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ANTECEDENTES
Mycobacterium tuberculosis
La tuberculosis es una infección bacteriana crónica causada por Mycobacterium
tuberculosis, el género Mycobacterium comprende un grupo de microorganismos muy
diverso, de amplia distribución en la naturaleza. Se han descrito más de 100 especies, 25
de las cuales han sido identificadas como agentes infecciosos frecuentes para el hombre.
Además de las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis: M. Bovis, M.
Africanum y M. Tuberculosis productoras de tuberculosis en humanos, existen especies
saprofitas, pudiendo actuar como patógenos oportunistas y causar enfermedad pulmonar
o infecciones en otras localizaciones (Davis, 1978).
Mycobacterium tuberculosis es un bacilo el cual fue descubierto por Roberto
Koch en 1882. Pertenece al orden Actinomicetales, familia Mycobacteriaceae; y son
consideradas formas de transición entre las eubacterias y los hongos. Se caracteriza por
ser de crecimiento lento en comparación con otras bacterias con un tiempo de 12 a 21
hrs. Es una mycobacteria que no forma esporas, aerobia, inmóvil y se tiñe con
dificultad, pero una vez teñidas resisten la decoloración con soluciones ácidas o por el
alcohol y son por lo tanto, llamadas “ácido-alcohol resistentes”. Los bacilos tuberculosos
son resistentes a la desecación y miden de 2 a 4µm de longitud y de 0.2 a 0.5 µm de
ancho, tiene un aspecto típico de bacilo delgado de anchura uniforme, ligeramente
curvo; es resistente a muchos antibióticos debido principalmente a la envoltura celular
altamente hidrofóbica que actúa como barrera permeable lo que hace difícil su
tratamiento (Ramírez R. NA., 2002).
Como todas la mycobacterias, su pared es compleja se caracteriza por tener una
cubierta lipídica constituida por ácidos micólicos- arabinogalactano- peptidoglucano
(mAGP), ello le ocasiona que, una vez teñidos con ciertos colorantes derivados de
anilinas (p. ej.- fucsina fenicada), retengan esta coloración a pesar de ser tratados,
aunado a esta peculiaridad la pared mycobacteriana posee proteínas, polisacáridos y una
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elevada cantidad de lípidos (50 a 60%) que le confieren un carácter hidrofóbico y la hace
refractaria al ataque por hidrólisis enzimática (Gorocica, 2005).
Dentro de su estructura, la pared celular separada de la membrana celular por el
espacio periplásmico, consta de cuatro capas. La capa más interna es la peptidoglucano
con moléculas de N-acetilglucosamina, esta es el esqueleto de la bacteria siendo
relativamente uniforme en todas las especies de mycobacterias que le da la forma y
rigidez. Mientras que externamente hay 3 capas compuestas: una por polímeros de
arabinosa y galactosa, otra formada por ácidos micólicos y otra superficial formada por
lípidos como sulfolípidos que son aproximadamente el 25% del peso seco de la bacteria.
Estos lípidos contienen ceras, micósidos específicos de especie (glucolípidos complejos)
y el factor cordón el cual se asocia al alineamiento en paralelo de las filas de bacilos
siendo esta una de las características de las cepas virulentas de M. tuberculosis. Las
cadenas peptídicas de la capa externa comprenden un 15% del peso de la pared celular y
tienen antígenos biológicos de importancia, que estimulan al sistema inmune celular del
paciente ante esta infección (Pan Fei y Col., 2001).
Las mycobacterias tienen elevada resistencia a los desinfectantes, pero son
destruidos por la pasteurización y la esterilización al calor; no segregan exotoxinas y
sólo libera endotoxinas al lisarse, pueden sobrevivir durante largos periodos en esputos
secos u otros líquidos corporales. Además, los componentes estructurales del complejo
de la pared celular de M. tuberculosis producen la virulencia del microorganismo y le
permiten sobrevivir en condiciones ambientales difíciles (Said F.S.,2005).
5
Tuberculosis
Transmisión tuberculosis pulmonar
Es uno de los padecimientos que sigue siendo considerado como una de las
enfermedades infecto-contagiosa de mayor impacto de salud pública en el mundo. El
nombre tuberculosis proviene de la palabra tubérculo. Es trasmitida en tres formas una
de ellas es de persona a persona por la inhalación del agente infeccioso el cual se
encuentra en el aire en forma de aerosoles los núcleos de gota que contienen M.
tuberculosis, por la ingestión de material contaminado usualmente leche (M. Bovis) y
finalmente por inoculación directa que ocurre en personas trabajadores del sector salud
principalmente (Villalba, 2003).
Estos núcleos de 1 a 5 micras que contienen de dos a tres organismos al entrar al
tracto respiratorio, pasan a ser pequeños tumores duros que se forman cuando el sistema
inmune constituye una pared alrededor de la bacteria de la mycobacteria, los cuales se
caracterizan histológicamente por la formación de granulomas. Habitualmente, la
enfermedad se localiza en los pulmones, pero puede afectar prácticamente a cualquier
órgano del cuerpo humano, pudiendo penetrar a través del tubo digestivo, el sistema
genitourinario y el sistema respiratorio. Esta última es la vía de infección más frecuente
ya que las partículas o aerosoles conteniendo bacterias pueden ser liberados por un
paciente con infección activa, se inspiran del aire contaminado que se encuentre en el
interior cerrado por largos periodos de tiempo por un individuo sano, se depositan en las
mucosas de las vías respiratorias superiores y viajan a los pulmones donde se instalan;
en ocasiones pueden moverse por medio del sistema linfático hacia otras partes del
cuerpo, tales como el riñón, espina dorsal y cerebro, donde generan una tuberculosis
extrapulmonar (Mariscal, 2005).
