Aplicaciones de la Ingeniería Genética

UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE INGENIERÍA

Asignatura: Biotecnología Programa: Ingeniería de Alimentos Docente: Óscar Julián Sánchez Toro, Ph.D. 1

INGENIERÍA GENÉTICA

Universidad de CaldasFacultad de Ingeniería

Asignatura: BiotecnologíaPrograma: Ingeniería de AlimentosDocente : Óscar Julián Sánchez Toro, Ing. Quím., M.Sc., Ph.D.

Principio de la Ingeniería Genética

Estructura del ADN: Nucléotidos





Estructura del ADN: Doble Hélice



Replicación del ADN

ADN y ARN

ADN:Adenina, Guanina, Citosina, TiminaAzúcar Desoxirribosa

ARN:Adenina, Guanina, Citosina, UraciloAzúcar Ribosa

ADN de una célula procariótica

El ADN flota libremente en el citoplasma junto con los ribosomas y el resto del material celular



ADN de un organismo eucariótico

HistonasPares de Bases

Célula

CromosomaNúcleo

Telómero

Telómero

Centrómero

Doble Hélicede ADN

Un genUn gen es una secuencia de nucleótidos (fragmento de ADN) que codifica la formación de una proteína



Biosíntesis de Proteínas I

1. El ADN se encuentra en el núcleo, mientras en el citoplasma se encuentran los aminoácidos

2. La ARN-polimerasa se desliza por el ADN hasta que encuentra un gen y se inicia la formación de ARNm (transcripción)

Biosíntesis de Proteínas II

3. El ARNm sale al citoplasma a través de los poros nucleares. En el citoplasma cada aminoácido está ligado a una molécula de ARNt

4. El ARNm empieza a deslizarse por el ribosoma, el cual va uniendo los aminoácidos de acuerdo a la secuencia codificada en el gen original (traducción)

Bionsíntesis de Proteínas IIIEl Código Genético



El Dogma Central de la

Biología Molecular

Esquema General de la Biosíntesis de Proteínas

Organización de un Gen

Promotor: Secuencia de ADN que le indica a la ARN polimerasa dónde se inicia la transcripción

Región Codificante: Secuencia que porta la información que codifica la sucesión de aminoácidos en la proteína

Secuencia de Terminación: Fragmento de ADN que le indica a la ARN polimerasa dónde termina la proteína, lo cual evita que se lea el cromosoma entero cuando sólo se necesita producir una proteína



Enzimas utilizadas en Biología Molecular

Endonucleasas de Restricción (Restrictasas)•Las endonucleasas de restricción son enzimas que cortan el esqueleto de azúcar-fosfato del ADN

•En la mayoría de los casos, cortan el ADN en ambas cadenas de la doble hélice

•Los sustratos de estas enzimas son secuencias específicas de ADN. Estas secuencias son palindrómicas:

“dábale arroz a la zorra el abad”

Endonucleasas de RestricciónSecuencias palindrómicas de algunas restrictasas(sitios de restricción)

Tipos de corte de las restrictasas

1. Extremos cohesivos (Sticky ends)

2. Extremos lisos (Blunt ends)

Enzimas utilizadas en Biología MolecularLigasas

•Las ligasas son enzimas que unen fragmentos alineados de ADN•Las ligasas catalizan la formación de enlaces covalentes entre los fragmentos de ADN



Enzimas utilizadas en Biología MolecularTranscriptasa Inversa•Las transcriptasas inversas permiten la síntesis de de ADN a partir de una cadena de ARNm•Estas enzimas son usadas por los retrovirus para infectar el genoma de las bacterias

Enzimas utilizadas en Biología MolecularADN Polimerasas•Las ADN polimerasas forman una cadena de ADN complementaria a otra cadena de ADN matriz, que le sirve de “molde”•Para el trabajo de la ADN polimerasa son necesarios fragmentos pequeños de ADN que inicien la reacción, llamados primers (“cebos”), además de que en el sistema existan los nucleótidos correspondientes

Plásmidos

Los plásmidos son cadenas de ADN circulares con las siguientes propiedades:

n Son replicablesn Poseen una secuencia que marca el inicio

de la replicación (ori )n Contienen varios genesn Pueden transferirse de una bacteria a otra



