progressão para LMA, como a Síndrome
de Down, deleções mitocondriais (síndrome de Pearson), doenças herdadas
de falência da medula óssea (Anemia de Fanconi por teste de DEB,
disqueratose congênita por clínica ou estudo de comprimento telomérico) e
anemia adquirida durante recuperação hematológica. Tais critérios foram
revisados a partir dos prontuários dos pacientes e dos resultados evolutivos
dos exames laboratoriais, incluindo exames citogenéticos/moleculares
utilizados para diagnóstico dessas doenças.
Critérios de inclusão constituíram pacientes com AAA idiopática ou
secundária que tinham material de BMO avaliável ao diagnóstico ou à
admissão nos serviços referidos acima. Inicialmente, foram excluídos 22
pacientes, pois não havia material disponível para estudo anatomopatológico
no Serviço (material retirado do arquivo pelos próprios pacientes). Dentre os
pacientes restantes (158), não foi possível obter o prontuário, em espécie ou
eletrônico, de 12 pacientes, por questões administrativas e logísticas do
Hospital das Clínicas, inviabilizando avalição adequada do seguimento clínico
dos mesmos, resultando 146 pacientes. Destes, nove foram excluídos por
insuficiência quantitativa do material anatomopatológico, restando um total de
137 pacientes. Os 15 pacientes que vieram de outros serviços já em
tratamento com imunossupressores também foram excluídos (vide Anexo 1),
restando 122 pacientes. Após a análise morfológica do material, quatro
Casuística e Métodos 20
pacientes foram excluídos por apresentar celularidade medular preservada
para a idade cronológica ao diagnóstico, resultando um total final de 118
pacientes.
Melhora clínica com resposta ao tratamento proposto para AAA excluiu
os pacientes da pesquisa de evolução para SMD/LMA. A evolução da doença
de AAA para SMD ou LMA foi considerada na presença de: disgranulopoese
ou dismegacariocitopoese importantes, mais de 15% de sideroblastos em
anel, blastos em sangue periférico ou mais de 5% de blastos na medula óssea
ao mielograma e/ou à BMO ou na presença de estudo citogenético (FISH ou
cariótipo) da medula óssea apresentando monossomia ou deleção do braço
longo do cromossomo 7 33.
A pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética para Análise de
Projetos de Pesquisa (CAPPesq) da Diretoria Clínica do Hospital das Clínicas
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo sob o Protocolo de
Pesquisa Número do Parecer: 249.707 com data da Relatoria: 06/03/2013
(Parecer consubstanciado do CEP).
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Coleta de dados clínicos
A coleta de dados clínicos foi realizada para todos os pacientes que
dispunham de prontuário no arquivo do Hospital das Clínicas e Instituto da
Criança, sendo observados os seguintes dados:
- Data de nascimento e gênero;
- Data da admissão e da biópsia de medula óssea;
- Uso de medicamentos e doenças de base ao diagnóstico;
- Medicamentos utilizados para o tratamento da AAA
* CsA
* ATG
* corticoides
Casuística e Métodos 21
- Datas e resultados de testes citogenéticos; e
- Data do evento final para o objetivo do trabalho:
* data do transplante de medula óssea
* data da evolução para SMD/LMA (data do exame que definiu tal
diagnóstico)
* data da última consulta ao seguimento
* data do óbito
4.2.2 Achados laboratoriais e morfológicos
Os achados morfológicos foram observados em esfregaços de sangue
periférico (SP), de MO e BMO à data do diagnóstico da AAA.
4.2.2.1 Hemograma
Os hemogramas foram realizados pelo Laboratório Central do Instituto
Central do HCFMUSP e foram computados como relevantes para diagnóstico
de aplasia medular a presença de, pelo menos, dois dos três critérios:
hemoglobina abaixo de 10g/dL; leucopenia menor que 3.500/mm³ (ou
neutropenia abaixo de 1.500/mm³) e plaquetopenia menor que 50.000/mm³.
Os critérios de gravidade foram determinados conforme Camitta e cols. 3 do
seguinte modo:
- grave (medula óssea com celularidade < 25% ou 25% a 50% com <30% de
células hematopoéticas residuais associadas a, pelo menos, dois dos
seguintes parâmetros em SP: neutrófilos < 500/mm³, plaquetas
< 20.000/mm³, reticulócitos < 20.000/mm³);
- muito grave (mesma definição de anemia aplástica grave associada a
neutrófilos < 200/mm³);
- não grave (paciente que não preencheram os critérios anteriormente
citados).
Casuística e Métodos 22
4.2.2.2 Mielograma
Os aspirados medulares ou “imprints” das BMO foram realizados e
avaliados por médicos capacitados do SH-HCFMUSP. As lâminas foram
submetidas à coloração de Leishman e de Perls.
A análise morfológica foi realizada sempre que possível em 250 células
para determinação da contagem diferencial, incluindo o número de blastos e
determinação de displasia. Na presença de mais de 50% de eritroblastos, os
blastos mieloides foram determinados dentro das células não eritroides 33.
A presença de displasia foi avaliada nas três séries hematopoéticas,
obedecendo aos critérios da OMS (2008) como a presença de displasia em,
pelo menos, 10% de células de uma determinada linhagem.
A coloração de Perls (coloração de azul da Prússia) foi utilizada para
determinação do percentual de sideroblastos em anel em 100 eritroblastos.
Sideroblasto em anel é definido pela presença de, pelo menos, cinco grânulos
de ferro com distribuição perinuclear circundando, pelo menos, um terço do
núcleo 64.
4.2.2.3 Biópsia de medula óssea
As biópsias de MO dos pacientes foram obtidas do arquivo da Divisão
de Anatomia Patológica do Instituto Central do Hospital das Clínicas, sendo
avaliados os parâmetros a seguir pela patologista orientada do Projeto e, a
seguir, pela patologista orientadora, revistos em conjunto os casos de dúvida
em microscópio de duas cabeças. O diagnóstico de AAA foi realizado pelo
achado em BMO de redução da celularidade a 25% do valor normal para a
idade ou redução significativa da hematopoese (menos de 30% de tecido
hematopoético, incluindo as três linhagens) em contexto de hipocelularidade
(menos de 50% do normal para a idade)12, associado a critérios clínico-
laboratoriais 1.
Casuística e Métodos 23
Para análise das BMO, foram utilizadas as colorações de Hematoxilina
e Eosina (HE), reticulina e reações imuno-histoquímicas, usando os
anticorpos primários relatados nos dados da Tabela 1.
Tabela 1 - Anticorpos utilizados
Antígeno Clone Marca Diluição Linhagem/Padrão de
marcação
Mieloperoxidase Policlonal
coelho Dako 1:12.000
Série granulocítica/citoplasmático
Glicoforina A JC159 Dako 1:10.000 Série eritrocítica/membranoso
Fator VIII F8/86 Dako 1:2.000 Série
megacariocítica/citoplasmático
CD34 QBEnd 10 Novocastra 1:100 Blastos mieloides e
magacariócitos/membranoso e citoplasmático
CD117 c-kit Dako 1:500 Blastos mieloides e
mastócitos/membranoso
Ki-67 MIB-1 Dako 1:100 Núcleos em fase
proliferativa/nuclear
4.2.2.3.1 Parâmetros morfológicos e imuno-histoquímicos
analisados
1. Tamanho da biópsia no maior eixo (em milímetros) – o comprimento ideal
é 2,0 cm; no entanto, 1,0 cm pode conter material suficiente para
diagnóstico 65.
2. Número de espaços intertrabeculares – pelo menos dez devem ser
avaliados 33.
3. Amostra subcortical: S (sim) ou N (não).
4. Artefatos: Sim (S) ou Não (N); se S – intensidade: 1+ a 3+, incluindo
hemorragia (H), fragmentação (F), arrancamento (A) e pinçamento (P).
5. Distribuição irregular do tecido hematopoiético: S ou N.
6. Celularidade geral
a. Dado numérico (%) – estimativa visual 66
Casuística e Métodos 24
b. Em relação à idade cronológica: 2 (aumentada), 1 (normal) ou 0
(diminuída).
7. Série granulocítica (HE e IHQ – mieloperoxidase):
a. Celularidade:
• Dado numérico da proporção de tecido hematopoético presente
na amostra em relação ao tecido adiposo (%) – estimativa visual;
• Em relação à idade cronológica: 2 (aumentada), 1 (normal) ou 0
(diminuída);
b. Distúrbio de arquitetura/maturação – localização anômala de
precursores imaturos (ALIP): S ou N;
Precursores imaturos anormalmente localizados (ALIP –
abnormally localized immature precursors): achado de, pelo
menos, três agregados (3-5 células) ou agrupamentos (mais de 5
células) de blastos localizados na porção central da medula óssea,
separados de estruturas vasculares e superfícies trabeculares 42.
8. Série eritrocítica (HE e IHQ – glicoforina A):
a. Celularidade:
• Dado numérico da proporção de elementos da SV em relação
aos elementos nucleados da MO (%) – estimativa visual;
• Em relação à idade cronológica: 2 (aumentada), 1 (normal) ou 0
(diminuída);
b. Distúrbio arquitetural: Sim ou Não – desorganização das colônias
de eritroblastos e presença de grupamentos de eritroblastos em
região peritrabecular;
c. Agrupamentos/colônias com 20 células nucleadas ou mais: S ou N
7;
d. Presença de formas jovens caracterizadas por proeritroblastos: S
ou N 7;
Casuística e Métodos 25
e. Presença de mitoses: S ou N 7;
f. Presença de atipias citológicas: c+d+e ou c+d ou c+e ou d+e,
dentre os itens acima.
9. Relação série granulocítica-série eritrocítica (HE e IHQ – MPO e
Glicoforina A).
