FACULTAD DE FARMACIA

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

TRABAJO FIN DE GRADO

“VESÍCULAS EXTRACELULARES

FÚNGICAS”

Autor: Marta Hernández Puertas

Tutor: María Concepción Gil

García Convocatoria: Junio 2018 Este

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ÍNDICE1. RESUMEN.......................................................................................................................1

2. INTRODUCIÓN Y ANTECEDENTES...........................................................................12.1 VESÍCULAS EXTRACELULARES EN EUCARIOTAS................................................................12.2 VESÍCULAS EXTRACELULARES FÚNGICAS.........................................................................3

3. OBJETIVOS....................................................................................................................4

4. METODOLOGÍA............................................................................................................4

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................................45.1 CARACTERIZACIÓN DE LAS VESÍCULAS EXTRACELULARES FÚNGICAS..............................45.2 SECRECIÓN DE LAS VESÍCULAS EXTRACELULARES FÚNGICAS..........................................6

5.2.1. Implicación de la membrana plasmática en la secreción........................................75.2.2. Relación del Aparato de Golgi con las vesículas extracelulares............................85.2.3. Secreción a través de la pared celular......................................................................85.2.4. Viscoelasticidad de la pared como posible puerta de salida para las vesículas extracelulares......................................................................................................................9

5.3 ANÁLISIS PROTEÓMICO DE LAS VESÍCULAS EXTRACELULARES FÚNGICAS EN SU INTERACCIÓN CON LAS CÉLULAS DEL HOSPEDADOR.............................................................105.4 VESÍCULAS EXTRACELULARES FÚNGICAS COMO MEDIO DE POTENCIACIÓN DE VIRULENCIA...........................................................................................................................125.5 PAPEL DE LAS VESÍCULAS EXTRACELULARES FÚNGICAS COMO VACUNAS......................14

6. CONCLUSIONES..........................................................................................................15

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1. RESUMEN Los conocimientos sobre las vesículas extracelulares en hongos son tan novedosos que

su comprensión y aplicación se está desarrollando en la actualidad. Estas estructuras se

desarrollan en todos los dominios, pero en el reino fungi todavía existen numerosas

incógnitas sobre todo en cuanto a su proceso de secreción. Hoy en día se piensa que ésta

puede producirse gracias a la existencia de enzimas degradadoras de la pared fúngica.

También, hay que tener en cuenta que su membrana lipídica y el aparato de Golgi son

fundamentales en la secreción de estas vesículas.

Gracias al Ambiosome se puso de manifiesto la propiedad viscoelástica de la pared

fúngica desarrollando así una nueva vía para el conocimiento de dicho mecanismo. Esta

propiedad confiere la característica por la cual la pared celular podría deformarse

permitiendo el paso de las vesículas al medio externo.

Las vesículas extracelulares fúngicas presentan numerosos componentes proteicos entre

los que se pueden destacar enzimas como gliceraldehido-3-fosfato, enolasa,

fosfoglicerato mutasa I y proteínas de choque térmico (HSP70) que intervienen

favoreciendo tanto la diseminación de la infección como la evasión del sistema inmune

en el hospedador.

Los últimos avances en este campo determinan que las vesículas extracelulares de

especies fúngicas patógenas son capaces de potenciar el crecimiento intracelular de

especies no virulentas fagocitadas sin ser necesario su proximidad entre ellas.

Hoy en día, se está trabajando en el desarrollo de diferentes vacunas conformadas con

vesículas extracelulares fúngicas para su futura aplicación en la clínica.

2. INTRODUCIÓN Y ANTECEDENTES

2.1 Vesículas extracelulares en eucariotas

A lo largo de los últimos veinte años ha surgido un auge en el interés científico por el

estudio de las vesículas extracelulares (EVs) debido al papel tan importante que

desempeñan en muchos procesos fisiológicos y patológicos [1].

Aunque existen discrepancias en cuanto a su clasificación por la falta de un “gold

estandard” metodológico, gracias a la “citometría de flujo” se están logrando numerosos

avances [2].

Las EVs son un conjunto heterogéneo de estructuras membranosas liberadas por las

células. Poseen una gran variedad de componentes (ácidos nucleicos, toxinas,

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lipoproteínas, enzimas…) y desempeñan importantes funciones en la patogénesis y

fisiología microbiana [3].

En la actualidad se diferencian 3 grandes subgrupos de EVs: cuerpos apoptóticos,

microvesículas y exosomas [4] [Figura 1].

Los cuerpos apoptóticos son restos celulares que se generan en la etapa tardía de la

apoptosis y se forman como consecuencia de la fragmentación celular generada en este

proceso. Presentan un alto contenido en proteínas resistentes a la proteólisis y su tamaño

puede comprender desde 1µm a 5 µm [6].

Las microvesículas o ectosomas se forman por pequeñas evaginaciones de la membrana

plasmática. La mayoría de ellas se rompen al poco de ser liberas pero otras pueden

llegar a recorrer largas distancias. Su tamaño varía entre 150 nm a 1 µm [7].

Los exosomas, son estructuras membranosas de un tamaño entre 30-100 nm que

albergan distintas macromoléculas. Estas se ensamblan en el endosoma dando lugar a

los cuerpos multivesiculares (MVBs) que se fusionan con la membrana plasmática [8].

En la actualidad, la función de los exosomas está en pleno estudio de investigación,

atribuyéndolas una función en la comunicación intercelular y, en ocasiones, la

intervención asociada a procesos patológicos.

Sus propiedades están estrechamente relacionadas con su membrana lipídica y la

composición de la misma. La primera procede en su mayor parte de la membrana

plasmática de la célula progenitora y presenta al mismo tiempo características

distintivas tales como; la presencia o ausencia de ciertas proteínas, ligandos y moléculas

Figura 1: Tipos de vesículas extracelulares. Imagen modificada de Gustafson y colaboradores [5].

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de adhesión específicas. Todo ello, lleva a pensar que cada exosoma tiene sus propias

características y funciones determinadas.

Cabe destacar que la composición de la membrana lipídica es responsable de las

características de los exosomas. Entre las cuales podemos destacar; inmunogenicidad,

toxicidad, selectividad de acción y capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica que

son necesarias para desempeñar sus funciones propias [9].

Las EVs, en definitiva, han sido descritas como un mecanismo para el tráfico de

moléculas al espacio extracelular producido por todas las células existentes, lo que hace

pensar que es un fenómeno universal [10].

2.2 Vesículas extracelulares fúngicas

A fecha de hoy, se sabe que todas las especies fúngicas que se han estudiado,

incluyendo levaduras e hifas, son capaces de usar las vesículas extracelulares como

mecanismo general de transporte de proteínas intracelulares a través de la pared celular.

Todavía no se ha descrito cómo es el proceso del paso a través de su gruesa pared

celular.

Su caracterización comenzó en 2007 con Cryptococcus neoformans [3], mediante

microscopía electrónica de transmisión (TEM).

En un primer momento existía la hipótesis de que las EVs sólo estaban relacionadas con

procesos patogénicos, debido a que en la mayoría de ellas se identificaban factores de

virulencia en su interior. Esto cambió cuando se descubrió en el modelo no patogénico

de Saccharomyces cerevisiae (yeast model) [11] en el que se evidenciaba la producción

de EVs.

