Upload
leliem
View
233
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
ATMOSFERDE EN ÇOK RASTLANAN MİKROFUNGUS
CİNSLERİNE AİT BAZI TÜRLERİN PROTEİN
PROFİLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI
Burhanettin YALÇINKAYA
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ANKARA
2012
Her hakkı saklıdır
TEZ ONAYI
Burhanettin YALÇINKAYA tarafından hazırlanan “Atmosferde En Çok Rastlanan
Mikrofungus Cinslerine Ait Bazı Türlerin Protein Profillerinin Karşılaştırılması”
adlı tez çalışması 09/11/2012 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak
kabul edilmiştir.
Danışman: Prof. Dr. N. Münevver PINAR
Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Jüri üyeleri:
Başkan: Prof. Dr. Kadriye SORKUN Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye : Prof.Dr. Nur Münevver Pınar Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye : Yrd. Doç. Dr. Ahmet Emre YAPRAK
Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Özer KOLSARICI
Enstitü Müdürü
i
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
ATMOSFERDE EN ÇOK RASTLANAN MİKROFUNGUS
CİNSLERİNE AİT BAZI TÜRLERİN PROTEİN
PROFİLLERİNİN KARŞILAŞTIRILMASI
Burhanettin YALÇINKAYA
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Prof. Dr. N. Münevver PINAR
Bu çalışmada Atmosferde en çok rastlanan mikrofungus cinslerine (Acremonium
kiliense, Alternaria alternata, Aspergillus flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae, Cladosporium herbarum, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium
floridanum, Penicillium chrysogenum), ait taksonların protein profillerinin
karşılaştırılması, SDS-Page yöntemiyle yapılmıştır. Bu yönteme göre, Acremonium
kliense, örneğinden SDS-Page yöntemi ile 19, Aspergillus flavipes örneğinden 17,
Aspergillus niger’den 10, Aspergillus oryzae’den 13, Alternaria alternata’dan 31,
Cladosporium herbarum’dan 25, Cladosporium obtectum’dan 16, Cylindrocladium
floridanum’dan 14 ve Penicillium chrysogenum’dan 20 farklı protein bandı elde
edilmiştir.
Elde edilen verilere göre toplam 82 farklı protein bandı elde edilmiş, 24kDA
büyüklüğündeki protein bandının 7 taksonda (Acremonium kiliense, Aspergillus
flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium obtectum,
Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum) ortak olduğu gözlemlenmiştir.
Kasım 2012, 69 sayfa
Anahtar Kelimeler: Atmosfer, Mikrofungi, Protein, SDS-Page, Türkiye
ii
ABSTRACT
Master Thesis
COMPARİSON OF PROTEİN PROFİLES OF SOME
MİCROFUNGİ SPECİES BELONGİNG TO MOST
OBSERVED GENERA İN ATMOSPHERE
Burhanettin YALÇINKAYA
Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Biology
Supervisor: Prof.Dr. N. Münevver PINAR
In this study, the protein profile comparison of most commonly found microfungus
genera taxa in the atmosphere (Acremonium kiliense, Alternaria alternata, Aspergillus
flavipes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium herbarum, Cladosporium
obtectum, Cylindrocladium floridanum, Penicillium chrysogenum) was conducted using
SDS-Page. According to this method, different protein bands for Acremonium kliense
(19), Aspergillus flavipes (17), Aspergillus niger (10), Aspergillus oryzae (13),
Alternaria alternata (31), Cladosporium herbarum (25), Cladosporium obtectum (16),
Cylindrocladium floridanum (14) and Penicillium chrysogenum (20) were obtained.
Based on data, 82 different protein bands were obtained and 24kDA-sized protein band
was determined to be common for 7 taxa (Acremonium kiliense, Aspergillus flavipes,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Cladosporium obtectum, Cylindrocladium
floridanum, Penicillium chrysogenum).
November 2012, 69 pages
Key Words: Atmosphere, Microfungi, Protein, Morphology, SDS-Page, Turkey
iii
TEŞEKKÜR
Bu çalışmanın gerçekleşmesindeki her aşamada bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyen
her şeyden öte hem akademik hemde insani olarak yetişmemde çok değerli katkıları
olan danışman hocam Sayın Prof. Dr. Nur Münevver PINAR’a (Ankara Üniversitesi
Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü), bilgi ve deneyimlerinden her zaman yararlandığım
Sayın Prof. Dr. Özlem YILDIRIM’a (Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji
Bölümü), çalışmalarım boyunca hep yanımda olan ve yardımlarını esirgemeyen Sayın
Yrd. Doç. Dr. Şenol ALAN’a (Bülen Ecevit Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi
Biyoloji Bölümü), Sayın Yrd. Doç. Dr. Talip ÇETER’e (Kastamonu Üniversitesi Fen
Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü), fungusları hayatıma sokan ve örneklerimin
temininde yardımcı olan Sayın Yrd. Doç. Dr. Adem İmalı’ya (Kilis 7 Aralık
Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü), çalışmalarım sırasında hertürlü
desteği aldığım dostum Ferudun KOÇER’e,
Çalışmalarım süresince maddi ve manevi fedakârlıklar gösteren aileme ve hep yanımda
olan eşim Saliha YALÇINKAYA’ya, en derin duygularla teşekkür ederim.
Bu tez çalışması, ‘TUBİTAK SBAG-COST ES0603-30 (109S265) Orta ve Doğu
Karadeniz Bölgesi Atmosferik Polen ve Mantar Sporlarının İncelenmesi’’ konulu proje
tarafından desteklenmiştir.
Burhanettin YALÇINKAYA
Ankara, Kasım 2012
iv
İÇİNDEKİLER
ÖZET ………………...………………………………………………………………….i
ABSTRACT ..................................................................................................................... ii
TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iii
KISALTMALAR DİZİNİ .............................................................................................. v
ŞEKİLLER DİZİNİ ....................................................................................................... vi
ÇİZELGELER DİZİNİ ............................................................................................... viii
1. GİRİŞ ............................................................................................................................ 1
2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI ........................... 4
2.1 Kaynak Araştırmaları ............................................................................................... 4
2.1.1 Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları .............................................. 4
2.1.2 Fungal protein çalışmaları ................................................................................. 8
2.2 Kuramsal Temeller ................................................................................................. 9
2.2.1 Araştırmada kullanılan örneklerin genel özellikleri ..................................... 9
3. MATERYAL VE YÖNTEM .................................................................................... 22
3.1 Örneklerin Temini ................................................................................................... 22
3.2 Örneklerin Çoğaltılması ......................................................................................... 23
3.2.1 Besiyerlerinin hazırlanması ................................................................................. 23
3.2.2 Örneklerin üretilmesi .......................................................................................... 25
3.2.3 Örneklerin özütlenmesi ....................................................................................... 25
3.3 Protein Profil Çıkarılmasında Kullanılan Yöntemler ......................................... 25
3.3.1 Özütlenen örneklerin total miktarlarının belirlenmesi .................................... 26
3.3.2 Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) .............. 26
3.4 MVSP (MultiVariate Statistical Package) ............................................................ 32
4. BULGULAR .............................................................................................................. 33
5. TARTIŞMA VE SONUÇ .......................................................................................... 53
KAYNAKLAR .............................................................................................................. 64
ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................... 69
v
KISALTMALAR DİZİNİ
APS Amonyum Persülfat
EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit
N-PAGE Native-Poliakrilamid Jel Elektroforez
ME Merkaptoetanol
PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforez
SDS Sodyum Dodesil Sülfat
SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez
TAE Tris Asetikasit EDTA
TEMED Tetra Etil Metilen Diamin
MVSP MultiVariate Statistical Package
kDa Kilodalton
MEA Malt Ekstrakt Agar
SDA Sabouraud Dekstroz Agar
vi
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 2.1 Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar ................................................. 4
Şekil 2.2 Türkiye'de yapılan aerofungus çalışmalarında kullanılan yöntemlerin illere
göre dağılımı ....................................................................................................... 5
Şekil 4.1 a. Çalışmada kullanılan örneklerin protein bant verilerine göre elde edilen
dendrogram b. Çalışmada kullanılan örneklerin sistematik verilerine göre
elde edilen dendrogram ..................................................................................... 34
Şekil 4.2 a. Acremonium kliense’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Acremonium
kliense’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Acremonium kliense’den SDS-Page
yöntemiyle elde edilen protein bantları. d. Standart proteinlerin log MW
değerlerine karşı, Rf değerleri........................................................................... 35
Şekil 4.3 Acremonium kliense total protein miktarı ........................................................ 36
Şekil 4.4 a. Alternaria alternata’nın katı besiyerinde görüntüsü b. Alternaria
alternata’nın sıvı besiyerinde görüntüsü c. Alternaria alternata’dan SDS-
Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log
MW değerlerine karşı, Rf değerleri .................................................................. 37
Şekil 4.5 Alternaria alternata total protein miktarı ........................................................ 38
Şekil 4.6 a. Aspergillus flavipes’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus flavipes’
in sıvı besiyerinde görüntüsü c.Aspergillus flavipes’den SDS-Page
yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW
değerlerine karşı, Rf değerleri........................................................................... 39
Şekil 4.7 Aspergillus flavipes total protein miktarı ......................................................... 40
Şekil 4.8 a. Aspergillus niger’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus niger’in
sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus niger’den SDS-Page yöntemiyle
elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine
karşı, Rf değerleri.............................................................................................. 41
Şekil 4.9 Aspergillus niger total protein miktarı ............................................................. 42
Şekil 4.10 a. Aspergillus oryzae’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus oryzae
’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus oryzae ’den SDS-Page
yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW
değerlerine karşı, Rf değerleri........................................................................... 43
Şekil 4.11 Aspergillus oryzae total protein miktarı ......................................................... 44
Şekil 4.12 a. Cladosporium herbarum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium
herbarum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium herbarum’dan
SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin
log MW değerlerine karşı, Rf değerleri ............................................................ 45
Şekil 4.13 Cladosporium herbarum total protein miktarı ............................................... 46
Şekil 4.14 a. Cladosporium obtectum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium
obtectum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium obtectum’un SDS-
vii
Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW
değerlerine karşı, Rf değerleri........................................................................... 47
Şekil 4.15 Cladosporium obtectum total protein miktarı ................................................ 48
Şekil 4.16 a. Cylindrocladium floridanum’un katı besiyerinde görüntüsü b.
Cylindrocladium floridanum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c.
Cylindrocladium floridanum’un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein
bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri ......... 49
Şekil 4.17 Cylindrocladium floridanum total protein miktarı ......................................... 50
Şekil 4.18 a. Penicillium chrysogenum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Penicillium
chrysogenum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Penicillium chrysogenum’dan
SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log
MW değerlerine karşı, Rf değeri ...................................................................... 51
Şekil 4.19 Penicillium chrysogenum total protein miktarı .............................................. 52
Şekil 5.1 Çalışmada kullanılan örneklerin özütleme işlemi sonucu total protein
miktarları ........................................................................................................... 62
viii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1 Türkiye’de Durham aleti ile yapılan aerofungus araştırmaları ...................... 5
Çizelge 2.2 Türkiye’de kültür besi yeri açma yöntemi ile yapılan çalışmalar .................. 6
Çizelge 2.3 Türkiye’de volümetrik (Burkard, Lanzoni aleti) yöntemle yapılan
aerofungus çalışmaları.................................................................................... 7
Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan örnekler ..................................................................... 23
Çizelge 3.2 Jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları ............................................... 30
1
1. GİRİŞ
Bitkiler aleminin ‘Mycota’ bölümünde iki alt bölüm (Myxomycotina ve Eumycotina)
halinde incelenen mantarlar, daha sonraları ‘Protista’ aleminin bir bölümü (divisio)
olarak kabul edilmiştir. Günümüzde ise ayrı bir alem ‘Fungi’ olarak ele alınmaktadır.
(Alexopoulos ve Mims 1979).
Funguslar özellikle nemli yerleri sevmelerine rağmen, değişik habitat ve substratlarda
gelişebilme özelliklerinden dolayı dünyanın birçok yerinde havada, karada, suda,
bitkide, hayvanların ve insanların üzerinde rastlayabiliriz. Fungusların bazıları
mikroskobik bazıları ise makroskobik canlılardır (Ökten ve Asan 2009).
Yaklaşık 1,5 milyon fungus türü olduğu tahmin edilse de 80 bin kadar türü
tanımlanmıştır. Bunlardan 15.000 – 20.000 makrofungus, 60.000 – 65.000 ise
mikrofungus’dur. Yeryüzündeki 80 bin fungusdan 112 fungusun alerjik reaksiyona
neden olduğu saptanmış olup, bunlardan da 50 fungusa atmosfer çalışmalarda daha fazla
rastlanmıştır (Acremonium, Agrocybe, Alternaria, Ascobolus, Aspergillus, Boletus,
Botrytis, Cercospora, Chaetomium, Cladosporium, Coprinus, Curvularia,
Cylindrocladium, Dictyosporium, Didymella, Drechslera, Epicoccum, Exosporium,
Fusarium, Ganoderma, Helminthosporium, Leptosphaeria, Melanomma, Melanospora,
Monilia, Mucor, Mycelia, Myrothecium, Nigrospora, Oidium, Paraphaeosphaeria,
Penicillium, Periconia, Peronospora, Pithomyces, Pleospora, Puccinia, Rhizopus,
Rhodotorula, Scopulariopsis, Sporormiella, Stemphylium, Tetracoccosporium, Torula,
Trichoderma, Ulocladium, Ustilago, Venturia ve Xylaria).
Bu funguslardan Türkiye’de Adana atmosferinde 34, Samsun 29, Kastamonu ve Ankara
atmosferinde 35’i saptanmıştır (Agrocybe, Alternaria, Ascobolus, Boletus, Botrytis,
Chaetomium, Cladosporium, Coprinus, Curvularia, Dictyosporium, Didymella,
Drechslera, Epicoccum, Exosporium, Fusarium, Ganoderma, Leptosphaeria,
Melanomma, Melanospora, Nigrospora, Oidium, Paraphaeosphaeria, Periconia,
Peronospora, Pithomyces, Pleospora, Puccinia, Sporormiella, Stemphylium,
2
Tetracoccosporium, Torula, Ustilago, Venturia, Xylaria, 1-septalı askospor) (Çeter vd.
2004, Çeter vd. 2006, Erkan vd. 2006, Çeter vd. 2008,).
Genellikle toprakta yaşayan funguslar çeşitli çevresel faktörlerin etkisiyle atmosfere
dağılabilir ve havayla taşınabilirler ve üremeyi garanti altına almak için çok miktarda
sporu atmosfere verirler. Örneğin Ganoderma applanatum (Persoon) Patouillard, bir
günde 30 milyar, Daldinia concentrica(Balt. ex Fr.) Ces. et De Not. günde 100 milyon,
Tilletia caries (De Candolle) Tulasne 12 milyon, Penicillium Link ise 400 milyon spor
üretebilmektedir (Smith 2000). Bu sporların solunması kronik bronşit, astım, fungal
alerjiler, aşırı duyarlı pnömoni ve Aspergillosis gibi çeşitli hastalıklara neden olabilir
(Sen 2001, Sakiyan 2003, Bavbek 2006, İnal vd. 2008, Başbülbül 2011).
Fungusların atmosferdeki yoğunlukları meteorolojik şartlara bağlı olarak da
değişmektedir. Sayıları yaklaşık m3’de 20.000- 2 milyon arasında bulunan mikroskobik
mantar sporları, birçok bireydeki astım ve alerjik rahatsızlıkların başta gelen
nedenlerindendir. Atmosferdeki spor miktarı, semptom şiddeti ile ilişkilidir. Funguslara
bağlı alerjik solunum hastalıkların prevalansı, genel populasyonlarda %6, atopik
kişilerde ise %20-30 olduğu düşünülmektedir (Wuethrich 1989).
Adana ilinde ise solunum alerjisi gösteren çocukların %11,6’da funguslara duyarlılık
saptanmıştır (İnal 2008). Avrupa ülkelerinde Cladosporium ve Alternaria duyarlılığının
%3-30 olduğu saptanmıştır. Ankara ilinde Cladosporium ve Alternaria’ya duyarlılık
erişkinlerde %14,8’dır (Bavbek 2006).
Ülkemizde henüz mikrofungusların protein profilleri ile ilgili bir çalışma
bulunmamaktadır. Buna karşın yurt dışında birçok mikrofungusun protein profilleri
çıkartılmış ve duyarlı kişilerde alerjik reaksiyonlara neden olan bantlar belirlenmiştir.
Ülkemizdeki bu eksikliği gidermek üzere atmosferde rastladığımız, Acremonium kliense
Grütz, Alternaria alternata Keisler, Aspergillus flavipes (Bainier & R. Sartory) Thom &
Church, Aspergillus niger Van. Tighem, Aspergillus oryzae (Ahlb.) E. Cohn,
Cladosporium herbarum (Pers) Link ex Gray, Cladosporium obtectum Rabenh,
Cylindrocladium floridanum Sobers&Seymour 1967, Penicillium chrysogenum Thom,
türleri bu tezde çalışılmıştır. Elde edilen veriler yapılan çalışmalarla karşılaştırılarak
3
benzer ve ortak bantlar belirlenmiştir. Bu tez ile aynı zamanda çalışılacak türlerde
bulunabilecek muhtemel yeni alerjenlerin belirlenmesi için gerekli olan ön verilerin
sağlanacağı düşünülmektedir.
