Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD
OFICINA REGIONAL PARA EUROPA
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de
Alimentos
Sesión nº 12
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA
F. Eyquem
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 2
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Índice
Sesión nº 12
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA
Introducción 3
La técnica ELISA 8
Práctica 12
Diagrama de flujo 21
Bibliografía 22
Bibliografía complementaria 22
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 3
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Introducción
La detección inmunológica específica de una proteína nueva sintetizada por un gen
introducido durante la transformación constituye un método alternativo de
identificación de plantas modificadas genéticamente. Hay que tener presente, no
obstante, que la modificación genética no siempre tiene por finalidad específica la
producción de una proteína nueva y no siempre se traduce en unos niveles de
expresión de la proteína útiles para la detección. Además, algunas proteínas se
expresan solo en determinadas partes de la planta (están utilizándose ya promotores
con especificidad tisular para fines concretos) o se expresan a niveles diferentes en
partes distintas o durante fases distintas del desarrollo fisiológico.
Se ha comunicado que los niveles de expresión de los productos transgénicos en las
plantas se sitúan entre el 0 y el 2 % de la proteína soluble total, incluso con
utilización de potentes promotores constitutivos para activar la expresión (Longstaff,
1995). En la mayor parte de los casos, no obstante, los niveles de expresión
comunicados (p. ej., en cultivos GM aprobados) se sitúan por debajo del límite
superior del 2 % (Hemmer, 1997).
Los inmunoensayos son sistemas de medición analítica que utilizan anticuerpos
como reactivos de ensayo. Los anticuerpos son proteínas específicas aisladas a
partir del suero de animales que solo se unen físicamente a la sustancia que ha
provocado su producción. Los anticuerpos se fabrican inyectando la sustancia que
se quiere detectar (p. ej., CP4 EPSPS, la proteína que confiere resistencia al
herbicida Roundup) a animales como el conejo o el ratón, cuyas células somáticas
reconocen la sustancia como «extraña» y responden produciendo anticuerpos contra
ella. Después se purifican los anticuerpos, se acoplan a un marcador detectable y se
utilizan como reactivos para detectar la sustancia de interés.
Un requisito previo para el desarrollo de métodos inmunológicos de detección es
disponer de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína nueva que se quiere
detectar. Además, es necesario que la muestra o las proteínas de interés no se
degraden significativamente.
Los anticuerpos son un instrumento precioso para el biólogo en la detección y
cuantificación de antígenos en mezclas complejas. Todos los inmunoensayos se
basan en la unión específica del anticuerpo al antígeno.
Interacciones anticuerpo-antígeno
Al describir las propiedades de los anticuerpos en tanto que proteínas, la mayoría de
los inmunólogos citará la capacidad de estas moléculas para precipitar los antígenos
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 4
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
de una solución, aun cuando la precipitación de anticuerpos apenas se utilice ya
para aislar o detectar antígenos experimentalmente y los anticuerpos raramente
precipitan antígenos in vivo, salvo en el caso de algunas enfermedades
autoinmunes. El valor pedagógico de la reacción de precipitación por anticuerpos,
ilustrada en la figura 1, es que refleja nítidamente muchas de las propiedades
fundamentales y universales de las moléculas de anticuerpo. Esta técnica
demuestra, entre otras cosas, que:
• los anticuerpos (lgG) séricos son bivalentes en sus reacciones con antígenos y
tienen la capacidad de entrecruzar antígenos;
• los antígenos son a menudo multivalentes en sus interacciones con los
anticuerpos;
• los anticuerpos séricos suelen ser policlonales en la naturaleza, y
• los anticuerpos son sumamente específicos en lo que se refiere a las estructuras
que reconocen en las moléculas antigénicas.
Cuadro 1. Curva de precipitación de un sistema de un antígeno y sus anticuerpos.
En la representación gráfica de la cantidad de anticuerpo precipitada frente a la
concentración de antígeno (siendo constante el total de anticuerpo) se distinguen
tres zonas:
ANTISUERO POLICLONAL
Zona de exceso de anticuerpos
Zona de equivalencia
Zona de exceso de antígeno
Mioglobina
ANTICUERPO MONOCLONAL
Sobrenadantes: Exceso de Ac Exceso de Ag
Anticuerpo precipitado
Antígeno añadido
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 5
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
- una «zona de exceso de anticuerpo» en la que queda inhibida la precipitación y
puede detectarse un exceso de anticuerpo en el sobrenadante;
- una «zona de equivalencia» de precipitación máxima, en la que anticuerpos y
antígenos forman grandes complejos insolubles (de tonos azules) y no se puede
detectar en el sobrenadante ni el antígeno ni el anticuerpo;
- una «zona de exceso de antígeno» en la que queda inhibida la precipitación y
puede detectarse un exceso de antígeno en el sobrenadante.