La principal aproximación para el estudio de la biogénesis de las EVs en hongos fue

mediante la caracterización de las vesículas producidas por mutantes con defectos en

ambos mecanismos de secreción (convencional y no convencional). Se estudiaron 8

mutantes de diferentes especies y aunque no se obtuvieron resultados concluyentes se

determinó la gran complejidad de los procesos para la formación de las EVs fúngicas

[12].

Uno de los problemas que existe para el estudio de las EVs fúngicas es el bajo número

de marcadores conocidos así como de técnicas para la observación in situ de las

vesículas. Se describió uno de ellos en un transformante de C. neoformans al expresar la

proteína 14-3-3 fusionada con la proteína verde de fluorescencia (GFP) por su extremo

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C-terminal. Esto permitió la utilización del microscopio de fluorescencia para su

observación [13].

3. OBJETIVOS El objetivo de esta revisión bibliográfica es dar a conocer la importancia de las

vesículas extracelulares fúngicas en los procesos fisiológicos y patogénicos.

En este trabajo se plasman los últimos avances de estas estructuras fúngicas que son

claves para conocer tanto su composición, la complejidad de su secreción, su modo de

interaccionar con el hospedador como su posible futura aplicación en el campo clínico

como diagnóstico y terapéutico.

4. METODOLOGÍA Para la realización de este trabajo, basado en una revisión bibliográfica, se utilizó en su

gran mayoría la base de datos PubMed® y buscadores de internet como Google

Académico y Google de donde se obtuvieron los diferentes artículos que comprende

este trabajo. Posteriormente, se contrastó toda la información recopilada y se procedió a

la elaboración de esta revisión.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En esta revisión bibliográfica se pretende abordar diferentes aspectos e hipótesis sobre

las vesículas extracelulares fúngicas. Su análisis, hoy en día, presenta numerosas

incógnitas que a lo largo de este apartado iremos mostrando.

5.1 Caracterización de las vesículas extracelulares fúngicas

Es muy importante llegar a conocer la composición de las EVs fúngicas pues permite

estudiar tanto su origen como el tipo celular del que fueron secretadas y aporta

información sobre su papel fisiológico.

Las vesículas de C.neorformans fueron las primeras en identificarse y se las asoció con

capas externas e internas de la membrana celular, relacionándolas con el proceso de

secreción, explicado anteriormente. Por espectrometría de masa, se detectaron

componentes glucídicos, esteroles y glucoceramidas propias de la pared fúngica.

Además, por técnicas de proteómica, se revelaron las similitudes que existían entre las

proteínas de las EVs de diferentes hongos como: S. cerevisiae (348 proteínas),

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C. neoformans (97 proteínas), Histoplasma capsulatum (260 proteínas) y

Paracoccidioides brasiliensis (205 proteínas) [Figura 2] [14].

Por otro lado, este análisis demostró la existencia de una especificidad propia de cada

especie como ocurre en el caso de S. cerevisiae que presenta 5 proteínas

glicosilfosfatidilinisitol (GPI) dentro de las cuales se diferencia: asparticoproteasa,

endogluconasa y otras 3 proteínas GPI de función desconocida, no localizadas en las

otras especies comparadas [11] o como en C. neoformans que es el único en el que se

han identificado la UDP-glucurónido descarboxilasa y la UDP-glucosa deshidrogenasa,

enzimas esenciales en el metabolismo del ácido glucurónico [15]. Todo esto sugiere

que a pesar de las similitudes en las proteínas existen procesos específicos de las

especies.

Se pone de manifiesto la presencia de múltiples enzimas de rutas metabólicas como

glicolisis, fermentación, gluconeogénesis, ruta de las pentosas fosfato, entre otras.

Siendo las enzimas más relevantes: gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, enolasa y

transaldolasa detectadas en C. neonformans, C. albicans, P. brasiliensis e H.

capsulatum [16].

También se han detectado enzimas que en situaciones de estrés celular, podrían

favorecer a la liberación de las vesículas como son hidrolasas, lipasas, glicosilasas y

proteasas [17].

Además, las EVs fúngicas pueden contener RNAm y microRNA [2].

Figure 2.Comparative analysis of proteins identified in EV obtained from different fungal species.Overlapping groups are shown in gray/black. Reproduced with permission from [35].

Rodrigues et al. Page 14

J Proteomics. Author manuscript; available in PMC 2015 January 31.N

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Figura 2: Comparativa del análisis de proteínas vesiculares de EVs de diferentes especies fúngicas. Imagen tomada de Rodrigues y colaboradores [14].

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5.2 Secreción de las vesículas extracelulares fúngicas

El proceso de secreción de las EVs fúngicas es tan diverso y complejo que ha generado

numerosos estudios e hipótesis.

Se pueden diferenciar tres hipótesis, no excluyentes entre sí, sobre la liberación de las

vesículas en los microorganismos [3] [Figura 3]:

1. La primera hipótesis sugiere que una vez liberadas por el citoplasma son

forzadas a pasar por su pared gracias a la presión del turgor.

2. La segunda hace referencia a la existencia de enzimas modificadoras de la pared

celular que se secretan junto a las vesículas y pueden generar el ablandamiento

de esta pared favoreciendo su liberación.

3. Tercera hipótesis. Las vesículas pueden pasar a través de los canales de la pared

celular debido a la deformación que estas pueden sufrir.

En cuanto a las rutas de secreción a través de las células se diferencian dos modelos;

convencional y no convencional. Esto se conoció al estudiar el secretoma de C. albicans

[18]. Los procesos de regulación de ambas vías interfieren en la composición, proceso y

cinéticas de las EVs [11] [Figura 4].

Nature Reviews | Microbiology

Peptidoglycan

a b c

Turgor pressure

Channel

Cell membrane

Protease

BasidiomycetesFilamentous fungi that reproduce sexually via the formation of specialized cells called basidia, which bear external spores called basidiospores. Some basidiomycetes can also reproduce asexually.

AscomycetesFungi that, when reproducing sexually, form a structure called an ascus in which the spores are formed. Some ascomycetes can also reproduce asexually.

S. cerevisiae cell wall varies from 50 nm to 500 nm and can increase to 400 nm under stress conditions64. This pore size is comparable to EV diameter, and the pore therefore represents a potential channel for EVs to trav-erse the cell wall in this species. In C. neoformans, the induction of melanization causes a decrease in cell wall pore size and is associated with the accumulation of vesicle-like structures between the plasma membrane and cell wall, which can be interpreted as a reduction in the porosity needed for EV export65,66. It is conceivable that remodelling of the cell wall to facilitate EV transit occurs in response to a secretion signal; alternatively, EV release may occur at natural ‘break points’ of the cell wall, such as at areas that undergo thinning during daughter cell budding67. EVs may stimulate remodelling by including wall-remodelling enzymes as their cargo: β-glucosidases and endochitinases have been identified in proteo-mic screens of both basidiomycetes and ascomycetes, raising the possibility that their enzymatic activities contribute to EV transit through the cell wall in these organisms2,36,57. Such a mechanism may be widespread, as EVs from the Gram-positive bacterium S. aureus carry peptidoglycan-degrading enzymes, such as Sle1, that can manipulate the thick Gram-positive peptidogly-can cell wall3. One possible explanation for the broad range of sizes of fungal EVs is that cytosol-derived EVs could swell when they are exposed to the lower osmo-lality of the extracellular environment (compared with that of the cytoplasm), causing them to burst and subse-quently reseal. However, we lack definitive information on how EVs cross the cell wall of Gram-positive bacteria, mycobacteria and fungi, and this is an important area for further investigation.