Existen cuatro factores que determinan la transmisión de Mycobacterium
tuberculosis: 1) el número de organismos que son expelidos en el aire, 2) la
concentración de organismos en el aire determinada por el volumen del espacio y su
ventilación, 3) la magnitud de tiempo a la que se encuentra expuesta la persona al aire
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contaminado y 4) presumiblemente el estado inmune del individuo expuesto. Las
personas infectadas por VIH y otras con alteraciones en la inmunidad celular son más
propensas a desarrollar enfermedad si son infectados. Sin embargo, no son más
susceptibles a transmitir Mycobacterium tuberculosis (Chávez T. NC., 2002).
El estado patológico de la infección y de la enfermedad ocurre en tres etapas:
inicial (infección primaria), latencia y enfermedad posprimaria. En la infección inicial,
los bacilos invaden el tejido en la puerta de entrada, generalmente las zonas medias y
bajas de los pulmones, multiplicándose allí al cabo de 3 a 6 semanas y originando una
pequeña lesión inflamatoria. Los bacilos entran inmediatamente en el sistema linfático y
son transportados al grupo de nódulos linfáticos más próximo, donde también provocan
lesiones inflamatorias. Además, la enfermedad reactiva, es decir cuando el bacilo
ingresa por primera vez al organismo que en general ocurre en edades tempranas como
en el caso de un niño (primoinfección), éste se reproduce y elimina con poca intensidad
por lo que resulta poco infeccioso; cuando se reactiva, el bacilo se reproduce con mayor
intensidad y se elimina en gran cantidad, y esta es responsable de las mayorías de las
tuberculosis activas diagnosticadas hoy en día. Se presenta con mayor frecuencia en los
ancianos y en los individuos con enfermedades crónicas o debilitantes. Aunque la
reactivación puede ocurrir en cualquiera de las lesiones focales, es más frecuente en la
de los lóbulos superiores o del vértice de los lóbulos inferiores de los pulmones, donde
se forman abscesos y cavidades tuberculosas (Chávez T. NC., 2002).
Patogenia
Posterior a la inhalación los núcleos goticulares conteniendo muy pocos bacilos
son lo suficientemente pequeños para llegar a los bronquíolos respiratorios o alvéolos y
ahí ser fagocitados por los macrófagos alveolares. Siendo el foco inicial en la zona
media de los pulmones donde el mayor flujo aéreo favorece el establecimiento de los
bacilos inhalados, dividiéndose aproximadamente de 25 a 32 hrs. dentro del macrófago.
Sin embargo la multiplicación bacteriana no puede ser impedida y, eventualmente,
destruye a los macrófagos. Donde son atraídos desde el torrente sanguíneo linfocitos y
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monocitos, diferenciándose los últimos en macrófagos que ingieren las bacterias
liberadas de las células degeneradas, los macrófagos infectados son llevados por vía
linfática a ganglios linfáticos hiliares, pero en el huésped no inmune no son detenidos
ahí y se pueden diseminar por vía hemática a diferentes tejidos. Antes del desarrollo de
hipersensibilidad el crecimiento bacteriano no está inhibido tanto en el foco inicial
dando lugar a la progresión de la enfermedad en los ápices pulmonares o en focos
extrapulmonares prontamente o después de largos periodos de latencia. Los bacilos
continúan multiplicándose, lesionando los órganos donde se localizan, provocando
licuefacción del tejido, donde crecen extracelularmente llegando a ser millones
(Sepkowitz, 1995).
Los bacilos con mayor capacidad agresiva tienen la facultad de resistir a los
mecanismos defensivos celulares y provocar una primo-infección tuberculosa. Se
constituye el llamado complejo primario, formado por el chancro de inoculación o
nódulo de Ghon. La repercusión sobre el pulmón se traduce en dos situaciones
patológicas distintas: una de ellas es la primoinfección tuberculosa o latente, se
caracteriza por la ausencia de síntomas y signos clínicos, radiológicos y bacteriológicos;
dando la prueba de tuberculina positiva. La segunda patología es la enfermedad
tuberculosa como tal, en la cual hay manifestaciones clínicas, radiológicas,
bacteriológicas e inmunológicas. La enfermedad se manifiesta antes de los 5 años que
siguen al contagio y se cataloga como tuberculosis primaria, mientras aquella que se
desarrolla más tarde se denomina tuberculosis postprimaria, secundaria o de tipo adulto.
Esta es poco frecuente en la infancia, ocurre fundamentalmente en la adolescencia
después de haber estado infectado durante varios años, puede producirse como
consecuencia de una reactivación endógena, por los bacilos que han estado acantonados
desde que ocurrió la infección primaria, o bien proceder del exterior y producir una
reactivación exógena; los síntomas son los propios de la tuberculosis: fiebre, tos, astenia,
dolor torácico, esputo hemoptoico, etc (Hurtado MP., 2001).
