Anti-liver_kidney Microssomal Antibody

8/6/2019 Anti-liver_kidney Microssomal Antibody

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C l i n .e x p .I m m u n o l .( 1 9 8 7 )6 9 ,5 4 3 - 5 4 9

C h a r a c t e r i z a t i o no f a n t i - l i v e rk i d n e ym i c r o s o m a la n t i b o d yi n c h i l d h o o da u t o i m m u n ec h r o n i ca c t i v eh e p a t i t i s :

e v i d e n c ef o rI g G 1s u b c l a s sr e s t r i c t i o n ,p o l y c l o n a l i t ya n d n o nc r o s s - r e a c t i v i t yw i t h h e p a t o c y t es u r f a c e a n t i g e n s

M. PEAKMAN,AVA LOBO-YEO,GIORGINA MIELI-VERGANI,E . T . DAVIES,A . P . MOWAT & D . VERGANI D e p a r t m e n t so f I m m u n o l o g ya n d C h i l dH e a l t h ,

K i n g ' sC o l l e g eS c h o o lo fM e d i c i n ea n dD e n t i s t r y ,L o n d o n

( A c c e p t e d f o rp u b l i c a t i o n1 8 M a r c h1 9 8 7 )

SUMMARY

An i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c et e c h n i q u ew a s u s e d t o i n v e s t i g a t et h ei m m u n o g l o b u l i nc l a s s ,I g G s u b c l a s s ,l i g h tc h a i n t y p ea n d c o m p l e m e n tf i x i n ga b i l i t yo f a n t i - l i v e rk i d n e ym i c r o s o m a la n t i b o d y( a n t i - L K M )i n t h e s e r ao f s i x c h i l d r e na n d f i v ea d u l t sw i t ha u t o i m m u n ec h r o n i ca c t i v eh e p a t i t i s( a C A H ) .Anti-LKM t i t r e sr a n g e df r o m 1 / 8 0t o1 / 2 0 , 4 8 0 .I n t h ec h i l d r e n ,t h ea n t i b o d yb e l o n g e dt o t h eI g G I s u b c l a s sa l o n e( t i t r e1 / 8 0 - 1 /2 0 , 4 8 0 )a n d w a sa b l et o f i xc o m p l e m e n t( t i t r e1 / 4 0 - 1 / 5 1 2 0 ) .I n t h ea d u l tg r o u p ,a n t i b o d yb e l o n g e dt o t h eI g G I s u b c l a s si nt h r e ec a s e s ( t i t r e1 / 4 0 - 1 / 6 4 0 )w h i l s tt w o

b e l o n g e dt ob o t h

I g G I ( t i t r e1 / 6 4 0 )a n d I g G 4( t i t r e1 / 4 0 ,1 / 6 4 0 ) .S u c hs u b c l a s sr e s t r i c t i o ni s s i m i l a rt o t h a tf o u n di no t h e ra u t o i m m u n ed i s o r d e r sa n dm a y b e g e n e t i c a l l yd e t e r m i n e d .I n v e s t i g a t i o no ft h el i g h tc h a i n c o n s t i t u e n to f a n t i - L K Mr e v e a l e dt h a tt h ek a p p at o l a m b d ar a t i ow a sc o n s i s t e n tw i t ha p o l y c l o n a la n t i b o d yr e s p o n s e .To i n v e s t i g a t et h en a t u r eo f t h ea n t i g e nt ow h i c ha n t i - L K Mi s d i r e c t e d ,t h ea b i l i t yo f t h e s es e r at o b i n d t o t h es u r f a c em e m b r a n eo fi s o l a t e dh u m a n h e p a t o m ac e l l s( A l e x a n d e rc e l l s )w a si n v e s t i g a t e d .F o u ro f t h e e l e v e ns e r as h o w e ds i g n i f i c a n tb i n d i n ga c t i v i t y .P r i o ri n c u b a t i o no f t h e s ef o u rs e r aw i t h A l e x a n d e rc e l l sa b o l i s h e dt h e i rm e m b r a n eb i n d i n ga c t i v i t y ,b u t d i d n o t a l t e rt h ea n t i - L K Mt i t r e .T h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a ta n t i - L K Mb i n d st oc y t o p l a s m i cc o n s t i t u e n t sa l o n ea n dd o e sn o tc r o s s - r e a c tw i t h s u r f a c ea n t i g e n s .

K e y w o r d sa n t i - L K Ma n t i b o d y c h r o n i ca c t i v eh e p a t i t i ss u b c l a s sr e s t r i c t i o n

I N T R O D U C T I O N

T h ea n t i - L K Ma n t i b o d yw a sf i r s td e s c r i b e db y R i z z e t t o ,S w a n a& D o n i a c h( 1 9 7 3 )a n d d e f i n e sas u b g r o u po f aCAH i nc h i l d r e na n dy o u n ga d u l t sw i t ha b a dp r o g n o s i s( M a g g i o r ee ta l . ,1 9 8 6 ;S m i t he t a l . , 1 9 7 4 ) .I t h a s a c h a r a c t e r i s t i ci m m u n o f l u o r e s c e n c ep a t t e r n ,b i n d i n g t o c y t o p l a s m i cc o n s t i t u e n t so f h e p a t o c y t e sa n dp r o x i m a lr e n a lt u b u l a rc e l l s .O u ri n t e r e s ti nt h en a t u r eo f a n t i - L K Mh a s b e ens t i m u l a t e db y r e c e n te v i d e n c et h a ti no t h e ra u t o i m m u n ed i s o r d e r s ,a u t o a n t i b o d i e se x h i b i ts u b c l a s sr e s t r i c t i o n .I n H a s h i m o t o ' st h y r o i d i t i s ,f o r e x a m p l e ,t h ea n t i - m i c r o s o m a la n t i b o d yi sc o n f i n e dt o t h eI g G I a n d I g G 4s u b c l a s s e s , w h i l s tt h ea n t i - t h y r o g l o b u l i na n t i b o d yi sp r e d o m i n a n t l yI g G 4( P a r k e se t a l . ,1 9 8 4 ) .T h e r ei s p r e f e r e n t i a lp r o d u c t i o no f I g G 3a n t i - m i t o c h o n d r i a la n t i b o d i e si n p r i m a r yb i l i a r yc i r r h o s i s( R i g g i o n e ,S t o k e s& T h o m p s o n ,1 9 8 3 ) .T h e a n t i b o d i e st o d o u b l e -

C o r r e s p o n d e n c e :Dr D . Ve r g a n i , D e p a r t m e n to f I m m u n o l o g y ,K i n g ' s C o l l e g eS c h o o lo f M e d i c i n ea n dD e n t i s t r y ,D e n m a r kH i l l ,L o n d o nS E 5 8 R X ,UK.