In Gram-negative bacteria, genes affecting OMV production have been identified in E. coli using a screen for known OMV components and lipids68. Although vesiculogenesis in Gram-negative bacteria has been

studied intensively, an OMV-null mutant has never been isolated; this raises the possibility that OMV for-mation is only partially under genetic regulation and is driven by physical and biochemical processes that are not attributable to single genes. Data about the genetic regulation of vesiculogenesis in Gram-positive bacteria, mycobacteria and fungi are lacking, with the exception of data concerning L. monocytogenes sigB (encoding RNA polymerase sigma factor σB) and M. tubercu-losis vesiculogenesis and immune response regulator (virR; also known as rv0431), the roles of which in vesiculo genesis offer insight into the mechanism of this process8,50.

Evidence suggests that the transcription factor σB regulates some aspects of vesiculogenesis in L. monocy-togenes8. σB regulates genes required for survival under cellular stress, as well as the expression of internalin B (InlB), which is important for bacterial invasion, and positive regulatory factor A (PrfA), which regulates the biosynthesis of the haemolytic toxin listeriolysin O (LLO)69 ,70. EVs isolated from a wild-type strain con-tained three times as much InlB as EVs from a ΔsigB mutant strain, whereas the expression of LLO associated with EVs remained the same in the two strains, indicat-ing that σB can contribute to EV cargo regulation8. Fewer EVs were recovered from the ΔsigB mutant than from the wild-type strain, as measured by protein content. Although the quantification of EVs is often determined based on protein concentration, this method does not take into account the possibility that the same number of EVs could be produced, but each could be associated with less protein than in the wild type. EVs from the ΔsigB mutant strain also appeared deformed compared with EVs from a wild-type strain8. A global decrease in transcription may explain the protein quantity differ-ences between these strains, but the variation in mor-phology indicates that σB, or proteins regulated by σB, may have a role in vesiculogenesis.

In a recent study, virR was identified as a regulator of immune modulation and EV formation in mycobac-teria50. Disruption of virR augments cytokine produc-tion by mouse and human macrophages in response to the bacterium, and results in an attenuated phenotype in macrophages and mice50. However, virR deletion mutants have no growth defect in broth culture, which suggests a role for virR in M. tuberculosis virulence. virR seems to control the release of immunomodulatory fac-tors, such as the lipoprotein LpqH, via EVs, as there is no evidence that virR deficiency globally enhances the non-EV secretory pathways mediated by SecA2 and Tat. However, only a limited number of proteins that are transported via the non-EV secretory pathway were tested (6 kDa early secretory antigenic target (Esat6), Ag85b, α-crystallin (HspX; also known as Acr), catalase–peroxidase (KatG; also known as CP) and β-lactamase (BlaC)), and it is possible that the virR mutation affects secretion of other non-EV substrates50. VirR is a cyto-plasmic protein with a highly hydrophobic region, which suggests that it binds to the inner face of the cell membrane or to a protein with a hydrophobic surface. Co-immunoprecipitation studies led to the identification

Figure 2 | Extracellular vesicle formation and release: three non-mutually exclusive hypotheses. Three hypotheses explain possible non-mutually exclusive mechanisms by which extracellular vesicles (EVs) traverse thick cell walls. a | EVs may be forced through the wall by turgor pressure after release from the plasma membrane. Pore size or cell wall thickness may regulate the size and ability of EVs to pass through the cell wall1,59. b | Cell wall-modifying enzymes released with EVs may ‘loosen’ the wall and increase pore size to facilitate EV release. Preparations of EVs from both fungi and Gram-positive bacteria include cell wall-modifying enzymes2,3. c | Protein channels or structural cables may guide EVs to the extracellular environment. Proteomic data show that many fungal EV preparations contain tubulin and/or actin, which are components of structural cables (not shown)1,59.

REV IEWS

NATURE REVIEWS | MICROBIOLOGY ADVANCE ONLINE PUBLICATION | 5

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Figura 3: Modelos de secreción de vesículas. a Presión del turgor. b Enzimas modificadoras. c Canales de la pared. Imagen tomada de Brown y colaboradores [3].

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En las células eucariotas, la ruta de secreción mayoritaria es la denominada ruta

convencional basada en la presencia del péptido señal en el extremo amino terminal.

Son translocadas al retículo endoplasmático posteriormente transportadas a través del

aparato del Golgi y de ahí a la superficie celular, secretando su contenido al exterior [3].

Se ha observado que numerosas proteínas que carecen del péptido señal utilizan

procesos vesiculares para ser secretadas, por lo que desarrollan una vía alternativa de

secreción a la convencional [18].

Como se sabe, el proceso de secreción tiene su última interacción con la membrana

plasmática de las células pero a nivel de hongos dicha interacción surge a nivel de la

pared celular [14]. Aquí es donde aparece una de las grandes incógnitas del proceso de

secreción puesto que por un lado, esta pared es una densa y compleja trama de

moléculas y por otro, la mayor parte de las proteínas fúngicas carecen del péptido señal

necesario para la secreción convencional [18].

Se pone de manifiesto la posible existencia de la ruta de secreción no convencional al

determinar que la eficacia de formación de vesículas extracelulares es semejante entre

mutantes de S. cerevisie, con defectos en la formación de cuerpos vesiculares derivados

del endosoma (MVBs), y su cepa silvestre [19] .

5.2.1. Implicación de la membrana plasmática en la secreción

La membrana plasmática es un componente a tener en cuenta para el conocimiento del

proceso de secreción de las EVs a través de la pared fúngica. Esto conlleva a tres

posibles procesos diferentes de implicación de la membrana plasmática [Figura 5]:

sequence of the other 10% of these proteins (the acid trehalaseAtc1, the 40 ribosomal subunit Asc1, the plasma membraneprotein Axl2, Orf19.6119, Orf19.6741 and the polyubiquitinUbi4), but in some of them this is not consistent with previousreports. This inconsistency might be related to bioinformaticsclues or sequence errors. In this way, Axl2 was identifiedexclusively in the EV-free supernatant fraction (not in vesicles),and curiously, it had been previously identified in a geneticscreening of C. albicans exported proteins. The screening wasbased on in-frame fusions of N-terminal signal sequences withan intracellular allele of the S. cerevisiae invertase gene, astrategy to identify putative secretion signals.8 In that work, asignal peptide for Axl2 was also detected. Furthermore, theS. cerevisiae Axl2 homologue also bears an N-terminal signalsequence.63 Also, Atc1, detected in the two fractions, has beendescribed as a cell wall-linked acid trehalase containing ahydrophobic N-terminal domain corresponding to a signalpeptide.64 Therefore, the percentage of canonical secretedproteins in the EV-free supernatant would increase to 93% (57proteins), which suggest that the classical secretory pathway isthe general mechanism used for C. albicans to secrete EV-freesupernatant proteins into the extracellular medium. Interest-ingly, in the unique report of a different comparative proteomicanalysis of vesicles and extracellular vesicles in a pathogenicfungi (P. brasiliensis), 70% of proteins are predicted assecretory, but most of them use nonconventional secretorypathways.22