10. Série megacariocítica (HE e IHQ – FVIII):
a. Celularidade:
• Número de células na amostra: <10 67, 10 a 24, > ou = 25 células
68;
• Celularidade: 2 (aumentada), 1 (normal) ou 0 (diminuída).
b. Características displásticas: S ou N - características de
megacariócitos displásticos (presentes em mais de 10% dos
elementos da amostra 68): micromegacariócitos – tamanho
semelhante ao do promielócito, megacariócitos binucleados
pequenos, megacariócitos multinucleados – núcleos pequenos
separados, megacariócitos com núcleo redondo – não lobulado 67.
c. Distúrbio de arquitetura: S ou N – localização atípica na borda
endosteal a agregados de duas células ou mais sem células
intervenientes 69.
d. Avaliação do CD34: positivo (>ou=20% de todos os megacariócitos
da biópsia) ou negativo (<20%) 70.
11. Blastos (HE e IHQ – CD34 e CD117)
a. Dado numérico (%): <1; 1-5; 6-10; 10-20; >20;
b. Distribuição: I ou A - Isolados (I) – 1 célula ou Agregados (A) – duas
ou mais células 46.
12. Contagem de índice proliferativo (IHQ – Ki-67): estimativa visual em
porcentagem (%) de células marcadas em relação ao total de células
Casuística e Métodos 26
nucleadas avaliadas em uma superfície de 10 mm² ou no total de
superfície da amostra 10.
13. Reticulogênese (coloração de prata para reticulina)
a. Semiquantificação de 0 a 3 71
• MF 0: reticulina linear esparsa;
• MF 1: rede de reticulina com várias interseções, especialmente,
perivasculares;
• MF 2: aumento difuso e intenso com extensas interseções,
feixes de colágeno focais e/ou osteosclerose focal;
• MF 3: aumento difuso e intenso com muitas interseções e
bandas densas de colágeno, geralmente, associada à
osteosclerose significativa.
b. Semiquantificação de 0 a 4 72
• 0: sem fibras demonstráveis de reticulina;
• 1+: apenas fibras individuais finas ocasionais;
• 2+: rede de fibras finas ao longo de quase toda a amostra, sem
fibras grossas demonstráveis;
• 3+: rede de fibras difusas com esparsas fibras grossas, mas sem
colágeno verdadeiro;
• 4+: rede de fibras grossas difusa com áreas de colagenização.
14. Avaliação dos critérios morfológicos e imuno-histoquímicos para SMD-h
conforme Bennett e Orazi 11: distúrbio de maturação da série granulocítica
caracterizado por ALIPs e/ou displasia de megacariócitos
(micromegacariócitos, megacariócitos binucleados ou multinucleados e
elementos hipo ou monolobados) e/ou aumento no número de blastos
CD34-positivos (>5%).
15. Avaliação dos critérios morfológicos e imuno-histoquímicos para CRI
segundo Baumann et al. 7: displasia eritroide caracterizada por agregados
Casuística e Métodos 27
de pelo menos 20 precursores eritroides com presença de formas jovens
eritroides (proeritroblastos) com ou sem aumento do número de mitoses
dos elementos.
4.2.2.3.2 Processamento do fragmento de biópsia de medula óssea
O processamento da biópsia de MO, no que diz respeito à fixação e
descalcificação, sofreu modificações ao longo do tempo, obedecendo a um
dos seguintes protocolos gerais:
I. Fixação em formalina salina a 10% ou líquido de Bouin por 6 a 24 horas
com posterior descalcificação em ácido nítrico a 10% por cerca de 3 horas.
II. Fixação em formol salino a 10%, tamponado por período mínimo de 6
horas, seguido de descalcificação em EDTA* onde permanece por 4
horas.
III. Do EDTA ou ácido nítrico passa para o processador de tecidos para a
rotina habitual.
*EDTA:
EDTA sódico p.a (TITRIPLEX III). .............................. 0,7 g
Tartarato de sódio e potássio p.a ............................... 8,6 g
Ácido clorídrico p.a ..................................................... 99,2 mL
Água destilada q.s.p. ou deionizada ........................... 1000 mL
Validade de 1 ano em temperatura ambiente.
Casuística e Métodos 28
4.2.2.3.3 Exame imuno-histoquímico (IHQ)
Os procedimentos técnicos relativos às reações de IHQ obedeceram
aos protocolos convencionais, descritos a seguir:
1. Desparafinização e hidratação - os cortes histológicos foram
desparafinizados em três banhos de xilol à temperatura ambiente durante
20 minutos cada. Posteriormente, foram hidratados em sequência
decrescente de etanol (absoluto, 95% e 70%) e água corrente durante 5
minutos cada.
2. Bloqueio da peroxidase endógena - em câmara escura com cinco
incubações em água oxigenada a 3% por 10 minutos cada. Em seguida,
as lâminas foram lavadas em água corrente e água destilada por 5
minutos cada e submersas em solução salina tamponada (PBS) pH 7,4.
3. Recuperação dos sítios antigênicos:
• Câmara de pressão controlada por microprocessador (Pascal) 121°C
por 3 minutos. Após esse tempo, a temperatura e pressão caem até
atingir 90°C por 10 segundos.
• Panela de pressão por 2 minutos.
• Panela a vapor durante 25 minutos após o aquecimento do tampão
por 20 minutos.
Utilizado tampão TRIS/EDTA 10mM/1mM com pH variável na
dependência do anticorpo primário utilizado. A seguir, as lâminas foram
lavadas em água corrente e água destilada por 5 minutos cada.
4. Bloqueio de proteínas inespecíficas do tecido com incubação em solução
de leite desnatado (Molico, Nestlé – marca registrada) a 10% durante 30
minutos à temperatura ambiente.
5. Incubação com o Anticorpo primário - as lâminas foram incubadas
overnight em câmara úmida na geladeira a 4°C com os anticorpos
primários.
Casuística e Métodos 29
6. Incubação com o sistema de detecção / amplificação - após serem
lavadas em PBS pH 7,4, por duas vezes, durante 5 minutos cada, as
lâminas foram incubadas com Novo Link Polymer Detection System
(Novocastra).
7. Cromógeno e contracoloração - as reações realizadas foram visualizadas
por meio do cromógeno diaminobenzidina (3,3´-diaminobenzidine, SIGMA
Chemical Co., St. Louis, MO/USA, código D5637) a 0,03% acrescido de
1,2mL de água oxigenada a 3%. A intensidade da cor foi controlada ao
microscópio óptico pelos controles positivos que acompanharam cada
reação. Os cortes assim processados foram lavados em água corrente
por 5 minutos, contracorados com hematoxilina de Carazzi por 24
segundos, lavados em água corrente, desidratados em etanol (95% e
absoluto) e diafanizados em xilol.
8. Montagem das lâminas - com resina Permount (FISHER Scientific, Fair
Lawn, NJ/USA, código SP15-100).
9. Leitura e interpretação das lâminas – a caracterização da positividade
para cada anticorpo foi feita de forma a complementar a análise
morfológica, estimando-se a proporção de cada linhagem hematopoética
e dos blastos de forma semiquantitativa, assim como sua distribuição
topográfica.
Controles positivos e negativos atestaram a validade das reações para
cada anticorpo utilizado.
Os controles negativos das reações foram obtidos pela omissão do
anticorpo primário, que foi substituído por PBS.
Os controles positivos corresponderam a fragmentos de medula óssea
de material de autópsia, processados em conjunto com as lâminas dos casos.
Casuística e Métodos 30
4.2.2.4 Citogenética
4.2.2.4.1 Citogenética convencional - Cariótipo
Os exames de citogenética convencional (cariótipo) e FISH foram
realizados no Laboratório de citogenética do SH-HCFMUSP. O cariótipo foi
realizado em amostras de MO em culturas, utilizando meio RPMI
suplementado por soro bovino fetal a 5%, em incubadora de CO2 por 24 a 48
horas, sem utilização de agentes mitogênicos, seguido por bandamento G 73.
As imagens arquivadas foram resgatadas e revisadas no mesmo Laboratório,
e a análise foi realizada por um observador capacitado e os resultados
descritos de acordo com as normas internacionais de nomenclatura ISCN
2013 74. O cariótipo foi considerado satisfatório quando 10 ou mais metáfases
foram analisadas.
4.2.2.4.2 Citogenética Molecular - hibridização “in situ” por
fluorescência (FISH)
A técnica de hibridização “in situ” por fluorescência (FISH) para
pesquisa da monossomia/deleção do cromossomo 7 foi realizada sempre que
possível em amostras (fixadas em metanol e ácido acético, excedentes da
preparação do cariótipo) da data do diagnóstico da aplasia medular e da data
da evolução para leucemia ou data do último exame citogenético realizado.
O procedimento técnico foi realizado com a sonda “LSI D7S48(7q31)
ORANGE, CEP7 GREEN Probes-Vysis, Inc”, seguindo as recomendações do
fabricante. A análise foi realizada em microscópio de fluorescência
(OlympusBX60), com objetiva de imersão (100X), equipado com filtros de
banda simples de espectros: verde, vermelho e azul, e filtro de banda tripla
(filtro com os três espectros). A análise foi realizada em 100 núcleos
interfásicos, por um observador capacitado e os resultados descritos de
acordo com as normas do ISCN 2013 74. O valor de referência foi determinado
previamente no laboratório, seguindo normas internacionais 55; 75. Casos
Casuística e Métodos 31
apresentando mais que 10% de núcleos interfásicos com apenas um sinal
verde e um vermelho e com dois sinais verdes e um vermelho foram
considerados como positivos para monossomia 7 ou deleção 7q,
respectivamente.
4.2.3 Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada, utilizando-se o programa
SPSS versão 16.0. As variáveis qualitativas nominais foram analisadas pelo
teste de Fisher para verificar se havia desproporção significativa entre os
grupos. As variáveis qualitativas ordinais foram analisadas para a diferença
entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney. O nível de significância adotado
foi 5% (p = 0,05). A sobrevida livre de eventos dos pacientes foi calculada pelo
método de Kaplan-Meier, desde o diagnóstico até a data de um dos seguintes
eventos: transplante de MO, evolução para SMD/LMA, óbito ou data do último
contato com o paciente na ausência dos anteriores. A comparação das curvas
de sobrevida foi realizada pelo teste de log-rank com nível de significância de
5% (α = 0,05).