5 4 3


2/7

s t r a n d e dDNA w h i c ha r eh i g h l ys p e c i f i cf o r t h ed i a g n o s i so f s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u sa r er e s t r i c t e dt o t h e I g G I a n d I g G 3s u b c l a s s e s( Z o u a l i ,J e f f e r i s& E y q u e m ,1 9 8 4 ) .One p o s s i b l ee x p l a n a t i o nf o rt h i ss u b c l a s sr e s t r i c t i o nw o u l db ea c l o n a l l yr e s t r i c t e dB l y m p h o c y t er e s p o n s e ,i nw h i c hc a s ea n t i b o d yp r o d u c t i o nw o u l di na d d i t i o nb e r e s t r i c t e dt oa p a r t i c u l a rl i g h tc h a i n ,k a p p ao rl a m b d a .I n t h i ss t u d yw e h a v ec h a r a c t e r i z e da n t i - L K Ma n t i b o d yi n t e r m s o f i t si m m u n o g l o b u l i nc l a s s ,I g Gs u b c l a s s ,l i g h tc h a i n e x p r e s s i o na n d c o m p l e m e n tf i x i n ga b i l i t y.

T h en a t u r ea n d s i t eo f t h ea n t i g e nt o w h i c ha n t i - L K Mi s d i r e c t e da n d ,t h e r e f o r e ,t h er o l eo f t h ea n t i b o d yi nt h ep a t h o g e n e s i so faCAH i su n c l e a r .I t i sw e l le s t a b l i s h e dt h a tt h ei m m u n o f l u o r e s c e n c ep a t t e r nr e l a t e st o a n t i g e n si n t h em i c r o s o m a lf r a c t i o no f t h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u m( R i z z e t t o ,B i a n c h i& D o n i a c h ,1 9 7 4 ) ,b u tc o n t r o v e r s ye x i s t sa s t o w h e t h e rt h ea n t i b o d ya l s oc r o s s - r e a c t sw i t hl i v e rc e l lm e m b r a n ea n t i g e n s ,w h i c hw o u l di n d i c a t ea d i r e c t r o l ei n t h em e d i a t i o no f c e l ld a m a g e .L e n z ie ta l .( I 1 9 8 4 )f o u n dt h a ta n t i - L K Mp o s i t i v es e r ar e a c t e dw i t ha n t i g e n i cd e t e r m i n a n t se x p r e s s e do n t h es u r f a c eo f i s o l a t e dm o u s e h e p a t o c y t e s .I n a d d i t i o n ,a n t i - L K Ms p e c i f i c i t yw a s a b s o r b e db yp r e - i n c u b a t i o no f t h es e r aw i t hi n t a c tm o u s el i v e rc e l l s ,s u g g e s t i n gt h a ta n t i - L K Mc r o s s - r e a c t sw i t hm e m b r a n ea n t i g e n s .I n c o n t r a s t ,A l v a r e ze t a l .( 1 9 8 5 )h a v e s h o w nt h a tt h em a j o rt a r g e to f a n t i -

LKM i s a n i n t e g r a lm e m b r a n ep r o t e i no f t h es m o o t he n d o p l a s m i cr e t i c u l u mo f r a t h e p a t o c y t e sw h i c hi s n o t e x p r e s s e do n t h el i v e rp l a s m ac e l lm e m b r a n e .C e l ls u r f a c eb i n d i n g e x p e r i m e n t sonn o r m a lh u m a nh e p a t o c y t e sa r eh a m p e r e db y t h ed i f f i c u l t y i no b t a i n i n gn o r m a lhuman l i v e ra ss u b s t r a t e .I na n a t t e m p tt oc l a r i f yt h er e a c t i v i t yo fa n t i - L K Mi nr e l a t i o nt oc e l ls u r f a c ea n t i g e n s ,weh a v e i n v e s t i g a t e dw h e t h e rt h ea n t i b o d yi s d i r e c t e da g a i n s ta n t i g e n so n t h ehuman h e p a t o c y t em e m b r a n eu s i n gA l e x a n d e rc e l l s( P L C / P R F / 5 ) ,a h e p a t o m ac e l ll i n ew h i c hs h a r e sa n t i g e n si nc o m m o nw i t hn o r m a lh u m a nh e p a t o c y t e ss u c h a s d e t e r m i n a n t sp r e s e n ti n t h eLSP ( l i v e rs p e c i f i cl i p o p r o t e i n )c o m p l e xa n d L M A g( l i v e rm e m b r a n ea n t i g e n )( C h i s a r ie t a l . ,1 9 8 1 ) .

MATERIALS AND METHODS

P a t i e n t s .A n t i - L K Mp o s i t i v es e r a w e r e o b t a i n e df r o m s i xc h i l d r e n( o n em a l e ,f i v ef e m a l e s ;m e d i a na g e 1 2 5 y e a r s ,r a n g e6 t o 1 9 )a n df i v ea d u l t s( a l lf e m a l e ;m e d i a na g e 3 1y e a r s ,r a n g e2 7 t o 4 2 )a l lw i t h a d i a g n o s i so faCAH m a d ea c c o r d i n gt o i n t e r n a t i o n a l l ya g r e e dc r i t e r i a( L e e v y ,P o p p e r&S h e r l o c k ,1 9 7 6 ) .S e r ah a d b e e n s t o r e da t - 7 0 Cf o ru p t o 5 y e a r sa n d w e r e d e c o m p l e m e n t e db yi n c u b a t i n ga t 5 6 Cf o r3 0m i n . I n t h ec a s e s o fS . B .a n d P. H . ,s e r a f r o mtwo d i f f e r e n tp e r i o d so f t h ed i s e a s ew e r e i n v e s t i g a t e d ,s e p a r a t e db y I a n d 5 y e a r sr e s p e c t i v e l y .E i g h tp a t i e n t sw e r e o ni m m u n o s u p p r e s s i v et r e a t m e n tw i t hp r e d n i s o l o n e( 02 5 - 0 - 5m g / k g / d a y )e i t h e ra l o n eo r i nc o m b i n a -t i o nw i t h a z a t h i o p r i n e( 1 - 5m g / k g / d a y )o r p e n i c i l l a m i n e( 2 0m g / k g / d a y ) .