It is important to note that the identification of the repertoireof 57 canonically secreted proteins presented in our workrepresents the most comprehensive analysis of the classicalsecreted proteins of C. albicans. As shown in SupportingInformation Table S1, most of the secreted proteins areinvolved in cell wall synthesis, integrity or remodeling, such asEng1, Cht1−3 or the glycosidase Phr2, described as located at

the cell wall62,65,66 or at the cell surface.67,68 From our point ofview, some of these proteins might reach the extracellularmedium due to the release from the cell wall during itsremodeling. On the other hand, some of the identified proteinswere categorized as virulence factors.3 In this way, Als proteins,Ecm33, Mp65, the Saps, glucoamylase (Gca2), Bgl2, Xog1,Plb1, Plb4.5, Phr2 and the protein repressed by Tup1 Rbt5were included as specialized proteins mediating C. albicansadherence to other cells and surfaces or involved in biofilmformation, nutrient acquisition, pH regulators or required fortissue invasion, such as secreted hydrolases and phospholi-pases.3,13,69−72

C. albicans Extracellular Vesicles As Carriers of CytoplasmicProteins Including Several Moonlighting Proteins

A very interesting result of our work, shown in Figure 3A andSupporting Information Table S1, is that all of the proteinsinvolved in metabolism were exclusively detected in the vesiclesample (Eno1, the phosphoglycerate mutase Gpm1, Pdc11,Pgk1, the transaldolase Tal1, Tdh3, Met6 and the s-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Sah1), as well as all proteins lacking asignal peptide involved in protein folding (the cyclophilinCyp1, Hsp70, the chaperone Kar2, the protein disulfide-isomerase Pdi1 and the HSP70 family chaperone Ssa2) orprotein synthesis (the aspartic proteinase Apr1, the elongationfactor Eft2 and the translation elongation factor Tef2). Inaddition, the metabolic enzymes Tdh3, Eno1, Pdc11 and Pgk1and the translation elongation factor Tef2 were abundantproteins in vesicles.The presence of these noncanonical secreted proteins in the

cell wall of C. albicans, although being controversial, wasreported many years ago (revised by Nombela30 andChaffin31); for example, for the glycolytic enzymes enolase73

or glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase74 and for the

Figure 6. Model of two different C. albicans secretory pathways. The classical protein ER−Golgi pathway that secretes proteins with N-terminalsignal peptide is shown in the upper part. Underneath, the unconventional secretion mechanism proposed, by which proteins (with and withoutsignal peptide) would be carried to the extracellular medium in vesicles formed at the plasma membrane, is represented. Enlarged view of EV wasshown. Representative protein groups and single proteins identified in EVs and EV-free supernatant were shown.

Journal of Proteome Research Article

dx.doi.org/10.1021/pr5007944 | J. Proteome Res. 2015, 14, 142−153149

Figura 4: Vías de secreción. A vía clásica o convencional. B vía alternativa o no clásica. Imagen modificada de Gil-Bona A y colaboradores [18].

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(I) macropinocitosis invertida, donde entra en juego su propia membrana plasmática,

(II) evaginación de la membrana desarrollando un ectosoma y (III) procesos de

endocitosis desarrollando los MVBs, basados en la semejanza con los exosomas de

mamíferos que pueden fusionarse con la membrana plasmática en el momento de

secreción para conformar así las vesículas extracelulares [20].

5.2.2. Relación del Aparato de Golgi con las vesículas extracelulares

Existe una concreta evidencia de que los patrones de secreción derivados del aparato del

Golgi interfieren en las vesículas extracelulares fúngicas [19]. Esto se evidencia porque

si se interfiere en la expresión de los genes SEC 4 y SEC 6 (codifican para el control

del transporte de proteínas a través del RE y Golgi en la vía alternativa) se inhibe la

formación EVs.

No se puede cuestionar la implicación del aparato de Golgi en la formación de estas

vesículas.

5.2.3. Secreción a través de la pared celular

En C. neoformans se desarrollaron 3 hipótesis para poder explicar el paso de las EVs a

través de la pared celular [20] que sugieren: (I) el movimiento por los canales de la

misma, (II) la presión mecánica que fuerza a las vesículas a pasar a través de los poros

de la pared y (III) la remodelación de dicha estructura para favorecer a su tránsito.

Al contrario que en las plantas, en la pared fúngica no se han observado canales en su

estructura y las vesículas interactuaran de forma directa con la pared sin ninguna

estructura previa, por lo cual la primera hipótesis queda descartada.

Fig 1. Overview of the functional aspects of fungal EVs. A. Fungal cells release heterogeneous populations of EVs that are immunologically active, asinferred from experimental models resulting in positive modulation of cytokine and nitric oxide (NO) production after exposure of host cells to EVs. Treatmentof immune effector cells with EVs induces increased expression of CD86 and MHC-II molecules. For details and references, see Table 1. B. Biogenesis offungal EVs is illustrated through (I) plasmamembrane remodeling, resulting in cytoplasmic subtractions (inverted macropinocytosis), (II) membrane budding,resulting in ectosome formation, and (III) multivesicular body (MVB) formation, followed by fusion with the plasmamembrane for the extracellular release ofexosomes. C. The current literature supports the notion that fungal EVs can be lyzed for cargo release (IV). Alternatively, fungal EVs can be eitherinternalized by (V) or fuse with the plasmamembrane of host cells, likely resulting in the intracellular release of vesicular cargo (VI).

doi:10.1371/journal.ppat.1005240.g001

PLOS Pathogens | DOI:10.1371/journal.ppat.1005240 December 3, 2015 2 / 6

Figura 5: Procesos de interacción de la membrana (I) macropinocitosis invertida, (II) ectosoma, (III) MVBS. Imagen tomada de Rodrigues y colaboradores [20].

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Por otro lado, mediante estudios de microscopía se ha demostrado la existencia de poros

de un tamaño de 1 a 400 nm en la pared pero al no evidenciarse la relación vesícula-

poro [20], esta teoría queda descartada.

De este modo la hipótesis más acertada es la tercera, remodelación de la pared

desarrollada por Nimrichter y sus colaboradores [15]. Gracias a estudios de las vesículas

de C. albicans, P. brasiliensis, H. capsulatum, S. cerevisiae, y C. neoformans se pudo

conocer que en su composición se localizan enzimas degradadoras de peptidoglucano

y/o quitina, lo que apoya dicha hipótesis [14].

Atendiendo a esta hipótesis, las vesículas son preformadas en el interior de la célula,

situándose en las invaginaciones de la membrana y ocupando el espacio periplasmático

de tal manera, que así pueden atravesar la pared celular y ser secretadas al exterior. Las

EVs fúngicas al atravesar la pared celular del hongo remodelan su estructura mediante

la hidrólisis de polisacáridos, manoproteínas y al mismo tiempo, esta lisis sirve para

exponer componentes internos al exterior.

5.2.4. Viscoelasticidad de la pared como posible puerta de salida para las

vesículas extracelulares

La pared fúngica presenta propiedades viscoelásticas y deformables que pueden llegar a

permitir el tránsito de las vesículas a través de ella. Esto se demostró gracias a Walker y

colaboradores [21] mediante la reciente investigación en la vía de entrada del

AmBisome en C. albicans y C. neoformans.

