Aplicación de Técnicas de Poliploidía para la Obtención de Triploides de almeja (Venus antiqua)

Universidad Católica del Norte Magister en Acuicultura

2008 ‐ 2009

Cultivo de Moluscos y Crustáceos

Aplicación de Técnicas de Poliploidía para la Obtención de Triploides de almeja (Venus antiqua)

Alumno Avelino Muñoz Manterola

Coquimbo, Mayo de 2008

Cultivo de Moluscos y Crustáceos Producción de Triploides de Almeja (Venus antiqua)

2 Magister en Acuicultura, Universidad Católica del Norte, Coquimbo ‐ Chile

Contenido

Introducción ............................................................................................................. 3

Objetivos .................................................................................................................. 4

Objetivo General ................................................................................................... 4

Objetivos Específicos ............................................................................................. 4

Antecedentes Generales .......................................................................................... 5

Nombre científico .................................................................................................. 5

Distribución ........................................................................................................... 5

Biología ‐ historia de vida ...................................................................................... 5

Técnicas de Producción ......................................................................................... 5

Estado del Arte ...................................................................................................... 6

Obtención de Gametos y Cultivo larval .................................................................. 12

Obtención de gametos ........................................................................................ 12

Fecundación ........................................................................................................ 12

Cultivo larval........................................................................................................ 13

Métodos de Aplicación ........................................................................................... 15

Método de Triploidización Propuesto ................................................................. 17

Métodos de Verificación ........................................................................................ 20

Recuento de Cromosomas .................................................................................. 21

Recuento de Nucleolos ....................................................................................... 21

Citometría de Flujo .............................................................................................. 22

Resultados Esperados ............................................................................................ 23

Bibliografía ............................................................................................................. 24



Introducción

La almeja Venus antiqua de amplia distribución en Chile, ha sido sometida a una intenso esfuerzo de pesca por lo que las capturas han disminuido drásticamente en los últimos años. Por tal motivo se ha realizado un esfuerzo interesante por parte de algunas instituciones como el Instituto de Fomento Pesquero y de la Universidad de Valparaíso en el desarrollo de técnicas de producción controlada de juveniles con resultados auspiciosos que permiten visualizar a corto plazo la iniciación de actividades de acuicultura comercial a gran escala de esta especie y de otras variedades de almejas nativas. Venus antiqua por sus características organolépticas se asimila a dos tipos de almejas de alto valor comercial, Mercenaria mercenaria y Venus gallina. La primera se cultiva comercialmente en la costa del Atlántico y Golfo de México de USA siendo los principales Estados productores Florida y Virginia con producciones valoradas en unos U$ 50 millones anuales con ejemplares idealmente de unos 35 mm de longitud, talla que es la más valorada. El precio a productor en USA alcanza a unos U$ 0.15 la unidad observándose un precio a público a U$ 0.53 la unidad en supermercados de Wiilliamsburg, Virginia en Noviembre de 2005.

El presente trabajo propone la producción de ejemplares triploides en una primara fase por medio de inducción química y producir líneas reproductoras de hembras triploides para luego establecer un stock reproductor tetraploide. Una vez obtenidos los ejemplares tetraploides se puede establecer una base para la producción de juveniles 100% triploides sin la inducción química sino que solamente por cruzas selectivas entre machos diploides con hembras tetraploides. Triploides y tetraploides son aquellos organismos con tres y cuatro sets de cromosomas respectivamente. Los moluscos triploides tales como ostiones y almejas, son de gran interés para la acuicultura ya que son mayoritariamente estériles y como consecuencia de esto poseen una mayor tasa de crecimiento y rendimiento en carne que sus símiles diploides. La producción de tetraploides es de suma importancia ya que no son estériles y en el cruzamiento de machos normales diploides con hembras tetraploides se consiguen ejemplares en un 100 % triploides.



Objetivos

Objetivo General Aplicación de métodos biotecnológicos para la obtención de ejemplares triploides de almeja (Venus antiqua) técnica y económicamente rentables para el mejoramiento de tasas de crecimiento y factor de condición en la fase de engorda factibles de ser transferidos al sector productivo con la finalidad de aumentar su competitividad con la incorporación al mercado de nuevos productos de mejor calidad.