C h a r a c t e r i z a t i o no fa n t i - L K Ma n t i b o d y.I m m u n o g l o b u l i nc l a s s ,l i g h tc h a i n t y p ea n d c o m p l e -m e n tf i x i n g a bi l i t yo f a n t i - L K Ma n t i b o d i e sw e r e d e t e r m i n e db yc o n v e n t i o n a lt w o - o r t h r e e - s t e pi n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s e n c e( I F L )( T h o m p s o n ,1 9 8 1 ) .B r i e f l y ,u n f i x e d5 y i mc r y o s t a ts e c t i o n so f r a tl i v e r ,k i d n e y ,s t o m a c ha n d p a n c r e a sw e r e u s e d a s s u b s t r a t e .F i f t ym i c r o l i t r e so f t e s t s e r a w e r ei n c u b a t e dw i t ht h es u b s t r a t ef o r3 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r ea t a s t a r t i n gd i l u t i o no f 1 / 2 0i np h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e( P B S , p H 7 2 ) a n d f u r t h e rd o u b l e d i l u t e dt o e x t i n c t i o no f t h ec h a r a c t e r i s t i cLKM p a t t e r n .T h et i t r eo fa n t i - L K Mw a s d e t e r m i n e db ya d d i n g5 0 P Io f f l u o r e s c e i ni s o - t h i o c y a n a t ec o n j u g a t e d( F I T C )a n t i - t o t a lh u m a n i m m u n o g l o b u l i n( U n i p a t h )d i l u t e d1 / 3 0i nP B S .T h ei m m u n o g l o b u l i nc l a s sa n d l i g h tc h a i n t y p ew e r e d e t e r m i n e db yu s i n g5 0P Io f F I T C a n t i -I g G , a n t i - I g M ,a n t i - I g A( We l l c o m e ) ,a n t i - k a p p aa n d a n t i - l a m b d a( D a k o )a t d i l u t i o n so f 1 / 3 0i nP B S .T h ea b i l i t yo f a n t i - L K Mt o f i xc o m p l e m e n tw a s d e t e r m i n e db yi n c u b a t i o na t 3 7 Cf o r3 0 m i no f t h e

s u b s t r a t e s ,p r e v i o u s l yi n c u b a t e dw i t h

p a t i e n t s 's e r a ,w i t h

g u i n e ap i gs e r u m d i l u t e d1 / 5i nPB S

a s a s o u r c e o f c o m p l e m e n t .F i x e dc o m p l e m e n tw a s r e v e a l e du s i n gF I T C g o a ta n t i - g u i n e ap i gC 3( C a p p e l ) .T i t r a t i o nt o e x t i n c t i o nw a s p e r f o r m e di n a l l t h e s ee x p e r i m e n t s .P r e p a r a t i o n sw e r ea n a l y s e d u s i n ga P o l y v a rf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e .A s c o n t r o l st h ea s s a y s w e r e p e r f o r m e di ni d e n t i c a lf a s h i o nb u t a d d i n gt o t h es u b s t r a t e sa s f i r s tr e a g e n te i t h e rp o o l e dn o r m a ls e r u m or PB Sa l o n e .

I g Gs u b c l a s s e so fa n t i - L K M .I g Gs u b c l a s s e sw e r e i n v e s t i g a t e di n a s i m i l a r ,t h r e e - s t e pi n d i r e c tI F L a s s a y u s i n gm u r i n em o n o c l o n a la n t i b o d i e s( M o A b ) ;a n t i - I g G l( c l o n eNL 16 ,c o d e BAM 1 5 ) ,

M. P e a k m a ne t a l .4 4


3/7

C h a r a c t e r i z a t i o no f a n t i - l i v e rk i d n e ym i c r o s o m a la n t i b o d ya n t i - I g G 2( c l o n eGOM 1 ,c o d eBAM 1 0 ) ,a n t i - I g G 3( c l o n eZ G 4 ,c o d eB A M 0 8 )a n da n t i - I g G 4( c l o n eR J 4 ,c o d eBAM I1 ;a l lU n i p a t h ) .T h es p e c i f i c i t ya n d r e a c t i v i t yo f t h e s eM o A bh a v eb e e ne v a l u a t e di na l a r g eW o r l dH e a l t hO r g a n i z a t i o nc o l l a b o r a t i v es t u d y( J e f f e r i se t a l . ,1 9 8 5 )a n d t h eM o A bu s e di n t h i ss t u d yg a v ea d e q u a t ep e r f o r m a n c e s .T h ea u t h o r so f t h es t u d yc o n c l u d et h a tn o M o A bw i t hp u t a t i v ea n t i - I g G 2s p e c i f i c i t yi s c o m p l e t e l ys a t i s f a c t o r yi n a l l t h ea s s a y s t e s t e d .C l o n eGOM 1 ,h o w e v e r ,p r o d u c e do n e o f t h eb e s ta n t i - I g G 2s p e c i f i c i t i e s .

To e s t a b l i s ht h ew o r k i n gc o n d i t i o n so f t h et h r e e - s t e pi n d i r e c tI F L t e c h n i q u ea n d t h es e n s i t i v i t yo f t h eM o A bi n d e t e c t i n gI g G s u b c l a s s e si n t h i sa s s a y ,p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t sw e r e p e r f o r m e du s i n gs e r a f r o m1 0p a t i e n t sw i t hp r i m a r yb i l i a r yc i r r h o s i sw i t ha n t i - m i t o c h o n d r i a la n t i b o d y( A M A )w h i c hi sknown t o c o n t a i na l lt h eI g Gs u b c l a s s e s( R i g g i o n ee ta l . ,1 9 8 3 ) .T i t r e so f AMA r a n g e df r o m1 / 4 0( f i v ep a t i e n t s )t o 1 / 6 4 0 .P a t i e n ts e r ad i l u t e d1 / 1 0 i nPBS w a si n c u b a t e dw i t hs u b s t r a t ef o r3 0 m i nf o l l o w e db yt h ea d d i t i o no f M o A bd i l u t e d1 / 1 0i n P B S .A f t e r i n c u b a t i o nf o r3 0 m i n ,s u b c l a s s e so fAMA w e r e v i s u a l i z e db y a d d i n gF I T C r a b b i ta n t i - m o u s ei m m u n o g l o b u l i n( D a k o p a t t s )d i l u t e d1 / 5 0i n PBS a n d i n c u b a t e df o r3 0 m i n . A l lf o u rI g G s u b c l a s s e sw e r ed e t e c t e di n n i n e p a t i e n t sa n dI g G l ,I g G 2a n d I g G 3d e t e c t e di n o n e p a t i e n tw h o s eAMA t i t r ew a s 1 / 4 0 .