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Prevalencia
La tuberculosis supone un auténtico problema de salud pública, tanto a nivel
nacional como mundial, por lo que su situación epidemiológica actual es preocupante.
Según cifras que la Organización Mundial de la Salud (OMS) publica en relación a la
situación de la tuberculosis en el mundo, aproximadamente un tercio de la población
mundial está infectado por M. tuberculosis (García G.M., 1995).
En 1990, la unidad de Tuberculosis de la OMS, realizó una evaluación para
determinar la situación arrojando como resultados, en el mundo hubo 1,722 millones de
infectados por M. tuberculosis, 8 millones de casos nuevos y de 2.6 a 2.9 millones de
defunciones por esta misma causa. Sin embargo se estima que la prevalencia global es
superior a 70 por 100 mil habitantes aunque es mucho mayor en algunas zonas
geográficas y grupos de riesgo, como en algunos países africanos, donde llega a ser de
400 por 100 mil habitantes. En cuanto a incidencia, África, y Asia ocupan el primer y
segundo lugar, y América Latina con 250 a 300 mil nuevos casos se ubica en el tercer
lugar. (figura 1) Y Brasil, Perú son los países que tienen las mayores incidencias;
mientras que México ocupa el tercer lugar en América en número de casos, pero en
problemática e incidencia se ubica en la posición número 20 (Farga C.V., 2006).
En México el comportamiento de la tuberculosis en los últimos diez años ha
obedecido a una disminución de su morbilidad como de su mortalidad. De acuerdo al
Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica, se tienen un gran número de casos
reportados, siendo los estados de Baja California, Chiapas, Nuevo León y Veracruz,
como aquellos con las mayores aportaciones (ver tabla 1). En el Estado de Sonora,
según Institución y grupos de edad, se presentaron en el año 2001, aproximadamente
514 casos nuevos de tuberculosis del aparato respiratorio, y para el 2004 se encontró una
610 casos nuevo de tuberculosis respiratoria (García, 2003 ).
La OMS ha estimado que entre el año 2000 y el 2020, 200 millones de personas
enfermarán y 35 millones morirán de tuberculosis sino se hace un riguroso control,
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según resultados obtenidos por esta organización permiten afirmar que cada segundo
una persona es infectada por primera vez por el bacilo, cerca del 1% de la población
mundial es infectada por primera vez cada año. La pandemia del VIH ha tenido gran
impacto en la epidemiología y en el año 2000 aproximadamente 12 millones de las 36
millones de personas infectadas con el VIH en todo el mundo, tenían coinfección con M.
tuberculosis y los 8.4 millones (70%) de estos coinfectados, vivían en la región del
África Subsahariana (Farga C.V., 2006).
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Figura 1. Incidencia a nivel mundial de la tuberculosis.
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Tabla Ⅰ. Casos de tuberculosis reportados en la república mexicana del año 2000 al
2004 por el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica
Años Numero de Casos en la República
Mexicana
2000 16 281
2001 15 269
2002 14 310
2003 14 852
2004 13 392
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Diagnóstico
La TB puede ser cien por ciento curable, siempre y cuando se
diagnostique a tiempo y se mantenga al paciente dentro de un régimen de tratamiento
estricto, como en los programas promovidos por la Organización Mundial de la Salud,
la Organización Panamericana de Salud y la Secretaría de Salud en México, los cuales
han demostrado ser altamente efectivos. Recientemente dentro de las estrategias para
combatir a la tuberculosis, el diagnóstico subyace como uno de los pilares más
importantes ya que permite una atención oportuna y eficaz así como el inicio del
tratamiento y en consecuencia una reducción de los riesgos de contagio y dispersión de
dicho padecimiento ( García G. ML., 2000).
Técnicas Tradicionales de Diagnóstico
Baciloscopía
En los últimos 100 años, la única prueba rápida para el diagnóstico de la
tuberculosis ha sido el examen microscópico, la “baciloscopía” con la tinción
microbiológica de Ziehl-Neelsen es la técnica de predilección para el diagnóstico de TB
activa en la mayoría de los laboratorios, por varias características básicas que aún no han
sido superadas por el resto de las técnicas por avanzadas que éstas han sido, como lo son
sencillez, reproducibilidad en cualquier medio, rapidez, bajo costo (Morán M.MC. y
Col, 2000).
La tinción consiste en la fijación de la fucsina sometiendo a calor la muestra
cubierta con el colorante, se continua el calentamiento observando la emisión de vapores
por unos 7 minutos, se elimina el colorante con agua, cayendo esta suavemente, después
se agrega alcohol-ácido por 2 minutos se enjuaga nuevamente y se aplica el colorante de
contraste azul de metileno por un espacio de 5 minutos, se enjuaga y se deja escurrir en
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forma vertical hasta secar. Esta técnica diagnostica a los enfermos con TB que son
bacilíferos, esto es, que son fuente de diseminación de la enfermedad. Sin embargo, es
en este sentido donde se han venido observando grandes limitaciones, ya que este
sistema, necesita un número mayor de 104 bacterias por mililitro para arrojar un
diagnóstico positivo (Valdés, 1999).