Objetivos Específicos • Definir y aplicar técnicas de inducción química de triploidía en almeja

(Venus antiqua) en base a manipulación cromosómica.

• Identificación e inducción al desove de hembras triploides, anormalmente fértiles e inducción de tetraploidía en los huevos por acción química.

• Evaluar parámetros de sobrevivencia, crecimiento y factor de condición en ejemplares triploides y normales de almejas en condiciones de cultivo.



Antecedentes Generales

Nombre científico Venus antiqua (King & Broderip, 1831)

Distribución Perú‐Puerto Williams (Chile), Uruguay a Islas Malvinas (Zagal et al. 2001).

Biología historia de vida Molusco bivalvo, que presenta una concha gruesa, de coloración blanquecina‐gris, a veces con manchas café. La superficie externa presenta estrías radiales y concéntricas definidas. Seno paleal anguloso y corto, no alcanza un tercio de la longitud total de la concha. Longitud máxima 8.4 cm (Zagal et al. 2001). Vive semienterrada en fondos arenosos del intermareal y submareal alcanzando 40 m de profundidad. Se alimenta filtrando plancton y detritus de la columna de agua. Es depredada por moluscos gastrópodos, aves y el hombre. Presenta sexos separados. La primera madurez sexual ocurre a 3.6‐4.0 cm de longitud en ambos sexos. En Metri, el ciclo reproductivo de esta especie presenta dos periodos de desove durante el año (Zagal et al. 2001). Se consume fresco y conservas. El desembarque de "almejas" alcanzó su máximo (43.761 t) en el año 1988. El promedio de extracción entre 1998 y 2002 fue de 17.895 t. Las estadísticas pesqueras incluyen los datos de otras especies (Osorio, 2002).

Técnicas de Producción Las técnicas de producción de semillas y de cultivo de almejas están bien desarrolladas en países como Italia y USA. En USA se desarrolló fuertemente el cultivo de almejas como consecuencia del desarrollo de técnicas de producción de semillas en sistemas controlados y de siembra y engorda en playas de la zona intermareal, originadas y perfeccionadas a nivel comercial por el Eastern Shore Laboratory en Wacahpreague perteneciente al VIMS (Virginia Institute of Marine Science) a principios de los años 80.

La experiencia en Chile con la almeja Venus antiqua indica que la primera madurez se produce a los 32 mm de longitud y se tiene que un ejemplar de talla



comercial para el mercado de exportación de 40 mm de longitud se obtiene a los 26 meses de cultivo. En los mercados mundiales la demanda de almejas es por las de una talla de entre 30 y 40 mm lo que requiere en forma obligatoria la producción de semillas en ambiente controlado debido a que el aumento en la demanda de almejas en Chile motivó un aumento del esfuerzo de pesca desproporcionado en relación con la abundancia del recurso, lo que obligó a la autoridad pesquera a establecer una talla mínima de extracción de 55 mm de longitud de valvas para todas las variedades de almejas (D. S. Nº 683 del 14 de Enero de 1981) Por lo tanto las únicas almejas liberadas de esta norma son aquellas producciones provenientes de la acuicultura.

Por otro lado, es importante hacer notar que hay un nicho interesante para el mercado de la almeja chilena en estado vivo, fresca en su concha tanto en la CEE como en el mercado de USA. Este último país importó durante el año 2005 U$ 24 millones en almejas frescas refrigeradas en su concha desde diferentes países con un precio medio de U$ 10.94 por kilo con valores que fluctuaron entre U$ 33.14/kg para almejas de las Islas Marshall y U$ 1.58 /kg para las provenientes de Vietnam. Como ejemplo se puede indicar que el precio en playa para la almeja Quahog (Mercenaria mercenaria) en el Estado de Virginia (Eastern Shore) en Noviembre de 2005 fue de U$ 0.18 por unidad y en supermercados de la ciudad de Williansburg en el mismo Estado y misma fecha el precio a público observado fue de U$ 0.53 por unidad (Hernández J. M. 2005) Estos precios indican que existe un potencial de desarrollo enorme más todavía si Chile es el único país Sudamericano que cuenta con un Convenio de Entendimiento entre el Food and Drugs Administration y el Servicio Nacional de Pesca de Chile para autorizar la exportación de mariscos frescos vivos.