T h ed i l u t i o no fM o A bt o b eu s e d i n t h ea s s a yw a se s t a b l i s h e db y p e r f o r m i n gb l o c kt i t r a t i o n so fp o s i t i v es e r a u s i n gM o A bd i l u t i o n so f 1 / 1 0 ,1 / 2 5 ,1 / 5 0a n d 1 / 1 0 0 ,d o u b l ed i l u t i o n so f t e s ts e r af r o m1 / 4 0t o e x t i n c t i o na n d a f i x e dd i l u t i o no f 1 / 5 0o f F I T C r a b b i ta n t i - m o u s ei m m u n o g l o b u l i n .T h ed i l u t i o no f M o A b c h o s e nw a s 1 / 2 5w h i c hw a s i n a l l c a s e st o w a r d st h e e n d - p o i n to f t h eb l o c kt i t r a t i o n( J o h n s o n ,H o l b o r r o w& D o r l i n g ,1 9 7 8 ) .

H e p a t o m ac e l ls u r f a c eb i n d i n ga s s a y .C e l l sf r o mt h eA l e x a n d e rh e p a t o m ac e l l l i n e ,g r o w i n gi n am o n o l a y e r ,w e r ei s o l a t e db y t r y p s i nd i g e s t i o n( 0 - 2 5 % )f o r1 0m i na t 3 7 0 Ca n d t h e n w a s h e dt w i c ei nM i n i m a lE s s e n t i a lMedium( M E M ) .O n eh u n d r e dm i c r o l i t r e so f h e a t - i n a c t i v a t e dt e s ts e r a ,d i l u t e d1 / 1 6 0i n MEM,w e r e i n c u b a t e dw i t h 1 x I 0 5c e l l sa t r o o mt e m p e r a t u r ef o r1 h . A f t e r t w ow a s h i n g s ,t o r e v e a lt h ep r e s e n c eo f a n t i b o d yb o u n dt o t h ec e l lm e m b r a n e ,t h eA l e x a n d e rc e l l sw e r e i n c u b a t e da t r o o m t e m p e r a t u r ew i t h 5 0 M Io f I 2 5 - P r o t e i nA ( 7 0 - 7 2 , 0 0 0c t / m i n )f o r4 5 m i n .A f t e r f u r t h e rw a s h i n g st h er a d i o a c t i v i t y a s s o c i a t e dw i t h t h ec e l lp e l l e tw a sd e t e r m i n e du s i n g a G a m m ac o u n t e r .C o n t r o l sc o n s i s t e do f A l e x a n d e rc e l l si n c u b a t e dw i t h 5 0p io f I 2 5 - P r o t e i nA i n t h ea b s e n c eo f s e r u mo r i n t h ep r e s e n c eo f s e r u mf r o mn o r m a ls u b j e c t s .To a s s e s sw h e t h e re n z y m a t i ci s o l a t i o nd e s t r o y sc e l ls u r f a c et a r g e t so f a n t i - L K Ma n t i b o d y ,t h eA l e x a n d e rc e l lm o n o l a y e rw a sm e c h a n i c a l l yi s o l a t e dw i t h a r u b b e r p o l i c e m a n .T h e l e v e l so f b i n d i n go b t a i n e dw i t h m e c h a n i c a l l yo r e n z y m a t i c a l l yi s o l a t e dc e l l sw e r e s i m i l a r .

A n t i - A l e x a n d e rc e l la n t i b o d i e sd e t e c t e db y i n d i r e c tI F L . A l e x a n d e rc e l l sg r o w i n gi na m o n o l a y e ra n dc e l l sh e l di ns u s p e n s i o na f t e rt r y p s i nd i g e s t i o nw e r ee x a m i n e db y i n d i r e c tI F L . I n b o t hc a s e s ,t e s ts e r a d i l u t e d1 / 1 0i n MEM w e r e a d d e d , f o l l o w e db y 3 0 m i n i n c u b a t i o na t r o o m t e m p e r a t u r e .A n t i b o d yb o u n dt o t h ec e l lm e m b r a n ew a sr e v e a l e dw i t h F I T C a n t i - t o t a lh u m a n i m m u n o g l o b u l i n

( U n i p a t h )d i l u t e d1 / 3 0i n M E M .A b s o r p t i o no f a n t i b o d yt o t h el i v e rc e l lm e m b r a n e .T o a b s o r bl i v e rc e l lmembrane s p e c i f i c i t i e s ,1 0 0p i o f a n t i - L K Mc o n t a i n i n gs e r a ,d i l u t e d1 / 1 0 ,p o s i t i v ei n t h eh e p a t o m ac e l ls u r f a c e b i n d i n ga s s a y ,w e r e i n c u b a t e dw i t h 0 5 x 1 0 6A l e x a n d e rc e l l sa t 3 7 Cf o r3 0 m i n .A f t e r c e n t i f u g a t i o n ,t h es u p e r n a t a n twas i n c u b a t e da g a i n w i t h0 5 x 1 0 6A l e x a n d e rc e l l sa t 4 Cf o r3 0 m i n .T h i s m a n o e u v r ea l l o w sa n t i b o d yw i t ho p t i m a lr e a c t i v i t ya t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r e st ob e r e m o v e d .T h es e r aw e r et h e nr e c o v e r e da n d t e s t e db o t h i n t h eh e p a t o m ac e l ls u r f a c eb i n d i n ga s s a y a n d f o rant i -LKM t i t r ea sa b o v e .