Un dato adicional que complica la aplicación de este método como el único
sistema para diagnosticar a pacientes tuberculosos, es la estimación de que más de la
mitad de los 10 millones de casos reportados anualmente, son infecciones pulmonares y
extrapulmonares con baciloscopía negativa, y en general, se considera que deben existir
entre cinco mil y diez mil bacilos ácido-alcohol resistentes por militiro de expectoración
para que exista un 50% de probabilidad de ser detectado, con esto se puede considerar
que a estos pacientes se les establezca un diagnóstico con otros criterios como clínico,
histopatológico, epidemiológico, radiológico e inmunológico (Cedeño R., 2004).
La no observación de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) en una muestra
clínica no descarta el diagnóstico de tuberculosis, ya que es una técnica de sensibilidad
limitada. La reducción del número de bacilos emitidos por el enfermo orienta sobre la
eficacia del tratamiento siempre que se acompañe de una mejoría de sus síntomas
clínicos. Cuando los pacientes bacilíferos son tratados con regímenes de primera
elección suelen negativizar sus esputos a partir de las 2 o 3 semanas de tratamiento. No
obstante, en algunos pacientes se negativizan antes los cultivos que las baciloscopías,
esto es debido a que los bacilos que se siguen eliminando están lo suficientemente
lesionados por el tratamiento para que no sean capaces de desarrollarse en los cultivos y
en muchos de los casos esto da lugar a la presencia de falsos positivos de la
baciloscopía. (Kulski, 1996).
A pesar de la positividad de la baciloscopía, estos pacientes no suelen tener
capacidad contagiante. En los casos de TB pulmonar se deben remitir tres muestras de
esputo de buena calidad, de la primera hora de la mañana, en días distintos. La
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baciloscopía es positiva en un 65 por ciento de los casos cuando se procesan tres esputos
(en las formas cavitadas en hasta un 95 por ciento) frente a un 30 por ciento con una
muestra aislada (Bennensed, 1996).
La baciloscopía es la técnica de elección en el diagnóstico de la TB, más sin
embargo el rendimiento en la identificación directa depende mucho del tipo de muestra
clínica como en muestras de bajo contenido de bacilos, LCR, líquidos pleurales,
continua siendo muy bajo; y por otro lado no es posible identificar la especie de
mycobacteria ni estudiar su resistencia a los fármacos, pasos imprescindibles en algunas
situaciones. Además la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes en el examen
directo de muestras clínicas, no siempre garantiza que se trate de un bacilo tuberculoso,
ya que puede tratarse de una mycobacteria atípica o de otro microorganismo que
comparta la característica de ácido alcohol resistencia ( M. leprae, Actinomyces,
Nocardia ). Esto puede ocasionar graves problemas en el diagnóstico y la terapéutica. El
rango de sensibilidad de la baciloscopía, oscila entre 50 – 80% y la especificidad oscila
entre 80 al 90% (Nava P., 2005).
Debido a las limitaciones dentro de las técnicas microbiológicas una de las
técnicas que ha venido a ser un apoyo más en el diagnóstico de la tuberculosis son las
fluorescentes utilizando la tinción de auramina – rodamina las cuales se basan en el
mismo principio de la ácido-resistencia característica del bacilo, con la ventaja de que
estas proporcionan una visualización más cómoda, y alcanza a detectar bacilos a una
cantidad más baja de 1,000 bacilos por mililitro de expectoración y son más rápidas en
comparación con las baciloscopías, las cuales no han tenido gran uso debido a la
dificultad que tienen en su gran mayoría los laboratorios para tener el equipo adecuado
para realizar el diagnóstico (Zenteno, 2003).
Cultivos
El cultivo de mycobacterias es el único método que permite asegurar y dar un
diagnóstico con certeza mediante la observación correspondiente del bacilo, así como es
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el único completamente válido para evaluar el seguimiento y curación del paciente
tuberculoso, motivo por el cual es considerado el estándar de oro en el diagnóstico de
TB. Los resultados del cultivo dependen en gran medida de los pasos previos a este, que
son la digestión y descontaminación de residuos orgánicos que le permitirán al bacilo de
Koch poder desarrollarse en el medio de cultivo sólido, sin embargo si estos procesos no
se llevan de manera adecuada, puede afectar la viabilidad de las mycobacterias presentes
en la muestra y dar lugar a falsos cultivos negativos debido a un exceso de
descontaminación ( Fagundo SR., 2004).
Los cultivos son mucho más sensibles que la baciloscopía, pudiendo detectar una
cantidad tan pequeña de bacterias, basta con que existan más de 10 bacilos por mililitro
en muestras digeridas o concentradas, para que sea positivo. El aislamiento en cultivo
puro es necesario para poder identificar correctamente las cepas aisladas; y los medios
de cultivo tradicionales que hasta la actualidad se han empleado para diagnóstico son
Löwenstein-Jensen, o el agar 7H10 y 7H11 de Middlebrook.