Estado del Arte La triploidización es una herramienta de manejo genético que consiste en inhibir el proceso de meiosis en la maduración del huevo que ocurre inmediatamente después de la fecundación e induce una dotación cromosómica de 3n frente a los 2n normal de las células. La aplicación de manipulaciones cromosómicas en moluscos se inició a mediados de la década de los 80, observándose que su aplicación producía ventajas similares a lo ocurrido con los peces ya que se



observa un incremento en el crecimiento somático al no distraer energía metabólica en la producción de gametos. En bivalvos es posible inducir la triploidización del huevo por bloqueo, en el proceso de la meiosis, de los cuerpos polares por medio de agentes físicos o químicos.

La triploidia es una condición genética en la cual hay tres sets de cromosomas en vez de dos que es lo normal. Un gran número de especies agrícolas de consumo común han sido mejoradas utilizando la triploidización tal es el caso de sandías sin semillas, plátanos y naranjas tipo navel como ejemplo. Ostras triploides y otros bivalvos son en general reproductivamente estériles, incapaces de tener una maduración sexual normal. Esto tiene ventajas para mejorar la calidad de la carne, especialmente en verano y se mejoran las tasas de crecimiento comparados con diploides normales y este fenómeno es conocido como “polyploid gigantism” (Gong N. et al 2004).

Por efecto de una mutación espontánea la triploidización ocurre en forma poco frecuente en casi todas las especies del reino animal, mientras que en algunas de ellas el fenómeno es letal. Asociada con anormalidades severas en mamíferos y aves la triploidía es viable y hasta morfológicamente irreconocible desde el punto de vista fenotípico en comparación con animales diploides normales en muchas especies de invertebrados, anfibios y peces (Fankhauser, 1945 ) Los animales triploides son estériles pero existen posibilidades de encontrar ejemplares hembras viables , que son la base para la formación de un plantel reproductor tetraploide 4n al cruzar hembras 3n con machos 2n y realizar la supresión de la expulsión de uno de los cuerpos polares en la fase de la división mitótica lográndose una descendencia tetraploide 4n la cual por ser sexualmente viable servirá de base para implementar un plantel reproductor para la producción individuos triploides por cruzas normales con hembras 2n normales y sin la adición de agentes químicos al proceso. (Guo et al. 2000) (Zebal R. com.per. 2007)

Existen varios métodos principales descritos para la inducción de triploidía en moluscos bivalvos. Estos consisten en tratar los huevos con shock térmico, inmersión en solución de Citocalasina B (Wada el al 1989) o también en inmersión en 6‐dimethylaminopurine (Wenshan et al. 2004) a varios intervalos después de



la fecundación con el fin de inhibir la expulsión de los Cuerpos Polares 1 y 2 (PB1 y PB2). Para la determinación del éxito del proceso se emplean técnicas de citometría de flujo (Huiping et al. 2004) o selección por tamaño mediante la utilización de tamizado en mallas de diferentes aberturas (Zebal R. com. per. 2007) ya que los huevos triploides son de app. un 30% de mayor tamaño que los huevos normales 2n. En experiencias con ostras C. gigas triploides se encontró, al cabo de 26 meses de cultivo, que ejemplares triploides obtuvieron un 30% de ganancia en rendimiento de carne respecto a ejemplares diploides normales (4Cs Breeding Tech. Inc 2006)

En Japón se han realizado experiencias de inducción de triploidía en ostra perlífera Pinctada funcata (Wada et al. 1989) para el efecto huevos de ostra perlífera se trataron con shocks térmicos de frío, calor y citocalasina B (CB) a diferentes intervalos de tiempo después de la fecundación para inducir la triploidía.. Los dos primeros tratamientos fueron inefectivos al producir daños afectando el desarrollo de los huevos con altas mortalidades y crecimiento de las larvas. El tratamiento más efectivo encontrado en esta experiencia consistió en la inmersión de los huevos en una solución con 0.5 mg/lt de CB por 20 a 50 minutos después de la fecundación lo que entregó un 100% de juveniles triploides. En otra experiencia con baños en una solución con 0.1 mg/lt de CB en tratamientos con los mismos intervalos de tiempo se obtuvo un 80% de triploides a los 3 meses de cultivo.