Aun cuando la reacción de precipitación se presta magníficamente a la
caracterización de las interacciones entre anticuerpos policlonales y antígenos
multivalentes, no suele resultar muy útil para caracterizar las interacciones entre
antígenos y anticuerpos monoclonales, salvo en caso de que los antígenos exhiban
múltiples epítopos idénticos (como las estructuras repetitivas de hidratos de carbono
que se encuentran en los polisacáridos, por ejemplo). Solo entonces podrá un
anticuerpo monoclonal monoespecífico entrecruzar y precipitar antígeno. Sin
embargo, habitualmente los anticuerpos monoclonales se pueden caracterizar
mediante tipos de medición más refinados que aportan detalles sobre la interacción
entre anticuerpo y antígeno, tales como la constante de equilibrio y las tasas
cinéticas de asociación y disociación.
Nunca se insistirá bastante en la utilidad de los anticuerpos para la detección y
aislamiento de antígenos, dado el amplio espectro de aplicaciones extremadamente
potentes de los anticuerpos que se ha ido desarrollando a lo largo de los años. La
utilidad de los anticuerpos se ve además reforzada por su estabilidad relativa en
varias reacciones de modificación química, que alteran la estructura del anticuerpo
sin destruir su capacidad para unirse a antígenos. Los anticuerpos han sido
marcados químicamente con compuestos fluorescentes, magnéticos, radiactivos y
de otros tipos a fin de facilitar la detección o aislamiento de antígenos en
condiciones experimentales diversas.
Preparación de anticuerpos monoclonales
El sistema inmunitario de un organismo es capaz de reconocer como invasoras las
sustancias extrañas al mismo, como las bacterias y los virus patógenos y otros
agentes infecciosos, denominadas antígenos. Nuestras defensas naturales contra
estos agentes infecciosos son los anticuerpos, proteínas que buscan los antígenos y
ayudan a destruirlos.
Los anticuerpos presentan dos características de gran utilidad. En primer lugar, son
extremadamente específicos, es decir, cada anticuerpo se une a un antígeno
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 6
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
particular para atacarlo. En segundo lugar, algunos anticuerpos, una vez activados
por la presencia de una enfermedad, siguen confiriendo resistencia a ella.
Esta segunda característica es la que permite desarrollar vacunas. Una vacuna es
un preparado de bacterias o virus muertos o debilitados que, al ser introducido en el
organismo, estimula la producción de los anticuerpos correspondientes a los
antígenos que contiene.
La primera característica de los anticuerpos, su especificidad, es la responsable de
que la tecnología de anticuerpos monoclonales sea tan valiosa. Los anticuerpos no
solo pueden utilizarse con fines terapéuticos, para proteger de la enfermedad, sino
también en el diagnóstico de una amplia variedad de enfermedades y en la
detección de la presencia en la sangre de medicamentos, de productos víricos y
bacterianos y de otras sustancias inusuales o anormales.
Dado que estas sustancias de lucha contra la enfermedad tienen usos muy diversos,
se ha investigado durante mucho tiempo su producción en cantidades puras. El
método convencional era inyectar el antígeno a un animal de laboratorio y luego, una
vez formados los anticuerpos, recogerlos del suero sanguíneo (el suero sanguíneo
que contiene anticuerpos se llama antisuero). Este método, sin embargo, presenta
dos problemas: produce antisuero que contiene sustancias no deseadas y produce
una cantidad muy pequeña de anticuerpos utilizables.
La tecnología de anticuerpos monoclonales permite producir grandes cantidades de
anticuerpos puros utilizando células que producen anticuerpos de forma natural y
una clase de células que puede crecer continuamente en cultivo. Si formamos un
híbrido que combine la característica de la «inmortalidad» con la capacidad de
producir la sustancia deseada disponemos, desde luego, de una fábrica de
anticuerpos en funcionamiento permanente.
En la tecnología de anticuerpos monoclonales se fusionan células tumorales
capaces de replicarse indefinidamente con células de mamífero que producen un
anticuerpo. El resultado de esta fusión celular es un «hibridoma» que produce
anticuerpos continuamente. Estos anticuerpos se llaman monoclonales porque
proceden de un único tipo de célula, el hibridoma, mientras que los producidos por
métodos convencionales derivan de preparados que contienen muchos tipos de
células, por lo que se denominan policlonales. Se da a continuación un ejemplo de la
obtención de anticuerpos monoclonales.