El AmBisome es un agente antifúngico conformado por anfotericina B empaquetada en

liposomas de 60-80 nm. Es uno de los pocos fungicidas de amplio espectro que se usa

en la clínica para el tratamiento de infecciones fúngicas sistémicas, el cual ha de

atravesar la pared celular para poder alcanzar la membrana plasmática donde interactúa

con el ergoesterol.

Esta forma farmacéutica de la anfotericina B es la menos tóxica para el ser humano de

las 3 formas lipídicas usadas en la clínica por esto, se usa como uno de los tratamientos

de elección en los casos de sospecha de una infección fúngica en los que se desconoce

el agente etiológico [22].

El AmBisome, puede transitar por la matriz de la pared celular sin problemas a pesar de

que el tamaño de los poros de la pared (5,8 nm) es mucho menor al tamaño del los

liposomas. Esto hace pensar que se aprovecha de la viscoelasticidad de la pared para su

entrada, por lo que las vesículas pueden utilizar dicha propiedad para su secreción [21].

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En realidad, el tamaño de estas partículas eran de 20 nm más pequeños que los

liposomas nativos, lo que puede ser debido al proceso de formación del AmBisome. Se

observó por TEM que los liposomas estaban intactos en la parte externa, interna y en la

membrana plasmática de la célula fúngica [Figura 6] pero se cree que se disocian al

llegar a la membrana plasmática, no se observan en el citoplasma, permitiendo la acción

de la anfotericina con el ergoesterol.

Posteriormente, para determinar la razón por la cual el AmBisome atraviesa la pared, se

realizó el mismo proceso pero englobando además de anfoterecina B en el liposoma

partículas de oro de 1,5 nm para aportar mayor rigidez e impedir su deformación. Del

mismo modo, se probó con partículas de oro sin estructura liposómica y se observó por

TEM que los liposomas de oro eran capaces de atravesar la pared y la membrana,

mientras que las partículas de oro aisladas eran incapaces de entrar [Figura 6]. Esto

implica que es el propio liposoma capaz de desplazar los polisacáridos de la pared para

poder penetrarla [21].

Estas observaciones sobre el paso del Ambiosome por la pared celular presentan

importantes implicaciones para esclarecer el proceso de secreción de las vesículas

extracelulares fúngicas. El hecho de que el liposoma pueda penetrar a través de la pared

hace pensar que exista un mecanismo semejante pero en dirección contraria, de tal

manera que las vesículas encuentran un camino para ser secretadas.

5.3 Análisis proteómico de las vesículas extracelulares fúngicas en su interacción

con las células del hospedador

La interacción de las EVs fúngicas con el hospedador se basa en el contacto existente

entre algunos componentes de la superficie de estas (α y β-glucanos, manoproteinas,

the AmBisome liposomes could penetrate the cell wall and capsule layers, apparentlyintact, of two phylogenetically distant fungal species, which are known to differ in cellwall architecture and composition.

Liposomes lacking amphotericin B fail to enter the inner cell wall. Whenliposomes that had the same lipid composition as AmBisome but were devoid ofamphotericin B were used, they were observed at the base of the fibrils of the outer cellwall of C. albicans, but they did not, or very rarely, entered the inner !-glucan– chitinlayer (Fig. 4a to c). For C. neoformans, liposomes containing amphotericin B wereobserved embedded inside the fungal cell wall, often in close proximity to the plasmamembrane, whereas liposomes without amphotericin B were excluded from enteringthe cell wall or were maintained at the exterior cell wall perimeter (not shown).Melanized C. neoformans cells, which have a considerably less porous cell wall thannonmelanized cells (26), were more resistant to amphotericin B-liposome transitthrough the cell wall, with a few liposomes transiting partially through the wall and nomembrane-adjacent liposomes observed (Fig. 3i and k).

Cell wall transit of AmBisome is altered in ergosterol-deficient Candida mu-tants. We next tested whether the transit of the liposomes would be altered if theywere exposed to ergosterol-deficient Candida mutants. C. albicans erg3-1 and erg11 nullmutants had significantly elevated MICs for AmBisome (4 and !16 "g/ml, respectively),compared to 0.5 "g/ml for the wild-type parent strain SC5314. When AmBisome was

FIG 1 TEM images of C. albicans SC5314 incubated with 12 "g/ml AmBisome, showing intact liposomesin the outer (a, c, and d) and inner (a, b, c, and e) cell wall and at the cell membrane (f), indicated byarrows. The granular particles in the cytoplasm are ribosomes, not liposomes. Bars, 100 nm.

Walker et al. ®

January/February 2018 Volume 9 Issue 1 e02383-17 mbio.asm.org 4

Figura 6: Imágenes de TEM de la pared de C. albicans SC5314 incubada con 12 µg/ml Ambiosome. [a] Liposomas intactos en la pared externa. [b] Liposomas con oro encapsulado atraviesan la pared celular [c] partículas de oro no encapsuladas son incapaces de atravesar la pared. Imagen tomada de Walker y colaboradores [21].

incubated with the erg3-1 or erg11 mutant, the liposomes were observed to concen-trate at the junction between the outer fibrillar and inner cell wall layers (Fig. 4d ande). Similarly, when an erg3/erg11 double null mutant of Candida tropicalis was used, theAmBisome MIC increased from 1 to 16 !g/ml and the liposomes again failed to enterthe inner cell wall layer and remained concentrated at the base of the outer cell wallmicrofibrils (images not shown).

AmBisome affects cell wall porosity. Since AmBisome liposomes seemed to beable to transit through cell walls with a porosity that was predicted to exclude them,we next tested whether AmBisome affected the measured cell wall porosity of C. al-bicans using a standard porosity assay based on assessing the relative speed of

FIG 2 TEMs of cell walls of wild-type C. albicans SC5314 cells revealing AmBisome liposomes encapsu-lating 15-nm-diameter colloidal gold particles (a to c) or AmBisome liposomal membrane studded with1.6-nm gold particles (d and e). Control gold unencapsulated particles failing to enter the outer or innercell walls are shown in panels f and g. Bars, 100 nm. The cartoon icons with orange spheres representAmBisome liposomes, and the gold spheres represent 15-nm or 1.6-nm gold particles that were eitherencapsulated inside the liposome or present within the liposomal membrane, respectively. Theseliposomal reagents were imaged in the indicated panels.

AmBisome Transit through Fungal Cell Walls ®

January/February 2018 Volume 9 Issue 1 e02383-17 mbio.asm.org 5

incubated with the erg3-1 or erg11 mutant, the liposomes were observed to concen-trate at the junction between the outer fibrillar and inner cell wall layers (Fig. 4d ande). Similarly, when an erg3/erg11 double null mutant of Candida tropicalis was used, theAmBisome MIC increased from 1 to 16 !g/ml and the liposomes again failed to enterthe inner cell wall layer and remained concentrated at the base of the outer cell wallmicrofibrils (images not shown).