En experiencias con abalón Haliotis rubra (Weshan et al 2004) la triploidización se realizó utilizando como inductor 6‐dimethylaminopurine (6‐DMPA) tomándose como signo de calidad de triploide la inhibición del segundo cuerpo polar en la división meiótica. Esta condición se constató mediante análisis en citometría de flujo. Tratamientos con 6 DMPA en dosis de 100 mg/lt produjeron los mejores resultados con tratamiento de los huevos a los 15‐20 minutos después de la fertilización y con una duración de 30 minutos. Se obtuvo un 93% de triploides con una supervivencia de 43 %.

En Chile se han realizado experiencias de inducción de triploidía en Ostión del Norte y ostra Japonesa, por medio de inductores químicos y físicos (Von Brand E.



1998, 2002; Toro Jorge et al 1995) Choro Zapato (Lepez I. 2001) con resultados experimentales prometedores. Sin embargo el mayor escollo para desarrollar una línea de reproductores triploides fértiles para poder obtener en forma masiva semillas triploides pasa por la obtención de huevos o espermios triploides viables para poder inducir la tetraploidía por cruzas normales de hembras 2n con machos 4n o viceversa machos 2n con hembras 4n sin tener que utilizar agentes químicos o físicos para el objeto (McCombie et al. 2005).

En análisis histológicos realizados a gónadas de ejemplares triploides de Ostión del Norte (Lorhman K. et al 2005) se encontraron anomalías morfológicas tanto en las gónadas masculinas como femeninas, suponiéndose su infertilidad lo que no permitiría en principio lograr ejemplares tetraploides por inducción química o física. Respecto a este punto es interesante indicar de que en los inicios de los trabajos en triploidía en C. virginica llevados a cabo por la University of Maine en 1978 y luego aplicados a C. gigas en el Estado de Washington a principios de los 80 (Zebal R. com. per. 2007.) se asumió que las gónadas de aspecto anormal con manchas oscuras eran esencialmente estériles. Fue solamente después de realizar “strip spawning” en forma masiva en hembras triploides que se descubrió un pequeño porcentaje de hembras mutantes fértiles y viables. De esta observación nació el método de 3n strip spawn/1st PB para inducir tetraploidía en ostras (Zebal R. com. per. 2007) (Desove por disección e inhibición del Primer Cuerpo Polar). Solamente la observación de gran cantidad de ejemplares triploides y paciencia pueden lograr descubrir los pocos ejemplares mutantes que pueden existir en la población triploide (Zebal R. com. per. 2007) ya que por ejemplo de 200‐300 millones de huevos obtenidos de hembras 3n, por medio de separación por tamaño y observación microscópica no se logran separar más de 5.000 huevos 3n factibles de ser fertilizados con espermios 2n para inducir la tetraploidía ( Zebal R. com. per. 2007). Los huevos obtenidos por striping y no por inducción natural del desove necesitan un estímulo para activarlos y así permitir su fecundación. (Zeba R. Com.per. 2007; Allen Robert 1953) ya que de no realizar esta acción es difícil lograr resultados medianamente exitosos. Este último autor utiliza diferentes agentes para realizar la activación del huevo en la almeja surf‐clam Spisula solidísima con agentes partenogénicos tales como irradiación ultravioleta,



aumento de la concentración del ión K en el agua de mantención, protamina entre otras, observándose buenas respuestas al aumento en la concentración del ión K.

El éxito para la producción en forma comercial y masiva de triploides en bivalvos marinos se basa en la metodología denominada cruza diploide – tetraploide que consiste en el cruzamiento de una hembra diploide (2n) con un macho tetraploide (4n) logrando individuos 100% triploides. (Zebal R. com. per.2007)

Este método se basa en que los individuos tetraploides son fértiles y en la cruza con animales normales 2n se obtienen descendientes triploides en forma directa sin la aplicación de químicos y con un mayor porcentaje de éxito en el proceso. Para utilizar este método hay que establecer un plantel de reproductores tetraploides (Zebal R. 2007; Luo X. et al.2000)