5 Resultados
Casuística e Métodos 33
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE DA CASUÍSTICA
Os resultados da análise descritiva clínica estão resumidos nos dados
das Tabelas 2 e 3. Dados de sobrevida livre de evento relacionada à faixa
etária e à gravidade da AAA dos pacientes estão descritos no Anexo 2.
Do grupo total de pacientes (118), 71 eram do gênero masculino e 47
do feminino. A mediana de idade ao diagnóstico foi 24,4 anos (7 meses de
vida até 76 anos), e 42 pacientes tinham menos de 19 anos. Oito
apresentavam AAA secundária (três eram portadores de hepatite não A não
B não C, um de hepatite A, um de timoma, um de malária, um de
mucopolissacaridose e um de doença reumatológica). Setenta e sete tiveram
diagnóstico de Anemia Aplástica Grave (AAG), 17 não grave (AAnG) e 24
muito grave (AAmG). Todos os pacientes foram acompanhados clinicamente
com tempo médio de seguimento de 6,0 anos (mediana de 5,0). Do total de
pacientes, 12 evoluíram com SMD/LMA em 4,8 anos em média (nenhum dos
pacientes que evoluiu para SMD/LMA havia sido previamente tratado).
Dezoito pacientes foram submetidos a transplante de medula óssea e houve
35 óbitos.
Do grupo pediátrico de pacientes (42), 25 eram do gênero masculino e
17 do feminino. A mediana de idade ao diagnóstico foi 9,8 anos (7 meses de
vida até 18 anos), e 21 pacientes tinham menos de 10 anos. Seis pacientes
tinham AAA secundária nesse grupo. Vinte e oito tiveram diagnóstico de
Anemia aplástica grave (AAG), dois não grave (AAnG) e 12 muito grave
(AAmG). Todos os pacientes foram acompanhados clinicamente com tempo
médio de seguimento de 5,7 anos (mediana de 5,1). Sete pacientes foram
submetidos a transplante de medula óssea e houve 16 óbitos.
Do grupo adulto de pacientes (76), 46 eram do gênero masculino e 30
do feminino. A mediana de idade ao diagnóstico foi 33,2 anos (de 19 a 76
anos). Dois pacientes tinham AAA secundária nesse grupo. Quarenta e nove
Casuística e Métodos 34
tiveram diagnóstico de Anemia aplástica grave (AAG), 15 não grave (AAnG)
e 12 muito grave (AAmG). Todos os pacientes foram acompanhados
clinicamente com tempo médio de seguimento de 6,1 anos (mediana de 4,8).
Onze pacientes submetidos a transplante de medula óssea e houve 18 óbitos.
Do grupo total de 118 pacientes, 12 evoluíram para SMD/LMA, sendo
seis adultos e seis crianças. Seis eram do gênero masculino e seis do
feminino. A mediana de idade ao diagnóstico de AAA foi 17,2 anos, com idade
mínima de 2,7 anos até 66,1 anos. Apenas um paciente, do grupo pediátrico,
apresentava doença associada ao diagnóstico (malária). Quatro receberam
diagnóstico de Anemia aplástica grave (AAG), um não grave (AAnG) e sete
muito grave (AAmG). Todos os pacientes foram acompanhados clinicamente
com tempo médio de seguimento de 4,6 anos (mediana de 4,3). Dois
pacientes foram submetidos a transplante de medula óssea e houve seis
óbitos.
Tabela 2 - Descrição dos grupos total, adulto e pediátrico
Grupo total (118)
Grupo adulto (76)
Grupo pediátrico (42)
Gênero masculino:feminino 1,51:1 1,53:1 1,47:1
Idade ao diagnóstico (anos) (mediana/mín/máx)
24,4/0,58/76 33,2/19/76 9,8/0,58/18
AAA secundária n (%) 8 (6,7) 2 (2,6) 6 (14,2)
AAG n (%) 77/ (65,2) 49 (64,5) 28 (66,7)
AAnG n (%) 17 (14,4) 15 (19,7) 2 (4,8)
AAmG n (%) 24 (20,4) 12 (15,8) 12 (28,5)
Tempo de seguimento (anos) (mediana/mín/máx)
5,1/0,08/22,17 4,8/0,08/22,17 5,1/0,08/19,5
Pacientes transplantados n (%) 18 (15,2) 11 (14,4) 7 (16,7)
Óbitos n (%) 35 (29,6) 18 (23,6) 16 (38,0)
AAA: Anemia aplástica adquirida; AAG: Anemia aplástica grave; AAnG: Anemia aplástica não grave; AAmG: Anemia aplástica muito grave
Casuística e Métodos 35
Tabela 3 - Descrição do grupo total, que não evoluiu para SMD/LMA e que evoluiu para SMD/LMA
Grupo total (118)
Grupo não evoluiu
SMD/LMA (106)
Grupo evoluiu
SMD/LMA (12)
Gênero masculino:feminino 1,51:1 1,58:1 1:1
Idade ao diagnóstico (anos) (mediana/mín/máx)
24,4/0,58/76 26,1/0,58/76 17,9/2,7/66,1
AAA secundária n (%) 8 (6,7) 7 (6,6) 1 (8,3)
AAG n (%) 77 (65,2) 73 (68,9) 4 (33,3)
AAnG n (%) 17 (14,4) 16 (15,1) 1 (8,3)
AAmG n (%) 24 (20,4) 17 (16,0) 7 (58,4)
Tempo de seguimento (anos) (mediana/mín/máx)
5,1/0,08/22,17 5,2/0,08/22,17 4,3/0,5/11,42
Pacientes transplantados n (%) 18 (15,2) 16 (15,1) 2 (16,7)
Óbitos n (%) 35 (29,6) 29 (27,3) 6 (50,0)
AAA: Anemia aplástica adquirida; AAG: Anemia aplástica grave; AAnG: Anemia aplástica não grave; AAmG: Anemia aplástica muito grave.
Casuística e Métodos 36
5.2 AVALIAÇÃO DAS AMOSTRAS DE BIÓPSIA DE MEDULA ÓSSEA
5.2.1 Qualidade das amostras
O resumo da análise da qualidade das amostras encontra-se nos dados
das Tabelas 4 e 5.
Quanto à qualidade das amostras para o grupo total, o tamanho das
biópsias foi, em média, 1,5 ± 1,9 cm (mediana de 1,3); o número de espaços
intertrabeculares teve média de 9,3 ± 4,6 espaços por biópsia (mediana de 9);
18 (15,2%) amostras eram subcorticais; a maior parte tinha algum grau de
artefato (92 amostras), incluindo descolamento (66 delas) (Figura 1),
hemorragia (38) (Figura 2) e fragmentação (4) (Figura 3), e uma amostra pode
ter mais de um tipo de artefato com intensidade variando de 1 a 3+, a maior
parte (54) com apenas 1+.
Figura 1 - Artefato de descolamento (HE, 50x)
Casuística e Métodos 37
Figura 2 - Artefato de hemorragia (HE, 100x)
Figura 3 - Artefato de fragmentação (HE, 100x)
Casuística e Métodos 38
Quanto à qualidade das amostras para o grupo pediátrico, o tamanho
das biópsias foi, em média, 1,7 ± 2,5 cm (mediana de 1,1); o número de
espaços intertrabeculares teve média de 8,5 ± 4,8 espaços por biópsia
(mediana de 8); 10 (23,8%) amostras eram subcorticais e 32 não o eram; a
maior parte tinha algum grau de artefato (36 amostras), incluindo
descolamento (22 delas), hemorragia (19) e fragmentação (2), e uma amostra
pode ter mais de um tipo de artefato com intensidade variando de 1 a 3+, 21
com apenas 1+, 11 com 2+ e 4 com 3+.
Quanto à qualidade das amostras para o grupo adulto, o tamanho das
biópsias foi, em média, 1,4 ± 1,5 cm (mediana de 1,3); o número de espaços
intertrabeculares teve média de 9,7 ± 4,5 espaços por biópsia (mediana de 9);
apenas oito (10,5%) amostras eram subcorticais e 68 não o eram. A maior
parte tinha algum grau de artefato (56 amostras), incluindo descolamento (44
delas), hemorragia (19) e fragmentação (2), e uma amostra pode ter mais de
um tipo de artefato com intensidade variando de 1 a 3+, 33 com apenas 1+,
17 com 2+ e 6 com 3+.
Quanto à qualidade das amostras do grupo que evoluiu para
SMD/LMA, o tamanho das biópsias foi, em média, 1,3± 0,5 cm (mediana de
1,3); o número de espaços intertrabeculares teve média de 10,8 ± 5,5 espaços
por biópsia (mediana de 9,5); duas (0,16%) amostras eram subcorticais; a
maior parte tinha algum grau de artefato (nove amostras), incluindo
descolamento (seis delas), hemorragia (6) e fragmentação (1), e uma amostra
pode ter mais de um tipo de artefato com intensidade variando de 1 a 3+, 5
com apenas 1+, 1 com 2+ e 3 com 3+.