Ayrıca funguslar her yıl tarımsal ürünlerde milyonlarca dolarlık zarara neden
olmaktadır. Bu organizmaların neden olduğu hastalıkların kontrolü için, fungal türlerin
teşhisi ve karakterizasyonu gereklidir. Fungusların morfolojik karakterlerine göre
yapılan sınıflandırmalar, moleküler sistematikle belirlenen filogenetik ilişkilerle birlikte
yeniden değerlendirilmeye başlamıştır. Taksonlar arasında morfolojik karakterlerin
birbirine anlamlı olmayan benzerliği, indirgenmiş olabileceği ya da taksonlar arasında
ortadan kalkmış olduğu durumlarda, filogenetik analiz için moleküler karakterlerin
kullanımı önem kazanmaktadır (Blackwell vd. 2007). Fungi alemi içindeki grupların
belirlenmesi ve sınıflandırılma çabaları oldukça eski olmakla birlikte, 2004 yılında
başlatılan ve şu anda da devam eden AFTOL (Assembling the Fungal Tree of Life) adı
verilen ortak bir çalışma ile (yeni moleküler filogenetik yöntemler kullanılarak)
fungusların tüm gruplarının en yüksek seviyede moleküler (filogenetik)
sınıflandırılması hedeflenmiştir. Bu çalışmada toplam 195 taksonu içeren bir fungus
grubuyla çalışılmış ve sonuçda 7 filum [Chytridiomycota, Neocallimastigomycota,
Blastocladiomycota, Microsporidia, Glomeromycota, Dikarya: (Ascomycota,
Basidiomycota)] 10 subfilum, 35 sınıf, 129 ordo şeklinde bir sınıflandırma elde
edilmiştir (Hibbett vd. 2007, Kılıçoğlu ve Özkoç 2008).
Birçok fungus türünün sporlarının veya hiflerinin kendi aralarında birbirlerine
benzemesi akla, akrabalık ilişkilerini getirmektedir. Bu tezde protein bantlarından elde
edilen verilere göre istatistiksel analiz yapılmış ve protein profilleri çıkarılan
fungusların birbirleri ile biyokimyasal özellikleri bakımından akrabalık ilişkileri de
araştırılmıştır.
2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI
2.1 Kaynak Araştırmaları
2.1.1 Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları
Ülkemizde atmosferdeki mantar sporlarını belirlemeye yönelik farklı yöntemlerle
yapılmış birçok atmosferik çalışma mevcuttur. Çalışmalarda, gravimetrik ve volümetrik
yöntemler kullanılmıştır. Gravimetrik yöntemde, kültür besiyeri (petri) açma ve Durham
aleti ile ölçüm olmak üzere 2 yöntemden faydalanılırken, volümetrik yöntemde Burkard
veya Lanzoni aletleri kullanılmıştır (Şekil 2.
a.
Şekil 2.1 Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar
a. Kültür besiyeri (petri) açma yöntemi,
Aksaray, Antalya, Burdur, Bursa, Çankırı, Düzce, Eskişehir, Karabük, Sivas
Zonguldak ve Trabzon
aleti ile yapılan çalışmalarda
dominant olarak görülmüştür (Çizelge 2.1 ). Ankara, Çorum
İstanbul, İzmir, Manisa, Samsun ve Trabzon
çalışmalarda, genel olarak
Alternaria, Mycelia
(Çizelge 2.2). Adana, Ankara,
4
KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI
Kaynak Araştırmaları
Türkiyede yapılan atmosferik fungus çalışmaları
Ülkemizde atmosferdeki mantar sporlarını belirlemeye yönelik farklı yöntemlerle
birçok atmosferik çalışma mevcuttur. Çalışmalarda, gravimetrik ve volümetrik
yöntemler kullanılmıştır. Gravimetrik yöntemde, kültür besiyeri (petri) açma ve Durham
aleti ile ölçüm olmak üzere 2 yöntemden faydalanılırken, volümetrik yöntemde Burkard
letleri kullanılmıştır (Şekil 2.1).
b.
Aerofungus çalışmalarında kullanılan tuzaklar
. Kültür besiyeri (petri) açma yöntemi, b. Durham aleti, c. Burkard aleti
Aksaray, Antalya, Burdur, Bursa, Çankırı, Düzce, Eskişehir, Karabük, Sivas
ve Trabzon illerinde gravimetrik yöntemin uygulama aracı olan Durham
aleti ile yapılan çalışmalarda Cladosporium, Alternaria ve Ustilago
örülmüştür (Çizelge 2.1 ). Ankara, Çorum, Edirne, Eskişehir, Isparta,
İstanbul, İzmir, Manisa, Samsun ve Trabzon gibi illerde petri açma yöntemi ile yap
çalışmalarda, genel olarak Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium,
Mycelia ve Scrohulariopsis cinsleri dominant olarak tespit edilmiştir
(Çizelge 2.2). Adana, Ankara, Bursa, Diyarbakır, Kastamonu ve Samsun illerinde
KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ARAŞTIRMALARI
Ülkemizde atmosferdeki mantar sporlarını belirlemeye yönelik farklı yöntemlerle
birçok atmosferik çalışma mevcuttur. Çalışmalarda, gravimetrik ve volümetrik
yöntemler kullanılmıştır. Gravimetrik yöntemde, kültür besiyeri (petri) açma ve Durham
aleti ile ölçüm olmak üzere 2 yöntemden faydalanılırken, volümetrik yöntemde Burkard
c.
Aksaray, Antalya, Burdur, Bursa, Çankırı, Düzce, Eskişehir, Karabük, Sivas,
illerinde gravimetrik yöntemin uygulama aracı olan Durham
Ustilago cinsi sporları
Edirne, Eskişehir, Isparta,
gibi illerde petri açma yöntemi ile yapılan
Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Fusarium, Rhizopus,
cinsleri dominant olarak tespit edilmiştir
Kastamonu ve Samsun illerinde
5
volümetrik yöntemle atmosferdeki spor konsantrasyonları çalışılmış, Cladosporium,
Alternaria, Leptosphaeria, Periconia, Ustilago, Fusarium, Exosporium ve Epicoccum
cinsi sporlarına dominant olarak rastlanmıştır (Çizelge 2.3) (Şekil 2-2).
Şekil 2.2 Türkiye'de yapılan aerofungus çalışmalarında kullanılan yöntemlerin illere göre dağılımı
Çizelge 2.1 Türkiye’de Durham aleti ile yapılan aerofungus araştırmaları
Şehir Araştırıcılar Fungus sayısı
Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus
cinsleri
AKSARAY Pehlivan ve Koç 2000 1 Alternaria
ANTALYA İnce ve Pehlivan 1991 (Serik) 1 Alternaria
BURDUR Tatlıdil vd. 2001 2 Cladosporium, Alternaria
BURSA Bıçakçı vd. 1999 (İnegöl İlçesi); Tatlıdil vd., 2000 (İznik); Bıçakçı vd. 2001 (Kemalpaşa)
2 Cladosporium, Alternaria
ÇANKIRI Altın vd. 1998 2 Cladosporium, Alternaria
DÜZCE Serbes ve Kaplan 2008 5 Alternaria, Ustilago, Cladosporium
ESKİŞEHİR Asan vd. 2004 (Merkez); Erkara vd. 2008 (Sivrihisar)
2 Cladosporium, Alternaria
KARABÜK Özdoğan ve Kaplan 2008 5 Alternaria, Cladosporium, Ustilago
SİVAS Pehlivan ve Özler 1999 1 Alternaria
ZONGULDAK Alan ve Kaplan 2004 2 Cladosporium, Alternaria
TRABZON Ayvaz vd. 2008 2 Cladosporium, Alternaria
6
Çizelge 2.2 Türkiye’de kültür besi yeri açma yöntemi ile yapılan çalışmalar
Şehir Araştırıcılar Fungus sayısı
Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus
cinsleri
ANKARA
Özkaragöz 1969a, b 14 Alternaria, Aspergillus,
Penicillium, Monilia, Mycelia,
Hormondendrum
Okuyanvd. 1976 20 Penicillium, Aspergillus, Mucor,
Oospora, Nigrospora, Fusarium,
Alternaria
ÇORUM İmalı vd. 2008
10 Aspergillus, Alternaria,
Cladosporium, Monilia,
Penicillium, Rhizopus,
Scolecobasidium, Stachybotrys,
Torula, Ulocladium
EDİRNE
Asanvd.2002 37 Aspergillus, Penicillium, Alternaria
Öktenvd.2005 7 Cladosporium, Alternaria,
Penicillium, Trichoderma,
Fusarium, Rhizopus
ESKİŞEHİR Asanvd.2004 12 Mycelia, Alternaria,
Cladosporium, Penicillium,
Scopulariopsis
ISPARTA Şimşekli vd. 2007 25 Cladosporium, Alternaria,
Mycelia, Penicillium, Aspergillus
İSTANBUL
Çolakoğlu 1996 (Anadolu yakası)
17 Cladosporium, Alternaria,
Epicoccum, Botrytis,
Leptosphaeria
Asan vd.2002 (Terkos gölü)
9 Scopulariopsis, Penicillium,
Cladosporium, Sphaerospermum,
Aspergillus
Çolakoğlu 2003 (Belgrad ormanı)
13 Aspergillus, Penicillium,
Cladosporium, Rhizopus,
Trichoderma
Çolakoğlu 1996 (Avrupa yakası)
18 Penicillium, Aspergillus,
Cladosporium, Alternaria,
Rhizopus, Fusarium
İZMİR Ayata vd. 1989 13 Cladosporium, Alternaria,
Mycelia, Penicillium, Phoma,
Aspergilus
MANİSA Kalyoncu 2008 21 Cladosporium, Aspergillus,
Alternaria
SAMSUN Ulutan vd. 1991 (Çarşamba)
12 Penicillium, Alternaria,
Scopulariopsis, Fusarium
TRABZON Topbaş vd. 2006 11 Penicillium, Alternaria, Fusarium,
Aspergillus, Cladosporium
7
Çizelge 2.3 Türkiye’de volümetrik (Burkard, Lanzoni aleti) yöntemle yapılan aerofungus çalışmaları (Çeter ve Pınar 2009 b).
Şehir Araştırıcılar Fungus sayısı
Atmosferde sporları dominant olarak tespit edilen fungus cinsleri
ADANA
Beyoğlu vd. 2006 (1997-1998)
2 Cladosporium, Alternaria
Çeter vd. 2006
35
Cladosporium,
Alternaria, Epicoccum,
Exosporium, Drechslera,
Periconia
ANKARA
Şakıyan ve İnceoğlu 1995 (1990-1991)
2 Cladosporium, Alternaria
Tekin ve İnceoğlu1995 (1991-1992)
2 Cladosporium, Alternaria
Ceylan ve İnceoğlu 1996 (1993-1994)
2 Cladosporium, Alternaria
Pınar ve Koçak 2000 (1998-1999)
1 Alternaria
Karakuş vd. 2005 (1999-2000)
2 Cladosporium, Alternaria
Ekiz vd. 2005 (2000-2001)
2 Cladosporium, Alternaria
Koçak ve Pınar 2003 (2001-2002)
2 Cladosporium, Alternaria
Çeter ve Pınar 2004 (2003-2004)
35
Cladosporium,
Alternaria,
Leptosphaeria, Ustilago,
Exosporium, Pleospora
BURSA
Ataygül vd. 2007
10
Cladosporium,
Alternaria,
Aspergillus/Penicillium,
Fusarium, Epicoccum
DİYARBAKIR Bursalı ve Doğan 2007 2 Cladosporium, Alternaria
KASTAMONU
Pınar vd. 2008 Çeter ve Pınar 2008
35
Cladosporium,
Alternaria,
Leptosphaeria,
Periconia, Ustilago
SAMSUN
Erkan vd.2006
35
Cladosporium,
Alternaria,
Leptosphaeria,
Periconia, Ustilago
8
2.1.2 Fungal protein çalışmaları
Mikrofungusların protein profillerinin belirlenmesi amacıyla ülkemizde henüz
kapsamlı bir çalışma yapılmamıştır. Ancak yurt dışında bazı cinslere ait
taksonların protein profillerinin belirlenmesini amaçlayan çalışmalar mevcuttur.
Mikrofungusların protein yapılarının belirlenmesindeki en önemli etken, hem
mikrofungusların moleküler düzeyde çalışılarak morfoloji çalışmalarına sistematik
açıdan yarar sağlanacağı düşüncesi, hem de alerjen bantların ortaya çıkarılarak
astım ve alerji alanındaki uzman hekimlere yardımcı olma düşüncesi ön plana
çıkmıştır.
Bendorf vd. (2008), iç ortam atmosferik mantarı Aspergillus versicolor’un spor
allerjenlerini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada, spor proteinleri için 2
boyutlu jel elektroforezi ve hasta serumlarından immünoblot yapmış ve 20’den
fazla alerjen tanımlamış ve bunların %90’ından fazlasının hasta serumlarıyla
pozitif etki gösterdiğinin sonucuna varmışlardır.
Li vd. (2008), Alerjenlerin başında gelen Cladosporium cladosporioides’in
immünolojik analizi ve kütle spektrometrisini tanımlamak amacıyla yaptıkları
çalışmada, Cladosporium cladosporioides’i karbonat tampon çözeltisi ile
ekstrakte etmişler. Daha sonra bu ekstrakttan SDS-PAGE yöntemiyle protein
bantlarını belirlemişlerdir. Elde edilen jel görüntüsünde 14 bant olduğu
kaydedilmiş ve bunların en belirginlerinin 72 kD, 61 kD, 42 kD, 36 kD, 35 kD, 34
kD, 24 kD, 22 kD, 18 kD ve 14 kD’luk protein bantları olduğunu belirtmişlerdir.
Al-Suwaini vd. (2001), Riyad atmosferindeki funguslar ve bunların ekstraktlarının
allerjenik tepkilerini araştırdıkları çalışmalarında, örnekleri Riyad atmosferinden
izole etmişlerdir. Atmoferden elde ettikleri mikrofunguslardan Aspergillus,
Alternaria, Cladosporium, Penicillium ve Ulocladium cinslerini ekstrakte etmiş
ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez analizi sonucunda elde
9
edilen protein bantlarının 13 ile 80 kDa arasında olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca
elde edilen ekstraktlarn sıvı ve liyofilize formları steril edilerek, bronşiyal astımı
ve alerjik riniti olan hastalara deri testi olarak uygulamışlardır. Deri testi
sonucunda hastaların %13’ü bu fungal ekstraktlara pozitif tepki göstermiş, alerjik
duyarlılıklarının olduğunu göstermişlerdir.
El-Kazzaz vd. (2008), moleküler biyoloji teknikleriyle bazı Fusarium
taksonlarının tanımlanması için yaptıkları çalışmada, Fusarium cinsine ait 7
taksonu (F. semitectum, F. culmorum, F. moniliforme, F. solani, F. graminearum,
F. oxysporum f.sp. lycopersici ve F. oxysporum f. sp. vasinfectum) morfolojik ve
patolojik karakterlerine göre tanımlamışlardır. Bu taksonları tanımlamak için
SDS-Page Poliakrilamid jel elektroforez yöntemini uygulamış ve elde ettikleri
protein bantlarının ölçülmesi sonucu elde ettikleri verileri UPGMA kümeleme
(cluster) analizi yapmışlardır. Kümeleme analizi sonucu dendrogramları çıkarılan
Fusarium izolatları arasında %93,8 benzerliğin olduğunu saptamışlardır.
Gupta vd. (2002), önemli bir inhalant alerjen olan Curvularia türlerindeki IgG ve
IgE bağlayan komponentleri araştırmışlardır. 7 farklı Curvularia türünde (C.
lunata, C. andropogonis, C. clavata, C. lunata var. lunata, C. pallescens, C.
geniculata, C. senegalensis), yarı sentetik bir ortamda 13 günde geliştirilen kültür
örneklerinin SDS-PAGE, immunoblat ve ELISA analizlerini yapmışlardır. Farklı
Curvularia türlerindeki 11-19 protein bandı SDS-PAGE yöntemi ile
çıkarmışlardır. Elde edilen proteinlerinin 12, 20, 31, 45, 53, 78 ve 97 kD’luk
özellikle IgE bağlayıcı ajanlar olduklarını saptamışlardır.
2.2 Kuramsal Temeller
2.2.1 Araştırmada kullanılan örneklerin genel özellikleri
2.2.1.1 Acremonium Link ex Fr.
10
Yaklaşık 100 kadar türü olan Acremonium cinsi, genellikle yavaş gelişen ve hoş
olmayan kokusuyla tespit edilebilir. Acremonium cinsi yutulduğunda toksik etki
yapabilir ve ayrıca mantar alerjisi olan bireylerde mide bulantısı, kusma ve ishale neden
olabilir. Tırnak enfeksiyonlarına ve menenjite neden olabilir (Hee vd. 2012,
www.moldunit.com/acremonium.html 2012).
Çürümüş ya da ölü bitkikerde, toprakta, gıdalarda, nem düzeyi yüksek olan iç
ortamlarda üreyebilirler. Saman nezlesi, astım, enfeksiyon ve diğer ciddi hastalıklara
neden olabilen alerjendir. trichothecene denilen mikotoksin üretme potansiyeline
sahiptir. Penisiline çok benzer bir çalışma mekanizması olan “Sefalosporin” denilen
antibiyotik yapmak için kullanılırlar (www.moldunit.com/acremonium.html 2012).