Los métodos de identificación convencionales después del cultivo incluyen
determinación de la velocidad de crecimiento, crecimiento a diferentes temperaturas,
morfología de la colonia, producción de pigmentos y susceptibilidad a los agentes. De
tal manera que en los casos en los que se requiera una toma de decisión rápida para
instaurar una terapéutica efectiva su valor es muy limitado. El mayor inconveniente del
cultivo convencional se deriva de la lenta capacidad de división de M. tuberculosis. Este
hecho motiva que el tiempo transcurrido entre la recepción de la muestra y la emisión
del resultado sea superior a 4-6 semanas en los medios sólidos convencionales, tiempo
excesivamente elevado para esperar un diagnóstico de certeza. Algunas mycobacterias,
muchas de ellas relacionadas con SIDA como M. hamophilum, M. malmoense, M.
genavens, exigen suplementar los medios de cultivo con factores de crecimiento
especiales como hemina, sangre, mycobactina o citrato amónico férrico. La incubación
de los medios sembrados en una atmósfera enriquecida con un 5-10% de CO2 favorece
el crecimiento de M. Tuberculosis (Folgueira, 1996).
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Estos métodos sólidos ofrecen las ventajas de su mayor sencillez de realización,
la posibilidad de realizar conteo de colonias, con la importancia que ello conlleva en el
seguimiento del tratamiento de pacientes. Sin embargo, tiene el inconveniente ya
expuesto de su lento crecimiento y de su lectura manual que puede ser la causa de
algunos errores. Estos inconvenientes han llevado a la búsqueda de técnicas más rápidas
y sensibles, y han permitido introducir nuevos métodos de cultivo, entre los que destacan
los métodos radiométricos (sistema Bactec), los cuales utilizan ácido palmítico con
carbono marcado, que al ser utilizado por las mycobacterias en crecimiento van a
producir CO2 marcado permitiendo su cuantificación por radiometría de la radiactividad
emitida por el CO2 marcado. Así también se han desarrollado los medios de cultivo
bifásicos (MB-Septi-Check) y las técnicas usadas para aislar mycobacterias de la sangre
(hemocultivo), son sistemas no radioactivos, totalmente automatizados, que han
permitido reducir el tiempo de detección de 11 a 15 días promedio en cada sistema,
permiten diferenciar de 3 a 5 días si el cultivo es positivo para TB y tienen mayor
sensibilidad (Robledo J. y Col., 2001)
Desafortunadamente tales pruebas tienen la desventaja de que son costosas en su
inicio, requieren de personal altamente calificado debido a la manipulación de material
radioactivo en el caso de los métodos radiométricos, y su sensibilidad y especificidad de
ambas técnicas radiométricas o no, son muy variables de uno a otro laboratorio. Por lo
tanto no están disponibles en todos los países en vías de desarrollo, y en el caso de un
diagnóstico precoz y específico no son lo suficientemente útiles (Eing, 1998).
Prueba de Tuberculina
Esta técnica es de poco valor diagnóstico, la prueba es una reacción cutánea de
hipersensibilidad que indica la existencia de infección por TB previa más no la
enfermedad. Se lleva a cabo con un derivado proteico etanólico purificado (PPD) de M.
tuberculosis (Portillo, 1996).
Este debe administrarse de forma intradérmica, aplicando en la cara anterior del
brazo 0.1ml de tuberculina que equivale a 5 Unidades de PPD. Las reacciones deben
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leerse midiendo el diámetro transverso de la zona de induración entre las 48 y 72 horas.
En la cual se ha recomendado que la prueba se considere positiva a partir de 5 mm; cabe
mencionar que pude dar positiva si el paciente ha tenido contacto con otras
mycobacterias no tuberculosas, en pacientes que han sido vacunados contra la TB con
BCG, el examen puede ser positivo durante un periodo aproximado de 10 años, en estos
casos se considera positiva cuando la reacción sea mayor de 14 mm (Portillo, 1996).
Debido a la reacción cruzada que se presenta en esta técnica con la vacuna BCG,
lo que arroja falsos positivos o falsos negativos, ha dado pie al desarrollo de un sistema
de diagnóstico para una infección latente de TB, donde se mide la cantidad de interferón
gamma producido por las células sanguíneas totales o de las células mononucleares de
sangre periférica previamente estimuladas con derivados proteicos purificados de
tuberculosis o antígenos más específicos. Sin embargo, el empleo de antígenos más
específicos aún sigue en estudio para su aprobación final (Guevara, 2003).
Métodos Serológicos
Uno de los métodos de diagnóstico para la tuberculosis que mayor potencialidad
de empleo ha demostrado ser el ensayo inmune ligado a enzima (ELISA). Mediante este
sistema es posible identificar anticuerpos circulantes específicos contra antígenos de
Mycobacterium y, de esta manera, indicar una infección. Este sistema genera resultados
en cuestión de horas y con sensibilidades que oscilan del 95 al 98% y especificidades del
85 al 92%, dependiendo del antígeno empleado. Posee las ventajas adicionales de que
permiten evaluar el nivel de respuesta inmune ante la infección bacteriana, es decir,
discernir cuándo se presentan bacterias vivas y muertas en el huésped, es más fácil de
estandarizar y necesita menos reactivos y equipamiento. Esta técnica ofrecería el mayor
potencial para la realización de pruebas serológicas rápidas y podría ser de gran valor
cuando sea difícil obtener muestras de esputo, como sucede en el caso de los niños y en
pacientes con tuberculosis extrapulmonar (Hermans M. PW., 1990).