AmBisome affects cell wall porosity. Since AmBisome liposomes seemed to beable to transit through cell walls with a porosity that was predicted to exclude them,we next tested whether AmBisome affected the measured cell wall porosity of C. al-bicans using a standard porosity assay based on assessing the relative speed of

FIG 2 TEMs of cell walls of wild-type C. albicans SC5314 cells revealing AmBisome liposomes encapsu-lating 15-nm-diameter colloidal gold particles (a to c) or AmBisome liposomal membrane studded with1.6-nm gold particles (d and e). Control gold unencapsulated particles failing to enter the outer or innercell walls are shown in panels f and g. Bars, 100 nm. The cartoon icons with orange spheres representAmBisome liposomes, and the gold spheres represent 15-nm or 1.6-nm gold particles that were eitherencapsulated inside the liposome or present within the liposomal membrane, respectively. Theseliposomal reagents were imaged in the indicated panels.

AmBisome Transit through Fungal Cell Walls ®

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galactomananos, glucuronoxilomanano (GXM), quitina y proteínas atípicas) y células

del hospedador [16].

También, se ha podido constatar que componentes de las EVs como la gliceraldehido-3-

fosfato deshidrogenasa (GAPDH), la enolasa, la transaldolasa intervienen en la

interacción con el hospedador.

La GAPDH es una proteína citoplasmática que se localiza también en el exterior de C.

albicans mediando en la interacción con la fibronectina y laminina, proteína de la

lámina basal, además se encuentra en P. brasiliensis interviniendo en la misma unión

que en el caso anterior pero interactúa con las fibras de colágeno I facilitando la

infección [16]. Gracias a estos conocimientos, hoy en día, la GAPDH es una diana de

vacunación ya que al poder bloquear su acción se puede limitar la diseminación del

microorganismo, desarrollando así anticuerpos frente a ella.

La enolasa, proteína imnunogénica, es importante en la interacción con el hospedador

tanto es así, que se sugiere que Ig G anti-enolasa y aldolasa frente a C. albicans en

combinación pueden ser marcadores para las candidiasis invasivas. Además, dicha

enzima puede inducir a la fibrolisis, facilitando la diseminación del parásito [16].

Se han determinado otras enzimas metabólicas que intervienen en las interacciones con

el hospedador como es la fosfoglicerato mutasa 1 (Pgmt1) que cataliza la 8ª reacción de

la glicólisis. Dicha enzima, presente en las EVs de C. albicans, interacciona con el

factor H, FHL-1 el plasminógeno, fibronectina... facilitando la infección, la evasión del

sistema inmune y la degradación de la matriz extracelular [16].

Se ha de resaltar la acción de las proteínas de choque térmico (HSP) que se localizan en

las EVs como por ejemplo, HSP70 recombinante (Cn-rHSP70) de C. neoformans. La

interacción de ésta con los macrófagos no daña a la fagocitosis pero sí incrementa la

supervivencia del hongo dentro de los macrófagos por un descenso de los niveles de

NO. Cn-rHSP70 puede regular la expresión de los receptores TLR4 de los macrófagos e

interfiere de forma directa en su temprana polimerización por lo que no pueden generar

un buen control sobre el hongo [23]. Todo ello indica que las EVs contienen proteínas

que favorecen la supervivencia de C. neoformans en el hospedador.

Por otro lado, C. albicans expresa en sus EVs dos proteínas del tipo de HSP70: SSA1 y

SSA2. Esta última se localiza en la pared y en la membrana plasmática tanto en su

forma de levadura como de hifa [16].

A su vez, SSA1 interactúa de forma parcial en la penetración de este hongo en las

células M del intestino, favoreciendo la evasión del sistema inmune.

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Al mismo tiempo, en las EVs se localizan componentes importantes de la pared celular

como son β-1,3 glucanasas (Xog1p, Sun41y MP65) caracterizadas en C. albicans [16].

Siendo la más importante la primera que es un receptor para el péptido antimicrobiano

LL-37 producido por los neutrófilos.

Sun41 interacciona con las citoquinas, interviene en la adhesión a los tejidos del

hospedador y en la formación de biofilms [24].

También existe influencia por otras glucanasas secretadas por C. albicans, H.

capsulatum, C. neoformans, and P. brasiliensis en el momento del reconocimiento por

el hospedador pero queda por determinar su acción.

5.4 Vesículas extracelulares fúngicas como medio de potenciación de virulencia

Una de las características más importantes de las cepas patógenas fúngicas es su rápida

proliferación dentro de los macrófagos del hospedador. El estudio de Bielska y

colaboradores en Cryptoccocus gattii [25] revela que existe una específica coordinación

en el comportamiento de cada una de estas células para llegar a multiplicarse lo más

posible. Este proceso se conoce como el mecanismo de “division of labour”.

Este mecanismo está mediado por las EVs fúngicas, concretamente se demostró en C.

gattii y se observó que únicamente las EVs de cepas patógenas son capaces de potenciar

el crecimiento intercelular de cepas no virulentas cuando se desarrolla una coinfección.

Además, para generar esa interacción no tienen porque estar ambas cepas en el mismo

macrófago, es decir, el mecanismo de “division of labour” se realiza a distancia [25].

Se comprobó mediante un sistema transmembrana donde se separaba físicamente a la

cepa patógena (C. gattii R265) de la no virulenta (C. gattii ICB 180) que estaba en

contacto con macrófagos, pero sí se permitía el paso de partículas menores a los 400

nm. Bajo estas condiciones se desarrolló un aumento significativo del crecimiento de

ICB 180 dentro de los macrófagos, demostrando así que las moléculas secretadas por

R265 son suficientes para dicha proliferación a distancia [25]. Al realizarse al contrario

no se produjo ningún aumento del crecimiento [Figura 7].

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Se determinó que el material capsular fúngico no era suficiente para generar el aumento

del crecimiento, lo que sugiere que es necesario un sistema de secreción intacto. Se

realizaron técnicas de ultracentrifugación, microscopía electrónica y análisis de

nanopartículas manifestándose la existencia de EVs de C. gattii con un tamaño menor a

100 nm.

Para demostrar si las EVs de R265 son las que presentan la capacidad de producir dicho

aumento de la proliferación en ICB 180, una vez fagocitada esta cepa se añadieron

dichas EVs y se produjo la respuesta esperada de manera dosis dependiente [Figura 8].

También se trabajó introduciendo las vesículas antes de la infección pero no se observó

tal crecimiento mientras, que si se trataba a los macrófagos con las EVs antes de la

infección si se desarrollaba un leve crecimiento [25]. Esta pequeña proliferación puede

deberse a que las EVs se desestabilizan en presencia de las proteínas séricas.

Todos estos resultados determinan a las EVs fúngicas como aceleradores del

crecimiento intracelular y por lo tanto, de la virulencia en C. gattii, pero sólo para cepas

que presenten una mínima capacidad de proliferación intracelular.

Figura 7: Representación gráfica del aumento de proliferación de C. gattii ICB 180 en presencia de Evs de C. gattii R265. Imagen tomada de Bielska y colaboradores [25].

of phagocytosed ICB180 yeasts per macrophage was not altered inthe presence of native or heat-inactivated EVsR265 (P= 0.8742,Kruskal−Wallis test; Supplementary Fig. 4b). The majority ofinfected macrophages contained only one fungal cell, and wenever observed more than three cells phagocytosed within firsttwo hours of fungal infection (Supplementary Fig. 4b). Thus theincreased IPR values we observe in the presence of R265-derivedEVs do not result from a higher rate of phagocytosis.