R E S U LT S( S e eT a b l e 1 )

I m m u n o g l o b u l i nc l a s s e s .Anti-LKM a n t i b o d yt i t r e sa s d e t e r m i n e db y i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s -c e n c e r a n g e df r o m1 / 8 0t o 1 / 2 0 , 4 8 0 .A l l s e r at e s t e dh a d a n t i - L K Ma n t i b o d yb e l o n g i n gt o t h e IgGc l a s s( t i t r e1 / 8 0t o 1 / 2 0 , 4 8 0 )b u tn o t t o I g Ao r I g M .O n t e s t i n gf o rI g Gs u b c l a s s e s ,t h e s e r ao f t h es i xc h i l d r e nh a d a n t i - L K Mo f I g G i ( 1 / 8 0t o 1 / 2 0 , 4 8 0 )b u t n o t o f t h et h r e eo t h e r s u b c l a s s e s .T w os a m p l e so f s e r a f r o mS . B .o b t a i n e da t I y e a r i n t e r v a l ,b o t hd u r i n gi m m u n o s u p p r e s s i v et r e a t m e n t ,

5 4 5


4/7


5/7

C h a r a c t e r i z a t i o no f a n t i - l i v e rk i d n e ym i c r o s o m a la n t i b o d y 5 4 71 0 0 0 0 0

( a ) ( b )

8000 - 2560 -C

6000 - )

C Z ~ ~ ~ ~ ~ 6 4 0 -____

2 4 0 0 0-a-~~~~~~~~~~~~22000 - 1 6 0 -

8 0

p r e p o s t p r e p o s t

F i g .1 .A b s o r p t i o no ff o u ra n t i - L K Mp o s i t i v es e r aw i t hA l e x a n d e rc e l l s .( a )B i n d i n go fa n t i b o d i e st oA l e x a n d e rc e l l sb e f o r ea n d a f t e ra b s o r p t i o n ;( b )a n t i - L K Mt i t r eb e f o r ea n d a f t e ra b s o r p t i o n .

s h o w e da n a n t i - L K Mt i t r eo f 1 / 6 4 0a n d 1 / 8 0b u t n o d i f f e r e n c ei ns u b c l a s se x p r e s s i o n .I n t h e c as eo fP. H . ,s e r u mo b t a i n e da t t h ea g e o f 1 0i n t h ea b s e n c eo f t r e a t m e n th a d a n a n t i - L K Mt i t r eo f 1 / 2 5 6 0b e l o n g i n gt o t h e I g G 1 s u b c l a s s o n l y .A t t h ea g e o f 1 5 ,d u r i n g s u c c e s s f u li m m u n o s u p p r e s s i v et r e a t m e n t ,t h ea n t i - L K Mt i t r ew a s1 / 6 4 0w i t hn o c h a n g e si ns u b c l a s se x p r e s s i o n .A l lf i v eo f t h e a d u l ts e r aw e r ep o s i t i v ef o rI g G I ( 1 / 4 0t o 1 / 6 4 0 )a n d ,i na d d i t i o n ,t w os h o w e dp o s i t i v i t yf o rI g G 4( 1 / 4 0 ,1 / 6 4 0 ) .

L i g h tc h a i nt y p e .A l ls e r ac o n t a i n e da n t i - L K Mo f b o t hk a p p aa n dl a m b d al i g h tc h a i nt y p e .I n s i x

o f t h e1 3 s e r at e s t e d ,t h et i t r e so f a n t i - L K Ma n t i b o d yo f t h ek a p p al i g h tc h a i n t y p ew e r eh i g h e rt h a nt h o s eb e l o n g i n gt o l a m b d a .C o m p l e m e n tf i x a t i o n .A l ls e r at e s t e dh a d a n t i - L K Ma n t i b o d yc a p a b l eo f f i x i n gc o m p l e m e n ta t

t i t r e sr a n g i n gf r o m 1 / 4 0t o 1 / 5 1 2 0 .A l e x a n d e rc e l ls u r f a c eb i n d i n g .S e v e na n t i - L K Mp o s i t i v es e r ah a d b i n d i n gt o A l e x a n d e rc e l l s

f a l l i n gw i t h i n t h en o r m a lr a n g e ( < 2 0 0 0c t / m i n )w h i l e f o u r h a d l e v e l sw h i c hw e r e s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d( a l l> 8 0 0 0c t / m i n ) .Of t h ef o u r s e r as h o w i n gp o s i t i v ec e l ls u r f a c eb i n d i n g ,t h r e ew e r ec h i l d r e n ,o f w h o mt w o ( M . D . a n dS . P. )w e r er e c e i v i n gi m m u n o s u p p r e s s i v et h e r a p ya t t h et im e o fs a m p l i n g ,w h i l s tR . P. h a d r e c e i v e dn o t r e a t m e n tb e f o re s a m p l in g .T h ef o u r t hp a t i e n t ,S . M . ,w a sa na d u l tr e c e i v i n gi m m u n o s u p p r e s s i v et h e r a p y .

A n t i - A l e x a n d e rc e l la n t i b o d i e sb y I F L . A l e x a n d e rc e l l si s o l a t e de n z y m a t i c a l l ya n d t h o s eg r o w i n gi n a m o n o l a y e rg a v e a f i n eg r a n u l a r f l u o r e s c e n c ep a t t e r no n t h eh e p a t o c y t es u r f a c eo n l y w h e ni n c u b a t e dw i t hs e r a p o s i t i v ei nt h eA l e x a n d e rc e l ls u r f a c eb i n d i n ga s s a y .S e r a p o s i t i v ef o ra n t i - L K Ma n t i b o d yb u t n e g a t i v ei nt h eA l e x a n d e rc e l ls u r f a c eb i n d i n ga ss ay d i dn o t s t a i nl i v eh e p a t o c y t es b u td i ds t a i nt h ec y t o p l a s mo f d e a d h e p a t o c y t e s .

A b s o r p t i o nt e s t s .P r e - i n c u b a t i o no f t h ef o u r s e r ap o s i t i v ei n t h eA l e x a n d e rc e l ls u r f a c eb i n d i n ga s s a y w i t hA l e x a n d e rc e l l sr e d u c e dt h eb i n d i n gt ob a c k g r o u n dl e v e l sb u t h a d n oe f f e c to n a n t i - L K Mt i t r e s( F i g .1 ) .T h i s s u g g e s t st h a t t h ea n t i - A l e x a n d e rc e l ls u r f a c er e a c t i v i t yo f t h e s es e r ad o e s n o td e r i v ef r o ma n t i - L K Ma n t i b o d y .