Casuística e Métodos 39
Tabela 4 - Qualidade das BMO dos grupos total, adulto e pediátrico
Grupo total (118)
Grupo adulto (76)
Grupo pediátrico
(42)
Tamanho das biópsias (média e mediana em cm)
1,5 e 1,3 1,4 e 1,3 1,7 e 1,1
Número de espaços intertrabeculares (média e mediana)
9,3 e 9,0 9,7 e 9,0 8,5 e 8,0
Amostras subcorticais n (%) 18 (15,2) 8 (10,5) 10 (23,8)
Presença de artefatos n (%) 92 (77,9) 56 (73,6) 36 (85,7)
Artefato mais frequente descolamento
descolamento
descolamento
Grau 1 de artefatos 54 33 21
Grau 2 de artefatos 28 17 11
Grau 3 de artefatos 10 6 4
Tabela 5 - Qualidade das BMO do grupo total, que não evoluiu para SMD/LMA e que evoluiu para SMD/LMA
Grupo total (118)
Grupo não evoluiu SMD/LMA
(106)
Grupo evoluiu
SMD/LMA (12)
Tamanho das biópsias (média e mediana em cm)
1,5 e 1,3 1,5 e 1,3 1,3 e 1,3
Número de espaços intertrabeculares (média e mediana)
9,3 e 9,0 9,1 e 9,0 10,8 e 9,5
Amostras subcorticais n (%) 18 (15,2) 16 (15,0) 2 (16,6)
Presença de artefatos n (%) 92 (77,9) 83 (78,3) 9 (75)
Artefato mais frequente descolamento descolamento descolamento
Grau 1 de artefatos 58 49 5
Grau 2 de artefatos 29 27 1
Grau 3 de artefatos 10 7 3
Casuística e Métodos 40
Do grupo total inicial, apenas nove de 146 amostras foram excluídas
do estudo inicialmente por não apresentar material em quantidade avaliável
(amostras constituídas essencialmente por coágulo sanguíneo ou tecido
adiposo/conjuntivo/ósseo sem tecido hematopoético). O tamanho médio foi
menor que o recomendado pela International Council for Standardization in
Hematology (ICSH) 65 de 2,0 cm, mas atingiu o comprimento de 1,5 cm e teve
número médio próximo de 10 espaços intertrabeculares recomendados pela
OMS 33. A média variou em torno de 1,5 cm e mediana de 1,3 e apresentou
quantidade média de espaços intertrabeculares de 9,4 e mediana de 9,0. A
presença de artefatos foi bastante frequente (quase 80% do total), mas a
maioria foi por descolamento parcial (nível 1 de intensidade) do material das
trabéculas ósseas, ainda assim permitindo visualização adequada do tecido
hematopoético e de suas alterações celulares, tanto quanto são adequados
para avaliação os coágulos de medula óssea. O grupo pediátrico apresentou
menor número de espaços intertrabeculares avaliáveis (mediana de 8,0 contra
10,0 do adulto), maior número de amostras subcorticais (23,8% contra 9,8%)
e maior frequência de artefatos (85,7% contra 75,3%), denotando a maior
dificuldade de obtenção de material da população pediátrica e tornando maior
seu valor, pois os procedimentos necessários são mais complexos. Os grupos
com evolução favorável (EF) e com evolução desfavorável (ED) tiveram
parâmetros de qualidade bastante semelhantes (Tabela 5), já que mesclam
adultos e crianças, que são distintos entre si como observado acima (Tabela
4).
5.2.2 Parâmetros morfológicos / imuno-histoquímicos estudados
Critérios morfológicos de medula óssea (anteriormente mencionados
no item Metodologia) estão descritos nos dados das Tabelas dos itens 5.2.2.1,
5.2.2.2 e 5.2.2.3. Presença de distribuição irregular do tecido hematopoético
foi identificada em 59 pacientes (50%) (Figura 4). Presença de distúrbio
maturação da série granulocítica foi identificada em três (2%) dos pacientes
(Figuras 5, 6, 7 e 8), caracterizada por localização anormal de precursores
Casuística e Métodos 41
imaturos. Agrupamentos de elementos nucleados da série eritrocítica foram
identificados em 54 (45,7%) dos pacientes (Figuras 9 e 10), com formas
jovens (Figura 11) em 32 (27,1%) e mitoses em 24 (20,3%) (Figura 12).
Quarenta e dois (35,5%) dos pacientes apresentaram um ou mais
megacariócitos à BMO (Figura 13), 15 (12,7%) com displasia caracterizada
por ausência de lobulação (Figura 14) em todos eles (12,7%), binucleação
(Figura 15) em apenas dois (1,6%) e multinucleação em 3 (2,5%) (Figura 16).
A presença de blastos CD34-positivos foi observada em 11 (9,3%) casos
(Figura 17), sempre isolados, constituindo menos de 1% da celularidade.
Reticulogênese aumentada foi identificada em três casos (Figura 18), os
mesmos casos que apresentaram reticulogênese grau 1 em escala de 0 a 3,
foram avaliados como grau 2 em escala de 0 a 4.
Figura 4 - Distribuição irregular do tecido hematopoético em paciente que não evoluiu para SMD/LMA, com área de maior celularidade ao lado de área com celularidade muito baixa (hematoxilina e eosina, 100x)
Casuística e Métodos 42
Figura 5 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica ao HE (400x) em paciente de 18 anos que não evoluiu para SMD/LMA
Figura 6 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica ao HE (400x) em paciente de 18 anos que não evoluiu para SMD/LMA
Casuística e Métodos 43
Figura 7 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica em paciente de 18 anos que não evoluiu à marcação imuno-histoquímica para MPO (elementos granulocíticos em marrom, 400x)
Figura 8 - Localização anormal de precursores imaturos da série granulocítica em paciente de 18 anos que não evoluiu para SMD/LMA, à marcação imuno-histoquímica para Glicoforina A (elementos eritroides em marrom e granulocíticos em azul) (glicoforina A, 200x)
Casuística e Métodos 44
Figura 9 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica ao HE (400x) em paciente de 16 anos que não evoluiu para SMD/LMA
Figura 10 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica ao HE (400x) em criança de 4 anos que evoluiu para SMD/LMA
Casuística e Métodos 45
Figura 11 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica com formas jovens (seta) (Glicoforina A, 200x)
Figura 12 - Agrupamento de mais de 20 células nucleadas da série eritrocítica ao HE (400x) com mitoses (setas)
Casuística e Métodos 46
Figura 13 - Megacariócitos em agregados (HE, 200x)
Figura 14 - Megacariócitos hipolobados (setas) (HE, 200x)
Casuística e Métodos 47
Figura 15 - Megacariócito binucleado (seta) (HE, 200x)
Figura 16 - Megacariócito multinucleado (seta) (HE, 200x)
Casuística e Métodos 48
Figura 17 - Blasto CD34-positivo entre dois vasos (seta) (CD34, 200x)
Figura 18 - Reticulogênese grau 2 (de 0 a 4) e grau 1 (de 0 a 3) (coloração para reticulina, 200x)
Casuística e Métodos 49
5.2.2.1 Comparação dos achados morfológicos/ imuno-
histoquímicos em crianças e adultos
As características morfológicas encontradas em biópsias de MO de
adultos e crianças estão descritas nos dados da Tabela 6. A análise
comparativa realizada entre crianças com menos de 14 anos e grupo com 14
anos ou mais não mostrou diferença estatística e encontra-se no Anexo 3.
Tabela 6 - Análise comparativa dos parâmetros MI entre grupo adulto e pediátrico
Variável
Grupo total
(n=118)
Grupo adulto (n=76)
Grupo pediátrico
<19a (n=42)
p
n n n
Distribuição irregular do tecido hematopoético 59 42 17 0,17
Distúrbio maturação da série granulocítica 3 1 2 0,27
Distúrbio arquitetural da série eritrocítica 13 8 5 0,51
Agrupamentos da série eritrocítica 54 38 16 1
Formas jovens da série eritrocítica 32 23 9 0,81
Mitoses da série eritrocítica 24 18 6 0,61
Atipias citológicas da série eritrocítica 35 24 11 0,81
Presença de células da série megacariocítica 42 28 14 0,84
Displasia da série megacariocítica 15 9 6 0,51
Megacariócitos binucleados 2 1 1 1
Megacariócitos multinucleados 3 1 2 0,25
Megacariócitos não lobulados 15 9 6 0,51
Distúrbio arquitetural da série megacariocítica 4 1 3 0,10
Blastos CD34-positivos 11 8 3 0,74
Reticulogênese grau 1 em escala de 0 a 3 3 1 2 0,28
Reticulogênese grau 2 em escala de 0 a 4 3 1 2 0,30
Índice proliferativo (Ki-67) (mediana) 25 30 15 0,198
Casuística e Métodos 50
5.2.2.2 Comparação dos achados morfológicos / imuno-
histoquímicos em pacientes que evoluíram e que não
evoluíram para SMD/LMA
O risco de evoluir para SMD/LMA foi testado no grupo adulto e
pediátrico e não houve diferença entre os dois grupos ao teste exato de Fisher
(p= 0,335).