Para la obtención de ejemplares tetraploides en C. gigas se han realizado experiencias con cruzamiento de hembras diploides (2n) con machos tetraploides (4n) (McCombie et al 2005) por medio de la inhibición del PB2 por medio de CB Citocalasina B( 2n x 4n +CB ). El método presenta dificultades ya que normalmente los ejemplares triploides son infértiles pero existen ejemplares mutantes que son fértiles y que deben ser identificados por observación microscópica para separarlos y utilizarlos como reproductores en base a observación de gran número de ejemplares examinados. Esta metodología ha dado resultados satisfactorios. Asimismo se han obtenido resultados positivos en cruzas 4n x 2n + CB (hembras en primer lugar) (McCombie et al. 2005). Esta metodología se basa en que si se eligen los huevos de mayor tamaño se obtienen mayores posibilidades de éxito (Zebal com. per. 2007).

En almeja Mercenaria sp. se han realizado experiencias de tetraploidización (Guo et al. 2001) con resultados negativos, ya que en inducción de triploidía por bloqueo PB1 y PB2 y se obtuvo un 100% de éxito con el bloqueo de PB2. Luego con los ejemplares triploides obtenidos se trató de obtener tetraploides por inhibición de PB1 lográndose un buen éxito en la obtención de larvas pero estas no sobrevivieron al estado de juveniles.



Los resultados de las investigaciones realizadas en Chile en el cultivo de la almeja por Institutos y Universidades permiten afirmar que en los próximos años se producirá un crecimiento espectacular en esta actividad y la consiguiente necesidad de semillas de buena calidad que abastezca la industria. Hay que considerar que a nivel mundial el cultivo de diferentes especies de almejas es una industria que tiene más de 20 años con técnicas desarrolladas y comprobadas tanto para la producción de semillas en hatcheries como en técnicas de cultivo en playa.

El incrementar las tasas de crecimiento y factor de condición en especies sometidas a procesos de cultivo conllevan directamente a una mejora en las tasas de rentabilidad de la operación al disminuir la inversión por la anticipación de los flujos de caja positivos y disminución del capital de trabajo de la empresa.



Obtención de Gametos y Cultivo larval

La obtención de gametos y el cultivo de larvas de Venus antiqua para realizar la experiencia y determinar el éxito de los tratamientos que se aplicarán serán obtenidos desde reproductores silvestres los cuales serán acondicionados e inducidos al desove de acuerdo a la metodología descrita por Matus (2006) para M. edulis.

Obtención de gametos La inducción al desove se realizará por medio de la técnica de shock térmico, la que consiste en someter a los reproductores, previamente seleccionados, a cambios bruscos de temperatura, provocando un estrés, que estimula la evacuación de gametos. Para ello, los reproductores se ubicarán en una bandeja de 20 L con agua de mar filtrada a 1μm, esterilizada con luz ultravioleta (UV) y temperada a ±17 °C. Después de 30 minutos, se cambiará el volumen total, por agua a 19 °C, la que se mantendrá por otros 30 minutos, se efectuara un tercer cambio con agua a 21 °C, manteniéndose por unos 30 minutos más, al cabo del cual debiera producirse el desove.

Fecundación Los gametos, tanto de machos como de hembras se colectaran en forma separada y luego se evaluarán y contabilizaran utilizando un microscopio. Se utilizará como criterio de buena calidad, la forma esférica de los ovocitos y tamaño y la alta movilidad de los espermatozoides. Los ovocitos se tamizaran con una malla de 60 μm, posteriormente se depositaran en un recipiente con agua de mar filtrada y esterilizada con luz UV; la fecundación se realizara agregando los espermatozoides, en relación 1:5 (ovocito: espermio).



Los huevos que se obtengan, en un tamiz de 75 μm, se depositaran en un estanque de 500 L de forma cónica a una densidad final de 20 huevos/mL, en agua de mar a 17°C (temperatura del agua en el ambiente), filtrada a 1μm y esterilizada con luz UV.