D I S C U S S I O NI n t h i ss t u d y w e h a v e s h o w nt h a ti n a u t o i m m u n ec h r o n i ca c t i v e h e p a t i t i st h e r ei s I g G s u b c l a s sr e s t r i c t i o ni nt h ee x p r e s s i o no f t h ea n t i - L K Ma n t i b o d y .I nc h i l d h o o dd i s e a s et h er e s t r i c t i o na p p e a r st o b e c o n f i n e dt o t h eI g G l s u b c l a s sw h i l s ti n t h e a d u l t s t h e r ei s e x p r e s s i o ni nb o t h I g G 1a n d I g G 4s u b c l a s s e s .S u c hs u b c l a s sr e s t r i c t i o ni s u n l i k e l yt o b e i n f l u e n c e db y e i t h e rt r e a t m e n to r d i s e a s ea c t i v i t ys i n c e t h es e r aw e r eo b t a i n e df r o mu n t r e a t e da sw e l la s t r e a t e dp a t i e n t s ,a n d s i m i l a rr e s u l t sw e r eo b s e r v e di np a t i e n tP. H . d u r i n ga c t i v ed i s e a s ea n d w h i l s to n s u c c e s s f u li m m u n o s u p p r e s s i o n .


6/7

5 4 8 M. P e a k m a ne t a l .

S u b c l a s sr e s t r i c t i o no f a u t o a n t i b o d i e sh a s b e e n d e s c r i b e di n o t h e r a u t o i m m u n ed i s e a s e s .T h es i g n i f i c a n c eo f t h i sp h e n o m e n ai s u n c l e a r .I g G s u b c l a s s e sa r ei d e n t i f i e do n t h eb a s i so f d i f f e r i n ge l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t i e s ,a n t i g e n i cm a r k e r sa n d b i o l o g i c a lp r o p e r t i e s( N a t v i g& K u n k e l ,1 9 7 3 ) ,s u g g e s t i n ga d i s t i n c tr o l ef o re a c h s u b c l a s s .T h u s t h e y d i f f e ri n t h e i r a b i l i tyt o f i xc o m p l e m e n t( I s h i z a k ie ta l . ,1 9 6 7 )a n d t o b i n dt om a c r o p h a g e F cr e c e p t o r s( A b r a m s o ne ta l . ,1 9 7 0 ) .I na d d i t i o n ,r e s p o n s et oa n u m b e ro f m i c r o b i a la n t i g e n si s I g Gs u b c l a s sr e s t r i c t e d .A n t i b o d i e st oS t a p h y l o c o c c u sa u r e u s a n d l i p o p o l y s a c c h a r i d ed e r i v e d f r o m E s c h e r i c h i ac o l ia r e m o s t l y I g G 2 a n d t h o s e t oB r a n h a m e l l ac a t a r r h a l i sa n d E p s t e i n - B a r rv i r u sI g G 3 ( Wa l k e r , J o h n s o n& M a c L e n n a n ,1 9 8 4 ) .A n t i b o d yt o a n t i - t e t a n u st o x o i di s m o s t l yI g G l ( Y o u n te t a l . ,1 9 6 8 ) .I n p h y s i o l o g i c a lr e s p o n s e s ,t h e n ,t h eI g G s u b c l a s s e sa p p e a r t o b e a s d i s t i n c ti n t h e i rr o l e sa s t h ei m m u n o g l o b u l i nc l a s s e st h e m s e l v e s .

I n a u t o i m m u n ed i s o r d e r s ,a u t o a n t i b o d yp r o d u c t i o no f a p a r t i c u l a ri m m u n o g l o b u l i ns u b c l a s si nr e s p o n s et o a n a u t o a n t i g e nc o u l dd e r i v ef r o mt h en a t u r eo f t h ea n t i g e n i t s e l fo r f r o ma g e n e t i c a l l yd e t e r m i n e dr e s t r i c t i o no f a u t o a n t i b o d ys y n t h e s i s .T h ed e v e l o p m e n to f aCAHa p p e a r st ob e s t r o n g l yi n f l u e n c e db y g e n e t i cf a c t o r s .T h ep o s s e s s i o no f H L AB8/DR3h a p l o t y p ec o n f e r sa g r e a t e rt h a n 1 0 -

f o l dr i s ko f d e v e l o p i n gt h e d i s e a s e( M a c k a y& Ta i t ,1 9 8 0 ) .T h er e l a t i v e r i s ki s f u r t h e ri n c r e a s e di ft h e s ea n t i g e n so c c u ri na s s o c i a t i o nw i t hp a r t i c u l a rGm a l l o t y p e so f I g G( W h i t t i n g h a me ta l . ,1 9 8 1 ) .I g Ad e f i c i e n c yh a s b e e nn o t e damong t h e s ep a t i e n t s( M a g g i o r ee t a l . ,1 9 8 6 )a sw e l la sa g e n e t i c a l l yd e t e r m i n e dd e f i c i e n c yo f t h ec o m p l e m e n tc o m p o n e n tC4 ( Ve r g a n ie ta l . ,1 9 8 5 ) .S u b c l a s sr e s t r i c t i o ni n t h ee x p r e s s i o no f a n t i - L K M ,t h e r e f o r e ,m ay b e a f u r t h e re x a m p l eo f t h ea b n o r m a lg e n e t i ci n f l u e n c e so n t h ed e v e l o p m e n to f aCAH, p o s s i b l yr e f l e c t i n ga d e f e c ti n t h er e a r r a n g e m e n to f t h ei m m u n o g l o b u l i nh e a v yc h a i n g e n e ( F l a n a g a n& R a b b i t t s ,1 9 8 2 ) .