Tabela 7 - Análise comparativa dos parâmetros MI entre grupo que evoluiu e que não evoluiu para SMD/LMA
Variável
Grupo total
(n=118)
Grupo total que não
evoluiu para SMD/LMA (n=106)
Grupo total que
evoluiu para SMD/LMA
(n=12)
p
n n n
Distribuição irregular do tecido hematopoético 59 53 6 1
Distúrbio maturação da série granulocítica 3 3 0 1
Distúrbio arquitetural da série eritrocítica 13 12 1 1
Agrupamentos da série eritrocítica 54 47 7 0,30
Formas jovens da série eritrocítica 32 31 1 0,15
Mitoses da série eritrocítica 24 22 2 1
Atipias citológicas da série eritrocítica 35 33 2 0,47
Presença de células da série megacariocítica 42 39 3 0,53
Displasia da série megacariocítica 15 15 0 1
Megacariócitos binucleados 2 2 0 1
Megacariócitos multinucleados 3 3 0 1
Megacariócitos não lobulados 15 15 0 1
Distúrbio arquitetural da série megacariocítica 4 4 0 1
Blastos CD34-positivos 11 11 0 0,60
Reticulogênese grau 1 em escala de 0 a 3 3 2 1 0,27
Reticulogênese grau 2 em escala de 0 a 4 3 2 1 0,58
Índice proliferativo (Ki-67) (mediana) 25 30 15 0,58
Resultados 51
5.2.2.3 Comparação dos achados morfológicos / imuno-histoquímicos no grupo total, em adultos e crianças que
evoluíram e que não evoluíram para SMD/LMA
Tabela 8 - Análise comparativa dos parâmetros MI entre grupo total, adulto e pediátrico que evoluiu e que não evoluiu para
SMD/LMA
Parâmetros morfológicos
Grupo total (n=118) Grupo total adulto (n=76) Grupo total pediátrico (n=42)
Grupo que não evoluiu para
SMD/LMA (n=106) n (%)
Grupo que evoluiu para
SMD/LMA (n=12) n (%)
Grupo que não evoluiu para SMD/LMA (n=70)
n (%)
Grupo que evoluiu para
SMD/LMA (n=6) n (%)
Grupo que não evoluiu para SMD/LMA (n=36)
(n e %)
Grupo que evoluiu para
SMD/LMA (n=6) (n e %)
Distribuição irregular do tecido hematopoético 53 (50) 6(50) 39 (56) 3 (50) 14 (39) 3 (50)
Celularidade geral ≤20% 95 (90) 12(100) 68 (97) 6 (100) 27 (75) 6 (100)
Distúrbio maturação da série granulocítica 3 (2) 0 (0) 1 (1) 0 (0) 2 (6) 0 (0)
Distúrbio arquitetural da série eritrocítica 12 (11) 1(8) 7 (10) 1 (17) 5 (14) 0 (0)
Agrupamentos da série eritrocítica 47 (44) 7 (58) 34 (49) 4 (67) 13 (36) 2 (33)
Formas jovens da série eritrocítica 31 (29) 1 (8) 22 (31) 1 (17) 9 (25) 0 (0)
Mitoses da série eritrocítica 22 (21) 2 (16) 17 (24) 1 (17) 5 (14) 1 (17)
Atipias citológicas da série eritrocítica 33 (31) 2 (16) 23 (33) 1 (17) 10 (27) 1 (17)
Presença de células da série megacariocítica 39 (37) 3 (25) 27 (39) 1 (17) 11 (31) 2 (33)
Displasia da série megacariocítica 15 (14,1) 0 (0) 8 (11) 0 (0) 7 (19,4) 0 (0)
Megacariócitos binucleados 2 (2) 0 (0) 1 (1) 0 (0) 1 (3) 0 (0)
Megacariócitos multinucleados 3 (3) 0 (0) 1 (1) 0 (0) 2 (6) 0 (0)
Megacariócitos não lobulados 15 (14,1) 0 (0) 9 (12,8) 0 (0) 6 (17) 0 (0)
Distúrbio arquitetural da série megacariocítica 4 (4) 0 (0) 1 (1) 0 (0) 3 (8) 0 (0)
Blastos CD34-positivos (até 5%) 11(10) 0 (0) 8 (11) 0 (0) 3 (8) 0 (0)
Reticulogênese grau 1 em escala de 0 a 3 2 (2) 1 (8) 0 (0) 1 (17) 2 (6) 0 (0)
Reticulogênese grau 2 em escala de 0 a 4 2 (2) 1 (8) 0 (0) 1 (17) 2 (6) 0 (0)
Índice proliferativo ao Ki-67 ≥10% 70 (66) 7 (58) 50 (71) 4 (67) 20 (56) 3 (50)
Critérios de Bennett e Orazi para SMD-h 16 (15) 0 (0) 8 (17) 0 (0) 8 (22) 0 (0)
Critérios de Baumann et al. para SMD pediátrica 29 (27) 1 (8) 20 (29) 0 (0) 9 (25) 1 (17)
Resultados 52
5.2.3 Avaliação de critérios de Bennett e Orazi e de Baumann et al. aos
grupos
Quando aplicados os critérios morfológicos de SMD hipocelular
conforme Bennett e Orazi 11 ao grupo total (118 pacientes) com relação à
evolução para SMD/LMA, 16 pacientes dentre os que não evoluíram
apresentavam, pelo menos, um desses critérios e nenhum dos que evoluíram
apresentava-os; e não houve diferença estatisticamente significante ao teste
exato de Fisher (p= 0,366).
Quando aplicados os critérios morfológicos de SMD conforme
Baumann et al. 7 ao mesmo grupo, 29 pacientes dentre os que não evoluíram
apresentavam esses critérios e apenas um dos que evoluíram apresentava-
os; e houve diferença estatisticamente significante ao teste exato de Fisher
(p= 0,036), denotando que o grupo com as características analisadas
apresentava menor risco de evolução para SMD/LMA.
Quando aplicados os critérios morfológicos de SMD hipocelular
conforme Bennett e Orazi 11 ao grupo total (118 pacientes) com relação à faixa
etária (grupo adulto e pediátrico), oito pacientes dentre os 76 adultos e oito
dentre os 42 pediátricos apresentavam, pelo menos, um desses critérios, e
não houve diferença estatisticamente significante ao teste exato de Fisher (p=
0,261).
Quando aplicados os critérios morfológicos de SMD conforme
Baumann et al. 7 ao mesmo grupo com relação à faixa etária (grupo adulto e
pediátrico), 20 pacientes dentre os 76 adultos e dez dentre os 42 pediátricos
apresentavam-nos, e não houve diferença estatisticamente significante ao
teste exato de Fisher (p= 0,657).
Resultados 53
Quanto à sobrevida livre de evento (transformação para SMD/LMA),
não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos que
apresentavam e os que não apresentavam critérios morfológicos de SMD
hipocelular conforme Bennett e Orazi 11 (p= 0,224) (Figura 19).
Figura 19 - Sobrevida livre de eventos, conforme os critérios de Bennett e
Orazi
Resultados 54
Quanto à sobrevida livre de evento (transformação para SMD/LMA),
não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos que
apresentavam e os que não apresentavam critérios morfológicos de SMD
conforme Baumann et al. 7 (p= 0,555) (Figura 20).
Figura 20 - Sobrevida livre de eventos, conforme os critérios de Baumann et al.
Resultados 55
5.2.4 Avaliação do índice proliferativo (Ki-67) em relação à celularidade
geral do grupo total
Índice proliferativo, avaliado pela imunoexpressão do marcador Ki-67,
maior que 10% foi observado em 77 (65,2%) pacientes (Figura 21). Foi
observada correlação entre os valores de celularidade geral das amostras e
seu índice proliferativo (Figura 22) em porcentagem, avaliada pelo teste não
paramétrico Rô de Spearman (Tabela 9). A correlação é estatisticamente
significante no nível 0,01, porém não é preditora. Alguns casos com
celularidade baixa tiveram alto índice proliferativo (Figura 23) e alguns com
celularidade mais alta tiveram baixo índice (Figura 24).
Figura 21 - Índice proliferativo ao Ki-67 alto (90% das células nesse campo)
no tecido hematopoético (Ki-67, 200x)
Resultados 56
Tabela 9 - Correlação entre celularidade e índice proliferativo pelo teste Rô de Spearman
Correlações
CEL GERAL Ki-67 %
Rô de Spearman
CEL GERAL
Correlações de coeficiente 1,000 ,331**
Sig. (duas extremidades) . ,000
N 118 118
Ki-67 %
Correlações de coeficiente ,331** 1,000
Sig. (duas extremidades) ,000 .
N 118 118
**. A correlação é significativa no nível 0,01 (duas extremidades).
Figura 22 - Correlação positiva entre celularidade medular e índice proliferativo
Resultados 57
Figura 23 - Índice proliferativo ao Ki-67 alto (aproximadamente 100% das
células nesse campo) no tecido hematopoético de amostra com
baixa celularidade (Ki-67, 200x)
Figura 24 - Índice proliferativo ao Ki-67 baixo (cerca de 5% das células
nesse campo) no tecido hematopoético de amostra com
celularidade relativamente mais alta (Ki-67, 200x)
Resultados 58
5.3 CITOGENÉTICA
Dos 118 pacientes (vide Anexo 3 para resultados individuais e Tabela
10 para dados resumidos), 74 tinham resultado conclusivo e normal de
citogenética (FISH e/ou cariótipo); 60 tinham resultado citogenético normal ao
diagnóstico, 31 apenas por FISH, 10 por cariótipo e 19 por ambos os métodos.
Quatorze pacientes tinham resultado de citogenética normal apenas ao
seguimento, quatro por FISH, sete por cariótipo e três por ambos. Dez dos 12
pacientes que evoluíram para SMD/LMA tinham alterações do cromossomo 7
(apenas um com deleção 7q e o restante com monossomia do cromossomo
7) à data da evolução, um apenas por cariótipo, cinco apenas por FISH e
quatro por ambos os métodos. Seis dos 10 (60%) pacientes pediátricos com
critérios de Bumann et al. e sete de oito (87,5%) pacientes adultos com
critérios de Bennett e Orazi tinham estudos citogenéticos normais ao
diagnóstico, incluindo o paciente pediátrico que evoluiu para SMD/LMA.
Tabela 10 - Resumo dos resultados de citogenética
Citogenética normal ao
diagnóstico (n=60)
Citogenética normal ao
seguimento (n=14)
Monossomia ou deleção do cromossomo 7 à
evolução para SMD/LMA (n=10)
FISH n (%) 31 (51,7) 4 (28,6) 5 (50)
Cariótipo n (%) 10 (16,6) 7 (50) 1 (10)
FISH e cariótipo n (%) 19 (31,7) 3 (21,4) 4 (40)
FISH: fluorescent in situ hybridization.
Resultados 59
5.4 DESCRIÇÃO DOS 12 PACIENTES QUE EVOLUÍRAM PARA SMD/LMA
Do grupo total de 118 pacientes, 12 evoluíram para SMD/LMA e sua
análise descritiva encontra-se no item 5.1 e a análise da qualidade das
amostras no item 5.2.1.
Os achados morfológicos estão descritos nos dados da Tabela 11; e as
Figuras 25 a 36 são referentes a cada um dos pacientes. Quanto à distribuição
irregular do tecido hematopoético, seis (50%) apresentavam-na. A média de
celularidade geral foi 7,8% (mediana de 10 e desvio-padrão 7,18). A série
granulocítica constituiu cerca de 64% do tecido hematopoético (mediana de
70 e desvio-padrão 32,9) com a série eritrocítica constituindo os 26%
complementares (mediana de 25 e desvio-padrão 27,3) (proporção normal de
cerca de 2,4:1 de série granulocítica em relação à eritrocítica). Não foi
observado distúrbio de maturação da série granulocítica em nenhum caso.