Plásmidos

Los plásmidos codifican información que no es vital para el funcionamiento de las bacterias, pero que les confiere ciertas propiedades como la resistencia a determinados antibióticos

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Región de ADN de interés 1 .El ADN se desnaturaliza. Los prim ers atacancada hilo. Se sintetiza un nuevo hilo de ADNdetrás de los prim ers sobre cada cadena matriz

2.Otra fase: el ADN sedesnaturaliza, los prim ers se adhieren, y el número de hilosde ADN se duplica



5.Las continuas fases de amplificación producen velozmenteun gran número de fragmentos idénticos. Cada fragmentocontiene el ADN de la región de interés

Análisis de ADNELECTROFORESIS•La Electroforesis en Gel es una técnica que separa las moléculas de ADN con base en su tamaño.•El gel está generalmente elaborado de agarosa y es conectado a electrodos, los cuales generan un campo eléctrico.•La carga del ADN es negativa, por lo que los fragmentos se ubican en unos orificios y viajan del polo (-) al polo (+)

HIBRIDIZACIÓN•Se sintetizan secuencias pequeñas de ADN y se mezclan con fragmentos desnaturalizados de ADN que les sean complementarios

SECUENCIACIÓN•Por métodos químicos se identifican cada uno de los nucleótidos que componen la secuencia de un fragmento de ADN



Tecnología del ADN Recombinante ILa Tecnología del ADN Recombinante (Ingeniería Genética) depende de la habilidad de los investigadores para:

•Obtener gran cantidad de moléculas poliméricas de ADN•Las moléculas de ADN se pueden propagar mediante plásmidos o bacteriófagos•Se han desarrollado una gran variedad de vectores

•Manipular el ADN in vitro, generalmente mediante enzimas•Cortar secuencias de ADN en sitios específicos para obtener fragmentos determinados usando restrictasas•Unir de nuevo estos fragmentos para obtener nuevos arreglos de ADN usando ligasas•Sintetizar químicamente nuevas secuencias de ADN•Replicar secuencias específicas in vitro usando la PCR•Analizar secuencias de ADN por tamaño y por secuencia

Tecnología del ADN Recombinante IILa Tecnología del ADN Recombinante (Ingeniería Genética) depende de la habilidad de los investigadores para:

•Identificar clones que:•Contengan un gen funcional en particular•Contengan una secuencia de ADN en particular•Produzcan una proteína en particular

•Expresar macromoléculas para estudios in vitro

•Crear nuevos organismos modificados genéticamente

Etapas en la Tecnología del ADN Recombinante

Etapa 1: Selección del Hospedero•E l hospedero debe tener en lo posible un genoma simple•El hospedero no debe ser patógeno•El hospedero debe ser fácilmente transformable•Debe tener un nivel bajo de enzimas de restricción

Microorganismos más comúnmente utilizados como hospederos:• Escherichia coli•Bacillus subtilis•Saccharomyces cerevisiae



Etapas en la Tecnología del ADN RecombinanteEtapa 2: Aislamiento del Gen•Aislamiento directo a partir del ADN total

• Se usa para el caso de genes bacterianos o fúngicos• Implica el fraccionamiento del ADN total del microorganismo y su posterior identificación

•Genotecas (bibliotecas de genes)• Genes de microorganismos, células vegetales y animales

•Obtención de genes a partir del ARNm• Obtención de genes de organismos eucarióticos• Se utiliza la transcriptasa inversa

•Síntesis química• Unión química de los nucléotidos hasta formar fragmentos de ADN que codifique la proteína de interés

• Se debe conocer previamente la secuencia de ADN del gen o de aminoácidos de la proteína que el gen codifica

Etapas en la Tecnología del ADN RecombinanteEtapa 3: Obtención del Vector Recombinante in vitroUn vector es una molécula de ADN que se utiliza para la introducción de un gen extraño de una proteína en las células del hospedero.