Producción de anticuerpos monoclonales
Un mieloma es un tumor de la médula ósea que puede adaptarse para que crezca
permanentemente en un cultivo. Al fusionar células de mieloma con células de bazo
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 7
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
de mamífero productoras de anticuerpos, se halló que las células híbridas
resultantes, o hibridomas, producían grandes cantidades de anticuerpos
monoclonales. Este producto de una fusión celular combinaba las cualidades
deseadas de los dos tipos de células diferentes, a saber, la capacidad de
crecimiento continuo y la de producir grandes cantidades de anticuerpo puro.
Como las células híbridas seleccionadas producen un solo anticuerpo específico,
son más puros que los anticuerpos policlonales producidos mediante técnicas
convencionales y pueden resultar más efectivos que los medicamentos
convencionales para combatir la enfermedad, ya que estos no solamente atacan a la
sustancia extraña, sino también a las células del propio organismo, produciendo a
veces efectos secundarios no deseados tales como reacciones alérgicas. Los
anticuerpos monoclonales atacan a la molécula diana y solo a ella, y sus efectos
secundarios son mínimos o inexistentes.
Producción de anticuerpos monoclonales
Inmunización de un ratón para estimular la producción de anticuerpos
Se aislan células formadoras de anticuerpos a partir del bazo
Se cultivan células tumorales en un cultivo tisular
Las células formadoras de anticuerpos se funden con células tumorales cultivadas para formar hibridomas
Selección de hibridomas para la producción de anticuerpos
Hibridomas productores de anticuerpos clonados
Anticuerpos monoclonales aislados para su cultivo
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 8
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
La técnica ELISA Definición
Un ensayo de inmunosorción enzimática («Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay»)
es cualquier inmunoensayo enzimático que utilice un inmunorreactivo (antígeno o
anticuerpo) marcado con una enzima y un inmunosorbente (antígeno o anticuerpo
unido a un soporte sólido). Para medir una concentración desconocida pueden
usarse diversos métodos (p. ej., unión competitiva entre el reactivo marcado y el
elemento desconocido sin marcar).
ELISA (Clark y Adams, 1977) se basa en interacciones específicas entre anticuerpos
y antígenos. Los reactivos clave en ELISA son los anticuerpos, que son proteínas
solubles producidas por el sistema inmunitario en respuesta a una infección por una
sustancia extraña (llamada «antígeno»). En caso de la detección de OGM, el
antígeno puede ser la nueva proteína sintetizada.
Esta técnica se aplica en la evaluación, en fase experimental, del nivel de expresión
de la(s) proteína(s) sintetizada(s) por el nuevo gen introducido. Por ello, es posible
encontrar información sobre la producción y el uso de anticuerpos específicos en
muchos artículos que describen la creación de plantas transgénicas (Mohapatra et
al., 1999).
Solo se dispone comercialmente de unos cuantos anticuerpos específicos dirigidos
contra proteínas que son producto de los transgenes utilizados en cultivos
modificados genéticamente aprobados: sirvan de ejemplo los anticuerpos contra el
producto del gen nptII, NPTII, o APH(3')II y contra el producto del gen gus.
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 9
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Existen tres métodos distintos de realizar el ensayo ELISA:
Un método de detección específica de la soja Roundup Ready basado en ELISA fue
desarrollado, sometido a prueba y validado por Lipp et al. (2000).
El método se basa en el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína
CP4 EPSPS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, enzima procedente de
Agrobacterium sp., cepa CP4) (Padgette et al., 1995), que es la proteína que
confiere la tolerancia frente al herbicida Roundup en la soja Roundup Ready. Los
resultados preliminares indican que este método (que se aplica utilizando un kit
comercia de ELISA) es capaz de detectar la presencia de OGM en material de soja
bruto en concentraciones que se sitúan entre el 0,3 % y el 5 %.
Principio
Para la detección de la proteína CP4 EPSPS se utiliza un ensayo de
inmunoadsorción enzimática (ELISA) directo de tipo sándwich, según se muestra en
las siguientes figuras:
a) ELISA indirecto
b) ELISA sándwich
c) ELISA competitivo
Pocillo revestido
de antígeno
Añadir anticuerpo específico
Añadir anticuerpo secundario conjugado con enzima
Añadir sustrato (s)
y medir color
Añadir sustrato y
medir color
Añadir sustrato sin color
Añadir anticuerpo secundario conjugado con enzima
Añadir anticuerpo secundario conjugado con enzima
Añadir antígeno
Añadir (Ag-Ac) al pocillo
revestido de antígeno
Pocillo revestido de anticuerpo
Incubar anticuerpo
con antígeno
lavado lavado lavado
lavado lavado lavado
lavado lavado
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 10
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Se reviste la superficie de una placa de microvaloración con un anticuerpo de
captura monoclonal específico.