Acremonium kiliense Grütz
Sabouraud dekstroz agar, glucose ve malt extrakt besiyerlerinde yavaş gelişirler.
Kolonileri malt extrakt agar üzerinde 20°C’de 10 günde 1.8-2.3 cm olmakta, pembemsi,
az ya da çok ıslak görünümlü bazen merkezde kümeli, Sabouraud agar ve daha az
olarak MEA üzerinde kahverengi renkte olmaktadır. 12 gün inkübasyondan sonra çok
sayıda şeffaf, kromofil çeperli 4-8 µm çapında klamidosporlar oluşmaktadır. Konidiler
silindirik 3.1-5.8 x 1.0-1.6 µm ölçülerindedir. A. tubaki’ye benzer ancak A. tubaki çok
daha fazla ve genellikle zincirler halinde klamidospor oluşturur ve besiyerinde herhangi
bir kahverengi renk oluşturmaz. A. kiliense, yaygın bir toprak fungusu olup çayırlardan,
tahıl ekili tarlalardan vs. izole edilmiştir (Hasenekoğlu 1991).
Bu fungus türü, saçta kepeklenme, deri ve tırnak enfeksiyonları, eklem ve alerjik
rahatsızlıklara sebep olmaktadır (Pastorino vd. 2005).
11
2.2.1.2 Alternaria Nees ex Fr.
Dış ortam havası fungusların başında gelse de kolay bir şekilde açık olan camdan içeri
girebilir, insan ve hayvan üzerine yapışan sporları sayesinde iç ortama girebilirler.
Alternaria cinsi yaklaşık olarak 50 türden oluşmaktadır ve bunlar çoğunlukla saprofit
veya bitki patojenidirler. Alternaria alternata yaygın olarak bitkilerde, odun, odun
hamuru, tekstil ve besinlerde saprofitik olarak bulunur. Dağılımı kozmopolitandır
(www.aiha.org). A.alternata, Deuteromycetes’in bir üyesi, en önemli alerjenik
mikrofunguslardan birisidir. (Achatz vd., 1995, Yunginger vd.,1980, Bush vd., 1997,
Paris vd.,1991). A. alternata yaprak dış yüzeylerinde gelişir ve havada özellikle de
Temmuz ve Ağustos aylarında bölgeye bağlı olarak pik yapar (metre küpte 500 spora
ulaşabilir). A. alternata’nın alerjenleri duyarlı kişilerde çok düşük dozda bile reaksiyon
verebilir (Gelişken 2008).
Genellikle ekstrinsik astıma neden olur. Akut semptomları ödem ve bronşial spazmı
içerir, kronik hastalarda pulmonarik amfizem gelişebilir Havada ve yaprak yüzeylerinde
bulunan A. alternata AAL toksin üretemez. Fitotoksin alternariol (bitkiler için toksik bir
bileşiktir) ve benzer metabolitler üretir. Ayrıca A. alternata tenuazonic asid ve ürettiği
diğer toksik metabolitleri ile hayvanve insanlarda hastalıklara neden olabilir (Gelişken
2008).
Alternaria sporlarının burun, ağız verespiratör cihazı üstünde birikebileceği ileri
sürülmektedir (www.aiha.org). Kolonileri yaygın, genellikle gri, koyu siyahımsı
kahverengi veya siyah görünümlüdür. Miselyum tamamen batık veya kısmen yüzeysel,
hifler renksiz, zeytinimsi kahverengi veya kahverengidir. Nadiren stroma oluşmaktadır.
Konidiyofor koyu renkli, bölmeli, bazen belirsiz, dallı veya dalsız olduğunda uçta tek
bir por vardır ve bu pordan tek bir konidi oluşmakta veya uçtaki hücrenin pora lateral
pozisyondaki bir bölgesinden uzaması sonucu genikulat olabilmektedir. Yeni oluşan bu
dal uçta bir konidi oluşturacağı gibi, başka bir genikulat uzantının başlangıcı
olabilmekte, konidiyumlar da doğrudan doğruya fonksiyoner konidiyofor
oluşturabilmektedir. Konidiler tek tek oluşabildiği gibi daha sık olarak basit veya dallı
zincirler meydana getirmektedir. Koyu pigmentli (kahverengi tonları, siyahımsı,
kırmızımsı, yeşilimsi ve sarımsı) ovid, distal uca doğru keskin veya yumuşak şekilde
sivrilmekte, düz veya pürüzlü, ovoid şekil genellikle gelişmenin çok erken evrelerinde
12
ve genellikle ilk bölmenin oluşumundan önce belirgin bir şekilde gaga şeklini
almaktadır. Kültürde sporlanan türler kısa sürede sporlanma yeteneklerini kaybederler.
Bu yüzden yulaf agar, mısır unu agar, ve patates-havuç agar gibi doğal besiyerlerinde
üretilmeleri ve UV’ye yakın ışıkta inkübe edilmeleri önerilmektedir (Rao 1965, Özmay
2007).
Alternaria alternata (Fr.) Keissl.
Majör alerjen olan Alternaria alternata kolonisi genellikle siyah veya zeytinimsi siyah,
bazen de gri renklerde olabilir. Konidiyoforlar tek veya küçük gruplar halinde, dallı
veya basit, düz veya kıvrımlı, bazen genikulat soluk veya orta derecede altınsarısı, dış
çeperli 50 µm’a kadar uzunlukta olabilir. 3-6 µm kalınlığında, 1 veya birkaç apikal
por’u vardır. 1-3 bölmelidir. Konidiler genellikle uzun sık dallanan zincirler halinde,
obklavat, obpriform, ovoid veya elipsoidal, genellikle kısa konik veya silindirik bir
gagaya sahip, bazen bu gaga konidinin üçte biri kadar uzun olmakta, konidiler, soluk
veya orta dereceli altın sarısı renginde, düz veya verrükuloz çeperli, 8’e kadar enine, ve
birkaç tane de boyuna veya oblig bölmeli bütün uzunluk 18-63 µm, eni ise 7-18 µm,
gaga soluk renkli 2-5 µm kalınlığındadır (Ellis 1971, Donsch vd. 1980).
Yaygın olarak bulunan Alternaria alternata sporlarına toprak, bitki, gıda ve iç ortam
havalarında rastlanılabilir. Önemli bir alerjen olan A. alternata’nın spor ve misel
parçaları solunduğunda duyarlı kişilerde ciddi hassasiyette astıma neden olabilir, hatta
ölümcül astıma neden olabilir (Kılıç 2008).
Atmosferik çalışmalarda sık karşılaşılan bu tür son derece yaygın bir saprofit olup,
birçok bitki artığı, gıda, toprak, tekstil maddeleri üzerinde bulunmaktadır.
13
2.2.1.3 Aspergillus Mich. ex Fr.
Aspergillus’lar yeryüzünde hemen her yerde yaygın olarak bulunan hifli mantarlardır.
Doğal yaşam ortamları toprak ve çürüyen bitki materyalidir. Doğadaki temel işlevleri
karbon ve azot çevrimiyle ilgilidir. Bu mantarlar ürettikleri enzimler sayesinde tüm
organik maddeleri ayrıştırarak kullanır ve saprofit olarak yaşarlar. Hayvan ve insanlarda
patojen hale geçebilirler. Üreme hız ve kapasiteleri yüksektir. Atmosfere dağılan
konidiumlar havada asılı kalabilir, toz ve diğer parçacıklarla her yere taşınabilirler.
Havada en yüksek yoğunlukta bulunan mantarlardan biridir. Ortam çalışmalarında
insanların solunumla günde en az birkaç yüz konidi aldıkları belirlenmiştir (Chazalet
vd. 1998, Hosphental vd. 1998, Kantarcıoğlu vd. 2003).
Koloniler ekseri hızla gelişirler, renkleri türlere ve gelişme koşullarına bağlı olarak
beyaz, sarı, sarımsı kahverengi, siyaha yakın kahverengi, kırmızı veya yeşiltonlarında
harelidir. Sık konidiyoforların oluşturduğu bir keçe görünümündedir. Besiyerine dağılan
pigment üretebilirler ve bu pigmentin rengi koloninin hava misellikısmının renginden
farklı olabilir. Hifler bölmelidir, ince veya kalın olabilir. Hifhücreleri genellikle çok
çekirdeklidir. Miselyum çeşitli enzimler ve bazı mikotoksinler üretme yeteneğine
sahiptir. Vejetatif hifin “ayak hücresi” denen özelleşmiş bir hücresinden dik olarak
çıkan konidiyofor denen konidiyum taşıyıcı hiflerin ucu şişkinleşmiştir. Yukarı doğru
oluşturdukları yuvarlak veya ovalbiçimdeki baş kısmına “vezikül” adı verilir. Vezikül
üzerindeki üreyebilen bölüm, türlere göre farklıdır ve bu özellik tür tanımında kullanılır.
Konidiyum yapıcı hücreler olan “fiyalidler” ya doğrudan vezikülün üzerinde veya
metulaların üzerinde doğarlar ve altındaki sap hücre ile birlikte konidiyumlu baş denen
tipik görünümüoluştururlar. Konidiyoforun uzunluğu; bölmeli, bölmesiz veya dallanmış
oluşu veduvarının düz, pürtüklü, dikenli olması gibi özellikleri türe göre farklıdır.
Konidiyumlar bir hücreli, duvarları düz veya pürüzlü, dikenli; şeffaf veya pigmentli
olabilirler (Kantarcıoğlu vd. 2003).
Aspergillus türleri doğada geniş bir bölgeye yayılmış olan saprofit mantarlardır ve
Aspergillosis’e (Solunum problemleri, Öksürük, Ateş, Baş Ağrıları, Göğüs ağrısı,
Tükenme ve düşük enerji) neden olabilir ayrıca bağışıklık sistemi zayıf olan kişilerde ve
14
akciğer rahastsızlğı olan kişilerde de zararlı olabilirler. ilgilidirler
(www.moldunit.com/aspergillus-mold.html, 2012). Aspergillus, ascomycetlerin eşeysiz
devresi gibidir. Aspergillus türleri dünyanın her yerinde yaygın olduğu halde ılık
iklimlerde daha yaygındırlar. Bu türler organik materyallerin üzerinde gelişirler. Birçok
türü kozmopolitandır. Kabul edilmiş 182 türü olmasına rağmen sadece 40 tanesi sık sık
tespit edilmiştir. Aspergillus türlerinin bir kaçının oldukça büyük etkileri vardır. A.
flavus güçlü bir karsinojenolan aflotoksinin başlıca üreticisidir. A. fumigatus hızla
yayılan aspergillozis hastalığına neden olduğundan önemlidir. Aspergillus fumigatus’un
küçük konidia demeti genellikle üst solunum yolunda birikmekte, küçük sporlar tek
başına aşağı solunum yollarına ulaşmaktadır (Burge, 1989; Kurup vd., 1993). A.
versicolor, A. fumigatus gibi inşaat malzemelerinin üzerinde yaygın olan birkaç tür, bazı
bölgelerde son baharda havada yaygın olarak bulunurlar (www.aiha.org).
Bu cins kısaca dik konidiyoforları, uçlarında vesikülleri ve vesiküllerin üzerinde bunları
kaplamış sterigmaları ile karakterize edilirler. Sterigmalar bir tabaka üzerinde gelişebilir
veya doğrudan doğruya vesiküllerden çıkabilirler, fiyalidlerden (sterigma) bazipetal
konidi zincirleri olşur. Vejetatif miselyum dallı ve bölmeli hiflerden oluşmuş renksiz,
parlak renkli veya birkaç türde kahverengimsi hale dönüşmektedir. Konidiyoforlar ayak
hücrelerinden gelişmektedir. Ayak hücreleri özelleşmiş, genişlemiş, kalın çeperli hif
hücreleridir. Konidiyoforlar bu hücrelerden dik olarak gelişirler. Aspergillus türleri
ılıman iklimlerde toprakta çok yaygın olarak bulunur.
Ayrıca kompostlarda, çürüyen bitki atıklarında, depolanmış tahıllarda v.s. de bol
miktarda bulunurlar. Koloni özelliklerinden, koloninin rengi, koloni altının rengi,
büyüme hızı, büyüme şekli, bazal miselyum, yüzey miselyumu, konidi başlarının nisbi
bolluğu ve düzenlenmesi, konidi başlarının şekli gibi kriterler önem arzeder (Raper ve
Fennell 1965, Özmay 2007).
15
Aspergillus niger Van. Tighem
Aspergillus niger, organik maddeler üzerinde aerobik koşullar altında gelişen flamentli
bir fungustur. Doğada toprak, çürüyen bitki materyalleri gibi organik yüzeylerden
gelişirler. Substrattan gelişen sporlar atmosfere dağılır ve bu sayede atmosferde de sık
rastlanılır. A. niger geniş bir sıcaklık aralığında gelişebilir (6-47°C) ancak optimum
sıcaklığı 35-37 °C gibi yüksek bir değerdir. Büyümeyi sınırlayan su aktivitesi diğer
Aspergillus türleri ile karşılaştırıldığında yüksek bir değerdir. (0,88). Ayrıca A. niger
1,4-9,8 gibi geniş bir pH aralığında gelişebilir. Bu özellikler ve hava ile dağılan
konidiosporların verimli üretimi bu türün sıcak ve nemli bölgelerde daha sı ve geniş bir
yayılım göstermesini sağlar (Schuster vd. 2002).
Aspergillus niger kolonileri Czapek agar besiyerinde yavaş gelişmekte ve 10 gün-2
haftada oda sıcaklığında 2,5-3 cm olmaktadır. Oldukça gevşek-kompakt beyaz-hafif sarı
bazal miselyum ve bol miktarda dik ve genellikle yığınlar halinde toplanmış konidi
yapıları bulunmaktadır. Tipik olarak karbon siyahına yakın siyah renkte veya bazen
koyu kahverengimsi siyah renkte, koloni yüzeyini dar bir kenar hariç tamamen
kaplamakta ve koloni altı genellikle renksizdir. Bazen merkezde soluk sarı, konidi
başları tipik olarak büyük ve siyah, özce globoz, daha sonra radiyat veya yaşlandığında
iki veya daha fazla gevşek iyi belirlenmiş sütun halinde yarılmaktadır.
Ayrıca A. niger Otomikoz (Kulakta görülen mantar enfeksiyonu), denen daha çok
tropikal ve subtropikal bölgelerde görülen kronik bir mantar enfeksiyonuna neden
olabilir (Ayberkin 2009).
Aspergillus flavipes Thom ve Church
Czapek agar besiyerinde koloniler oldukça yavaş gelişmektedir. 10 gün- haftada oda
sıcaklığında 3-5 cm olmaktadır. Nispeten derin bazal misellerden ve havai hiflerden bol
miktarda sporlanma olmaktadır. Deve tüyü- soluk fındık renginde, koloni yüzeyi beyaz
konidi başları veya ırklarında kahverengi konidiyoforların renginde, bazı ırklarda
özellikle yeni izole edilmiş olanlarda sıkı yünümsü sarı- portakal renkli hif kitleleri, çok
16
sayıda dallanma göstererek iç içe girmiş şekilde gelişmekte, kalın çeperli uzamış hif
elementlerinden ibarettir. Koloni altı genellikle sarı- kahverengi- kırmızı- kahverengi
tonlarındadır. Bazende oldukça koyu renkli, konidi başları gevşek şekilde kolumnar.
Bazı ırklarda kısa, bazı ırklarda ise radiyat olma eğilimi göstermektedir. Devamlı olarak
beyaz veya çok soluk deve tüyü renginde, sarı-kahverengi konidiyoforlar ile kontrast
oluşturmaktadır. 150-180 x 50-80 µm ölçülerindedir. Havai hiflerden gelişenler daha
incei konidiyoforlar genellikle 500-800 x 5.5-8.0 µm ölçülerinde, bazen daha küçük,
ancak yaşlı kolonilerin kenarlarında gelişenler 2-3 mm uzunlukta, çeper nisbeten kalın
1.0-1.5 µm, mikroskop altında sarı- açık kahverengi renkte, renkler daha çok çeperin dış
tabakasında toplanmıştır. Bunun dışında çeper düz veya hafif granüllü, vesiküller
subgloboz-vertikal olarak uzamış, genellikle açık renklidir. Büyük başlarda 18-25 µm
çapında, globoza çok yakın küçük başlarda ise konidiyoforların genellikle iki katı kadar
çapta, sterigma iki seridir. Bazı ırklarda renksizdir. Diğerlerinde hafif renklidir. Küçük
başlarda vesikülün üst kısmından gelişmektedir. Büyük başlarda ise vesikülü
kaplamaktadır. Birinci seri sterigma 5.5-7.5 x 2.5- 4.5 µm. İkinci seri ise 5-7 x 2.0-3.0
µm ölçülerindedir. Konidiler globoz-subgloboz, 2-3 µm çapındadır. Düz çeperli, renksiz
veya renksiz gibi hülle hücreleri geliştiğinde şişmiş ve genellikle düzensiz dallı hif
elementleri veya daha büyük ve kalın çeperli uzamış hücreler şeklindedir.
Askoma (kleisotesyumlar) sadece birkaç izolatta görülmektedir. Üç hafta içersinde hif
kitlelerinin arasından gelişmektedir. Çeper birkaç tabaka sarı ve ince çeperli hiflerden
oluşmuş, askuslar genellikle 4 sporlu, askosporlar subgloboz, belirsiz bir ekvator
olukları vardır. Düz çeperli şeffaf – soluk sarı, 6.4- 8.0 x 5.6-6.4 µm ölçülerindedir.
Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn
Czapek agar besiyerinde koloniler hızlı gelişmekte ve 10 günde oda sıcaklığında 5-6 cm
olmaktadır. Vejetatif miseller çoğunlukla batık ancak tipik olarak derin gevşek yapılı,
uzun saplı konidi yapıları yüzeyden gelişmekte önce beyaz, birçok ırkta soluk yeşilimsi
sarı, zeytin yeşili deve tüyüne yakın, zeytin yeşili-sarı veya sarımsı limon renkli, diğer
ırklarda sarımsı limon sarısına yakın-donuk limon sarısı, bazı ırklarda ise biraz yeşil
17
renk göstermekte ve hızla koyu zeytin yeşili-deve tüyü haline dönüşmektedir. Daha
sonra tipik olarak açık-donuk kahverengi tonlarına kaymakta, koloni altı renksiz, konidi
divergent veya gevşek şekilde yapışık konidi zincirlerinden oluşmaktadır. Nadiren
gerçek sütunlar oluşmakta, konidiyoforlar genellikle batık misellerden gelişmekte,
renksiz, tipik olarak uzun ve 4-5 mm, bazı ırklarda 2-5 mm’yi nadiren geçmekte,
tabandan itibaren 4-6 µ kalınlıktan yukarıya doğru genişleyerek vesikülün altında 12-25
µm olmaktadır. Çeper nispeten ince bazı ırklarda bütün çeper boyunca veya büyük bir
çoğunluğunda belirgin şekilde pürüzlü, diğer ırklarda hemen tamamen düz, sadece
terminal bölgede pürüzlük izleri farkedilmekte, vesiküller tipik olarak globoz, daha az
olarak şişe şeklinde, sterigmalar bütün yüzeyini veya üstten ¾ kısmını kaplamış,
genellikle ince çeperli ve kolayca deforme olmakta, 40-50 µm veya bazı ırklarda 60-75
µm çapında (uzun saplar üzerinde büyük başlarda), sterigma değişken, genellikle bir
seri, 12-15 x 3-5 µm ölçülerinde veya iki seri, birinci seri 8-12 x 4-5 µm, ikinci seri 8-10
x 3-3.5 µm ölçülerinde, her iki durum aynı ırkta ve hatta aynı konidi başında
görülmekte. Yaşlı yapılarda sterigmalar homojen şekilde şişmemiş, konidiler az veya
çok priform veya eliptikal, ve bazı ırklarda böyle kalmakta, diğer bazı ırklarda ise
olgunlaştığında genellikle subgloboz veya globoz olmakta, farklı ırklarda büyüklükleri
değişmekte, genellikle globoz veya subgloboz olduğunda 4.5 – 7.0 µm, eliptikal
olduğunda 8.0 bazen de 10.0 µm uzun eksenli, bazı ırklarda düz çeperli, diğerlerinde ise
az veya çok pürüzlü, gençken genellikle daha fazla ekinulat, genellikle yeşilimsi-
kahverengimsi sarı tonlarında, çok nadir olarak sklerosyum gelişmektedir.
2.2.1.4 Cladosporium Link ex Fries: Link
Cladosporium’ların çoğu saprofit veya bitki patojeni olan yaklaşık olarak 500 türden
oluşan bir cinstir. Bunların sadece 20 tanesi yaygındır. Cladosporium
sphaerosphermum, C. cladosporoioides ve C. herbarum en yaygın türlerdir. Hepsi
bitkiler, odun, odun tozu ve besinler üzerinde bulunur. Üç tür içinde C.
sphaerosphermum türü özellikle inşaat malzemeleri üzerinde bulunur. Diğer ikisi
yaprak yüzeylerinde bulunurlar. Haziran, Temmuz veya Ağustos aylarında pik yaparak
havada yüksek düzeylerde bulunurlar (metre küpte 10.000 spora ulaşabilirler)
18
(www.aiha.org). Koloniler oldukça yavaş gelişmektedir. Genellikle yeşilimsi-
kahverengi, siyahımsı-kahverengi, bol miktarda konidi geliştiğinde tozlu bir görünüm
almaktadır. Vejetatif hifler, konidiyoforlar ve konidiler aynı şekilde pigmentli,
konidiyoforlar vejetatif hiflerden az veya çok farklı, dik, düz veya dalgalı, dalsız veya
apikal olarak dallı, çok sayıda dallanmış konidi zinciri oluşturmaktadır. En alttaki
konidi en büyük ve bölmeli olup ramokonidi adını almakta, üstteki konidiler ise tek
hücreli, elipsoidal veya fusiform, konidiyoforlar ucunda bulunan 1-3 sayıda geniş
şekilde konik dentiküller üzerinde veya subapikal olarak bir bölmenin altından veya
daha önce gelişmiş konidilerin uçlarından Blastokonidiler gelişmekte, blastokonidiler
bir bölme ile ayrılmakta, bölme kalın çeperli ve koyu renkli, konakçı bitkilerde ve
invitro olaraközellikle amonyum sülfat bulunan besiyerlerinde stomatik yapılar
oluşmaktadır (Ellis 1971, Domsch ve ark, 1980, Von Arx, 1981, Barron 1983,). Dik,
pigmentli, ağaç benzeri blastospor zincirlerden oluşmuş dalları olan konidiyoforlar bu
cins için karakteristik bir özelliktir. Cinsin tanımı genellikle sadece konidiler ile
yapılabilir. Konidilerinde çok belirgin bağlantı kalıntıları görülmektedir (konidi
çıkıntıları), konidiler büyüklük ve bölmemelilik bakımından önemli değişim gösterir
Organik atıklar üzerinde yaygın olan bir cinstir. Aynı zamanda birçok konakçı üzerinde
yaşayan parazit birçok türü vardır (Barron 1983, Özmay 2007).
C. herbarum çok farklı antijen üretebilir ve yaklaşık olarak toplumun %10’u
Cladosporium’a duyarlıdır. Yaprak yüzeylerinde bulunan Cladosporium türleri
materyal toksisitesi gösteren metabolit üretimi yapmaz (www.aiha.org).
Cladosporium herbarum (Pers.) Link ex S.F. Gray
Bitki patojeni olan C. herbarum, toprakta çürümüş bitkiler üzerinde gelişebilirler. Tabii
ortamlarda ve kültürlerde koloniler yaygın, zeytin yeşili veya zeytinimsi kahverengi
renklerinde bulunur. Velvet, koloni altı malt ağar besiyerinde yeşilimsi siyah, stroma
bazen özellikle otsu gövdelerde iyi gelişmekte, konidiyoforlar düz veya dalgalı, bazen
genikulat, çoğunlukla nodoz, soluk-orta zeytinimsi kahverengi veya kahverengi düz
çeperli, 250 mikrona kadar uzunlukta, 3-6 mikron kalınlıkta, terminal veya interkalar
şişkinlikler varsa 7-9 mikron çapındadır. Konidiler oldukça uzun, genellikle dallanmış
19
zincirler halinde, elipsoidal veya oblong, uçlarda yuvarlak soluk- orta kahverengi veya
zeytinimsi kahverengi oldukça kalın çeperli, belirgin şekilde verrukuloz, uzun olmayan
siğilli, tamamiyle 0-1 bölmeli, bazen daha fazla bölmekler de oluşabilmektedir. 5-23x
3-8 (çoğunlukla 8-15x4-6) mikron bir ucunda veya iki ucunda çıkıntılı, çıkıntılar küçük
fakat açık şekilde dışarıya çıkmış, çok kozmopolit bir türdür. Özellikle ılıman zonlarda
yaygın, otsu ve odunsu bitkiler üzerinde, havadan, topraktan gıda maddelerinden tekstil
maddelerinden vs. izole edilmektedir (Ellis 1971).
Cladosporium herbarum ve Alternaria alternata türleri alerjiye neden olan
mikrofungusların başında gelmektedir. Şimdiye kadar tespit edilmiş alerjenlerin büyük
bir kısmı C. herbarum’un hücre içi proteinleridir (Breitenbach 2002).
Cladosporium obtectum Rabenh
Koloniler yaprakların altında, yaygın, soluk zeytinimsi kahverengi, ince, konidiyoforlar
dalgalı, genellikle dallı, çok soluk veya orta soluk kahverengi, düz çeperli, çok sayıda
belirgin ve koyu renkli çıkıntılı, 50 µm’a kadar uzunluktadır. Ancak genellikle daha
kısa, 3-7 µm kalınlıkta, konidiler zincir şeklinde, elipsoidal veya silindirik, 0-5 bölmeli,
soluk-orta kahverengi, düz veya verrukuloz, 8-34 x 5-8 µm, artemisia maritima
yaprakları üzerindedir (Ellis 1976).
2.2.1.5 Penicillium Link ex Gray
Penicillium, Ascomyceteslerin eşeysiz devresini gösterir ve Penicillium türleri dünyanın
her yerine dağılmış olduğu halde ılıman iklimlerde dahayaygındırlar. Bu türler organik
materyallerin üzerinde gelişirler. Doğada; hava, toprak ve bitkilerde yaygın şekilde
bulunduğu gözlenmiştir (Erbakan,1994). Birçok türü kozmopolitandır. Kabul edilen 225
türü var iken sadece 70’ine sık rastlanmıştır. Penicillium türlerinden bazılarının
ekonomik önemi vardır (www.aiha.org).
20
Katı besiyerinde hızlı ürerler. Çoğunlukla koloni yüzeyleri önceleri beyaz sonradan
mavi-yeşil ve tümü pudramsı bir görünüm alır. Kolonilerin tabanları genellikle
beyazdır. Septalı hifler, dallanan ve dallanmayan konidiyoforlar ve konidiyoforlarda
metula adı verilen ikinci dallanmalar görülür. Konidiyumların oluşturduğu ve dallanma
göstermeyen diziler veya zincirler bulunur. Tüm bu yapı ‘Penicillium’ veya fırça
görünümündedir (Erbakan 1994, www.aiha.org).
Hifler bölmeli, dar, genellikle 2-3 µm eninde, renksiz veya parlak renkli, düzensiz
dallanmakta ve yoğun ve kompakt miselyum oluşturmaktadır. Koloni kenarı genellikle
çok belirgin, konidiyoforlar farklılaşmamış yüzey altı veya havai hiflerden gelişmekte,
saplar nispeten dar ve ince çeperli, genellikle 1-2 bölmeli, bazı türlerde apikal olarak
şişkin, ancak vesiküller daima 10 µm’dan küçük çapta, karakteristik şekilde penisillat
dallanmış ve ‘penisillus’ denilen yapılar gelişmektedir. Bunlar genellikle terminal ve
doğrudan saplar üzerinde gelişmekte veya bir, iki ve daha fazla metula üzerinde
gelişmekte, fiyalidler terminal ve komptakt vertisiller halinde, nispeten kısa, nadiren 15
µm’ u geçmekte, ampuliform, çok nadir olarak silindiroidal, düz çeperli, uç kısmı
genellikle 3 µm’dan kısa ve daima düz, konidiler bazipetal olarak gelişmekte, genellikle
uzun zincirler halinde, tek hücreli, çok küçük, genellikle 2-4 µm çapında, nadiren 6
µm’u geçmekte, küresel, elipsoidal, priform veya apikulat, nadiren silindiroidal, kitle
halinde gri-yeşil, gri-mavi veya gri, nadir olarak zeytin veya kahverengidir (Pitt 1979,
Hasenekoğlu 1991).
Penicillium chrysogenum Thom
Eskiden Penicillium notatum bilinen Penicillium chrysogenum kolonileri tipik olarak
velvet az veya çok saplı sıkı yapıdadırlar. Konidiyoforlar substrattan bir ekin şeklinde
gelişmektedir. Bazı ırklarda koloniler az veya çok früktoz, bunlarda konidiyoforlar
havai hiflerden gelişmektedir. Genellikle radiyat şeklinde oluklu, eksudat genellkile bol
miktarda oluşur. Parlak sarı damlalar halinde, koloni altı gelellikle eksudatla aynı renkte
parlak sarı renkte, yaşlandığında ise kahverengiye döner. Yüksek su koşulları olan
ortamlarda iyi yetişir (Hasenekoğlu 1991, Ward vd. 2010).
21
2.2.1.6 Cylindrocladium Morgan
Vejetatif miselyum yünümsü, önce beyaz, yaşlandığında kahverengi olmaktadır. koloni
hızlı yayılmakta ve merkezde açık-koyu kahverengi, zincirler halinde çok sayıda
klamidospor ve mikrosklerezyum kümeleri oluşmaktadır. konidiyoforlar iyi gelişmiş ve
farklılaşmış dik veya die yakın, uç kısmına yakın defalarca dallanmakta ve penisillat bir
şekil oluşturmaktadır. konidiyoforların ekseni genellikle uzamakta ve ucu şişmiş bir
uzantı oluşturmakta, konidiler silindirik çok bölmeli, palizat benzeri bir küme
oluşmakta ve mukusla bir arada tutulmakta, simetrik olarak yuvarlak veya hemen
hemen tamamen turunkat uçları vardır (Hasenekoğlu 1991).
Cylindrocladium türlerinin büyük çoğunluğu bitki paraziti olup özellikle ılıman kuşakta
yaygındır.
Cylindrocladium floridanum Sobers ve Seymour
Konidiyofor dalları bir saptan lateral olarak gelişmektedir. primer ve sekonder dallar
bölmesiz veya bir bölmelidir. 10,2-26,0 µm uzunluğunda, tersiyer dallar bölmesiz, 7,8-
10,2 µm, fiyalidler şeffaf, 7,8-15,6 µm, konidiler şeffaf, silindirik, bir bölmeli, 36,4 –
57,2 x 2,6-4,6 µmsteril flamentlerin ucunda, globoz bir vezikül vardır. Ekseri izolatlarda
sekonder steril flamentler bulunmaktadır.
Dünyada tropik ve subtropik bölgelerde yaygın olmakla beraber, birçok bitki
çeşitlerinde patojendir.
22
3. MATERYAL VE YÖNTEM
Çalışmada 6 farklı mikrofungus cinsine ait 9 farklı tür kullanılmıştır. Kullanılan
mikrofungus örnekleri, daha önceden atmosferik ve toprak mikrofungus florası
çalışmalarında elde edilerek teşhis edilmiş ve kültüre alınmış örnekler içerisinden,
atmosferde sık rastlanan taksonlar arasından seçilmiştir.
Çalışma 6 aşamada gerçekleşmiştir.
1. Mikrofungusların üremesi için uygun besiyerlerinin hazırlanması.
2. Özütlenecek mikrofungusların üretilmesi.
3. Üretilen mikrofunguslardan protein özütlemesi.
4. Elde edilen özütlerin total protein miktarlarının belirlenmesi.
5. Elde edilen özütlerin SDS-Page yöntemi ile protein profillerinin belirlenmesi.
6. Protein profilleri belirlenen örneklerin elde edilen veriler kullanılarak MVSP
istatistik programında dendrogramlarının çizilmesi.
3.1 Örneklerin Temini
Çalışmada, daha önceden atmosferik ve toprak mikrofungus florası araştırmalarından
elde edilerek teşhis edilmiş ve kültüre alınmış örnekler kullanılmıştır. Çalışmada
kullanılan örnekler çizelge 5’de gösterilmiştir. Çalışılan örneklerin uzun süre
saklanması için steril şartlarda birer yedekleri yatık Malt extract agarlı tüplere inoküle
edimiştir (İmalı 2005).
23
Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan örnekler
Örnek adı Örneklerin Alındığı Üniversite ve Teşhis Eden
Acremonium kiliense Grütz (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Alternaria alternata Keisler β (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Aspergillus flavipes Bain ve Sartory (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Aspergillus niger Van. Tighem (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Aspergillus oryzae (Ahlburg) Cohn (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Cladosporium herbarum (Pers) Link ex. Gray
(Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Cladosporium obtectum Rabenh. (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Cylindrocladium floridanum Sobres ve Seymour
(Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
Penicillium chrysogenum Thom (Kilis 7 Aralık Üniversitesi, İmalı vd.
3.2 Örneklerin Çoğaltılması
3.2.1 Besiyerlerinin hazırlanması
Çalışma boyunca 3 farklı özellikte besiyeri kullanılmıştır. Kullanılan besiyerleri; Malt
extract agar (MEA), Malt extract broth ve Czapek - dox agar (CA)’dır. Besiyerlerinin
içeriği ve hazırlanması aşağıda belirtilmiştir.
Malt extact agar (MEA)
Distile Su 1000ml
Malt Extract 30 gr
Pepton 3gr
Agar agar 15 gr
Tartımı yapılan maddeler ve distile su 1000 mL.’lik erlene konulup, ısıtıcılı manyetik
24
karıştırıcı ile çözdürülür. Otoklavda 1.1 atmosfer basınç altında 121ºC’de 15 dakika
sterilize edilir.
Stok kültür için hazırlanacak olanlar ise ısıtıcılı manyetik karışıtırıcıda eritildikten sonra
15 ml falkon tüplere, içerisinde 10'ar ml besiyeri olacak şekilde dağıtıldıktan sonra
otoklavda sterilize edilir ve otoklavdan çıktıktan sonra tüpler yatırılarak dondurulur
(Rapp1974).