Presença de distúrbio arquitetural da série eritrocítica em um caso, de
agrupamentos da mesma em seis casos, de formas jovens em apenas um e
de mitoses desta série em dois casos. A série megacariocítica estava
representada em apenas três amostras, sem evidências de displasia. A
presença de blastos não foi identificada em nenhumas das amostras. A
reticulogênese quando graduada de 0 a 3 estava aumentada (grau 1) em um
caso, que também apresentava reticulogênese grau 2 quando graduada de 0
a 4. Um caso apresentava reticulogênese grau 1 (de 0 a 4). O índice
proliferativo do tecido hematopoético ao Ki-67 teve média de 36% (mediana
de 15 e desvio-padrão 38,9). Apenas uma das amostras com índice
proliferativo de valor nulo (zero). Destes 12 pacientes, dez apresentaram
monossomia ou deleção do braço longo do cromossomo 7 ao FISH ou
cariótipo ao seguimento (cinco por FISH, nove por cariótipo e quatro por
ambos os métodos) e, dos outros dois, um tinha FISH normal, com excesso
de blastos ao mielograma e o outro não tinha material disponível para
citogenética, mas apresentava excesso de blastos à biópsia de medula óssea.
Resultados 60
Tabela 11 - Descrição morfológica resumida dos 12 pacientes que evoluíram para SMD/LMA
S: sim (presente); N: não (ausente); SE: série eritrocítica; SM: série megacariocítica.
Paciente Idade (anos)
Distribuição irregular do
tecido hematopoético
Celula-ridade geral (%)
SE celula-ridade
(%)
SE distúrbio
arquitetural
SE agrupa-mentos
Formas jovens
SE mitoses
SM N° células
SM displasia
Reticulo-gênese
0 a 3
Ki-67 (%)
Critérios de
Bennett e Orazi
Critérios de
Baumann et al
1 4,75 N 10 30 N S N N 0
0 20 N N
2 14,83 S 20 50 N S N N 1 N 0 70 N N
3 4,08 N 1 0
1 N 0 1 N N
4 6,75 N 1 0
0
0 0 N N
5 6,42 S 10 20 N S S S 0
0 90 N S
6 2,75 S 1 0
0
0 1 N N
7 25,25 S 10 40 S S N N 1 N 1 10 N N
8 21,92 N 10 30 N N N N 0
0 5 N N
9 23,75 S 1 90 N S N N 0
0 90 N N
10 21,00 N 1 10 N N N S 0
0 5 N N
11 66,17 S 20 50 N S N N 0
0 50 N N
12 54,67 N 10 50 N S N N 0
0 90 N N
Resultados 61
Figura 25 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 1 (HE, 100x)
Figura 26 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 2 (HE, 100x)
Resultados 62
Figura 27 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 3 (HE, 100x)
Figura 28 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 4 (HE, 100x)
Resultados 63
Figura 29 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 5 (HE, 100x)
Figura 30 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 6 (HE, 100x)
Resultados 64
Figura 31 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 7 (HE, 100x)
Figura 32 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 8 (HE, 100x)
Resultados 65
Figura 33 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 9 (HE, 100x)
Figura 34 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 10 (HE, 100x)
Resultados 66
Figura 35 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 11 (HE, 100x)
Figura 36 - Biópsia de MO na data do diagnóstico da AAA referente ao paciente 12 (HE, 100x)
6 Discussão
Discussão 68
6 DISCUSSÃO
Uma das complicações mais temíveis da Anemia Aplástica Adquirida é
sua evolução para Síndrome Mielodisplásica ou Leucemia Mieloide Aguda. O
diagnóstico de certeza de aplasia medular é necessário, mas, muitas vezes,
confunde-se com o da SMD hipocelular e também há dúvidas se podem existir
dados clínicos ou laboratoriais em aplasia medular que possam ajudar na
determinação do risco de evolução para doença clonal medular. Nesse
processo, a biópsia de MO é fundamental e decisiva. A iniciativa de realizar
este estudo partiu da observação clínica hematológica de evolução dos
pacientes com AAA para SMD/LMA e do intuito de reavaliar os critérios
diagnósticos de AAA no sentido de se verificar se os casos que evoluíram de
forma desfavorável (definida como evolução para SMD/LMA) já poderiam ser
diagnosticados como SMD-h desde o início utilizando-se de um protocolo de
morfologia detalhado com auxílio de marcadores imuno-histoquímicos. Uma
das maiores dificuldades da avaliação de amostras de MO desses pacientes
é sua celularidade muito baixa, geralmente com pouco substrato para análise
tanto morfológica como genética. Além da dificuldade de obtenção de
material, a AAA é uma doença com baixa incidência, tornando nossa
casuística limitada, mesmo tendo sido o estudo realizado em centro de
referência nacional com acompanhamento clínico rigoroso dos pacientes.
Nesse contexto, a evolução de pequeno número de pacientes para SMD/LMA
(9,7%) é significativa. É importante salientar que a Citopenia Refratária da
Infância (CRI) continua sendo uma entidade provisória na OMS de 2016 41,
tornando seu estudo importante para determinar seu estabelecimento como
entidade diagnóstica definitiva.
Os grupos adulto e pediátrico não tiveram diferenças quanto à
frequência na incidência dos gêneros masculino e feminino (maior frequência
no sexo masculino nos dois grupos, 1,4:1 e 1,6:1, respectivamente). No
entanto, o grupo pediátrico apresentou maior frequência de pacientes com
AAA secundária (seis pacientes) que o grupo adulto (dois pacientes) e maior
Discussão 69
frequência de diagnóstico de AAmG (28,5% contra 14,8% do grupo adulto). O
tempo de seguimento dos pacientes foi em média de 6,5 anos, tempo
suficiente e adequado 5 para avaliar possível evolução para SMD/LMA. Dos
123 pacientes com AAA, 12 (9,7%) evoluíram para SMD/LMA, taxa
semelhante à encontrada na literatura de 15% 28, variando entre 1,7 a 57%
em um período observacional entre 5 e 11 anos 5. A maioria dos pacientes
apresentava AA grave, tanto no grupo adulto como no pediátrico, e o risco de
evolução para SMD/LMA não mostrou diferença estatisticamente significante
entre eles (p=0,335).
Dos 137 pacientes do grupo total analisado, 15 já se encontravam em
tratamento com algum agente imunossupressor (resultados descritos no
Anexo 1). À avaliação destas amostras, nota-se que a média e mediana de
celularidade geral são semelhantes às do grupo total não tratado; no entanto,
quatro pacientes apresentavam celularidade igual ou maior que 40% (dois
tratados com corticoide e dois com ciclosporina, e os tratados com
ciclosporina tinham 70% e 90% de celularidade), o que aumenta a chance de
encontrar todos os elementos hematopoéticos, incluindo megacariócitos, que
apresentavam displasia caracterizada, sobretudo, por hipolobulação. Esta
não é a caraterística displástica mais específica para SMD, mas,
estatisticamente tornou o grupo previamente tratado diferente do não tratado,
o que nos levou à exclusão deste grupo da casuística. Pode-se assumir que
a celularidade pode estar aumentada em pacientes tratados por recuperação
medular, ainda que parcial, pela diminuição da agressão das células T aos
precursores hematopoéticos.
No que se refere à análise morfológica das BMO, a distribuição irregular
do tecido hematopoético teve alta frequência, tanto no grupo adulto como no
pediátrico, no que evoluiu para SMD/LMA e também no que não evoluiu. Esta
característica não é comumente observada em casos AAA e sim nos de SMD
e SMD-h. No entanto, em nossa visão, isso pode se explicar pela forma de
evolução da doença, ou seja, conforme se dá a destruição de precursores
hematopoéticos na MO, podem restar “ilhas” de tecido hematopoético 76; 77,
resultando em um quadro morfológico com irregularidade de distribuição.
Discussão 70
O distúrbio de maturação da série granulocítica, com localização
anormal de precursores imaturos (ALIP), bastante clássico na SMD, foi
encontrado em raros casos de AAA em casos de crianças e adultos, mas,
diferentemente do esperado, em nenhum caso dentre os que evoluíram para
SMD/LMA. Isso pode ser parcialmente explicado pela diferença de
celularidade entre as amostras dos pacientes com ED e EF, pois apesar da
mediana ter sido igual a 10 nos dois grupos, a média de celularidade foi 11,3
no EF e 7,9 no ED, diminuindo a chance de encontrar algumas características.
Características menos típicas de AAA, como distúrbio arquitetural da
série eritrocítica, agrupamentos, formas jovens e mitoses foram identificadas
com frequência semelhante nos grupos adulto, pediátrico, que evoluíram e
que não evoluíram para SMD/LMA. Inicialmente, estas características foram
descritas como critérios diagnósticos para a SMD pediátrica (CRI) 7 e, em
nosso trabalho, foram observadas em casos de AAA, mostrando que estes
critérios devem ser associados a outros mais específicos para definição
diagnóstica. No grupo adulto, características como agrupamentos de mais 20
células nucleadas com mitoses ou formas jovens não são descritas como
sugestivas de SMD, e sim são características como multinucleação, lobulação
nuclear, grânulos citoplasmáticos e elementos megaloblastoides 67. Assim, as
primeiras tornaram-se um achado interessante e novo em nosso estudo, já
que foram identificadas no grupo adulto que evoluiu e que não evoluiu para
SMD/LMA.
Megacariócitos constituem a série hematopoética menos frequente
encontrada na AAA (menos da metade dos casos em todos os grupos).
Quando identificados, são em número muito baixo, de um a nove no total da
amostra, geralmente, como é esperado em casos de AAA. Nesse contexto, a
identificação de raros elementos hipolobados, como ocorreu em nosso
estudo, torna a amostra displástica em relação à série megacariocítica. De
fato, a displasia mais encontrada foi a hipo/monolobação, que não tem a
mesma relevância que a binucleação e a multinucleação, identificadas em
raros casos dentre os que não evoluíram para SMD/LMA e em nenhum dos
que evoluíram.