Cuando se añade la muestra de interés, el anticuerpo de captura se une al antígeno.
Los componentes de la muestra que no se han unido se eliminan mediante lavado.
Tras el lavado, se añade un anticuerpo policlonal, unido covalentemente a la
peroxidasa de rábano (HRP), que es específica para un segundo sitio antigénico en
la proteína CP4 EPSPS unida.
Superficie revestida
Y Anticuerpo monoclonal
Superficie revestida
Antígeno
Superfic. revestida
HRP
Superfic. revestida
TM TM
Anticuerpo detector
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 11
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Tras otro lavado, se añade el cromógeno tetrametilbencidina de la peroxidasa de
rábano. La peroxidasa de rábano genera una señal de color que es proporcional a la
concentración de antígeno en un intervalo lineal. Para detener el desarrollo del color
se añade una solución de parada. El nivel de color producido se mide a una longitud
de onda de 450 nm.
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 12
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Práctica (GMO Food Ingredient Testing, Soya kit User’s Guide (1999). Strategic Diagnostics,
Inc., Rev. 052099, Vers. 1.8.)1
Introducción
El siguiente protocolo especifica un método ELISA para la determinación de la
proteína CP4 EPSPS expresada en la soja Roundup Ready en productos agrícolas
brutos y elaborados como las harinas de soja y las proteínas aisladas de soja.
El método es aplicable a muestras que han sido poco o en absoluto tratadas, por lo
que la proteína CP4 EPSPS no está desnaturalizada. Por ejemplo, la temperatura a
la que se transforman los ingredientes de los alimentos puede repercutir en las
posibilidades de detección de la proteína. Según los datos, las temperaturas de
transformación de no más de 65 °C durante no más de 60 minutos permiten una
detección fiable.
El método ha sido validado para la detección de la proteína CP4 EPSPS y puede
usarse para determinar la concentración de la proteína en la muestra en el intervalo
del 0,3 % al 5 % (p/p) usando material de referencia específico. El kit puede
emplearse igualmente a niveles de detección más bajos (0,05 % a 0,3 %) con
modificaciones en el protocolo.
Instrumental
• Tubos de centrifugación cónicos de polipropileno de 15 ml
• Tubos de ensayo de vidrio de 12 X 75 mm
• Hojas de plástico o aluminio para envolver
• Cinta de plástico o lavador de placas manual
• Frascos lavadores, p. ej. de 500 ml
• Pipetas de precisión capaces de transferir de 20 µl a 500 µl
• Mezclador de torbellino
• Bandejas de pesar o equivalentes
• Espátulas
• Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g
1 El kit que se describe en esta sesión era el único protocolo validado disponible en el comercio en el momento en que se organizaron los cursos y se preparó el presente Manual. El CCI y la OMS no promocionan ninguna marca concreta de kits disponibles en el comercio.
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 13
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
• Centrifugadora que pueda trabajar a 5 000 - 10 000 rpm
• Lector de placas de microvaloración capaz de leer una absorbancia a 450 nm
• Horno de incubación capaz de mantener 37 °C
• Tamiz de 450 µm de abertura o equivalente
• Tamiz de 150 µm de abertura (malla 100) o equivalente
• Pipeta multicanal, p. ej., de 50 µl a 300 µl (opcional)
• Depósitos de reactivo para distribución multicanal (opcional)
• Lavador de placas automático (opcional)
• Soporte para tubos de centrifugación de 15 ml (opcional).
Reactivos
Generalidades
Durante los análisis, y a menos que se indique otra cosa, se utilizarán solamente
reactivos de grado analítico y agua desionizada o destilada.
Cualquier desviación de los criterios de rendimiento definidos podría indicar una
merma de la estabilidad de un reactivo. En caso de que los componentes del
sustrato hayan ya virado de transparente a azul, deberá descartarse el reactivo. No
deberán usarse soluciones tampón turbias.
Todos los componentes del kit deberán almacenarse a una temperatura de entre
2 °C y 8 °C. El período de validez de los componentes del kit viene indicado por su
fecha de caducidad. Sobre la base de ensayos de estabilidad acelerados, la fecha
de caducidad del kit de ensayo se ha fijado en 9 meses a una temperatura de entre
2 °C y 8 °C.