Malt extact broth (MEB)
Distile Su 1000ml
Malt Extract 17 gr
Dehidre besiyeri, 17,0 g/L olacak şekilde damıtık su içinde eritilir ve amaca uygun
kaplara (erlen, tüp vb.) dağıtıldıktan sonra, otoklavda 115ºC’de 10 dakika sterilize
edilir. Aşırı ısıtılmamalıdır. Hazırlanmış besiyeri berrak ve sarı renkli olup, 25°C’da
pH'sı 4,8±0,2’dir (Rapp1974).
Czapek - dox agar (CA)
Distile Su 1000ml
NaN03 3 gr
K2HP04 1 gr
MgS04 0,5 gr
KCl 0,5gr
FeS04 0,01 gr
Sukroz 30 gr
Agar agar 13 gr
25
Dehidre besiyeri, 48,0 g/L olacak şekilde ısıtılarak damıtık su içinde eritilir ve
otoklavda 121°C'da 15 dakika sterilize edilir. Otoklav sonrasında 45-50°C'a soğutulup,
sterilpetri kutularına 12,5'er mL dökülür. Hazırlanmış besiyeri bulanık ve beyazımsı
olup, 25°C'da pH'sı 7,3±0,2'dir (Czapek 1902, 1903).
3.2.2 Örneklerin üretilmesi
Protein ekstraksiyonu için örnekler steril koşullar altında önce hem katı hem de sıvı
Malt extract besiyerlerine ekilerek 7 gün 25°C de inkübasyona tabi tutulmuştur. Katı
besiyerinden örneklerin geri kazanım oranı, sıvı besiyerine oranla daha az ve zor olması
nedeniyle örnekler çalışma boyunca Malt extract broth besi yerlerinde inkübe edilmiştir.
Daha önceden hazırlanarak steril edilmiş içerisinde Malt extract broth (250 ml) bulunan
500ml’lik erlenlere bünzen bek alevi yanında ekim yapılmıştır. Ekim yapıldıktan sonra
erlenlerin ağızları steril pamuklarla kapatılıp etüvde (25°C sıcaklıkta), 7 gün süre ile
inkübasyona tabii tutulmuştur.
3.2.3 Örneklerin özütlenmesi
İnkübasyon sonrası üreyen mikrofungus örnekleri çeker ocak altında bek alevinin
yanında Whatman no. 1 filtre kâğıdı yardımıyla süzülmüştür. Elde edilen filtratlar, steril
filtre kâğıtlarıyla beraber alüminyum folyolara sarılarak 25°C’lik etüvde 24 saat süre ile
kurutulmuştur. Kurutulan örnekler daha sonra hassas terazide tartılmış ve 0,2M fosfat
tamponu (PBS) pH 7.5 ile içerisinde steril kum bulunan soğuk havanlarda öğütülerek
özütlenmiştir.
3.3 Protein Profil Çıkarılmasında Kullanılan Yöntemler
Ham özüt 15000g de 30dk santrifüjlenmiştir. Üst sıvı alınarak spektrofotometrede
(NanoDrop) total protein miktarları ölçülmüştür. Protein kaybı yaşanmaması ve
26
yapılarının bozulmaması için Sigma marka kokteyl proteaz inhibitörü kullanılmıştır.
Örneklerin protein profilleri sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi
yöntemine göre çıkarılmıştır.
3.3.1 Özütlenen örneklerin total miktarlarının belirlenmesi
Örnekler SDS-PAGE ile ayrılmadan önce, her kuyucuğa aynı miktar protein yüklemek
amacıyla total protein miktarları ölçülmüştür. Total protein miktarı ölçümü için,
NanoDrop 1000 Spectrofotometre cihazı kullanılmıştır. Protein miktarları ölçümünde
ilk olarak, kör örnek olarak özütleme sırasında tampon çözeltisi olarak kullanılan, pbs
kullanılmış, daha sonra her örnek için pipetle 2µl hacimde numune alınarak cihazda
okutma yapılmıştır. (http://www.mun.ca/biology/ dmarshall/ nd-1000-users-manual.pdf
2012).
3.3.2 Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)
Elekroforez, bir elektrik alanının etkisi altında yüklü bir partikülün göç etmesi olarak
tanımlanabilir. Aminoasitler, peptitler, proteinler, nükleotidler ve nükleik asitler gibi
biyolojik moleküller iyonize gruplar içerirler Bu sayede herhengi bir pH’da elektrikçe
yüklü katyonlar (+) veya anyonlar (-) olarak olarak bulunurlar. Bir elektrik alan etkisine
maruz bırakılan bu moleküller net yüklerine bağımlı olarak katoda veya anoda doğru
göç ederler. Bu moleküllerin elektriksel alanda göç hızları veya mobiliteleri; alanın
şiddetine, moleküllerin net yüküne, büyüklüğüne, şekillerine, viskozitesine vb. bağlıdır.
Elektroforezde, örnek bir destek matriksi üzerinde göç eder. Bu matriks, kağıt, selüloz,
aselat, nişasta, jel, agaroz veya poliakrilamid jeli olabilir (Zihnioğlu 1996, Balkan
2008).
Elektroforezde, örnek moleküller, belli bir protokole göre hazırlanmış agaroz ya da
poliakrilamid bir jel üzerine uygulanır. Jel burada durgun fazdır. Hareketli faz olarak
elektrik akımı kullanılır. Tampon çözeltiler elektrik akımının geçişini sağlarlar.
27
Elektroforezde, bazik pH’da çalışılarak, moleküllerin negatif yüklü (-) olması sağlanır.
bu sayede elektrik akımı verildiğinden moleküller pozitif kutba doğru göç ederler. Göç
sırasında jel, gözenekli yapısı (yapılacak işleme göre değişebilir) ile süzgeç gibi çalışır
ve ayrışmayı sağlar. Moleküllerin jelden çıkmasını önlemek için küçük molekül
ağırlığına negatif yüklü boya (brom fenol mavisi) kullanılır. Boya en önde gider ve jel
sonuna gelince elektrik akımı kesilir. Daha sonra protein bantları uygun boya ile
boyanarak görünür hale getirilir (Balkan 2008).
Elektroforezde büyük ve asimetrik moleküller yavaş, küçük moleküller ise, hızlı hareket
ederler. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) protein ve 1 akb’ın altındaki DNA
fragmentlerinin ayrımında kullanılabilen, bir dizi işlem içerir. Poliakrilamid jeller
akrilamid ve çapraz bağlayıcı bisakrilamidin kopolimerizasyonu ile hızlanır. Akrilamid
ve bis akrilamid yüzdeleri değiştirilerek amaca göre çeşitli por çaplarında jeller
hazırlanabilir. Jel yoğunluğu arttıkça, por çapı küçülür.
Proteinler, sodyum dodesilsülfat (SDS) ve bir tiol reaktifi (2- merkaptoetanol ya da
dithiothreitol=DDT) içeren ortamda ısıtılarak denatüre edildiklerinde, yaklaşık her iki
aminoasit için bir molekül SDS bağlar. Bağlanan SDS, proteinin negatif elektrik
yüklenmesine neden olur. Bu sayede proteinler elektrik akımı verildiğinde yalnız
molekül ağırlığına göre jelde hareket ederler. Molekül ağırlıkları bilinen standartlardan,
molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin molekül ağırlığı çeşitli programlar kullanılarak
hesaplanır. (Zihnioğlu 1996, Balkan 2008).
Özütleme
0,2 M Fosfat Buffered Saline (PBS)
Na2HPO4.12H20 2,75 gr
NaH2PO4.2H2O 8,32 gr
NaCl 9 gr
dH2O 997 ml
Hazırlanan çözeltinin pH’sı 6 N HCl kullanılarak 7,5 olarak ayarlanır.
28
Proteinlerin Jele Yüklenmesi ve Ayrılması
Stok Çözeltiler
A. %30’luk Akrilamid Çözeltisi
B. 1,5 M Tris Tamponu, pH 8,8
Tris 18,17 gr
SDS 0,4 gr
dH2O 100 ml
Hazırlanan çözeltinin pH’sı 6 N HCl çözeltisi ile 8,8’e ayarlanır.
C. 0,5 M Tris Tamponu, pH 6,8
Tris 6,06 gr
SDS 0,4 gr
dH2O 100 ml
Hazırlanan çözeltinin pH’sı 6 N HCl çözeltisi ile 6,8’e ayarlanır.
D. %10’luk Amonyum persülfat
Amonyum persülfat 0,1 gr
dH2O 1 ml
Bu çözelti kullanımdan hemen önce, taze olarak hazırlanır.
Akrilamid 29,2 gr
Bisakrilamid 0,8 gr
dH2O 100 ml
29
E. Örnek Uygulama Tamponu 2x
SDS %4
Tris 0,125 M
Gliserol % 20
2-merkaptoetanol %10
Bromofenol mavisi %0,2
Geri kalan hacim saf su ile tamamlanır.
F. Tank Tamponu 5x, pH 8,3
Tris 0,025 M
Glisin 0,192 M
SDS %0,1
G. Fiksatif
Metanol 500 ml
Asetik asit (glasiyel) 100 ml
dH2O 400 ml
H. Boyama Çözeltisi
Metanol 500 ml
Comassie Brillant Blue 1 gr
Asetik asit (glasiyel) 100 ml
dH2O 400 ml
Comassie Brillant Blue’nun iyice çözünmüş olması gerekir.
30
İ. Yıkama Çözeltisi
Metanol 120 ml
Asetik asit (glasiyel) 175 ml
dH2O 2200 ml
1 mm kalınlığında jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları Çizelge 1’de verilmiştir.
Çizelge 3.2.Jel hazırlamak için gerekli çözelti miktarları
Ayırma Jeli %12,5 Yığma Jeli %4,5
A Çözeltisi 7,5 ml 0,9 ml
B Çözeltisi 4,5 ml -
C Çözeltisi - 1,5 ml
D Çözeltisi 0,07 ml 0,018 ml
TEMED 0,01 ml 0,01 ml
Saf su 6 ml 3,6 ml
Jellerin Hazırlanması
Ayırma Jeli
Yukarıdaki tablodaki oranlara göre amonyum persülfat (D) çözeltisi hariç olmak üzere
diğer çözeltiler karıştırılır ve bir peristaltik pompa yardımıyla havası alınır. Daha sonra
içine amonyum persülfat çözeltisi eklendikten sonra hızlı bir şekilde jel dökme sistemi
üzerinde bulunan camlar arasına bir enjektör ya da pipet yardımıyla dökülür.
Polimerizasyon yüzeyini düzleştirmek amacıyla jelin üzerine suyla doymuş n-butanol
çözeltisi dökülür. Polimerizasyondan sonra ne butanol çözeltisi dökülür.
Yığma Jeli
Yine yukarıdaki tabloda yığma jeli sütunundaki çözeltiler D çözeltisi hariç karıştırılır ve
31
peristaltik bir pompa yardımıyla karışımın içerisinde bulunan hava uzaklaştırılır. Daha
sonra D çözeltisi ilave edildikten sonra cam plaklara arasına yerleştirilen uygun tarak
aparatının kenarından iki cam arasına akıtılır. Polimerizasyon işlemi tamamlandıktan
sonra bu tarak dikkatli bir biçimde çıkarılır. Jel dökme sisteminden çıkarılan camlar
dikey elektroforez tankına yerleştirilir ve tankın tampon hazneleri 5 kat seyreltilen tank
tamponu ile elektrotların üzerine kadar doldurulur.
Örneklerin Hazırlanması ve Jele Yüklenmesi
Özütleme sonrası elde edilen örnekler eşit miktarda protein içerecek şekilde örnek
tamponu (E) ile karıştırılır. Mikrosantrifüj tüpü içerisinde 5-10 dakika kaynatılan
örnekler tarakların çıkartıldığı yerlerdeki kuyucuklara yüklenir. Daha sonra uygun akım
verilerek proteinlerin jelde ayrımı sağlanır. Bu işlem örnek tamponu içerisinde yer alan
izleme boyası bromofenol mavisinin jelin alt ucuna 0,5 cm kalana dek devam edilir.
İşlem tamamlandıktan sonra tank güç kaynağından ayrılır. Cam plakalar dikkatli bir
şekilde birbirinden ayrılır ve jelin bir kenarı karışıklığı önlemek amacıyla kesilir.
Jellerin Comassie Brillant Blue ile Boyanması
Jel alkole ve aside dayanıklı plastik veya cam bir kapta, hacminin 3-5 katı fiksatif içinde
2 saat boyunca düşük hızda çalkalanır. Fiksatif dökülerek plastik kabın içerisine
boyama çözeltisi katıldı ve oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat çalkalanarak bekletilir. Daha
sonra boya çözeltisi uzaklaştırılarak 1-2 dakika fiksatifle çalkalanır. Fiksatif dökülür ve
2 saat yıkama çözeltisinde hafifçe çalkalanır.
Yeni bir yıkama çözeltisine alınan jel, zemindeki boya çıkıp bantlar belirgin hale gelene
dek bu işlem yıkama çözeltisi yenilenerek yapılır (Temizkan ve Arda 2007).
32
Elde Edilen Bantların Molekül Ağırlıklarının Hesaplanması
Yürütülen jeller daha sonra fotoğraflandıktan sonra Macromedia Flash programı
yardımıyla ölçülmüş ve rF değerleri belirlenmiştir. Elde edilen bu rF değerleri, bantların
molekül ağırlıklarının tahmin edilmesinde kullanılmıştır. Molekül ağırlıkları
hesaplanırken, elektroforez markerlarının rF değerlerine göre çizilen standart eğri
denklemi kullanılmıştır.
3.4 MVSP (MultiVariate Statistical Package)
MVSP (İngilizce açılmıyla: Multi Variate Statistical Package), araştırma geliştirme ve
dağıtım, veri madenciliği, metin analizi, istatistiksel analiz ve işbirliği ve dağıtım (toplu
ve otomatik skorlama hizmetler) için kullanılan bir bilgisayar programıdır.
MVSP bilimsel alanlarda çok değişkenli sayısal analizler yapan ucuz ve kullanımı kolay
bir programdır. Sağlık araştırmalarında, fen bilimlerinde, sosyal bilimlerde, pazar
araştırmalarında, anket şirketleri, hükümetler ve eğitim kurumları olmak üzere pek çok
kurum tarafından istatiksel analiz için kullanılan bir bilgisayar yazılımdır.
Kullanımı grafiksel bir kullanıcı arayüzüne bağlı olup, açılır menüler yardımıyla
kolaylaştırılmıştır. Ayrıca makro dilleri yardımıyla kullanıcı kendi amaçları
doğrultusunda programı yönlendirebilmektedir.
Bu program ile, mevcut veriler, t-testi, ANOVA, Korelasyon, Cluster (kümeleme)
analizi ve daha birçok istatistiki analizleri uygulayabilir, verileri grafiksel olarak ifade
edilebilmektedir. (www.kovcomp.co.uk. 2012)
Bu çalışmada MVSP programı kullanılarak jellerden skorlanan verilere göre, örneklerin
istatistiksel analizleri yapılmıştır.
33
4. BULGULAR
Tez çalışmasında, atmosferde sık rastlanan mikrofunguslar gerek yurt içi gerekse yurt
dışı çalışmalar da da araştırılmış, elde edilen verilerene göre tez de kullanılacak
funguslar belirlenmiştir. Belirlenen fungusların protein profilleri sodyum dodesil sülfat-
poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), yöntemi ile çıkarılmıştır.
MVSP programında ikili veri için benzerlik ölçüsüne (Jaccards katsayısına) göre
benzerlikler hesaplanmış ve UPGAMA kümeleme metodu kullanılarak dendrogramlar
çizilmiştir (Şekil 4.1).
Jaccard katsayısı����
�����������
f01 = farklı sınıfta aynı kümede bulunan obje çifti sayısı
f10 = aynı sınıfta farklı kümede bulunan obje çifti sayısı
f11 = aynı sınıfta ve kümede bulunan obje çifti sayısı
Çalışmada kullanılan örneklerin; sıvı besiyerinde görüntüsü, katı besiyerinde görüntüsü,
SDS-Page yöntemiyle elde edilen bant görüntüleri ve elde edilen bantların molekül
ağırlıklarının hesaplanırken, elektroforez markerlarının rF değerlerine göre çizilen
standart eğri denklemi her örnek için ayrı sayfada olmak üzere aşağıda verilmiştir.
34
A.
B.
Şekil 4.1 a. Çalışmada kullanılan örneklerin protein bant verilerine göre elde edilen dendrogram b. Çalışmada kullanılan örneklerin sistematik verilerine göre elde edilen dendrogram
UPGMA
Jaccard's Coefficient
Aspergillus niger
Alternaria alternata
Cladosporium herbarum
Penicillium chrysogenum
Aspergillus flavipes
Aspergillus oryzae
Cladosporium obtectum
Cylindrocladium floridanum
Acremonium kiliense
0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1
UPGMA
Jaccard's Coefficient
Penicillium chrysogenum
Aspergillus oryzae
Aspergillus flavipes
Aspergillus niger
Cladosporium herbarum
Cladosporium obtectum
Alternaria alternata
Cylindrocladium floridanum
Acremonium kiliense
0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1
35
Örneklerin; petride ve sıvı besiyerinde görüntüsü, kullanılan marker ile elde edilen
bantların görüntüleri;
Acremonium kiliense Grütz
A. B.
C. D.
Şekil 4.2 a. Acremonium kliense’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Acremonium kliense’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Acremonium kliense’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları. d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri
y = -1,4898x + 2,1659
R² = 0,9424
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
36
Acremonium kliense Grütz 1925, den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları;
209 kDa, 120 kDa, 85 kDa, 61 kDa, 52 kDa, 46 kDa, 43 kDa, 35 kDa, 32 kDa, 30 kDa,
29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 20 kDa ve 19 kDa’dur
(Şekil 4.2).