Discussão 71
A presença de blastos CD34-positivos foi também um achado
surpreendente, já estas células precursoras são alvo dos linfócitos na AAA.
Eles foram identificados em 9,7% das amostras dos adultos e em 7,1% das
de crianças, sempre em baixo número (menos de 5% da celularidade) e de
forma isolada. Também diferentemente do esperado, todos os casos que
apresentavam blastos estavam dentre os que não evoluíram para SMD/LMA.
As fibras reticulínicas estavam aumentadas em raros casos em todos
os grupos e em baixa quantidade, como esperado na AAA.
A avaliação do índice proliferativo celular ao marcador Ki-67 é pouco
estudada e sabe-se que o índice é baixo em MO normais (até 3%), em AA e
em SMD e mais elevado nos casos de falência congênita de MO 78. Em nosso
estudo, a mediana desse índice foi 30,0 no grupo adulto e 15,0 no pediátrico,
sem diferença estatisticamente significante entre eles. No entanto, este índice
já se mostrou mais elevado que o considerado normal, com índice maior que
3%, na grande maioria (87 de 118) das amostras. De maneira interessante, o
índice proliferativo associa-se à celularidade quantitativa da MO, mostrando
que há uma relação positiva entre estes parâmetros (p=0,01), mas não se
pode dizer que sempre que há maior celularidade há maior proliferação, ou
seja, a relação não é preditora, pois houve casos de muito baixa celularidade
com índice muito alto, já que havia poucas células nas amostras e a maior
parte delas marcava ki-67 e também amostras com maior celularidade e
índice muito baixo. Neste último caso, a presença de artefatos e a
degeneração do material ao longo dos anos podem ter diminuído a
antigenicidade do tecido ao marcador.
Quanto à citogenética, 62,7% (74 pacientes) tiveram resultado normal.
A alteração mais comumente encontrada ao cariótipo na evolução foi a
monossomia do cromossomo 7 (nove dos 10 pacientes), conforme observado
na literatura, assim sendo, para os testes de FISH foram usadas sondas para
verificar esta alteração. A maior parte dos resultados adveio do exame de
FISH, que apresentou maior sensibilidade que o cariótipo nos casos
hipocelulares, em que a obtenção de metáfases é mais difícil. Do total de 74
pacientes, 37,3% não tiveram nenhum resultado conclusivo. Apesar desse
Discussão 72
número ser grande e da citogenética ser ferramenta importante e decisiva no
diagnóstico de CRI ou SMD-h, nem sempre o material é adequado para a
realização desse exame. Isto é descrito na literatura, na qual 16% dos
pacientes com CRI hipocelular não obtiveram resultados à cariotipagem 6,
mostrando que a citogenética exerce papel limitado em muitos dos casos
hipocelulares. Um trabalho mostrou resultados inconclusivos de cariótipo em
3% dos pacientes com AAA e 12% dos com SMD-h, problema que foi
resolvido com análise de cariótipo baseado em matriz de polimorfismos de
nucleotídeo único (SNP-array), que não requer células em divisão para
detectar alterações cromossômicas 79. Uma das limitações com relação a
nosso estudo foi a impossibilidade técnica e financeira de realizar pesquisa de
mutações somáticas e alterações cromossômicas usando métodos
moleculares mais avançados nos pacientes com AAA, o que, conforme alguns
trabalhos da literatura, poderia se associar a pior prognóstico e maior taxa de
transformação maligna.
Nossos resultados mostraram que AAA pode ter alterações displásicas
leves e que isso não se correlacionou com pior prognóstico em nossa coorte,
o que sugere que AAA e CRI/SMD hipocelulares podem representar um
espectro do mesmo processo. A relação entre essas doenças vem sendo
estudada há, pelo menos, 50 anos 62; 80; 81; 82. Muitos estudos têm sido feitos a
respeito da fisiopatologia dessas doenças, pois, vários de seus aspectos são
sugestivos de que elas pertençam a um mesmo espectro, incluindo aspectos
clínico-epidemiológicos, resposta a imunossupressores em maior ou menor
grau nas duas doenças, além do desenvolvimento de SMD após uso de
imunossupressores na AAA, sugerindo que a vigilância imune pode ser
importante na supressão de clones malignos 21. Um estudo mostrou que
algumas células T que atacam as células progenitoras da MO têm restrição
de HLA classe I. Tal possibilidade foi avaliada por sequenciamento completo
do exoma humano que identificou um grupo de pacientes com mutações do
HLA que levam à perda de função celular e tem uma doença mais grave com
maior frequência de complicações clonais 83. Há evidências de que a inibição
de hematopoese mediada por linfócitos T também ocorre em SMD,
Discussão 73
contribuindo para a pancitopenia em alguns pacientes que pode ser revertida
por tratamento imunossupressor com regressão dos clones predominantes.
Mas, há pacientes que não respondem a esse tipo de tratamento e nestes
foram identificadas células T clonais não responsivas 84. Há a possibilidade
de que a diminuição da população de células-tronco da AAA torne-se uma
doença oligoclonal, e na SMD há a expansão de um clone aberrante que se
sobressai dentre as outras células-tronco 32; 79. Nessa linha de pensamento, a
destruição imunomediada da MO pode ocorrer ao mesmo tempo que evolui
um clone maligno, ou seja, cuja proliferação não é mais compatível com
hematopoese normal, causando uma sobreposição diagnóstica entre esses
conceitos de doença 22. Os achados de hematopoese clonal desfavorável em
contexto clínico de AAA, na ausência de evidências morfológicas ou
citogenéticas de SMD, indicam que pode ser necessária uma redefinição de
SMD, especialmente, para diferenciar SMD-h de AAA 23. É relevante salientar
o contexto clínico em que as mutações genéticas aparecem para que sejam
interpretadas com cautela 32. Embora nosso estudo não apresente dados
genéticos detalhados, os aspectos morfológicos encontrados são condizentes
com a possibilidade de uma sobreposição entre essas doenças.
7 Conclusões
Conclusões 75
7 CONCLUSÕES
1. Nenhum dos parâmetros morfológicos/imuno-histoquímicos da BMO
estudados se associou à evolução para SMD/LMA em portadores de AAA.
2. Pacientes adultos e pediátricos com AAA e pacientes adultos e pediátricos
com AAA que evoluem para SMD/LMA têm características morfológicas e
imuno-histoquímicas semelhantes dentro de suas limitações de
amostragem.
3. As alterações descritas por Baumann et al. para SMD pediátrica também
são encontradas em casos de AAA pediátricos e adultos.
4. Algumas alterações descritas por Bennett e Orazi para SMD hipocelular
foram identificadas em casos de crianças e adultos com AAA.
5. Índice de proliferação celular avaliado por meio da imunoexpressão de Ki-
67 esteve, frequentemente, presente (>3% em 74,8% dos casos) e
elevado (>10% em 56,9% dos casos) nos casos de AAA.
6. A imunoexpressão de Ki-67 não apresentou correlação com desfecho
desfavorável neste estudo.
7. Blastos CD34-positivos isolados (<5%) foram identificados nas crianças e
adultos (7% e 10%, respectivamente) sem correlação com a evolução
desfavorável.
8 Referências
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9 Anexos
Anexos 92
ANEXO 1: ANÁLISE DOS PACIENTES PREVIAMENTE TRATADOS
Do grupo total de 133 pacientes, quinze haviam sido previamente
tratados em relação à data da biópsia, 7 deles com corticoide (prednisona) e
7 deles com ciclosporina e/ou anti-timoglobulina e um deles com eritropoetina.
Para a análise estatística, o grupo total foi dividido em grupo com
tratamento prévio à biópsia e grupo que não havia sido previamente tratado
(virgem de tratamento). Observamo diferença estisticamente significante
entre eles quanto à presença de displasia da série megacariocítica com
p=0,004 ao teste exato de Fisher (megacariócitos não lobulados com
p=0,004). Assim sendo, o grupo tratado foi excluído do trabalho, restando o
grupo de 118 não tratados (76 adultos e 42 crianças).
Variável
Grupo total tratado (n=15)
Grupo total não tratado
(n=118) p
n n
Distribuição irregular do tecido hematopoético 6 59 0,58
Distúrbio maturação da série granulocítica 1 3 0,4
Distúrbio arquitetural da série eritrocítica 2 13 0,66
Agrupamentos da série eritrocítica 7 54 1
Formas jovens da série eritrocítica 5 32 0,52
Mitoses da série eritrocítica 6 24 0,07
Atipias citológicas da série eritrocítica 6 42 0,19
Presença de células da série megacariocítica 6 42 0,77
Displasia da série megacariocítica 6 15 0,004
Megacariócitos binucleados 0 2 1
Megacariócitos multinucleados 1 3 0,42
Megacariócitos não lobulados 6 15 0,004
Distúrbio arquitetural da série megacariocítica 2 4 0,15
Blastos CD34-positivos 2 11 0,64
Reticulogênese grau 1 em escala de 0 a 3 0 3 1
Reticulogênese grau 2 em escala de 0 a 4 0 3 0,41
Índice proliferativo (Ki-67) (mediana) 30 25 0,84
Anexos 93
ANEXO 2: AVALIAÇÃO DE SOBREVIDA LIVRE DE EVENTO DOS
PACIENTES SEGUNDO FAIXA ETÁRIA E GRAVIDADE DA ANEMIA
APLÁSTICA
Do grupo total de pacientes (118), obteve-se mediana de idade ao
diagnóstico de 24,4 anos (7 meses de vida até 76 anos), sendo que 42
pacientes tinham menos de 19 anos. Setenta e sete tiveram diagnóstico de
Anemia Aplástica Grave (AAG), 17 não grave (AAnG) e 24 muito grave
(AAmG). Todos os pacientes foram acompanhados clinicamente com tempo
médio de seguimento de 6,0 anos (mediana de 5,0).
Realizada análise de sobrevida livre de evento dos pacientes segundo
sua faixa etária e não foi observada diferença estatística entre os grupos
pediátrico e adulto (p=0,295) (Figura 1).