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Con todo, las técnicas de inmunodiagnóstico tienen la desventaja de presentar
variaciones dependiendo del antígeno empleado, arroja falsos positivos por mal manejo
de los reactivos o contaminación de la muestra, y se necesita personal altamente
capacitado y equipo especializado para la lectura de las muestras, por lo regular caro, lo
cual limita su empleo en los países pobres. Por otro lado, la habilidad de la micobacteria
de infectar un paciente y permanecer latente por muchos años antes de su reactivación es
un obstáculo clave para el control y eliminación de la tuberculosis y las fallas en la
identificación y tratamiento de individuos latentemente infectados permite continuar con
la cadena de transmisión. El diagnóstico de tuberculosis latente se ha realizado a través
de la prueba de la tuberculina, sin embargo, el proceso de vacunación con BCG en
muchas ocasiones da lugar a una reacción cruzada con esta prueba, y en otras genera un
proceso de anergia, lo que arroja falsos positivos o falsos negativos. Debido a esto se a
derivado una técnica de ELISA llamada ELISPOT, que ha permitido desarrollar un
sistema de diagnóstico más para una infección latente. El sistema mide la cantidad de
interferón gama producido por las células mononucleares de sangre periférica
previamente estimuladas por antígenos específicos o por derivados proteicos purificados
(PPD). Con la finalidad de evitar falsos positivos actualmente se están desarrollando
nuevos sistemas inmuno-enzimáticos que empleen otros antígenos no presentes en la
vacuna, los cuales aún no se han aprobado (Guevara, 2003).
Nuevas Estrategias en el Diagnóstico para TB
Técnicas de Biología Molecular
Durante la última década se han desarrollado una serie de técnicas de biología
molecular que permiten la amplificación de secuencias de ADN y ARN específicas de
M. tuberculosis. Esta tecnología ha logrado solucionar, al menos en parte, los principales
problemas inherentes a las técnicas microbiológicas convencionales, permitiendo
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establecer diagnósticos rápidos entre 2 y 8 horas, y mejorar la sensibilidad de las
técnicas clásicas. Esto es particularmente importante en las muestras clínicas de origen
extrapulmonar en las que el inóculo mycobacteriano es habitualmente bajo (Rodríguez,
2000).
Debido a la óptima sensibilidad y especificidad de estas técnicas de
amplificación cercana al 100 por ciento, cuando son aplicadas a muestras con
baciloscopía positiva tanto respiratorias como extrarrespiratorias, un valor positivo de
amplificación establecería el diagnóstico de TB. En este tipo de muestras, un valor
negativo de amplificación aseguraría la presencia en la muestra de una mycobacteria no
perteneciente al complejo M. tuberculosis. En muestras con baciloscopía negativa, y
debido a la excelente especificidad de estas técnicas, un valor positivo de la
amplificación establecería con relativa seguridad un diagnóstico de TB. Por último, un
valor negativo de amplificación obtenido en muestras con baciloscopía negativa
descarta el diagnóstico de TB (Méndez Álvarez S., 2004).
A pesar del aporte de éstas técnicas de amplificación al diagnóstico de TB, han
presentado grandes inconvenientes y la principal radica en que se diagnostican falsos
positivos con gran facilidad debido a la contaminación de los reactivos causados por un
personal mal capacitado, a la posibilidad de formación de aerosoles en el ambiente con
amplicones, por lo que se ha visto en la necesidad de trabajar en ambientes separados
dentro del mismo laboratorio, se recomienda el uso de distinto vestuario de una sección
a otra en la preparación de reactivos (Soylemez, 2005).
Solventando los problemas que existieron en un inicio, en la actualidad se
dispone en el mercado de una gran variedad de sistemas de amplificación, que proveen
todos los reactivos necesarios y que permiten trabajar en condiciones estandarizadas. El
desarrollo y perfeccionamiento de la PCR ha ido seguida del diseño de nuevos sistemas
de amplificación genética de segunda generación: amplificación de hebra por
desplazamiento “strand displacement amplification” (SDA), reacción en cadena de la
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ligasa (LCR), Q-beta replicasa, amplificación mediada por transcripción (TMA), etc
(Soini, 2001).
En general, todos estos sistemas necesitan de tres pasos fundamentales: 1)
preparación de la muestra, dirigida a eliminar las posibles substancias inhibidoras de la
reacción de amplificación, 2) amplificación del ácido nucleico específico del complejo
M. tuberculosis, disponiéndose de diferentes formatos que permiten amplificar tanto
ADN como ARN mycobacteriano; y 3) detección del producto amplificado, mediante
diferentes métodos (Loera, 2003).
Las técnicas de amplificación disponibles en la actualidad para el diagnóstico de
la TB se pueden clasificar según la naturaleza del ácido nucleico a amplificar, ADN o
ARN (Yang, 2001).
Técnicas que amplifican el ARN mycobacteriano
Amplificación mediada por transcripción (TMA) o RT - PCR
El sistema AMTDT-2 la prueba directa de amplificación de M. tuberculosis por
sus siglas en inglés (Amplified M. tuberculosis Direct Test) se basa en la amplificación
de ARN ribosomal mediante la síntesis de ADN complementario y ARN, utilizando una
mezcla enzimática compuesta por la transcriptasa inversa y la ADN polimerasa.