A l t h o u g ha n t i - L K Mt i t r e sa r er e l a t e dt o d i s e a s ea c t i v i t y ,i t i s u n c e r t a i nt o w h a te x t e n ti f a n ya n t i - L K Mc o n t r i b u t e st op a t h o g e n e s i s .T h i s s t u d yp r o v i d e se v i d e n c et h a ta n t i - L K Ma n t i b o d ymayn o t b i n dt ot h eh u m a nh e p a t o c y t es u r f a c e .R e a c t i v i t yt ot h em e m b r a n eo f A l e x a n d e rc e l l sw a sf o u n di no n l yf o u rp a t i e n t s ,wh o d i d n o t a p p e a rt od i f f e ri nd i s e a s ea c t i v i t y ,t r ea t m e n t o ra g e f r o mt h eo t h e rs e v e n s t u d i e d .A b s o r p t i o no f t h e s es e r aw i t h A l e x a n d e rc e l l sd i d n o t a l t e ra n t i - L K Mt i t r e .T h i sc o n t r a s t sw i t h t h es t u d yb y L e n z i e t a l . ( 1 9 8 4 )w h i c hs h o w e dt h a ts e r a c o n t a i n i n ga n t i - L K Ma n t i b o d i e sc r o s s - r e a c tw i t hh e p a t o c y t es u r f a c ea n t i g e n s ,s u g g e s t i n ga d i r e c t r o l ef o rt h ea n t i b o d yi nc e l ld a m a g e .T h ed i s c r e p a n c yw i t h t h e s ea u t h o r sm i g h tb e d u e t o t h e i ru s e o f m o u s e h e p a t o c y t e s .M u r i n el i v e rc e l lm e m b r a n em a y s h a r ea n t i g e n sw i t h m i c r o s o m e sw h i c ha r e n o t e x p r e s s e do n t h es u r f a c eo f h u m a n l i v e rc e l l s .I n c o n t r a s t ,we h a v eu s e d i s o l a t e dh u m a n h e p a t o c y t e s ,w h i c ha l t h o u g hf r o ma t u m o u rl i n e ,p o s s e s sa n t i g e n so f t h eLSP c o m p l e xa n d L M A g( C h i s a r ie ta l . ,1 9 8 1 ) .I t c a n n o tb e e x l u d e d ,h o w e v e r ,t h a tt h el i v e rk i d n e ym i c r o s o m a la n t i g e ni s e x p r e s s e do n t h emembrane o fn o r m a lh e p a t o c y t e s .

I n c o n c l u s i o n ,a n t i - L K Ma n t i b o d yi nc h i l d h o o daCAH i sr e s t r i c t e dt o t h eI g G1 s u b c l a s s ,i sa b l e

t o f i xc o m p l e m e n t ,b u t i su n l i k e l yt o b e d i r e c t l yi n v o l v e di n l i v e rc e l ld a m a g es i n c ei t d o e sn o t r e a c tw i t hh e p a t o c y t em e m b r a n ea n t i g e n s ,s u c ha s LSP c o m p l e xa n dLMAgw h i c ha r e t h el i k e l yt a r g e t so ft h eimmune a t t a c k( M c F a r l a n e ,1 9 8 4 ) .

A . L . Y.a n d G . M - V .w e r e s u p p o r t e db y t h eM i c h a e lM c G o u g hF o u n d a t i o n .

REFERENCES

A B R A M S O N ,N . , G E L F A N D ,E . W . , J A N DL ,J . H . &R O S E N ,F . S .( 1 9 7 0 )T h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nhumanm o n o c y t e sa n d r e d c e l l s .J . e x p . M e d .1 3 2 ,1 2 0 7 .

A LVA R E Z ,F . ,B E R N A R D ,O . ,H O M B E R G ,J . C .& K R E I -B I C H ,G . ( 1 9 8 5 )A n t i - l i v e r - k i d n e ym i c r o s o m ea n t i -b o d yr e c o g n i s e sa 5 0 , 0 0 0m o l e c u l a rw e i g h tp r o t e i no f t h ee n d o p l a s m i cr e t i c u l u m .J . e x p .M e d . 1 6 1 ,1 2 3 1 .

C H I S A R I ,F . V. ,B I E B E R ,M . S . ,J O S E P H O ,C . A . ,X AV I E R ,

C . & A N D E R S O N ,D . S . ( 1 9 8 1 )F u n c t i o n a lp r o p e r t i e so f l y m p h o c y t es u b p o p u l a t i o n si n H e p a t i t i sB v i r u si n f e c t i o n .J . I m m u n o l1 2 6 ,4 5 .

F L A N A G A N ,J . G . & R A B B I T T S ,T . H . ( 1 9 8 2 )A r r a n g e -m e n to f h u m a n i m m u n o g l o b u l i nh e a v yc h a i n c o n -s t a n tr e g i o ng e n e si m p l i e se v o l u t i o n a r yd u p l i c a t i o no f a s e g m e n tc o n t a i n i n gg a m m a ,e p s i l o na n d a l p h ag e n e s .N a t u r e3 0 0 ,7 0 9 .

I S H I Z A K A ,T . , I S H I Z A K A ,K . , S A L M O N ,S . & F U D E N -


7/7

C h a r a c t e r i z a t i o no f a n t i - l i v e rk i d n e ym i c r o s o m a la n t i b o d y 5 4 9B E R G ,H . ( 1 9 6 7 )B i o l o g i ca c t i v i t i e so f a g g r e g a t e di m m u n o g l o b u l i n .A g g r e g a t e di m m u n o g l o b u l i no fd i f f e r e n tc l a s s e s .J . I m m u n o l .9 9 ,8 2 .

J E F F E R I S ,R . ,R E I M E R ,C . B . ,S K VA R I L ,F . e t a l . ( 1 9 8 5 )E v a l u a t i o no f m o n o c l o n a la n t i b o d i e sh a v i n gs p e c i -f i c i t yf o rh u m a n I g Gs u b c l a s s e s :r e s u l t so f a n I U I S /WHO c o l l a b o r a t i v es t u d y .I m m u n o l .L e t t .1 0 ,2 2 3 .

J O H N S O N ,G . D . , H O L B O R R O W ,E . J .& D O R L I N G ,J .( 1 9 7 8 )H a n d b o o ko f E x p e r i m e n t a lI m m u n o l o g y ,Vo l . I ( E d .D . M . We i r ) 3 r d e d n ,B l a c k w e l lS c i e n t i f i c ,O x f o r d .

L E E V Y,C . M . , P O P P E R ,H . & S H E R L O C K ,S . ( 1 9 7 6 )D i s e a s e so f t h eL i v e ra n dB i l i a r yT r a c t :S t a n d a r d i s a -t i o no f N o m e n c l a t u r e ,D i a g n o s t i cC r i t e r i a& D i a g -n o s t i cM e t h o d o l o g y .S p o n s o r e db y t h e J o h n E .F o g a r t yI n t e r n a t i o n a lC e n t r ef o rA d v a n c e dS t u d yi n H e a l t hS e r v i c e s& I n t e r n a t i o n a lA s s o c i a t i o nf o rt h eS t u d yo f t h eL i v e r .P r o c e e d i n gn o .2 2 ,W a s h -i n g t o nD C ,US G o v e r n m e n tP r i n t i n gO f f i c e ,P u b l i -c a t i o nn o . ( N I H )7 6 - 7 2 5 ,2 1 2 .