La solución madre «conjugado de soja» de conjugado de anticuerpo y la solución de
trabajo de conjugado de anticuerpo deberán almacenarse a una temperatura de
entre 2 °C y 8 °C hasta la fecha de caducidad del kit. El tampón de lavado de trabajo
diluido deberá almacenarse a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C sin sobrepasar
la fecha de caducidad del kit.
Reactivos que suelen facilitarse con el kit de ensayo
• Tampón de extracción de soja, tampón de borato de sodio, pH 7,5
• Tampón de extracción de soja, PBS, Tween 20, seroalbúmina bovina, pH 7,4
• Pocillos en tiras revestidas (12 tiras de 8 pocillos cada una revestidas con los
anticuerpos de captura monoclonales y un portatiras)
• Conjugado de soja, proteína anti-CP4 EPSPS de conejo, liofilizada
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 14
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
• Diluyente del conjugado de soja, suero de ratón inactivado por calor al 10 %
• Sustrato cromogénico, K-Blue, tetrametilbencidina (TMB), peróxido de
hidrógeno, dimetilformamida al 5 % como disolvente de base
• Solución de parada, ácido sulfúrico al 0,5 %
• Tampón de lavado concentrado diez veces, PBS, Tween 20, pH 7,1
• Patrones de referencia negativos y positivos.
Procedimiento
Limitación del procedimiento
Este sistema de ensayo de la modificación genética mediante ELISA solo es válido
para muestras en las que la expresión de la proteína CP4 EPSPS se pueda
correlacionar con el nivel de material modificado genéticamente presente en los
patrones de referencia utilizados.
El kit de ELISA ha sido diseñado para ofrecer un rendimiento óptimo a una
temperatura ambiente de 15 °C a 30 °C. La absorbancia del patrón de referencia
más elevado debe ser superior a 0,8 y no estar fuera del intervalo lineal del
espectrómetro (el límite superior varía según el aparato). Es importante tener
presente que los valores de la densidad óptica aumentan más deprisa a
temperaturas superiores a 30 °C. En consecuencia, si la temperatura es elevada,
será necesario acortar el tiempo de incubación del sustrato. A temperaturas bajas
(inferiores a 15 °C), por el contrario, habrá que alargar dicho tiempo.
Medidas encaminadas a evitar la contaminación durante la preparación de la muestra
Generalidades. El sistema ELISA de ensayo de OGM es una técnica
extremadamente sensible capaz de detectar cantidades muy pequeñas de
contaminantes GM. Por este motivo, es imperativo que todo el instrumental utilizado
para procesar las muestras de soja sea limpiado a fondo entre dos lotes de
muestras. Los procedimientos que se mencionan a continuación incluyen un primer
paso de eliminación física de cuantas partículas sea posible. El segundo paso, un
lavado con alcohol, tiene por finalidad desnaturalizar la muestra de manera que no
reaccione durante el ensayo con ninguna proteína GM que pueda haber quedado en
el instrumental.
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 15
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Limpieza del triturador o batidora. Cepillar con un cepillo de cerdas suave. Lavar
el cepillo periódicamente y remojarlo en una solución de alcohol. Secar el cepillo
antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave o un paño de laboratorio.
Lavar con alcohol, que puede tenerse almacenado para su uso en una botella con
pulverizador o pitorro. Se recomiendan dos lavados o pulverizaciones. Luego, se
enjuagará a fondo con agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizar enseguida el
instrumento, con un secador de pelo comercial.
Limpieza del tamiz. El polvo de soja suele endurecerse, atascando el tamiz.
Sacudir bruscamente el tamiz contra una superficie dura para desprender el material
endurecido.
Cepillar con un cepillo de cerdas suave y limpio. Lavar el cepillo periódicamente y
remojarlo en una solución de alcohol durante al menos un minuto. Secar el cepillo
antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave.
Remojar en alcohol durante al menos cinco minutos y luego enjuagar a fondo con
agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizarlo enseguida, con un secador de pelo
comercial.
Una alternativa sería el uso de un baño de ultrasonidos seguido de un secado al
aire.
Limpieza de la zona de trabajo. También es importante la limpieza de la zona de
trabajo. Dado que el ensayo es muy sensible, una ligerísima contaminación por
polvo GM del tubo de ensayo podría conducir a un falso positivo. Hay que evitar la
contaminación por polvo de soja en la zona de trabajo. No debe permitirse que el
polvo de soja de un proceso contamine el instrumental que se usará en un proceso
posterior. Lo ideal es realizar el ensayo en un espacio separado de la instalación en
la que se efectúa el triturado y la preparación de la muestra, a fin de evitar la posible
contaminación por polvo.