Ayrıca Acremonium kliense özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için
spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.3).
Şekil 4.3 Acremonium kliense total protein miktarı
Alternaria alternata
A.
C.
Şekil 4.4 a. Alternaria alternataalternata’nın sıvı besiyerinde görüntüsü Page yöntemiyle elde edilen protein bantları değerlerine karşı, Rf değerleri
37
Alternaria alternata Keisler β
B.
D.
Alternaria alternata’nın katı besiyerinde görüntüsü ’nın sıvı besiyerinde görüntüsü c. Alternaria alternata
Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri
’nın katı besiyerinde görüntüsü b. Alternaria Alternaria alternata’dan SDS-. Standart proteinlerin log MW
38
Alternaria alternata’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 160 kDa,
142 kDa, 132 kDa, 123 kDa, 116 kDa, 108 kDa, 103 kDa, 99 kDa, 92 kDa, 88 kDa, 84
kDa, 81 kDa, 72 kDa, 66 kDa, 64 kDa, 61 kDa, 56 kDa, 52 kDa, 50 kDa, 46 kDa, 44
kDa, 43 kDa, 41 kDa, 37 kDa, 34 kDa, 31 kDa, 26 kDa, 23 kDa, 14 kDa, 11 kDa,
9kDa’dur (Şekil 4.4).
Alternaria alternata, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için
spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.5).
Şekil 4.5 Alternaria alternata total protein miktarı
39
Aspergillus flavipes Bain ve Sartory
A. B.
C. D.
Şekil 4.6 a. Aspergillus flavipes’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus flavipes’in sıvı besiyerinde görüntüsü c.Aspergillus flavipes’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri
y = -1,4898x + 2,1659
R² = 0,9424
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
40
Aspergillus flavipes’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 218 kDa,
115 kDa, 81 kDa, 59 kDa, 46 kDa, 39 kDa, 35 kDa, 31 kDa, 29 kDa, 28 kDa, 26 kDa,
25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 19 kDa’dur (Şekil 4.6).
Aspergillus flavipes özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için
spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.7).
Şekil 4.7 Aspergillus flavipes total protein miktarı
Aspergillus niger Van. Tighem
A.
C.
Şekil 4.8 a. Aspergillus nigerbesiyerinde görüntüsü edilen protein bantları değerleri
41
an. Tighem
B.
D.
Aspergillus niger’in katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus niger ’in sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus niger’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf
. Aspergillus niger ’in sıvı Page yöntemiyle elde
. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf
42
Aspergillus niger, den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarnın molekül
ağılıkları; 103 kDa, 92 kDa, 89 kDa, 75 kDa, 64 kDa, 61 kDa, 47 kDa, 41 kDa, 24 kDa,
14 kDa’dur (Şekil 4.8).
Aspergillus niger Van. Tighem 1867, özütleme işleminden sonra protein miktarı
belirlenmek için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.9).
Şekil 4.9 Aspergillus niger total protein miktarı
43
Aspergillus oryzae (Ahlb.) E. Cohn
A. B.
C. D.
Şekil 4.10 a. Aspergillus oryzae’nin katı besiyerinde görüntüsü b. Aspergillus oryzae ’nin sıvı besiyerinde görüntüsü c. Aspergillus oryzae ’den SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri
y = -1,4898x + 2,1659
R² = 0,9424
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
44
Aspergillus oryzae’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının molekül
ağırlıkları; 234 kDa, 134 kDa, 97 kDa, 74 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 37 kDa, 32 kDa, 29
kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa ve 23 kDa dur (Şekil 4.10).
Aspergillus oryzae özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için
spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.11).
Şekil 4.11 Aspergillus oryzae total protein miktarı
Cladosporium herbarum
A.
C.
Şekil 4.12 a. Cladosporium herbarumherbarum’un sıvı besiyerinde görüntüsü SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantlarıMW değerlerine karşı, Rf değerleri
45
Cladosporium herbarum (Pers) Link ex. Gray
B.
D.
Cladosporium herbarum’un katı besiyerinde görüntüsü ’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium herbarum
Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri
’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium Cladosporium herbarum’dan
. Standart proteinlerin log
46
Cladosporium herbarum’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının
molekül ağırlıkları; 89 kDa, 85 kDa, 83 kDa, 82 kDa, 78 kDa, 73 kDa, 69 kDa, 62 kDa,
61 kDa, 55 kDa, 47 kDa, 44 kDa, 41 kDa, 36 kDa, 33 kDa, 31 kDa, 30 kDa, 28 kDa, 25
kDa, 23 kDa, 17 kDa, 14 kDa, 11 kDa, 10 kDa ve 9kDa’dur (Şekil 4.12).
Cladosporium herbarum özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için
spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.13).
Şekil 4.13 Cladosporium herbarum total protein miktarı
47
Cladosporium obtectum Rabenh.
A. B.
C. D.
Şekil 4.14 a. Cladosporium obtectum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cladosporium obtectum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cladosporium obtectum’un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri
y = -1,4898x + 2,1659
R² = 0,9424
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
48
Cladosporium obtectum’den SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantlarının
büyüklükleri; 246 kDa, 136 kDa, 89 kDa, 71 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 31 kDa, 28 kDa, 27
kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 22 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil 4.14).
Cladosporium obtectum, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için
spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.15).
Şekil 4.15 Cladosporium obtectum total protein miktarı
49
Cylindrocladium floridanum Sobers ve Seymour
A. B.
C. D.
Şekil 4.16 a. Cylindrocladium floridanum’un katı besiyerinde görüntüsü b. Cylindrocladium floridanum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Cylindrocladium floridanum’un SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değerleri
y = -1,4898x + 2,1659
R² = 0,9424
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,2 0,4 0,6 0,8
50
Cylindrocladium floridanum’dan SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 167
kDa, 95 kDa, 72 kDa, 47 kDa, 36 kDa, 31 kDa, 29 kDa, 28 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24
kDa, 23 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil 4.16).
Cylindrocladium floridanum, özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek
için spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.17).
Şekil 4.17 Cylindrocladium floridanum total protein miktarı
Penicillium chrysogenum
A.
C.
Şekil 4.18 a. Penicillium chrysogenumchrysogenum
SDS-Page yöntemiyle elde edilen protein bantlarıMW değerlerine karşı, Rf değer
51
llium chrysogenum Thom
B.
D.
Penicillium chrysogenum’un katı besiyerinde görüntüsü chrysogenum’un sıvı besiyerinde görüntüsü c. Penicillium chrysogenum
Page yöntemiyle elde edilen protein bantları d. Standart proteinlerin log MW değerlerine karşı, Rf değeri
’un katı besiyerinde görüntüsü b. Penicillium Penicillium chrysogenum’dan
. Standart proteinlerin log
52
Penicillium chrysogenum’dan SDS-Page yöntemi ile elde edilen protein bantları; 106
kDa, 100 kDa, 97 kDa, 89 kDa, 85 kDa, 82 kDa, 78 kDa, 75 kDa, 69 kDa, 67 kDa, 61
kDa, 57 kDa, 41 kDa, 33 kDa, 24 kDa, 20 kDa, 14 kDa, 12 kDa, 11 kDa ve 10 kDa’dur
(Şekil 4.18).
Penicillium chrysogenum özütleme işleminden sonra protein miktarı belirlenmek için
spektrofotometrede ölçüm yapılmıştır (Şekil 4.19).
Şekil 4.19 Penicillium chrysogenum total protein miktarı
53
5. TARTIŞMA VE SONUÇ
Son yıllarda hava da bulunan mantarların konsantrasyonlarındaki yükseliş ve bunlara
bağlı alerjilerdeki artış, ticari ve tarım amaçlı ürünlerin muhafazasında karşılaşılan
problemler günümüzde mikrofungus araştırmalarını önemli hale getirmiştir. Bu nedenle
özellikle aerobiyologların mikrofunguslara büyük ilgi göstermesine neden olmuştur. Bu
çalışmada da atmosferde sık rastlanan mikrofunguslara ait taksonların protein profilleri
belirlenmiştir.
Bu tez çalışmasında Acremonium kliense, örneğinden SDS-Page yöntemi ile 19 farklı
büyüklükte protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının molekül
ağırlıkları; 209 kDa, 120 kDa, 85 kDa, 61 kDa, 52 kDa, 46 kDa, 43 kDa, 35 kDa, 32
kDa, 30 kDa, 29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 20 kDa ve 19
kDa’dur (Şekil 4.2).
Acremonium kiliense’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine
göre Aspergillus niger ile aralarında 2 (46 kDa, 24 kDa), Aspergillus flavipes ile 9 (46
kDA, 35kDa, 29kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 19 kDa), Aspergillus
oryzae ile 4 (29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa), Alternaria alternata ile 5 (61 kDa, 52
kDa, 46 kDa, 43 kDa, 26 kDa), Cladosporium obtectum ile 6 (27 kDa, 26 kDa, 25 kDa,
24 kDa, 22 kDa, 21 kDa), Cladosporium herbarum ile 4 (85 kDa, 61 kDa, 30 kDa, 25
kDa), Cylindrocladium floridanum ile 6 (29 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 21 kDa, 20
kDa), Penicillium chrysogenum ile 4 (85 kDa, 61 kDa, 24 kDa, 20 kDa) ortak bantları
olduğu belirlenmiştir. Ayrıca yapılan araştırmalara göre literatürde Acremonium
kiliense’ye ait protein çalışmalarına rastlanmamıştır.
Acremonium kiliense’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 22 kDa,
26 kDa, 29 kDa, 32 kDa ve 46 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde
alerjen olarak tanımlanmış olan [Alt a 7 (22 kDa), Cla h 7 (22 kDa) YCP4 protein], [Alt
a 13 (26 kDa) Glutathion-S-transferaz], [Alt a 8 (29 kDa) Mannitol dehidrogenaz] ve
54
[Pen ch 18 (32 kDa) vakuolar serin proteaz] proteinlerden biri olma ihtimalini akla
getirmekte ve ileride Acremonium kiliense için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya
çıkmasında yarar sağlayacağı düşünülmektedir.
Çalışmada Aspergillus cinsine ait 3 farklı tür çalışılmıştır. Aspergillus flavipes
örneğinden SDS-Page yöntemi ile 17 farklı büyüklükte protein bandı elde edilmiştir.
Elde edilen protein bantları; 218 kDa, 115 kDa, 81 kDa, 59 kDa, 46 kDa, 39 kDa, 35
kDa, 31 kDa, 29 kDa, 28 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 22 kDa, 21 kDa, 19
kDa’dur (Şekil 4.6).
Aspergillus flavipes’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre
Acremonium kiliense ile aralarında 9 (46 kDA, 35kDa, 29kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa,
22 kDa, 21 kDa, 19 kDa), Aspergillus niger ile aralarında 4 (24 kDa, 40 kDa, 46 kDa,
59 kDa), Aspergillus oryzae ile 5 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 29 kDa, 40 kDa), Alternaria
alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 46 kDa,81 kDa), Cladosporium obtectum ile 7 (21 kDa,
22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa), Cladosporium herbarum ile 3 (23
kDa, 25 kDa, 28 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 7 (29 kDa, 28 kDa, 26 kDa, 25
kDa, 24 kDa, 23 kDa, 21 kDa), Penicillium chrysogenum ile 1 (24 kDa) ortak bantları
olduğu belirlenmiştir.
Aspergillus flavipes’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 22 kDa, 26
kDa, 28 kDa, 29 kDa ve 46 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen
olarak tanımlanmış olan [Alt a 7 (22 kDa), Cla h 7 (22 kDa) YCP4 protein], [Alt a 13
(26 kDa) Glutathion-S-transferaz], [Cla h 8 (28 kDa) Mannitol dehydrogenaz ], [Alt a 8
(29 kDa) Mannitol dehidrogenaz], ve [Cla h 6 (46 kDa) Enolaz] proteinlerden biri olma
ihtimalini akla getirmekte ve ileride Aspergillus flavipes için tanımlacak olan yeni
alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı düşünülmektedir.
Çalışmada kullanılan bir diğer Aspergillus örneği de Aspergillus niger’den SDS-Page
yöntemi ile 10 farklı büyüklükte protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein
55
bantlarının molekül ağırlıkları; 105 kDa, 92 kDa, 89 kDa, 75 kDa, 64 kDa, 61 kDa, 47
kDa, 41 kDa, 24 kDa, 14 kDa’dur (Şekil 4.8).
Aspergillus niger’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre
Acremonium kiliense ile aralarında 2 (46 kDa, 24 kDa), Aspergillus flavipes ile
aralarında 4 (24 kDa, 40 kDa, 46 kDa, 59 kDa), Aspergillus oryzae ile 3 (24 kDa, 40
kDa, 74 kDa), Alternaria alternata ile 5 (14 kDa, 46 kDa, 64 kDa, 92 kDa, 103 kDa),
Cladosporium obtectum ile 2 (24 kDa, 89 kDa), Cladosporium herbarum ile 2 (14 kDa,
89 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 1 (24 kDa), Penicillium chrysogenum ile 3 (14
kDa, 24 kDa, 89 kDa) ortak bantları olduğu belirlenmiştir.
Aspergillus niger için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar; Asp n 14 (105 kDa) Beta-
xylosidaz (Sander vd. 1998), Asp n 18 (34 kDa) Vakuolar serin proteaz (Shen vd.
1999), Asp n 25 (66-100 kDa) 3 fitaz B (Baur vd. 2002). Literatürde tanımlanmış
alerjen protein bantların bir kısmının bulanamaması ekstraksiyon işlemleri ve boyama
sırasında çevresel koşullardan kaynaklandığı düşünülmektedir. Ayrıca Aspergillus niger
besiyerinde siyah bir renk aldığı için protein ekstraksiyonu sırasında ve jel görüntüleme
sırasında büyük zorluklar yaşanmıştır.
Aspergillus niger’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 46 kDa olan
protein bandının bulunması, literatürde alerjen olarak tanımlanmış olan [Cla h 6 (46
kDa) Enolaz] proteini olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Aspergillus niger için
tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı düşünülmektedir.
Aspergillus cinsine ait 3. örnek olan Aspergillus oryzae’den SDS-page yöntemi ile 13
farklı büyüklükte protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının molekül
ağırlıkları; 234 kDa, 134 kDa, 97 kDa, 74 kDa, 50 kDa, 40 kDa, 37 kDa, 34 kDa, 29
kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa, 23 kDa’dur (Şekil 4.10).
56
Aspergillus oryzae için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar; Asp o 13 (34 kDa)
Alkalin serin proteaz (Shen HD vd. 1998), Asp o 21 (53 kDa) TAKA-amilaz A
(http://fermi.utmb.edu/cgi-bin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid=171, 2012). Bu
tezde literatürde tanımlanmış Asp o 13; alkaline serin proteaz (34 kDa) protein
bandı ekstraksiyon sonrası elde edilerek jel üzerinde görüntülenmiştir (Şekil 4.10).
Aspergillus oryzae’den elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre
Acremonium kiliense ile aralarında 4 (29 kDa, 27 kDa, 26 kDa, 24 kDa), Aspergillus
flavipes ile aralarında 5 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 29 kDa, 40 kDa), Aspergillus niger
ile 3 (24 kDa, 40 kDa, 74 kDa), Alternaria alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 34 kDa, 37
kDa), Cladosporium obtectum ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 27 kDa ), Cladosporium
herbarum ile 1 (23 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa,
29 kDa ), Penicillium chrysogenum ile 2 (24 kDa, 97 kDa) ortak bantları olduğu
belirlenmiştir.
Aspergillus oryzae’den elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 26 kDa ve
29 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen olarak tanımlanmış olan
[Alt a 13 (26 kDa) Glutathion-S-transferaz] ve [Alt a 8 (29 kDa) Mannitol
dehidrogenaz], proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Aspergillus
oryzae için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı
düşünülmektedir.
Saeednejad vd. (2010) İran atmosferinde rastlanan Aspergillus cinsine ait 3 fungus
türünün protein banlarının belirlenmesi için yaptıkları çalışmada Aspergillus
fumigatus, Aspergillus flavus ve Aspergillus niger örneklerini saboraud glucose
agar besiyerinde inkübe etmiş ve sonrasında SDS-page yöntemiyle protein
profillerini çıkarmışlardır. Aspergillus niger’den elde ettikleri 26 farklı protein
bantlarının büyüklüklerinin 11,5 kDa, 13,5 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 30
kDa, 34 kDa, 35 kDa, 36 kDa, 38 kDa, 40 kDa, 42 kDa, 47 kDa, 48 kDa, 50,5 kDa, 56,5
kDa, 63 kDa, 69 kDa, 74,5 kDa, 78,5 kDa, 83 kDa, 95 kDa, 101 kDa, 120 kDa, 178 kDa
olduğunu belirtmişlerdir.