Interestingly, only EVs from virulent, outbreak cryptococciappear to be able to induce this effect, since EVs isolated fromICB180 were not able to increase the IPR of ICB180 or R265(Fig. 3d, +EVsICB180). Similarly, exposing R265 to additional EVsderived from the same strain could not further augmentintracellular proliferation (Fig. 3d, +EVsR265-10 μg) even at highervesicle concentration (Fig. 3d, +EVsR265-50 μg). EVs isolated fromthe outbreak strain were also not capable of boosting theintracellular survival of completely avirulent C. gattii strains CBS

8684 and NIH 312 (Supplementary Fig. 6). Lastly, EVs isolatedfrom the virulent C. neoformans KN99 strain were unable to raisethe IPR of ICB180 (Fig. 3e). Thus, taken together, these datasuggest that EVs act as an ‘accelerator’ of intracellular prolifera-tion (and thus virulence) within C. gattii, but only for strains thatalready have the capacity for low (but not zero) rates ofintracellular proliferation.

Enhanced survival requires proteins and RNA from outbreakEVs. Heat inactivation of EVsR265 blocked their ability to triggerenhanced survival of ICB180 cells when added either before orduring macrophage infection (Fig. 3b, +EVsR265hk), suggestingthat the activity of EVs requires either a heat-labile component oran intact vesicular structure that is rendered inactive by hightemperature. To further test if capsule polysaccharides might havea role in promoting proliferation of yeasts inside macrophages, we

Opsonisation

Activation

IPR

IPR

IPR

IPR

8 14

12

10

8

ns

ns ****

*ns

ns ns

ns

P=0

.820

3 P=0

.128

9

P=0

.403

7

P>0

.999

9 P<0

.000

1

P=0

.149

0

P=0

.330

3

6

4

2

0

6

4

2

0

6

4

2

0n =

9/9/

9/9/

24/1

6/11

exp

n =

20/2

4/24

/16

exp

n =

8/11

/11

exp

ICB180

ICB180

R265KN99

ICB180

+EVs KN99-10 µg

+EVs KN99-50 µg

R265

+EVs R265-10 µg

+EVs ICB180

+EVs ICB180

+EVs R265-10 µg

+EVs R265-50 µg

+EVs R265-50 µg

14 +EVsR265 +EVsR265hk

12

10

8 P=0

.002

0

P=0

.109

4

P=0

.003

9

P=0

.015

6

P=0

.062

5

P=0

.128

9

P=0

.195

3

P=0

.195

3

6 ** nsns

ns ns ns

n =

10/1

1/8/

3/9/

9/8/

3/9/

9 ex

p

**

**

*4

2

0

R265

ICB180

PHS opsonisa

tion

PHS opsonisa

tion

Ab opsonisa

tion

Ab opsonisa

tion

Activa

tion

Activa

tion

Infection

Infection

Infection

MO J744

ICB180

EVs

(i)

(ii)

(iii)

a b

c d e

Fig. 3 EVs increase survival of cryptococci inside macrophages. a A schematic representation of the experimental assay in which extracellular vesicles(EVs) were added at different time points, either (i) to the cryptococci during opsonisation, 1 h prior to infection (‘Opsonisation’), (ii) directly to themacrophages J774 (MO J774) during 1 h of activation prior to infection (‘Activation’) or (iii) at the same time as the cryptococci are added to themacrophages (‘Infection’). b IPRs of R265 growing alone (R265), ICB180 growing alone (ICB180) and in the presence of 10 μg of EVs isolated from R265cells (EVsR265) or heat-inactivated EVsR265 (EVsR265hk) added at different stages of infection, as described above: during yeast opsonisation by pooledhuman serum (‘PHS opsonisation’) or by GXM-specific antibodies—Mab 18B7 (‘Ab opsonisation’), J774 activation (‘Activation’) or during incubation withboth macrophages and ICB180 yeast cells (‘Infection’). Data are presented as scattered dot plots with lines representing their medians. Data arerepresentative of results from 3 (with biological triplicates) to 11 independent experiments with 213–1767 total number of yeasts counted for each sample.Wilcoxon paired t test where * (P≤ 0.05), significant difference; ** (P≤ 0.01; and P= 0.0078 for infection with EVsR265), highly significant difference andns (P > 0.05), not significantly different. c IPR values can be further increased after adding higher amounts of EVs (+EVsR265-50 μg). Data are presented asscattered dot plots with lines representing their medians. Data are representative of results from 8 to 11 independent experiments with 1504–1948 totalnumber of yeasts counted for each sample. Wilcoxon paired t test where * (P= 0.0186), significant difference. d EVs isolated from ICB180 (+EVsICB180) donot increase IPRs of ICB180 or R265 and proliferation of R265 is not enhanced by its own EVs (+EVsR265) even at higher concentration (+EVsR265-50 μg).Data are presented as scattered dot plots with lines representing their medians. Data are representative of results from 9 to 24 independent experimentswith 275–7888 total number of yeasts counted for each sample. Wilcoxon paired t test where ns (P > 0.05), not significantly different. e IPR of a non-virulent ICB180 strain is not altered by the presence of EVs isolated from C. neoformans virulent strain KN99 even at higher concentration of those vesicles(+EVsKN99-50 μg) added during the infection step. Data are presented as scattered dot plots with lines representing their medians. Individual Wilcoxonmatched-pairs signed rank test presented as P values above each dot plot, where ns (P > 0.05), not significantly different. Data are representative of resultsfrom at least 16 independent experiments with 1742–5209 total number of yeasts counted for each sample

ARTICLE NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/s41467-018-03991-6

4 NATURE COMMUNICATIONS | �(2018)�9:1556� | DOI: 10.1038/s41467-018-03991-6 | www.nature.com/naturecommunications

Figura 8: Gráfica del efecto dosis dependiente del aumento de proliferación de C. gattii ICB180 en presencia de EVs de C. gattii R265. Imagen tomada de Bielska y colaboradores [25.]

Cryptococcosis is a major human and animal life-threatening fungal disease1–3. Globally, most humaninfections are caused by Cryptococcus neoformans, with

the related species Cryptococcus gattii causing less than 1% of allhuman cryptococcal disease. However, in the late 1990s a near-clonal lineage of C. gattii became established in British Columbia,Canada, and subsequently caused a major cluster of human andanimal disease that has come to be known as the PacificNorthwest Outbreak4. A defining feature of cells within theoutbreak lineage is their ability to proliferate very rapidly withinhost phagocytes5. We previously demonstrated that this rapidproliferation is driven by a ‘division of labour’ mechanism, inwhich individual fungal cells coordinate their behaviour tomaximise proliferation of the population as a whole6. However,the mechanism by which this coordination occurs at a cellularlevel has remained enigmatic.Here we demonstrate that the key regulator of this ‘division of

labour’ process is the release and exchange of extracellular vesicles(EVs) by outbreak strains of C. gattii. These EVs are efficientlytaken up by infected host macrophages and trafficked to thefungal phagosome, where they induce rapid proliferation ofthe recipient pathogen cell and thereby drive pathogenesis in thishighly virulent lineage.