Preparación de la muestra
Debe tomarse de la muestra de laboratorio una submuestra incremental homogénea.
Si la muestra es de semillas de soja en bruto, se colocarán al menos 500 g en una
batidora adecuada y se triturarán durante 3 minutos aproximadamente, o hasta que
sea suficientemente fina para atravesar los tamices. Para análisis cuantitativos,
deberá obtenerse un tamaño de partícula inferior a 150 µm, y para análisis
cualitativos, inferior a 450 µm. En la fase de tamizado debe ponerse cuidado en
evitar la contaminación, así como en evitar el calentamiento excesivo. La batidora
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 16
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
permitirá mezclar y triturar la muestra. Se tomará una submuestra de
aproximadamente 100 g de material triturado, que se pasará a través de un tamiz
con un tamaño de poro de 450 µm (malla 40). Al menos el 90 % de esta submuestra
deberá atravesar el tamiz de 450 µm. Puede usarse este material directamente si se
trata de un ensayo cualitativo, pero si es cuantitativo debe volverse a pasar por un
tamiz con tamaño de poro de 150 µm. Como se ha demostrado que el material que
atraviesa el tamiz de 450 µm es homogéneo, basta hacer pasar por el tamiz de
150 µm suficiente material para obtener la muestra final.
Otros tipos de muestras deben recibir un tratamiento semejante, aunque puedan
utilizarse tamaños de muestra más pequeños.
Procedimiento de ensayo
Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de usarlos.
Se sacan las tiras revestidas y el portatiras de la bolsa de papel de aluminio. Tras
extraer el número de tiras adecuado, hay que volver a cerrar siempre la bolsa.
Hacen falta diez pocillos para los patrones de referencia y los blancos de ensayo.
Cada placa debe tener sus propios patrones y controles. Si se utiliza un lavado
manual, pegar con cinta de plástico los bordes de todas las tiras necesarias para un
ciclo al portatiras, a fin de evitar que caigan accidentalmente de este durante el
lavado.
Preparación del conjugado de anticuerpo
Solución madre de conjugado de anticuerpo. Pipetear 1 ml de diluyente de
conjugado de soja procedente de la botella de diluyente de conjugado de soja en el
frasco de conjugado de soja. Agitar en el mezclador de torbellino durante 10 s
aproximadamente.
Solución de trabajo de conjugado de anticuerpo. Volver a poner 240 µl de
conjugado de soja reconstituido en la botella de diluyente de conjugado de soja.
Marcar la botella con la fecha del día y mezclar invirtiéndola 20 veces.
Preparación del tampón de lavado
Dejar que el tampón de lavado concentrado diez veces alcance la temperatura
ambiente.
Diluir dicho tampón concentrado en agua desionizada para preparar el tampón de
lavado de trabajo (p. ej., 50 ml de tampón de lavado concentrado diez veces en 450
ml de agua desionizada).
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 17
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Añadir al lavador de placas automático o al frasco lavador.
Extracción de muestras y patrones de referencia
Se extraen las muestras y los patrones de referencia negativos y positivos en las
mismas condiciones y por duplicado, según se describe a continuación.
Cuando vayan a pesarse las muestras, pesar cada patrón de referencia por orden de
concentración creciente y luego las muestras.
Pesar 0,5 g ± 0,01 g de cada patrón de referencia y de la muestra en distintos tubos
de centrifugación de polipropileno de 15 ml. Para evitar la contaminación, limpiar la
espátula entre cada pesada.
Añadir 4,5 ml de tampón de extracción de soja en cada uno de los tubos que
contienen una muestra de 0,5 g y agitar en un mezclador de torbellino durante 10 s.
Centrifugar las mezclas a aproximadamente 5000 rpm durante 15 minutos.
Utilizando una pipeta de transferencia, retirar cuidadosamente el sobrenadante sin
aspirar material sólido y colocarlo en un tubo de centrifugación de 15 ml limpio y
etiquetado.
Antes de comenzar el ensayo, diluir los extractos de la muestra y los extractos del
patrón de referencia con tampón de ensayo de soja con arreglo a lo indicado en el
cuadro 1.
Los extractos de proteína deben almacenarse a entre 2 °C y 8 °C, pero no durante
más de un día de trabajo.
Cuadro 1. Intervalos de dilución en función de la matriz
Matriz Dilución
Semillas de soja Harina de soja
Harina de soja desgrasadaAislado de proteínas
1:300 1:300 1:300 1:10
Dilución de extractos de muestras Para el control negativo extraído, para cada referencia positiva extraída y para cada
muestra, se precisan dos tubos de ensayo de 12 X 75 mm para realizar la dilución.