Cultivo larval Transcurridas las primeras 48 hrs. después de la fecundación, aparecerán larvas tipo o en forma de D, las que serán seleccionadas a través de tamices de 90, 60 y 44 μm de abertura de malla. El primer tamiz (90 μm) se utilizará para retener partículas grandes y basura; en el tamiz de 60 μm quedarán las larvas en buen estado; y en el tamiz de 44 μm se retendrán los ovocitos no fecundados y larvas deformes, las que se eliminarán. Las larvas retenidas en el tamiz de 60 μm se contarán tomando una alícuota y observándolas por medio de un microscopio. Inmediatamente se dejarán en un estanque de 500 L, a una densidad de 2 larvas/mL, con agua de mar filtrada (1μm), esterilizada con luz UV, temperatura a 17°C y serán alimentadas diariamente con la microalga Isochrysis galbana (clone T‐Iso) a una concentración de 50.000 cél/mL. Los cambios de agua y limpieza de estanques de cultivo se efectuarán cada dos días.

Embriones (44 um) Larva D (62 um)



Larvas Pediveligeras (230 um) Postlarvas (400 a 600 um)

Semillas “Baby Clams”



Métodos de Aplicación

Los triploides se producen al impedir la meiosis del huevo para que éste permanezca en estado diploide (2n). Cuando los espermatozoides en fase haploide (1n) fecundan un huevo diploide el resultado es un animal triploide.

Para el bloqueo de la salida de polocitos, se han utilizado tanto tratamientos físicos como químicos. Los tratamientos físicos se refieren principalmente a la aplicación de temperaturas y altas presiones que inhiben la salida de los polocitos (Arai et al., 1986). Dentro de los químicos se ha utilizado citocalacina B, (Beaumont & Fairbrother, 1991; Nell, 2002; Liu et al., 2004) y en los últimos años la 6‐Dimetil‐amino purina (6‐DMAP) (Desrosiers et al., 1993; Gérard et al., 1994; Nell et al., 1996; Zhang et al., 1998; Liu et al., 2004)

Se puede evitar que los huevos de los bivalvos pasen por la meiosis y alcancen la fase haploide sometiéndolos a un tratamiento térmico o químico. Al principio la mayoría de los triploides se producían mediante el tratamiento químico de los huevos con la Citocalasina B. Los huevos de las hembras se obtenían manualmente y se fecundaban con espermatozoides. Se mantenían a los gametos separados hasta que estuvieran listos para la fecundación para controlar de cerca el proceso y después de la aparición del primer cuerpo polar, se aplicaba la citocalasina B en los huevos fecundados, impidiendo así la meiosis. De esta manera, los huevos permanecían en el estado diploide y con el juego de cromosomas del macho, dando como resultado un embrión triploide. Con el tiempo se ha conseguido perfeccionar la técnica con un nivel de éxito en la producción de triploides del 90%.



Sin embargo este método plantea dos problemas; en primer lugar, no produce triploides en el 100% de los casos y en segundo lugar, la citocalasina B es cancerígena y –aunque sólo se utilice en la fecundación de los animales y presente pocas posibilidades de acumular toxicidad– el público ha expresado su preocupación. Ya no suele emplearse este método químico en los criaderos para producir ostras triploides.

Ahora algunos criaderos prefieren el método del choque térmico. Los huevos fecundados normalmente se mantienen a 25 °C, pero se les somete a un cambio brusco de temperatura a 32 °C durante dos minutos y luego se restaura la temperatura a 25 °C. El choque térmico se aplica después de la emisión del primer cuerpo polar, unos veinte minutos después de la fecundación. Este método también se ha perfeccionado y el nivel de éxito en la producción de triploides es el mismo que con el tratamiento químico, es decir un promedio de éxito del 90%. Tanto el método químico como el térmico son efectivos, pero la mayor desventaja es que raramente se consiguen triploides en el 100% de los casos. Se necesitaba un método que pudiera producir triploides constantemente con cada selección en



el 100% de los casos. Las investigaciones realizadas en Europa y los Estados Unidos han ayudado al desarrollo de métodos para producir ostras tetraploides (4n). Hasta la fecha sólo se han producido machos tetraploides y como el método está patentado, se conocen pocos detalles. Sin embargo se puede llegar a acuerdos con las empresas que producen tetraploides para obtenerlos y utilizarlos en el criadero como reproductores. Cuando se cruzan con ostras diploides siempre producen triploides. El método es efectivo y probablemente llegará a emplearse de manera extensiva por los criaderos y la industria de engorde conforme aumente la disponibilidad de tetraploides.