Es un proceso isotérmico y autocatalítico diseñado para amplificar ARN
ribosomal 23S mycobacteriano; totalmente manual, que no requiere instrumentos ni
instalaciones sofisticadas, fácilmente aplicable a cualquier laboratorio y que permite
obtener resultados rápidos (menor de 4 horas), con una elevada sensibilidad y
especificidad (Rosino, 2004).
21
Por su parte, el sistema AMTDT-3, similar al previo, ofrece la ventaja de la
completa automatización de los procesos de amplificación y detección del producto
amplificado, así como la incorporación de un control interno de amplificación , a pesar
de esto una barrera que no ha permitido el uso de esta técnica es debido a falta de acceso
en los laboratorios de países subdesarrollados.
Q-Beta-replicasa
Descrito inicialmente en 1988, se basa en la incorporación de un oligonucleótido
diseñado para unirse específicamente al ácido nucleico diana (ARNr 23S). Es un sistema
completamente automatizado, en el que la detección del producto amplificado se realiza
mediante un ensayo fluorométrico, en donde la cantidad de fluorescencia emitida es
proporcional a la cantidad de ARN amplificado (Kaboev, 2000).
Técnicas que amplifican el ADN mycobacteriano
Amplificación por desplazamiento (SDA)
Este sistema emplea cebadores específicos, ADN polimerasa y una endonucleasa
de restricción, con la finalidad de conseguir una amplificación del ADN diana original
después de 2 horas de reacción. Aunque el sistema es complejo, las etapas de reacción
ocurren individualmente y, una vez iniciada la reacción, no exige más cuidados. Tiene
las ventajas de ser isotérmico, salvo la etapa inicial de desnaturalización a 95ºC, de no
requerir un laboratorio especializado y de que puede ser aplicado sobre una hebra
sencilla o doble de ADN (Schirm, 1995).
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Reacción en cadena de la ligasa (LCR)
La reacción en cadena de la ligasa (LCR) consta de las mismas etapas que la
PCR. Sin embargo, utiliza cuatro iniciadores diseñados para flanquear la región a
amplificar, de tal modo que quedan dispuestos en posiciones adyacentes.
Así, las sondas pueden unirse enzimáticamente, mediante la ADN ligasa, después
de la actuación de la ADN polimerasa, para formar el producto amplificado, que a su vez
servirá de molde para posteriores ciclos de amplificación. El LCx MTB es un sistema
semiautomático en el que la detección del producto amplificado se realiza por una
técnica de inmunoensayo enzimático de micropartículas ( Cohen, 1998)
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Dada a conocer por Kary Mullis, la técnica se basa en la replicación del ADN en
los organismos eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la
síntesis de una cadena complementaria de ADN en el sentido 5’→ 3’ usando un molde
de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región
doble cadena se usan los denominado iniciadores (primers). Son una pareja de
iniciadores sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los
extremos 3’ del fragmento de ADN que se desea amplificar (William Benjamin, 2001).
Aunque es imposible detectar moléculas individuales de ADN, estas pueden ser
amplificadas usando la técnica de la PCR, pueden detectarse secuencias específicas del
ADN en pocas horas, facilitando su análisis cualitativo y cuantitativo con técnicas
comunes de laboratorio. Es de extrema sensibilidad, confiable en un 99% de los casos y
bajo condiciones experimentales óptimas, permite la amplificación de más de un billón
de copias de la secuencia deseada a partir de una sola copia del ADN original (Beige,
1995).
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Partiendo de este principio, la reacción en cadena de la Polimerasa se basa en la
repetición de un ciclo formado por tres etapas:
1) Desnaturalización de la cadena doble de ADN.
2) Hibridación de los iniciadores a la zona 3’ específica de cada una de
las hebras.
3) Extensión, a partir de los cebadores. Esta reacción se desarrolla por la
actuación de una ADN polimerasa (TaqADN polimerasa).
En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos
hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97°C).
La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.
En el segundo paso (hibridación) los iniciadores se unen a las zonas 3’
complementarias que flanquean el segmento que queremos amplificar. Se realiza gracias
a la disminución de la temperatura (50-65°C).
En la tercera etapa (Elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla
(produciéndose un fragmento de doble cadena por complementariedad) en la dirección
5’→ 3’ mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los dNTPs presentes en
el medio siguiendo la cadena molde. Todos estos pasos se pueden apreciar gráficamente
en la figura 2. Estas tres etapas representan un único ciclo de amplificación, y la
repetición de cada ciclo implica un incremento exponencial del producto a amplificar
(Corvalán A.R., 2002).