57
Atmosferde sık rastlanan funguslardan ikinci olan Alternaria’dan, Alternaria
alternata türünden SDS-Page yöntemi ile 31 farklı protein bandı elde edilmiştir. Elde
edilen protein bantlarının molekül ağırlıkları; 160 kDa, 142 kDa, 132 kDa, 123 kDa,
116 kDa, 108 kDa, 103 kDa, 99 kDa, 92 kDa, 88 kDa, 84 kDa, 81 kDa, 72 kDa, 66 kDa,
64 kDa, 61 kDa, 57 kDa, 52 kDa, 50 kDa, 46 kDa, 45 kDa, 43 kDa, 41 kDa, 37 kDa, 34
kDa, 31 kDa, 26 kDa, 22 kDa, 14 kDa, 11 kDa ve 9kDa’dur (Şekil 4.4).
Alternaria alternata için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar; Alt a 5 (11 kDa)
Ribozomal protein P2 (Vouge vd. 1998), Alt a 12 (11 kDa) Asit ribozomal protein P1
(www.allergen.org 2012), Alt a 7 (22 kDa) YCP4 protein (Achatz 1995),Alt a 13 (26
kDa) Glutathion-S-transferaz (www.allergen.org 2012), Alt a 8 (29kDa) Mannitol
dehidrogenaz (Schneider 2006), Alt a 6 (45 kDa) Enolaz (Breitenbach 2002), Alt a 10
(53 kDa) Aldehit dehidrojenaz ve Alt a 4 (57 kDa) Disulfit izomeraz (Achatz 1995) dır.
Bu tezde Alternaria alternata’dan literatürde tanımlanmış 8 protein bandından 6 sı elde
edilerek jel üzerinde görüntülenmiştir (Şekil 4.4).
Alternaria alternata’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine göre
Acremonium kiliense ile aralarında 5 (61 kDa, 52 kDa, 46 kDa, 43 kDa, 26 kDa),
Aspergillus flavipes ile aralarında 4 (23 kDa, 26 kDa, 46 kDa,81 kDa), Aspergillus
oryzae ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 34 kDa, 37 kDa), Cladosporium obtectum ile 4 (23 kDa,
26 kDa, 31 kDa ), Cladosporium herbarum ile 7 (9 kDa, 11 kDa, 14 kDa, 23 kDa, 31
kDa, 41 kDa, 61 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 31 kDa, 72
kDa), Penicillium chrysogenum ile 4 (11 kDa, 14 kDa, 41 kDa, 61 kDa) ortak bantları
olduğu belirlenmiştir.
Alternaria alternata’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 34 kDa,
46 kDa ve 66 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen olarak
tanımlanmış olan [Asp n 18 (34 kDa) Vakuolar serin proteaz, Pen ch 13 (34 kDa) ve
Asp o 13 (34 kDa) Alkalin serin proteaz], [Cla h 6 (46 kDa) Enolaz] ve [Asp n 25
(66-100 kDa) 3 fitaz B], proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride
58
Alternaria alternata için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar
sağlayacağı düşünülmektedir.
Atomosferde sık rastlanan fungusların en başında gelen Cladosporium cinsinden 2
farklı tür çalışılmış, bunlardan Cladosporium herbarum’dan SDS-page yöntemi ile
25farklı protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının molekül ağırlıkları;
89 kDa, 85 kDa, 83 kDa, 82 kDa, 78 kDa, 73 kDa, 69 kDa, 62 kDa, 61 kDa, 55 kDa, 46
kDa, 45 kDa, 41 kDa, 36 kDa, 33 kDa, 31 kDa, 30 kDa, 28 kDa, 25 kDa, 22 kDa, 17
kDa, 14 kDa, 11 kDa, 10 kDa ve 9 kDa’dur (Şekil 4.12).
Cladosporium herbarum için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar: Cla h 2(45 kDa),
Cla h 5(11 kDa) Acid ribosomal protein P2 (Achatz 1995), Cla h 12 (11 kDa) Acid
ribosomal protein P1 (www.allergen.org, 2012), Cla h 7(22 kDa) YCP4 protein (Achatz
1995), Cla h 8 (28 kDa) Mannitol dehydrogenaz (Simon-Nobbe 2006). Cla h 6 (46 kDa)
Enolaz, Cla h 10 (53 kDa) Aldehit dehydrogenaz (Achatz 1995). Bu tezde
Cladosporium herbarum’dan literatürde tanımlanmış 7 protein bandından 4’ü elde
edilerek jel üzerinde görüntülenmiştir (Şekil 4.12).
Cladosporium herbarum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine
göre Acremonium kiliense ile aralarında 4 (85 kDa, 61 kDa, 30 kDa, 25 kDa),
Alternaria alternata ile 7 (9 kDa, 11 kDa, 14 kDa, 23 kDa, 31 kDa, 41 kDa, 61 kDa),
Aspergillus flavipes ile aralarında 3 (23 kDa, 25 kDa, 28 kDa), Aspergillus oryzae ile 1
(23 kDa), Cladosporium obtectum ile 9 (17 kDa, 23 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36
kDa, 45 kDa, 71 kDa, 89 kDa), Cylindrocladium floridanum ile 6 (23 kDa, 25 kDa, 28
kDa, 31 kDa, 36 kDa, 47 kDa), Penicillium chrysogenum ile 10 (10 kDa, 11 kDa, 14
kDa, 33 kDa, 41 kDa, 61 kDa, 78 kDa, 82 kDa, 85 kDa, 89 kDa) ortak bantları olduğu
belirlenmiştir.
Cladosporium herbarum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 36
kDa olan protein bandının bulunması, literatürde alerjen olarak tanımlanmış olan [Pen
59
ch 35 (36.5 kDa) Transaldolaz] proteini olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride
Cladosporium herbarum için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar
sağlayacağı düşünülmektedir.
Cladosporium cinsinin tezde kullanılan bir diğer türü Cladosporium obtectum’dan SDS-
page yöntemi ile 16 protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantlarının
molekül ağırlıkları; 246 kDa, 136 kDa, 89 kDa, 71 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 31 kDa, 28
kDa, 27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 22 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil
4.14).
Cladosporium obtectum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine
göre Acremonium kiliense ile aralarında 6 (27 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 22 kDa, 21
kDa), Alternaria alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 31 kDa ), Aspergillus flavipes ile
aralarında 7 (21 kDa, 22 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa), Aspergillus
oryzae ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 27 kDa ), Cladosporium herbarum ile 9 (17 kDa,
23 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa, 45 kDa, 71 kDa, 89 kDa), Cylindrocladium
floridanum ile 9 (21 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa,
167 kDa), Penicillium chrysogenum ile 2 (24 kDa, 89 kDa) ortak bantları olduğu
belirlenmiştir.
Cladosporium obtectum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 22
kDa, 26 kDa, 28 kDa, 36 kDa ve 45 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde
alerjen olarak tanımlanmış olan [Alt a 7 (22 kDa), Cla h 7 (22 kDa) YCP4 protein], [Alt
a 13 (26 kDa) Glutation-S-transferaz], [Cla h 8 (28 kDa) Mannitol dehidrojenaz], [Pen
ch 35 (36.5 kDa) Transaldolaz] ve [Alt a 6 (45 kDa) Enolaz ve Cla h 2(45 kDa)]
proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Cladosporium obtectum
için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı
düşünülmektedir.
60
Atmosferde rastlanan Cylindrocladium cinsine ait bir tür çalışılmıştır. Cylindrocladium
floridanum’dan SDS-Page yöntemi ile 14 protein bandı elde edilmiştir. Edilen protein
bantları; 167 kDa, 95 kDa, 72 kDa, 47 kDa, 36 kDa, 31 kDa, 29 kDa, 28 kDa, 26 kDa,
25 kDa, 24 kDa, 23 kDa, 21 kDa ve 20 kDa’dur (Şekil 4.16).
Cylindrocladium floridanum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler
büyükülüklerine göre Acremonium kiliense ile aralarında 6 (29 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24
kDa, 21 kDa, 20 kDa), Alternaria alternata ile 4 (23 kDa, 26 kDa, 31 kDa, 72 kDa),
Aspergillus flavipes ile aralarında 7 (29 kDa, 28 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa, 23 kDa,
21 kDa), Aspergillus oryzae ile 4 (23 kDa, 24 kDa, 26 kDa, 29 kDa ), Cladosporium
herbarum ile ile 6 (23 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa, 47 kDa), Cladosporium
obtectum ile 9 (21 kDa, 23 kDa, 24 kDa, 25 kDa, 26 kDa, 28 kDa, 31 kDa, 36 kDa, 167
kDa), Penicillium chrysogenum ile 2 (20 kDa, 24 kDa) ortak bantları olduğu
belirlenmiştir.
Cylindrocladium floridanum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü
26 kDa, 28 kDa, 29 kDa ve 36 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde
alerjen olarak tanımlanmış olan [Alt a 13 (26 kDa) Glutation-S-transferaz], [Cla h 8
(28 kDa) Mannitol dehyirojenaz], [Alt a 8 (29kDa) Mannitol dehidrojenaz] ve [Pen ch
35 (36.5 kDa) Transaldolaz] proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride
Cylindrocladium floridanum için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında
yarar sağlayacağı düşünülmektedir.
Atmosfer çalışmalarında sık rastlanan ve major alerjenlerden olan Penicillium cinsine
ait bir tür çalışılmıştır. Çalışılan tür; Penicillium chrysogenum’dan SDS-page yöntemi
ile 20 protein bandı elde edilmiştir. Elde edilen protein bantları; 106 kDa, 100 kDa, 97
kDa, 89 kDa, 85 kDa, 82 kDa, 78 kDa, 75 kDa, 68 kDa, 67 kDa, 61 kDa, 57 kDa, 41
kDa, 32 kDa, 24 kDa, 20 kDa, 14 kDa, 12 kDa, 11 kDa ve 10 kDa’dur (Şekil 4.18).
61
Penicillium chrysogenum için literatürde tanımlanmış alerjen bantlar: Pen ch 33 (16
kDa) Calreticulin (http://fermi.utmb.edu/cgibin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid=
1259, 2012), Pen ch 18 (32 kDa) vakuolar serin proteaz, Pen ch 13 (34 kDa) alkaline
serin proteaz (Shen vd. 1999), Pen ch 35 (36.5 kDa) Transaldolaz (www.allergen.org
2012) Pen ch 20 (68 kDa) N-acetil glukozaminidaz (Shen vd. 1995) Bu tezde
Penicillium chrysogenum’dan literatürde tanımlanmış 5 protein bandından 2’si elde
edilerek jel üzerinde görüntülenmiştir (Şekil 4.18).
Penicillium chrysogenum’dan elde edilen protein bantlarının moleküler büyükülüklerine
göre Acremonium kiliense ile aralarında 4 (85 kDa, 61 kDa, 24 kDa, 20 kDa)
Alternaria alternata ile 4 (11 kDa, 14 kDa, 41 kDa, 61 kDa), Aspergillus flavipes ile
aralarında 1 (24 kDa), Aspergillus oryzae ile 2 (24 kDa, 97 kDa), Cladosporium
herbarum ile ile 10 (10 kDa, 11 kDa, 14 kDa, 33 kDa, 41 kDa, 61 kDa, 78 kDa, 82 kDa,
85 kDa, 89 kDa), Cladosporium obtectum ile 2 (24 kDa, 89 kDa), Cylindrocladium
floridanum ile 2 (20 kDa, 24 kDa) ortak bantları olduğu belirlenmiştir.
Penicillium chrysogenum’dan elde edilen protein bantlarından molekül büyüklüğü 11
kDa, 57 kDa, ve 100 kDa olan protein bantlarının bulunması, literatürde alerjen olarak
tanımlanmış olan [Alt a 5 (11 kDa) Ribosomal protein P2 ve Cla h 5(11 kDa) Acid
ribosomal protein P2], [Alt a 4 (57 kDa) Disulfit isomeraz] ve [Asp n 25 (66-100 kDa)
3 fitaz B] ve proteinlerden biri olma ihtimalini akla getirmekte ve ileride Penicillium
chrysogenum için tanımlacak olan yeni alerjenlerin ortaya çıkmasında yarar sağlayacağı
düşünülmektedir.
Tüm örneklerin özütleme işleminden sonra, total protein miktarlarını belirlenmek için
spektrofotometrede ölçümleri yapılmıştır. Spektrofotometrede total protein miktarları
Acremonium kiliense’den 7.99 mg/ml, Alternaria alternata’dan 3.78 mg/ml, Aspergillus
niger’den 5.51 mg/ml, Aspergillus flavipes’den 26.17 mg/ml, Aspergillus oryzae’den
16.43 mg/ml, Cladosporium herbarum’dan 17.82 mg/ml, Cladosporium obtectum’dan
29.47 mg/ml, Cylindrocladium floridanum’dan 14.52 mg/ml ve Penicillium
chrysogenum’dan 24.71 mg/ml olarak ölçülmüştür (Şekil 5.1).
Şekil 5.1 Çalışmada kullanılan örneklerin özmiktarları
Özütleme işleminden sonra elde edilen verilere göre en yüksek total protein miktarının
Cladosporium obtectum (29.47 mg/ml) ve en düşük total protein miktarının ise
Alternaria alternata’dan (3.78 mg/ml) olduğu
Alternaria alternata’dan elde edilen total protein miktarının düşük olmasına rağmen
aeroalerjen fungusların en başında gelmesinin en büyük nedeninin, atmosferde çok
yaygın olarak bulunması ve diğer mikrofunguslara göre daha fazla farklı pr
sahip olması düşünülmektedir.
Çalışmada kullanılan örneklerden
büyüklükleri Laemmli (1970)’e göre
programı kullanılarak taksonlar arasında kümeleme analizi
0
5
10
15
20
25
30
To
tal
pro
tein
mik
tarı
(m
g/m
l)
62
Çalışmada kullanılan örneklerin özütleme işlemi sonucu total protein
Özütleme işleminden sonra elde edilen verilere göre en yüksek total protein miktarının
Cladosporium obtectum (29.47 mg/ml) ve en düşük total protein miktarının ise
Alternaria alternata’dan (3.78 mg/ml) olduğu belirlenmiştir.
Alternaria alternata’dan elde edilen total protein miktarının düşük olmasına rağmen
aeroalerjen fungusların en başında gelmesinin en büyük nedeninin, atmosferde çok
yaygın olarak bulunması ve diğer mikrofunguslara göre daha fazla farklı pr
sahip olması düşünülmektedir.
Çalışmada kullanılan örneklerden SDS-page sonucu elde edilen bantların, molekül
Laemmli (1970)’e göre hesaplanmış ve elde edilen veriler MVSP
programı kullanılarak taksonlar arasında kümeleme analizi yapılmıştır
ütleme işlemi sonucu total protein
Özütleme işleminden sonra elde edilen verilere göre en yüksek total protein miktarının
Cladosporium obtectum (29.47 mg/ml) ve en düşük total protein miktarının ise
Alternaria alternata’dan elde edilen total protein miktarının düşük olmasına rağmen
aeroalerjen fungusların en başında gelmesinin en büyük nedeninin, atmosferde çok
yaygın olarak bulunması ve diğer mikrofunguslara göre daha fazla farklı proteinlere
sonucu elde edilen bantların, molekül
hesaplanmış ve elde edilen veriler MVSP
yapılmıştır.
63
Elektroforez sonucu ayrılan protein bantlarının moleküler ağırlığı, elektroforez
markerları kullanılarak hesaplandıktan sonra, bantlar molekül ağırlığı ve pattern
özellikleri göz önüne alınarak eşleştirilmiştir. Daha sonra farklı olarak belirlenen her
bant için örnekler “1” ve “0” olarak skorlanmıştır. Elde edilen tablo uzaklık
hesaplanması için kullanılmıştır. Uzaklık hesaplanması için ikili (binary) veriler için en
çok kullanılan yöntemlerden biri olan Jaccards'ın katsayısı göz önünde tutulmuştur. Son
aşamada ise MVSP istatistik programı kullanılarak elde edilen matriksin kümeleme
analizi UPGMA (Ağırlıklı Olmayan Çiftleştirilmiş Grup Metodu Aritmetik Ortalaması)
yöntemine göre yapılarak dendrogram hazırlanmıştır (Şekil 4.1 a).
Ayrıca yapılan çalışmayı karşıllaştırmak amacıyla örneklerin taksonomik
sınıflandırmasına da aynı metod uygulanmış ve elde edilen veriler ile de dendrogram
hazırlanmıştır (Şekil 4.1 b).
Dendrogramlar karşılaştırıldığında protein profilleri verilerine göre hazırlanan
dendrogramın Aspergillus flavipes ile Aspergillus oryzae arasındaki beklenen sonucu
verdiği ancak aynı cins üyelerinden Aspergillus niger’in beklenenden uzak olduğu
görülmektedir. Bunun sebebinin ise Aspergillus niger’den diğer türlere nazaran protein
eldesinin çok daha zor olduğu, özellikle jel üzerinde koyu bir görüntü oluşturması
nedeniyle protein bantlarının yeterince elde edilemediği düşünülmektedir.
Ancak majör alerjen taksonların bir kümelenme oluşturmasında, bu türlerin arasındaki
ortak proteinlerin diğerlerine oranla daha fazla olması ve muhtemel ortak alerjenlerin
etkisinin olduğu düşünülmektedir.
Bu çalışmadan elde edilen verilerin, ileride yapılması muhtemel olan yeni alerjenlerin
tanımlanmasında, taksonlar arsında ortak alerjenlerin tanımlanmasında ve bu
taksonların atmosferdeki yoğunluklarının atmosferde olası alerjen protein miktarlarının
hesaplanmasında yararlı olacağı düşünülmektedir.