Método de Triploidización Propuesto Para la inducción de la triploidía se debe bloquear la meiosis I y II del huevo recién fertilizado debido a que los gametos se liberan previos a la expulsión del primer polocito. Este proceso se obtiene utilizando elementos químicos o físicos tales como presión y temperatura. En el caso nuestro se realizarán las pruebas utilizando dos agentes químicos que han resultado eficientes en lograr triploidía en moluscos estos son Citocalasina B (CB) y 6‐Dymetilaminopurine (6‐DMPA).

Célula diploide

2n=4

Ovocito con la meiosis detenida

Metafase de la 1ª división meiótica

Fecundación y reanudación de la

Meiosis

Anafase de la 1ª división meiótica y

eliminación del primer corpúsculo polar

Metafase de la 2ª división meiótica

Anafase de la 2ª división meiótica con

bloqueo de la eliminación del

segundo corpúsculo polar

Cigoto con la dotación

cromosómica normal para la especie 2n=4

MECANISMO DE OBTENCIÓN DE TRIPLOIDES

Anafase de la 2ª división meiótica sin

bloquear la eliminación del

segundo corpúsculo polar



Después de fertilizados se procederá a realizar inmersiones de los huevos de almejas en Citocalsina B (CB) en soluciones de 0.5 mg/lt y 1mg/lt por tiempos de 25 y 40 minutos, y en 6‐DMPA en soluciones de 50mg/lt y 100mg/lt por tiempos de 15 y 20 minutos.

Una vez que el porcentaje de triploidización alcance niveles adecuados se continúa con el batch en cultivo. Llegado el estado de larva tipo D se seleccionan las larvas tamizándolas con mallas de 90, 62, y 44 micrones desechando los tamizados de 90 y 44 micrones por corresponder probablemente a impurezas de mayor tamaño y a huevos no fecundados. El paso siguiente consiste en el conteo de las larvas con la ayuda de una cámara Sedgewick y dejar densidades de 2 larvas/ml en estanques de 500 lts. Con agua de mar filtrada a 1 micrón y adición de microalgas a razón de 50.000 cel/ml. Al cabo de unos 20 días se inicia el proceso de metamorfosis con la aparición de la disoconcha y las larvas se tamizan a 250 micrones para retener las de mejor crecimiento y continuar el cultivo. Cuando las semillas alcanzan una talla de 1 milímetro se trasladan al sistema de nursery.

Las etapas definidas en el proceso de obtención de triploides son las siguientes:

• Etapa 1: Producción de triploides por inducción química desde huevos 2n

• Etapa 2: Generación de stock de reproductores triploides por identificación y selección de ejemplares 3n anormales, funcionalmente fértiles.

• Etapa 3: generación de stock de reproductores tetraploides a partir de la fertilización de gametos 3n + n.

• Etapa 4: Obtención de ejemplares 100% triploides a partir de la fertilización de gametos 2n + n

La siguiente secuencia describe las etapas antes mencionadas hasta la obtención de triploides por cruzamiento de gametos 2n + n:







Métodos de Verificación

La verificación de los efectos de la aplicación de los métodos de Triploidización y tetraploidización pueden ser evaluados por varios métodos, entre los cuales se encuentran el recuento directo de cromosomas, recuento de nucléolos o por citometría de flujo, la aplicación de cualquiera de estos procedimientos entrega resultados confiables para la evaluación final de la dotación cromosómica de los ejemplares tratados.

Recuento de Cromosomas

2n 3n

Recuento de Nucleolos

2n 3n



Citometría de Flujo La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. Estos parámetros son:

• Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma.

• Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo).

Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad. (www.citometriadeflujo.com)



Resultados Esperados

• Desarrollo y validación de una técnica para la producción de ejemplares

triploides de almeja (Venus antiqua) por medio de la técnica de cruzas de

ejemplares 2n con 4n.

• Definición de métodos de selección de triploides fértiles de almeja (Venus

antiqua).

• Generación de planteles de reproductores de almeja (Venus antiqua)

triploides y tetraploides seleccionados.

• Producción de ejemplares triploides con mejores tasas de crecimiento y

factor de condición con el objeto de mejorar los índices de rentabilidad de

la industria



Bibliografía

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Aplicación de Técnicas de Poliploidía para la Obtención de Triploides de almeja (Venus antiqua)