Pipetear 280 µl del tampón de ensayo de soja en uno de los dos tubos de ensayo de
12 x 75 mm.
Pipetear 380 µl del tampón de ensayo de soja en el otro tubo de ensayo de 12 x 75
mm. Marcar el tubo de 280 µl con la inscripción «1:15» y el de 380 µl con «1:300».
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 18
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Pipetear 20 µl de cada extracto de muestra en el tubo «1:15» y agitar en el
mezclador de torbellino.
Transferir 20 µl del tubo «1:15» agitado al tubo «1:300» y agitar en el mezclador de
torbellino.
Repetir los mismos pasos para el control negativo, para cada referencia positiva y
para los extractos de muestra.
Procedimiento de inmunoensayo ELISA
Generalidades
El kit de ensayo ELISA puede utilizarse en distintos formatos con cualquier número
de bandas de 8 pocillos. Se recomienda seguir un sistema de carga aleatorio.
Todos los pocillos de reacción deben emplearse por duplicado, calculándose el valor
medio de absorbancia de cada pocillo. Cada ciclo está integrado por el blanco del
tampón de ensayo, el control negativo y la referencia positiva.
Una vez iniciado un ensayo, deben completarse todas sus etapas sin interrupción.
Adición de la muestra
Añadir 100 µl de extractos diluidos y el blanco de ensayo a los pocillos oportunos.
Usar puntas desechables distintas en cada etapa de pipeteo para evitar la
contaminación cruzada. Cubrir la placa con hoja de aluminio o de plástico para evitar
la contaminación y la evaporación.
Incubación de la muestra
Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.
Lavado
Lavar 3 veces con 300 µl de tampón de lavado.
Lavado manual. Vaciar los pocillos invirtiéndolos sobre un fregadero o un
contenedor de residuos adecuado. Utilizando un frasco lavador de 500 ml que
contenga solución de lavado de trabajo, llenar cada pocillo hasta el borde, dejar
reposar 60 s, y luego vaciar la placa como se acaba de indicar. Repetir el lavado un
total de 3 veces. Eliminar el líquido y las burbujas residuales sacudiendo boca abajo
la placa sobre varias capas de toallas de papel.
Se impedirá que las tiras caigan del marco sujetándolas con cinta adhesiva.
Lavado automático. Al final del período de incubación, aspirar el contenido de
todos los pocillos utilizando un lavador de micropocillos, y luego llenarlos con
tampón de lavado de trabajo. Repetir la aspiración y el llenado un total de 3 veces.
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 19
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Por último, aspirar todos los pocillos mediante el lavador de micropocillos y sacudir
la placa invertida sobre una pila de toallas de papel para eliminar las gotitas
residuales de tampón de lavado y las burbujas.
No hay que dejar que los pocillos se evaporen, ya que esto podría afectar al
rendimiento del ensayo.
Un lavado inadecuado puede ocasionar resultados erróneos. Tanto si se utiliza un
lavador manual como automático, es importante cerciorarse de que todos los
pocillos de ensayo se lavan con idénticos volúmenes.
Adición del conjugado de anticuerpo
Añadir 100 µl de solución de trabajo de conjugado de anticuerpo a cada pocillo.
Cubrir la placa para evitar la contaminación y la evaporación.
Incubación
Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.
Lavado
Concluido el período de incubación, repetir el lavado según lo anteriormente
descrito.
Adición del sustrato
Añadir 100 µl de la solución de color a cada pocillo.
Agitar suavemente la placa e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La adición de sustancia cromogénica debe efectuarse sin interrupciones. Mantener
la misma secuencia e intervalo de tiempo durante el pipeteo. Proteger la placa de
microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del color.
Adición de la solución de parada
Al final del período de incubación, añadir 100 µl de solución de parada a cada
pocillo, pipeteándola en la misma secuencia en que se haya añadido el reactivo de
color.
La adición de solución de parada debe efectuarse sin interrupciones. Proteger la
placa de microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del
color.
Lectura de la absorbancia
Utilizando un lector de microplacas equipado del filtro adecuado para efectuar
lecturas a 450 nm, medir la absorbancia de cada pocillo de ensayo.
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 20
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Todas las lecturas deben efectuarse dentro de los 30 minutos siguientes a la adición
de la solución de parada.
Tomar nota de los resultados obtenidos y calcular los valores medios de
absorbancia, o recurrir a un programa informático.