Results‘Division of labour’ can be triggered over large distances. Wepreviously showed that outbreak strains of C. gattii induce therapid intracellular proliferation of otherwise non-virulent strainsduring co-infection6. To test whether this effect required thefungal cells to be present within the same host cell, we generatedfluorescently tagged versions of an outbreak (R2657) and non-outbreak (ICB180) strain of C. gattii and confirmed that thesestrains were unaltered from their parental strains in morphology,growth or stress tolerance (Supplementary Fig. 1). ICB180-mCherry and R265-GFP were used to infect J774 macrophageseither alone or together. Microscopy observations of infectedmacrophages at 2 hours post infection (h.p.i.; Fig. 1a) and 24 h.p.irevealed that dually infected host cells were exceptionally rare(2/5479 infected host cells; Fig. 1a), suggesting that isolates do notneed to be in the same phagocyte to trigger ‘division of labour’.To test this in more detail we infected macrophages with the non-outbreak strain ICB180 and then used a transwell system(ThinCertTM) to physically separate C. gattii R265 (an outbreakstrain) from contact with the macrophages while continuing toallow them to freely exchange particles below the 400 nmtranswell cut off (Fig. 1b). Under these conditions, the presence ofan outbreak strain, but not a non-outbreak strain, in the upper

30ICB180R265

2 h

24 h

n =

12/1

2/8/

12/1

2/8

exp

ICB180-m

Ch

R265-GFP

co-in

fection

co-in

fection

ICB180-m

Ch

R265-GFP

25

20

15

MO

con

tain

ing

yeas

ts (%

)

10

5

0

IPR

6

10

n =

22/2

1/22

/12

exp

ns

**5

4

3

2

1

0

ICB180

ICB180(

+R265)

R265

R265(+IC

B180)

ThinCertTM

Well

R265

ICB180

MO

Upper compartment

Porous PETmembrane

Lower compartment

a

b

Fig. 1 Long-distance communication can drive rapid intracellular proliferation in C. gattii. a During co-infection, different strains of C. gattii (R265-GFP shownin green; ICB180-mCherry shown in red) are rarely phagocytosed by the same macrophage. Bar: 10 μm. The number of infected macrophages containingboth isolates of yeast at the same time is very low at 2 h.p.i. (2 in total 5479 tested macrophages) and at 24 h.p.i (1 in total 3235 tested macrophages). Dataare presented as scattered dot plots with lines representing their medians. Data are representative of results from 8−12 independent experiments with aminimum of 150 macrophages analysed per sample per experiment. b A schematic representation of the experiment using transwell system ThinCertTM

with 400 nm porous membrane that separates lower from upper compartments thereby allowing splitting of growth of two different C. gattii strains R265(pathogenic) and ICB180 (non-pathogenic). After two initial hours of the infection the transwell system was removed and intracellular proliferation rate (IPR)of ICB180 was measured (as T0) and after following 24 h (as T24). The 2-h presence of R265 (outbreak) cryptococci in the transwell system (ICB180(+R265))induces significantly higher intracellular proliferation of ICB180 (non-outbreak strain) within macrophages (P= 0.0038, Wilcoxon matched-pairs signed ranktest), an effect that is not seen when R265 is replaced for ICB180 (R265(+ICB180); P= 0.9263, Wilcoxon matched-pairs signed rank test). Data are presentedas scattered dot plots with lines representing their medians. Data are representative of results from 12–22 independent experiments with 879–5238 totalyeasts counted for each sample. Wilcoxon matched-pairs signed rank test where ** (P≤ 0.01), significant difference; ns (P > 0.05), not different

ARTICLE NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/s41467-018-03991-6

2 NATURE COMMUNICATIONS | �(2018)�9:1556� | DOI: 10.1038/s41467-018-03991-6 | www.nature.com/naturecommunications

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Este fenómeno no sólo se desarrolla por la presencia de EVs sino que también es

fundamental su composición porque si se alteran sus proteínas, membrana lipídica o

RNA se elimina su capacidad de aumentar la proliferación. Por otro lado, se ha

constatado que la alteración o presencia del DNA no es imprescindible para dicha

función [25].

5.5 Papel de las vesículas extracelulares fúngicas como vacunas

Las EVs además de proporcionar mejores condiciones y estabilidad a los componentes

proteicos, facilitan su diseminación por el organismo y la interacción con las células del

sistema inmune del hospedador.

Las vacunas vesiculares son siempre más seguras y presentan menos problemas que las

conformadas por cepas atenuadas. En la actualidad, se han desarrollado vacunas con

vesículas de membrana externa de bacterias Gram negativas (OMV), como la vacuna

para la meningitis B (Bexsero) [26].

Este tipo de vacunas son muy eficaces cuando la cepa que circula por el medio es la

misma que las de las EVs. Sin embargo, no todas son óptimas para desarrollar vacunas

como ocurre en C.neoformans que son inestables en presencia de las proteínas del suero

del hospedador [26].

En Malassezia sympodialis, se ha observado la acción inmunológica de las EVs

fúngicas por su capacidad de modular el sistema inmune in vivo a través de la

estimulación de la IL-4 y el TNF-α .

En la clínica no existe todavía ninguna vacuna antifúngica y mucho menos conformada

por EVs, pero se está trabajando con diferentes estrategias como proteínas

recombinadas y glucoconjugados, ya que las células del hospedador carecen de estos

últimos compuestos [27].

Un ejemplo de posible vacuna proteica de C. albicans es la desarrollada en el estudio

llevado acabo por Gil-Bona y colaboradores [18]. En el que se seleccionó una proteína

de la pared 1,3- β-glucosiltransferasa (Bgl2) que se localiza tanto en las vesículas como

en su secretoma y presenta un carácter inmunogénico, lo cual interesó para su posible

uso como vacuna. Además, por análisis proteómicos se clasificó como un biomarcador

de las candidiasis sistémica.

Los problemas que se deben tener en cuenta para el desarrollo de una vacuna anti-

Candida son; su gran capacidad de variación morfológica, la existencia de una posible

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tolerancia inmunológica por parte del hospedador y la dificultad de generar inmunidad

activa en pacientes imunocomprometidos [27].

Se ha de destacar que las Evs fúngicas activan la inmunidad por múltiples mecanismos

hasta el punto de poder actuar a favor del hospedador frente a la infección, lo cual

refuerza su sentido como vacuna.

Se necesitan más estudios sobre las Evs fúngicas para su aplicación como vacunas en el

futuro.

6. CONCLUSIONES Los estudios realizados sobre las EVs fúngicas son tan recientes que todavía queda

mucho camino por recorrer para conocer toda su complejidad y funciones más

relevantes.

1. Todas las células son capaces de producir EVs y en concreto las EVs fúngicas

presentan numerosos componentes proteícos, glucídicos, esteroles,

glucoceramidas, RNAm y microRNA.

2. Numerosas proteínas fúngicas carecen del péptido señal y utilizan procesos

vesiculares para ser secretadas.

3. La pared fúngica presenta propiedades viscoelásticas y deformables que pueden

llegar a permitir el tránsito de las vesículas a través de ella.

4. Las EVs fúngicas son estructuras ricas en antígenos que ayudan a la secreción de

enzimas metabólicas que intervienen y facilitan la infección. Además, podrían

activar la inmunidad por múltiples mecanismos.

5. La GAPDH, la enolasa y la Pgmt1 interaccionan con la fibronectina facilitando

la diseminación del microorganismo y la evasión del sistema inmune.

6. Es necesario realizar estudios para ver la utilidad de las EVs fúngicas como

vacunas.

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