L E N Z I ,M . , B I A N C H I ,F . B . ,C A S S A N I ,F .& P i s i ,I . ( 1 9 8 4 )L i v e rc e l ls u r f a c ee x p r e s s i o no f t h ea n t i g e nr e a c t i n gw i t h l i v e r - k i d n e ym i c r o s o m a la n t i b o d y .C l i n .e x p .I m m u n o l .5 5 ,3 6 .

M A C K A Y,I . R .& T A I T ,B . D . ( 1 9 8 0 )H L Aa s s o c i a t i o n sw i t h a u t o i m m u n et y p ec h r o n i c a c t i v eh e p a t i t i s :I d e n t i f i c a t i o no f B 8 - D RW 3h a p l o t y p eb y f a m i l ys t u d i e s .G a s t r o e n t e r o l .7 9 ,9 5 .

M A G G I O R E ,G . ,B E R N A R D ,O . ,H O M B E R G ,J - C . ,HAD-C H O U E L ,M . , A LVA R E Z ,F . , O D I E V R E ,M. & A L A -G I L L E ,D . ( 1 9 8 6 )L i v e rd i s e a s ea s s o c i a t e dw i t ha n t i -l i v e rk i d n e ym i c r o s o m a la n t i b o d yi n c h i l d r e n .J .P e d .1 0 8 ,3 9 9 .

M c F A R L A N E ,I . G .( 1 9 8 4 )A u t o i m m u n i t yi n l i v e r d i s -e a s e .C l i n .S c i .6 7 , 5 6 9 .

N AT V I G ,J . B . & K U N K E L ,H . G . ( 1 9 7 3 )H u m a ni m m u n o g l o b u l i n s :c l a s s e s ,s u b c l a s s e s ,g e n e t i cv a r i -a n t s a n d i d i o t y p e s .A d v .I m m u n o l .1 6 ,1 .

PA R K E S ,A . B . ,M c L A C H L A N ,S . M . , B I R D ,P . & R E E S -

S M I T H ,B . ( 1 9 8 4 )T h e d i s t r i b u t i o no f m i c r o s o m a la n d t h y r o g l o b u l i na c t i v i t yamong t h e I g G s u b -c l a s s e s .C l i n .e x p .I m m u n o l .5 7 ,2 3 9 .

R I G G I O N E ,O . ,S T O K E S ,R . P. & T H O M P S O N ,R . A . ( 1 9 8 3 )P r e d o m i n a n c eo f I g G 3s u b c l a s si n p r i m a r yb i l i a r yc i r r h o s i s .B r .m e d .J . 2 8 6 ,1 0 1 5 .

R I Z Z E T T O ,M . , S W A N A ,G . T . & D O N I A C H ,D . ( 1 9 7 3 )M i c r o s o m a la n t i b o d i e si n a c t i v ec h r o n i ch e p a t i t i sa n d o t h e rd i s o r d e r s .C l i n .e x p .I m m u n o l .1 5 ,3 3 .

R i z z E r r o ,M . , B I A N C H I ,F . B .& D O N I A C H ,D . ( 1 9 7 4 )C h a r a c t e r i s a t i o no f t h em i c r o s o m a la n t i g e nr e l a t e dt o a s u b c l a s so f a c t i v ec h r o n i ch e p a t i t i s .I m m u n o l .2 6 , 5 8 9 .

S M I T H ,M . G . M . ,W I L L I A M S ,R . , WA L K E R ,G . , R i z -Z E T T O ,M. & D O N I A C H ,D . ( 1 9 7 4 )H e p a t i cd i s o r d e r sa s s o c i a t e dw i t h l i v e r / k i d n e ym i c r o s o m a la n t i -b o d i e s .B r .m e d .J . 2 , 8 0 .

T H O M P S O NR . A . ( 1 9 8 1 )T e c h n i q u e si n C l i n i c a lI m m u -n o l o g y .2 n de d n ,B l a c k w e l lS c i e n t i f i c ,O x f o r d .

V E R G A N I ,D . ,W E L L S ,L . ,L A R C H E R ,V. F . ,N A S A R U D -D I N , B . A . , D AV I E S ,E . T . ,M I E L I - V E R G A N I ,G . &M O WAT ,A . P. ( 1 9 8 5 )G e n e t i c a l l yd e t e r m i n e d l o wC 4 : a p r e d i s p o s i n gf a c t o rt o a u t o i m m u n ec h r o n i ca c t i v eh e p a t i t i s .L a n c e ti i , 2 9 4 .

WA L K E R ,L . ,J O H N S O N ,G . D . & M A C L E N N A N ,I . C . M .( 1 9 8 4 )T h eI g Gs u b c l a s sr e s p o n s e so f h u m a n l y m -p h o c y t e st o B c e l la c t i v a t o r s .I m m u n o l .5 0 ,2 6 9 .

W H I T T I N G H A M ,S . , M A T T H E W S ,J . D . ,S C H A N F I E L D ,M . S . ,TA I T ,B . D .& MACKAYI . R .( 1 9 8 1 )I n t e r a c t i o no f H L A a n d Gm i n a u t o i m m u n ec h r o n i ca c t i v eh e p a t i t i s .C l i n .e x p .I m m u n o l .4 3 ,8 0 .

Y O U N T ,W. J . , D O R N E R ,M . M . , K U N K E L ,H . G . &K A B AT ,E . A . ( 1 9 6 8 )S t u d i e so n h u m a na n t i b o d i e s :V I . S e l e c t i v ev a r i a t i o ni n s u b g r o u pc o m p o s i t i o na n d g e n e t i cm a r k e r s .J . e x p .M e d .1 2 7 ,6 3 3 .

Z O U A L I ,M . , J E F F E R I S ,M . & E Y Q U E M ,A . ( 1 9 8 4 )I g Gs u b c l a s sd i s t r i b u t i o no f a u t o a n t i b o d i e st o DNAa n d t o n u c l e a rr i b o n u c l e o p r o t e i n si n a u t o i m m u n ed i s e a s e s .I m m u n o l .5 1 ,5 9 5 .

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