Evaluación
Deben usarse los valores de los patrones para desarrollar una curva patrón. El valor
del blanco de ensayo deberá sustraerse de todos los valores de las muestras y
patrones de referencia. Se utilizarán los valores medios corregidos correspondientes
a cada punto de referencia duplicado para crear una curva patrón. Luego se
utilizarán los datos promedio de cada muestra duplicada para interpolar una
concentración a partir de dicha curva.
Criterios de aceptación o rechazo de un ciclo
Para tener validez, cada ciclo deberá satisfacer los criterios de aceptación o rechazo
del procedimiento. Un ciclo consistirá en lo siguiente: el blanco de ensayo, la
extracción de cada patrón GM de referencia positiva, el control negativo y cada
muestra desconocida. Todos los extractos de proteína y el blanco de ensayo se
utilizarán en duplicados. Si un ciclo no satisface los criterios de aceptación del
ensayo, deberá repetirse íntegramente.
Ciclo Criterios
Blanco de tampón de ensayo A450nm < 0,30
Patrón 0 % GM A450nm < 0,30
Referencia 2,5 % A450nm > 0,8
Todos los patrones positivos CV de los duplicados < 15 %
Muestras desconocidas CV de los duplicados < 20 %
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 21
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Diagrama de flujo Diagrama de la extracción de la muestra y del patrón de referencia
Procedimiento Volumen/peso Descripción
Pesada 0,5 g Pesar muestras, blanco de ensayo y patrones de referencia
Adición 4,5 ml Añadir el tampón de extracción
Mezclado Mezclar la muestra con el tampón de extracción hasta que quede homogénea
Centrifugado 5000 rpm Centrifugar la muestra a 5000 rpm durante 15 minutos Eliminar el sobrenadante y pasarlo a un tubo limpio
Dilución 1:300 o 1:10 según el material investigado
Diluir las muestras y patrones de referencia
Diagrama del procedimiento de inmunoensayo ELISA
Procedimiento Volumen Descripción
Adición 100 µl Pipetear los extractos diluidos de muestras, patrones de referencia y blanco tampón de ensayo en los correspondientes pocillos
Incubación Incubar 1 h a 37 °C
Lavado Lavar 3 veces con tampón de lavado
Adición 100 µl Distribuir el conjugado de anticuerpo en cada pocillo de ensayo
Incubación Incubar 1 h a 37 °C
Lavado Lavar 3 veces con tampón de lavado
Adición 100 µl Distribuir la solución de color en cada pocillo
Incubación Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Adición 100 µl Distribuir la solución de parada en cada pocillo de ensayo
Medida de la absorbancia
Medir el valor de la absorbancia de cada pocillo en un lector de placas a 450 nm
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 22
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Bibliografía
Clark, M.F. y Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of
enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of
General Virology 34, 475–483.
Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and
Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts
of the Swiss Priority Program Biotechnology – Report 2/97, 61 pages.
http://www.bats.ch/bats/publikationen/1997-2_gmo/index.php (Último acceso
enero de 2010)
Lipp, M., Anklam, E. y Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for
detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food
fractions using reference materials. Journal of AOAC International 83, 919–927.
Longstaff, M., Edmonds, H.S. y Newell, C.A. (1995). An improved method for the
detection and quantification of recombinant protein in transgenic plants. Plant
Molecular Biology Reporter 13, 363–368.
Mohapatra, U., Mccabe, M.S., Power, J.B., Schepers, F., Vanderarend, A. y Davey,
M.R. (1999). Expression of the bar gene confers herbicide resistance in
transgenic lettuce. Transgenic Research 8, 33–44.
Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,
Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eichholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L.,
Taylor, N.B. y Kishore, G.M. (1995). Development, identification, and
characterization of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35, 1451–
1461.
Bibliografía complementaria
Brett, G.M., Chambers, S.J., Huang, L. y Morgan, M.R.A. (1999). Design and
development of immunoassays for detection of proteins. Food Control 10, 401–
406.
Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 23
Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 12
Directiva 79/700/CEE de la Comisión, de 24 de julio de 1979, por la que se
establecen los métodos comunitarios de toma de muestras para el control oficial
de los residuos de plaguicidas en las frutas y hortalizas. DO L 239 de 22.9.1979,
p. 24.
Rogan, G.J. Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach,
J.N., Sanders, P.R. y Fuchs, R.L. (1999). Immunodiagnostic methods for
detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Roundup Ready
soybeans. Food Control 10, 407–414.
Stave, J. W. (1999). Detection of new or modified proteins in novel foods derived
from GMO - future needs. Food Control 10, 367–374.
Van der Hoeven, C., Dietz, A. y Landsmann, J. (1994). Variability of organ-specific
gene expression in transgenic tobacco plants. Transgenic Research 3, 159–165.