La detección del producto de la reacción en cadena de la polimerasa se realiza
normalmente mediante el corrido electroforético dependiendo del tamaño de la
amplificación y la resolución deseada se utilizará diferentes medios (agarosa,
poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualización se puede realizar
con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia,
radioactividad; la electroforesis en general permite la separación de las moléculas como
consecuencia de su diferencia de movilidad en un campo eléctrico. Por lo tanto, el
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parámetro esencial es la diferencia de carga eléctrica de las moléculas, cabe mencionar
que la carga depende del pH del medio (Butt, 2004).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), al multiplicar por millones de
veces un fragmento determinado de ADN, es aplicable a la identificación de diferentes
maneras. Se puede proceder de tres formas: 1) Amplificar con los cebadores apropiados
y detectar después un fragmento específico de una determinada especie por
electroforesis y tinción con bromuro de etidio 2) amplificar un fragmento de ADN
común a todas las especies de mycobacterias y posteriormente reconocer el amplificado
con sondas específicas de especie 3) amplificar un fragmento de ADN común a todas
las especies de mycobacterias, someterla a lisis con enzimas de restricción y visualizar
los fragmentos de restricción en gel de agarosa, tras teñir con bromuro de etidio. Esta
metodología, conocida como reacción en cadena de la polimerasa y análisis del
polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (PRC o PCR-RFLP), es de
gran utilidad en la identificación rápida de las especies del género Mycobacterium (Taci,
2003) .
La caracterización de las regiones hipervariables del fragmento 16S ARNr,
específicas de las especies mycobacterianas, ha permitido el desarrollo de un esquema
de identificación de las mycobacterias basado en la secuenciación de sus ácidos
nucleicos. Tras amplificar un fragmento genómico por PCR, se realiza la secuenciación,
y la identificación de especie se logra al comparar el resultado obtenido con las regiones
específicas conocidas de cada especie mycobacteriana. Con esta tecnología se han
podido identificar y describir nuevas especies del género Mycobacterium (Laniado LR.,
2001).
Actualmente se disponen de métodos automatizados para PCR, que incorporan,
además del gran atractivo que supone la automatización, dos novedades importantes: la
introducción de un control interno de amplificación y el uso de partículas magnéticas
unidas a la sonda específica para la captura de amplicones (Miller, 2002).
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Figura 2. Pasos básicos de la PCR
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Marcadores Moleculares en la Tuberculosis
Tradicionalmente, el estudio de la epidemiología de la TB se ha visto dificultado
por la ausencia de marcadores de cepa adecuados. Así, el único marcador utilizado hasta
fechas recientes, el estudio de susceptibilidad a mycobacteriófagos, presenta
limitaciones importantes derivadas de su bajo poder descriminativo. Otros métodos
investigados como el enzimotipo, serotipo y antibiotipo, no han conseguido tener
aplicación práctica en epidemiología (García, 2003).
Segmento de Inserción IS6110
A finales de la década de 1980, Zainuddin y Dale, al buscar plásmidos en
aislamientos clínicos de M. tuberculosis encontraron un elemento dentro del genoma con
características similares a las de un transposón, en número variable y los cuales generaba
patrones de ADN polimórfico. Al poco tiempo, diferentes investigadores en Estados
Unidos y en Europa identificaron estos elementos como secuencias de inserción, y que
por su diversidad dentro del genoma presentaban un poder distintivo de discriminación
suficiente para establecer el parentesco entre los aislados.
A partir de ese momento, se generó una explosión de información referente a la
aplicación de estas metodologías para el reconocimiento de líneas de transmisión,
surgiendo así la epidemiología molecular (Ponce, 1999).
En la actualidad, la aplicación a la epidemiología de las técnicas moleculares
permite establecer con precisión las cepas circulantes en una población. Se ha utilizado
la restricción genómica seguida de electroforesis con alternancia de campos, los patrones
de restricción-hibridación con sondas complementarias de secuencias repetidas en el
genoma de M. tuberculosis, o el polimorfismo de amplificación por PCR. De todos estos
marcadores, el más utilizado por su gran poder descriminativo ha sido el estudio del
polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLP), utilizando la secuencia de
inserción IS6110 que desde 1993 se estableció como estándar (Walter, 1996).
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Existe un protocolo estandarizado que permite comparar los resultados entre
distintos laboratorios y establecer bancos de datos a gran escala. Este marcador puede
utilizarse: a) para conocer el patrón epidemiológico general en una población, b) en el
control de epidemias, c) en la diferenciación de las recaídas de las reinfecciones
exógenas, y d) en el estudio de contaminaciones cruzadas en el laboratorio (Cortinas,
2002).
El genoma de M. tuberculosis contiene, en general, un elevado número de copias
del elemento IS6110, entre cinco y 20, localizadas en posiciones variables a lo largo del
cromosoma, debido a su capacidad de transposición. Por ello, las cepas no relacionadas
epidemiológicamente presentan patrones de restricción-hibridación propios y, por lo
tanto, un elevado grado de polimorfismo (Neimark, 1996).
Contrariamente, las relacionadas epidemiológicamente muestran patrones
idénticos, pudiendo establecerse fácilmente una relación de clonalidad. No ocurre lo
mismo en el caso de cepas sin ninguna copia de IS6110 en su cromosoma, o con un
número muy reducido de copias integradas, normalmente, en posiciones constantes. En
estos casos es necesario diferenciar las cepas no relacionadas epidemiológicamente
mediante otros marcadores moleculares que ofrezcan un mayor grado de polimorfismo
(Mulcahy M.G.,1996).
Es necesario resaltar que, aunque estos estudios pueden ser de gran utilidad en
conocer la dinámica de la transmisión en la comunidad, sus resultados deben ser
adecuadamente interpretados, y siempre ser evaluados conjuntamente con lo que aporta
la epidemiología convencional (Mathema y Col., 2002).