Figura 1 - Sobrevida livre de evento dos pacientes com AAA segundo faixa etária
Anexos 94
Quando realizada análise de sobrevida livre de evento dos pacientes
segundo a gravidade da AAA, foi observada diferença estatisticamente
significante entre os grupos (p=0,002), com maior sobrevida dos graves e não-
graves em relação aos muito graves (Figura 2), denotando a validade das
informações clínicas e evolutivas da casuística deste estudo.
Figura 2 - Análise de sobrevida livre de evento dos pacientes com AAA segundo classificação por gravidade da doença. AAG: anemia aplástica grave; AANG: anemia aplástica não-grave; AAMG: anemia aplástica muito grave
Anexos 95
ANEXO 3: COMPARAÇÃO DOS ACHADOS MORFOLÓGICOS/IMUNO-
HISTOQUÍMICOS EM CRIANÇAS COM MENOS DE 14 ANOS E GRUPO
COM 14 ANOS OU MAIS
O capítulo da OMS referente a CRI considera os critérios diagnósticos
que descreve para crianças abaixo de 14 anos e a OMS reconhece como
pediátricos os pacientes com menos de 19 anos. Assim, fizemos uma análise
comparativa dos dados entre grupo maior e grupo menor que 14 anos para
avaliar possíveis diferenças, mas não houve nenhum resultado
estatisticamente significante.
Variável
Grupo ≥ 14a (n=93)
Grupo <14a (n=25) p
n n
Distribuição irregular do tecido hematopoético 51 8 0,07
Distúrbio maturação da série granulocítica 3 0 1
Distúrbio arquitetural da série eritrocítica 11 2 1
Agrupamentos da série eritrocítica 47 7 0,26
Formas jovens da série eritrocítica 29 3 0,24
Mitoses da série eritrocítica 20 4 1
Atipias citológicas da série eritrocítica 30 5 0,77
Presença de células da série megacariocítica 36 6 0,23
Displasia da série megacariocítica 14 1 0,39
Megacariócitos binucleados 2 0 1
Megacariócitos multinucleados 3 0 1
Megacariócitos não lobulados 14 1 0,39
Distúrbio arquitetural da série megacariocítica 3 1 0,47
Blastos CD34-positivos 9 2 1
Reticulogênese grau 1 em escala de 0 a 3 2 1 0,51
Reticulogênese grau 2 em escala de 0 a 4 2 1 0,30
Índice proliferativo (Ki-67) (mediana) 30 10 0,39
Anexos 96
ANEXO 4: RESULTADOS DE ESTUDOS CITOGENÉTICOS
Estudo Citogenético (cariótipo e FISH) dos pacientes ao diagnóstico, ao seguimento e à evolução para SMD/LMA
Paciente Idade (anos)
Cariótipo e/ou FISH ao diagnóstico Cariótipo e/ou FISH ao seguimento pré-
evolução para SMD / LMA Evolução para
SMD / LMA Cariótipo e/ou FISH à evolução para SMD / LMA
1 2,6 NR NR N
2 9,3 NR NR N
3 4,8 NR NR S 45, XX,-7[16]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x1[23/100]
4 17,3 NR 46,XY[8]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] N
5 15,9 NR NR N
6 6,3 NR nuc ish(D7Z1,D7S486)x1[11/100] N
7 26,6 NR NR N
8 18,8 NR NR N
9 0,6 46,XY[13] nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] N
10 18,3 AM NR N
11 18,8 46, XX[10]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
12 18,4 AM NR N
13 5,8 46, XX[8] 46, XX[8]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[98/100] N
14 3,7 NR NR N
15 14,8 46, XY[10] NR S
16 8,3 46, XY[10] AM N
17 15,1 NR NR N
18 10,3 AM NR N
19 18,5 46,XY[16] 46,XY[19] N
20 7,5 AM 46, XY[9] N
21 2,3 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] 46,XY[20] N
22 14,7 NR NR N
23 1,9 AM NR N
24 16,3 AM NR N
continua
Anexos 97
Estudo Citogenético (cariótipo e FISH) dos pacientes ao diagnóstico, ao seguimento e à evolução para SMD/LMA (continuação)
Paciente Idade (anos)
Cariótipo e/ou FISH ao diagnóstico Cariótipo e/ou FISH ao seguimento pré-
evolução para SMD / LMA Evolução para
SMD / LMA Cariótipo e/ou FISH à evolução para SMD / LMA
25 4,1 46, XX[15]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] 46,XX[20] S
26 5,8 46, XX[19] NR N
27 19,8 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[98/100] 46, XY[20] N
28 5,2 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[99/100] NR N
29 14,4 AM NR N
30 1,2 46,XY[5]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[97/100] NR N
31 17,3 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[98/100] NR N
32 4,9 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[99/100] NR
33 11,1 NR NR N
34 6,8 NR NR S 46,XX,del(7)(q22q32)[11]
35 3,4 AM NR N
36 17,8 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] 46,XX[3] N
37 19,8 46, XX[23] NR N
38 12,1 46,XY[3]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
39 2,6 46,XX[19]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
40 6,4 46,XY[15]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[98/100]
NR S 45,XY,-7[20]
41 2,8 AM nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[99/100] S 45,XY,-7[2]/46,XY[7]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x1[50/200]
42 11,2 46,XX[18] 46,XX[8] N
43 32,6 AM nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[99/100] N
44 47,7 NR NR N
45 25,3 NR NR S 45XY,-7[9]/46,XY[4]; 45,XY,-7[2]/46,XY,-7+21[8]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x1[63/100]
46 23,6 NR NR N
47 28,3 NR NR N
48 34,8 NR NR N
Anexos 98
Estudo Citogenético (cariótipo e FISH) dos pacientes ao diagnóstico, ao seguimento e à evolução para SMD/LMA (continuação)
Paciente Idade (anos)
Cariótipo e/ou FISH ao diagnóstico Cariótipo e/ou FISH ao seguimento pré-
evolução para SMD / LMA Evolução para
SMD / LMA Cariótipo e/ou FISH à evolução para SMD / LMA
49 45,8 AM NR N
50 32,3 AM NR N
51 22,8 NR NR N
52 28,1 46, XX[9] nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] N
53 49,3 46,XY[10]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
54 68,3 NR NR N
55 26,2 46, XX[10] NR N
56 27,8 AM AM N
57 19,6 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
58 21,9 NR NR S 46,XX,-7,+21[20]
59 63,2 NR NR N
60 48,3 NR NR N
61 21,4 NR NR N
62 29,3 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
63 76,0 AM NR N
64 30,4 NR NR N
65 58,8 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
66 66,9 NR NR N
67 29,7 NR NR N
68 45,8 NR NR N
69 60,4 46, XY[10]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[99/100] AM N
70 29,9 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
71 69,8 46, XX[3]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] 46, XX[3] N
72 20,3 AM NR N
73 26,8 NR 46,XY[8]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] N
continua
Anexos 99
Estudo Citogenético (cariótipo e FISH) dos pacientes ao diagnóstico, ao seguimento e à evolução para SMD/LMA (continuação)
Paciente Idade (anos)
Cariótipo e/ou FISH ao diagnóstico Cariótipo e/ou FISH ao seguimento pré-
evolução para SMD / LMA Evolução para
SMD / LMA Cariótipo e/ou FISH à evolução para SMD / LMA
74 26,8 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
75 51,0 46, XX[12]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
76 19,1 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] AM N
77 45,6 46,XX [8]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
78 49,0 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] 46,XY [24] N
79 35,4 AM 46,XY[13]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] N
80 49,1 NR 46,XX[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[95/100]
N
81 71,8 46, XY[18] NR N
82 56,2 AM nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] N
83 25,3 AM NR N
84 23,8 AM AM S nuc ish (D7Z1,D7S486)x1[76/100]
85 50,0 46, XY[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
86 40,7 46, XX[15]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
87 34,0 46, XY[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
88 24,3 AM NR N
89 23,8 46, XX[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[98/100]
NR N
90 23,5 46, XY[20] 46,XY[16]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] N
91 46,3 NR NR N
92 29,1 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
93 21,0 46, XY[17]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
94 71,4 NR NR N
95 67,8 46, XY[7]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[98/100] 46,XY[20] N
96 38,1 46, XY[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
97 51,9 46,XX[10] NR N
98 35,1 AM NR N
Anexos 100
Estudo Citogenético (cariótipo e FISH) dos pacientes ao diagnóstico, ao seguimento e à evolução para SMD/LMA (conclusão)
Paciente Idade (anos)
Cariótipo e/ou FISH ao diagnóstico Cariótipo e/ou FISH ao seguimento pré-
evolução para SMD / LMA Evolução para
SMD / LMA Cariótipo e/ou FISH à evolução para SMD / LMA
99 26,4 46,XX[4] NR N
100 35,6 46, XY[6]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
101 21,0 46,XX[3]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR S 45,XX,-7[9]/46,XX[1]
102 16,4 AM NR N
103 26,1 46,XX[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[99/100]
NR N
104 24,7 46,XX[8]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] 46,XX[15] N
105 71,4 46,XY[9]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] AM N
106 30,8 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
107 35,0 NR NR N
108 66,2 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR S 45,XY,-7[2]/46,XY,-7,+21[17]/46,XY[1]
109 17,7 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[97/100] NR N
110 20,7 46,XY[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] AM N
111 39,8 nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
112 18,1 NR NR N
113 19,8 46,XX[20]; nuc ish (D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
114 72,4 46,XY[5]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[98/100] NR N
115 66,6 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
116 54,7 NR NR S 45,XX,-7[12]/46,XX,-7,+21[3]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x1[58/100]
117 36,8 46,XX[10]; nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[99/100] NR N
118 32,3 nuc ish(D7Z1,D7S486)x2[100] NR N
FISH: hibridização “in situ” por imunofluorescência; NR: não realizado; AM: ausência de metáfase. Nomenclatura de cariótipo e FISH de acordo com ISCN2013.