64
KAYNAKLAR
Anonymous. 2012 http://www.allergen.org/. Erişim Tarihi: 10.07.2012
Anonymous. 2012 http://www.aiha.org/governmentaffairs-pr/htm1/mold-glossary.htm. Erişim Tarihi: 11.07.2012
Anonymous.2012 http://fermi.utmb.edu/cgibin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid= 1259 . Erişim Tarihi: 09.08.2012
Anonymous. 2012 http://fermi.utmb.edu/cgi bin/SDAP/sdap_02?dB_Type=0&allid= 171. Erişim Tarihi: 09.08.2012
Anonymous. 2012 http://www.kovcomp.co.uk/mvsp/mvsp3fea.html Erişim Tarihi: 14.08.2012
Anonymous. 2012 http://www.moldunit.com/acremonium.html Erişim Tarihi: 14.08.2012
Anonymous. 2012 http://www.mun.ca/biology/ dmarshall/ nd-1000-users-manual.pdf Erişim Tarihi: 23.08.2012
Achatz, G., Oberkofler, H., Lechenauer, E., Simon, B., Unger, A., Kandler, D., Ebner, C., Prillinger, H., Kraft, D. and Breitenbach, M., 1995. Molecular cloning of majör and minor allergens of Alternaria alternata and Cladosporium herbarum. Mol Immunol, Vol. 32(3); pp.213–227.
Alexopoulos, C.J. and Mims, C.W. 1979. Intro-ductory mycology. John Wiley and Sons, 632p., NewYork.
Al-Swaini, A.S., Hasnain, S.M. and Bahkali, A.H. 1999. Viable airborne fungi in Riyadh, Saudi Arabia, Aerobiologia, Vol. (15); pp.121-130
Al-Subai, A., 2002. Air-borne fungi at Doha, Qatar. Aerobiologia,Vol. 18(3-4); pp.175-183
Ayberkin, E. ve Çiftçi, E. 2009. Çocuklarda Aspergillus Enfeksiyonları. Çocuk Enfeksiyonları Dergisi, Vol.3(3);pp.118-25
Balkan, B. 2008. Katı Substrat Fermentasyonu ile Ham Nişastayı Parçalayan Yeni Bir Fungal Amilaz Üretimi Saflaştırılması ve Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi. Trakya Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 77 s. Edirne.
Barron, G.L. 1983. The genera of Hyphomycetes from soil. Robert E. Krieger Pubishin Company, 364 p., Malabar, Florida.
Başbülbül, Özdemir, G., Bıyık, H., Kalyoncu, F., Kalmış, E. ve Oryaşın, E. 2011. Aydın, İzmir ve Manisa illerinde Endüstriyel Atıksular ile Kirlenmiş Toprakların Mikrofungus Florasının Belirlenmesi. Ekoloji, Cilt 20(80); s.66-73.
Baur, X., Melching-Kollmuss, S., Koops, F., Strassburger, K. and Zober, A. 2002. IgE
mediated allergy to phytase -- a new animal feed additive. Allergy, Vol. 57(10);pp.943-5
Bavbek, S., Erkekol, F.Ö., Çeter, T., Mungan, D., Özer, F., Pınar, N.M ve Mısırlıgil, Z. 2006. Sensitization to Alternaria and Cladosporium in patients with respiratory allergy and outdoor counts of mold spores in Ankara atmosphere. Turkey Journal of Asthma, Vol.43(6);pp.421-6.
65
Benndorf, D., Muller, A., Bock, K., Manuwald, O., Herbarth, O., Vonbergen, M. 2008. Identification of spore allergens from the indoor mould Aspergillus versicolor. Allergy Vol.63(4);pp.454-60.
Blackwell, M., Vilgalys, R., James, T.Y. ve Taylor, J.W. 2009. Fungi. Eumycota: mushrooms, sac fungi, yeast, molds, rusts, smuts, etc. Tree of Life Web Project. Retrieved, http://tolweb.org/Fungi/2377.
Breitenbach, M., Simon-Nobbe, B. 2002. The Allergens of Cladosporium herbarum and Alternaria alternata. Chem Immunol, (81);pp.48–72
Chazalet, V., Debeaupuıs, J. P., Sarfatı, J., Lortholary, J., Rıbaud, P., Shah, P., Cornet, M., Vu Thien, H., Gluckman, E., Brücker, G. and Latgé, JP. 1998. Molecular typing of environmental and patient isolates of Aspergillus fumigatus from various hospital settings. J Clin Microbiology, Vol.36(6);pp.1494-500.
Czapek, F. 1902-1903. Untersuchungen über die Stickstoffgewinnung und Eiweiß bildung der Pflanzen Beitr. Chem. Physiol. u. Pahtol, Vol.(1); pp.540-560, Vol.(3); pp.47-66.
Çeter, T., Alan, Ş., Pınar, N.M. and Altıntaş, D.U., Airborne spore concentration in Adana Turkey, 2004. 2006. The 8th International Congress on Aerobiology, p.211, Neuchatel, Switzerland.
Çeter,T. 2004. Ankara havasında bulunan fungus sporlarının cinsleri ve bunların meteorolojik faktörlerle değişimi (2003-2004). Yüksek lisans tezi. Ankara Üniversitesi, 134 s., Ankara.
Çeter, T. 2008. Kastamonu ili (Merkez) atmosferi polen ve sporları ve bunların meteorolojik faktörlerle değişimi Ocak 2006-Aralık 2007. Doktora tezi. Ankara Üniversitesi, 279 s., Ankara.
Çeter, T. ve Pınar, N.M. 2009 a. Ankara atmosferi mantar sporları konsantrasyonu ve meteorolojik faktörlerin etkisi (2003 Yılı). Mikrobiyoloji Bülteni, Cilt (43); s.627-638.
Çeter, T. ve Pınar, N.M. 2009 b. Türkiye’de yapılan atmosferik fungus spor çalışmaları ve kullanılan yöntemler. Asthma Allergy Immunol, (7);3-10.
De Vouge, M.W., Thaker, A.J., Zhang, L., Muradia, G., Rode, H. and Vijay, H.M. 1998. Molecular cloning of IgE-binding fragments of Alternaria alternata allergens. Int Arch Allergy Immunol, (116); pp.261–268
Domsch, K.H., Gams, W. and Anderson, T.H., 1980. Compendium of soil fungi. Academic press., 377s., London.
El-Kazzaz, M.K., El-Fadly, G.B., Hassan, M.A.A., and El-Kot, G.A.N. 2008. Identification of some Fusarium spp. using molecular biology techniques. Egypt journal of phytopathology, Vol. 36(1-2); pp.57-69
Ellis, M.B., 1971. Dematiaceous Hyphomycetes. Comman Wealth Mycological Institue, 608p., UK.
Erbakan, N., 1994. Saprofit mantarlar ve hastalıkları. Grafik Sanatlar ve Matbaacılık A. Ş., 241s., Ankara.
Erkan, M.L., Çeter, T., Atıcı, A.G., Özkaya, Ş., Alan, Ş., Tuna, S. ve Pınar, N.M. 2006. Samsun ilinin polen ve spor takvimi. XIV. Ulusal Allerji ve Klinik İmmünoloji Kongresi, Side, Antalya. .
66
Gelişken, R. 2008. Adana’daki Ev İçi Mantarlardan Protein Ekstraktlarının Hazırlanması ve Alerjik Taramada Yararlanılan Deri Testinde Kullanılabilirliği. Yüksek Lisans tezi. ÇukurovaÜniversitesi, 103 s., Adana.
Gupta, R., Sing, B.P., Sridhara, S., Kumar, R. and Arora, N. 2002. Identification of cros reactive proteins amongst different Curvularia species. Internatianol Archives of Allergy and Immunlogy, Vol. 127(1); pp.38 -46
Hasenekoğlu, İ., 1991. Toprak Mikrofungusları. Atatürk Üniversitesi Yayınları, 7 Cilt Erzurum.
Hibbett, D.S., Binder, M., Bischoff, J.F., Blackwell, M., Cannon, P.F., Eriksson, O.E., Huhndorf, S., James, T., Kirk, P.M., Lücking, R., Lumbsch, H.T., Lutzoni, F., Matheny, P.B., Mclaughlin, D.J., Powell, M.J., Redhead, S., Schoch, C.L., Spatafora, J.W., Stalpers, J.A., Vilgalys, R., Aime, M.C., Aptroot, A., Bauer, R., Begerow, D., Benny, G.L., Castlebury, L.A., Crous, P.W., Dai, Y.-C., Gams, W., Geiser, D.M., Griffith, G.W., Gueidan, C., Hawksworth, D.L., Hestmark, G., Hosaka, K., Humber, R.A., Hyde, K.D., Ironside, J.E., Kõljalg, U., Kurtzman, C.P., Larsson, K.-H., Lichtwardt, R., Longcore, J., Miadlikowska, J., Miller, A., Moncalvo, J.-M., MozleyStandridge, S., Oberwinkler, F., Parmasto, E., Reeb, V., Rogers, J.D., Roux, C., Ryvarden, L., Sampaio, J.P., Schüßler, A., Sugiyama, J., Thorn, R.G., Tibell, L., Untereiner, W.A., Walker, C., Wang, Z., Weir, A., Weiss, M., White, M.M., Winka, K., Yao, Y.-J. and Zhang, N. 2007 A higher-level phylogenetic classification of the Fungi. Mycology Research Vol. (111) ; pp.509-547.
Hosphental, D. R., Kwon-Chuang, K. J. and Bennett, J. E., 1998. ConcentratIons of airborne Aspergillus compared to the Incidence of İnvazive Aspergillosiss:lack of Correlation. Med Mycol, Vol.(36); pp.165–168.
İmalı, A., Koçak, M. ve Yalçınkaya, B. 2008. Çorum ili atmosferinde hava ile taşınan alerjen funguslar. 19. Ulusal Biyoloji Kongresi, p.318, Trabzon.
İmalı, A., 2005. Van (Merkez İlçe) Atmosferindeki Fungus Florası ve Mevsimsel Dağılımı. YYÜ Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora tezi, 120s., Van.
İnal, A., Karakoç, G.B., Altıntaş, D.U., Pınar, M., Çeter, T.,Yılmaz, M. and Kendirli, S.G. 2008. Effect of outdoor fungus concentrations on symptom severity of children with asthma and/or rhinitis monosensitized to molds. Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology, Vol. 26(1);pp.11-7.
Kantarcıoğlu, A. S. ve Yücel, A., 2003. Aspergillus cinsi mantarlar ve İnvazıv aspergilloz: mikoloji, patogenez, laboratuar tanımı, antifungallere direnç ve duyarlılık deneyleri. Cerrahpaşa Tıp Dergisi, Vol. (34); pp.140–157.
Kılıç, M., Altıntaş, D.U., Güneşer, Kendirli, S., Yılmaz, M., Bingöl, Karakoç ve G., İnal, A. 2008. Çocukluk Çağı Astımında İnhalan Allerjenlerin Cinsi ile Astım Şiddeti ve Prognozu Arasındaki İlişki. Astım Allerji İmmünoloji, Vol. 6(2);pp.66-73.
Kılıçoğlu, M. ve Özkoç, İ., 2008. Fungal sistematikteki moleküler gelişmeler. Anadolu Journal of Agricultural Sciences, p. 65-72.
U. K. Laemmli (1970). Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature Vol. 227;pp. 680 – 685.
67
Li, L., Li, Q., Liu, Z. and Wu, H. 2008. Immunological analysis and mass spectrometry identification of the major allergen from Cladosporium cladosporioides. Wei Sheng Yan Jiu (Journal of hygiene research), Vol. 37(1);pp.50-2.
Özmay, Aka, Y., 2007. Adana’daki ev dışı (outdoor) fungusların izolasyonu, identifikasyonu, mevsimsel dağılımı ve alerjik hastalıklarla ilişkilendirilmesi, Yüksek Lisans tezi. Çukurova Üniversitesi, 88 s., Adana.
Ökten, S.S. ve Asan, A. 2009. Hastane iç ortam havasının mikrobiyal açıdan incelenmesinin önemi. XI. Ulusal Tesisat Mühendisliği Kongresi, s.717-723, TESKON, İzmir.
Pastorino, A.C., Menezes, U.P., Marques, H.H.S., Vallada, M.G., Cappellozi, V.L., Carnide, E.M.G. and Jacob, C.M.A. 2005. Acremonium kiliense infection in a child with chronic granulomatous disease. Braz J. Infect Dis, Vol.(9);pp.529 534.
Pitt, J.I. and Hocking, A.D., 2009. Fungi and food spoilage. Third Edition. Springer, 519p., Australia.
Rao, R.P., 1965. The fungus genus Alternaria in Bombay-Maharashtra I. And II. Sydowia Vol. (18); pp.44-64, 65-85.
Raper, K.B., fennell, D.I., 1965. The genus Aspergillus. The Williams & Wilkins Comp. 686 pp., USA,
Rapp, M. 1974. Indikatorzusätze zur Keimdifferenzierung auf Würze- und Malzextrakt Agar. Milchwiss., Vol. (29);pp.341-344
Saeednejad, L., Sabokbar, A., Khosravi, A., Bayat, M. and Bakhtiari, A. 2010. Determining Protein Patterns for Three Fungus Species Aspergillus fumigatus, Asp. flavus and Asp. niger, Obtained from Outdoor Air in Iran. Global Veterinaria,Vol. 4(2); pp.130-134.
Sakiyan, N. ve Inceoğlu, Ö. 2003. Atmospheric concentrations of Cladosporium Link and Alternaria Nées spores in Ankara and the effects of meteorological factors. Turk J Bot, Cilt.(27);s.77-81.
Sander, I., Raulf-Heimsoth, M., Siethoff, C., Lohaus, C., Meyer, H.E. and Baur, X. 1998. Allergy to Aspergillus-derived enzymes in the baking industry: identification of beta xylosidase from Aspergillus niger as a new allergen (Asp n 14). J Allergy Clin Immunology, Vol. 102(2):pp.256-64.
Schneider, P.B., Denk, U., Breitenbach, M., Richter, K., Schmid-Grendelmeier, P., Nobbe, S., Himly, M., Mari, A., Ebner, C. and Simon-Nobbe, B. 2006. Alternaria alternata NADP dependent mannitol dehydrogenase is an important fungal allergen. Clin Exp Allergy, Vol. (36);pp.1513–1524.
Schuster, E., Coleman, N. D., Frısvad, J. C. and Dıjck, P.W.M., 2002. On The Safety of Aspergillus niger-A Review. Appl. Microbiol. Biotechnol. Vol.(59);pp.426–435.
Sen, B., Asan, A. 2001. Airborne fungi in vegetable growing areas of Edirne, Turkey. Aerobiologia, (17); 69-75.
Shen, H.D., Liaw, S.F., Lin, W.L., Ro, L.H., Yang, H.L. and Han, S.H. 1995. Molecular cloning of cDNA coding for the 68 kDa allergen of Penicillium notatum using MoAbs. Clin Exp Allergy, Vol.(25);pp.350–356.
Shen, H.D., Lin, W.L.,Tam, M.F., Wang, S.R., Tzean, S.S., Huang, M.H. and Han, S.H. 1999. Characterization of allergens from Penicillium oxalicum and P. Notatum
68
by immunoblotting and N-terminal amino acid sequence analysis. Clin Exp Allergy, Vol.(29);pp.642–651.
Shen, H.D., Tam, M.F., Chou, H. and Han, S.H. 1999. The importance of serine proteinases as aeroallergens associated with asthma.Int Arch Allergy Immunology, Vol.119(4);pp.259-64.
Simon-Nobbe, B., Denk, U., Schneider, P.B., Radauer, C., Teige, M., Crameri, R., Hawranek, T., Lang, R., Richter, K., Schmid-Grendelmeier, P., Nobbe, S., Hartl, A. and Breitenbach, M. 2006. NADP-dependent mannitol dehydrogenase, a major allergen of Cladosporium herbarum. J Biol Chemistry, Vol. (281): pp.16354-16360.
Temizkan, G. ve Arda, N. 2004. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler. Nobel tıp kitabevleri, 345s., İstanbul.
Von, J.A. 1981. The genera of fungi sporulating in pure culture. 3rd Ed. J. Cramer. 424p., Vaduz.
Ward, M.D.W., Chung, Y.J., Copeland, L.B. and Doerfler, D.L. 2010. A comparison of the allergic responses induced by Penicillium chrysogenum and house dust mite extracts in a mouse model. Indoor Air, Vol. (20); pp.380–391.
Wuethrich, B. 1989. Epidemiology of allergic diseases: Are they really on the increase. Int. Arch. Allergy Appl. Immunology, Vol.(90); pp.3-10.
Zihnioğlu, F. 1996. Protein saflaştırması ve karakterizasyonu elektroforetik yöntemler, Biyokimya lisansüstü yaz okulu 150s., Çeşme, İzmir.
69
ÖZGEÇMİŞ
ADI/SOYADI : Burhanettin YALÇINKAYA
Doğum Yeri : Muş
Doğum Tarihi : 25Ocak 1986
Medeni Hali : Evli
Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lise :Gemlik Celal Bayar Anadolu Lisesi, 2003
Lisans :Gazi Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, 2004-2008
Çalıştığı Kurumlar ve Yıl
TÜBİTAK – Ulusal Metroloji Enstitüsü (UME) 2011 –
MEB-Sakarya İl Milli Eğitim Müdürlüğü 2010-2011