Los vectores deben cumplir los siguientes requisitos:

•Deben poderse replicar (deben ser replicones)•Deben tener uno o más marcadores selectivos que permitan identificar las células que los contienen•Deben poderse separar fácilmente de los cromosomas•Deben tener porciones de ADN que no sean esenciales para su replicación•Deben tener como mínimo un site de restricción único•En el caso de los vectores de expresión, deben tener promotores regulables

El plásmido pBR 322

Este plásmido ha sido extraído de Escherichia coli y tiene alrededor de 4000 pares de bases nitrogenadas



Obtención del Vector Recombinante

Etapa 4. Transformación de las Células del Hospedero

Las células del hospedero se tratan para obtener células competentes:- Se adicionan sales como MgCl2 y KCl- Se mantienen las células a temperaturas de 4°C- Después de este tratamiento se agregan los plásmidos - Se utiliza también enzimas como la lisozima- El rendimiento de este método es del 2-3%

Etapa 5. Identificación de los Microorganismos Recombinantes



Etapa 5. Expresión del Gen

•Las células recombinantes se transfieren a cultivos líquidos hasta llegar al nivel de los fermentadores industriales•Se cultivan las células hasta la fase exponencial•Se induce el gen mediante tratamiento térmico o con ayuda de sustancias químicas•Se lleva a cabo la separación y purificación del producto recombinante

El primer producto recombinante autorizado: la Insulina

Algunos Productos “Tradicionales”de la Ingeniería Genética

n Insulinan Interferónn Vacuna hepatitis Bn Hormona de crecimiento humanon Renina recombinanten Amilasas y proteasas industrialesn Somatotropina bovina



Ingeniería Genética de PlantasEl objetivo de la IG de plantas es el mejoramiento de cultivos de importancia económica y la obtención de nuevas variedades de plantas con características totalmente nuevas como:nAumento en la productividad y la fertilidadnResistencia a insectosnResistencia al uso de herbicidasnAdaptación de las plantas a otras condiciones de cultivonObtención de alimentos con mejores propiedades nutricionalesnObtención de alimentos con mayor vida de anaquelnObtención de metabolitos secundarios

Técnicas Tradicionales de Mejoramiento de Cultivos

n Selección de los mejores individuos y almacenamiento de sus semillas para utilizarlas en la siguiente cosecha

n Selección y cruce de los mejores individuos para la obtención de combinaciones genotípicas superioresn Sólo se puede hacer entre la misma especie o especies

muy similares con organismos de diferente sexon Las nuevas cualidades se limitan a las que ya existen en

la especie que se cruzan Algunas características no deseadas se incorporan a los

individuos obtenidos por cruce

Ventajas de la Ingeniería Genética de Plantas para el Mejoramiento de Cultivosn Se incorporan genes a las

plantas con información específica

n Sólo se confiere la cualidad o característica deseada

n No es necesario el cruce entre plantas, por lo que la barrera “sexual” entre especies se supera

Cualidades, como el color de los granos, son controladas por el

ADN



Etapas de la Ingeniería Genética de PlantasEtapa 1. Extracción del ADN•Se toman los tejidos vegetales y se maceran para romper las células•Se disuelve el ADN en soluciones acuosas bufferadas•Se purifica el ADN mediante la extracción con solventes orgánicos en los que otras moléculas como grasas y proteínas se disuelven•Se separa la solución acuosa de ADN y se precipita agregando alcohol. El ADN adquiere una consistencia semisólida de hilo•El ADN se deposita en tubos de ensayo con una solución buffer débil que se puede almacenar por largos períodos de tiempo

Maceración del tejido vegetal para liberar el ADN

ADN extraído de soya después de su

precipitación

Etapas de la Ingeniería Genética de PlantasEtapa 2. Clonación de los Genes•Se conforma una genoteca con el ADN del organismo del cual se va a extraer el gen de interés

Etapa 3. Diseño del GenUtilizando enzimas de restricción se puede cambiar la secuencia de los genes con el fin de obtener una característica en especialSe pueden utilizar diferentes promotores para regular la expresión de los genes

•El promotor 35S hace que el gen se exprese en todos los tejidos todo el tiempo

•El promotor PEP Carboxilasa hace que el gen se exprese sólo en los tejidos verdes de la planta y cuando fotosintetiza con mayor actividad

Al reemplazar el promotor 35S por PEP Carboxilasa, la proteína se expresa sólo

en los tejidos verdes

Etapas de la Ingeniería Genética de Plantas

Etapa 4. Transformación de las Plantas

•Es imposible transformar cada una de las células de una planta•Se usan cultivos de tejidos vegetales que consisten en la propagación masiva de células no diferenciadas (callo)•El ADN con el gen de interés se integra en los cromosomas de las plantas•Técnicas usadas:

•Pistola Genética•Agrobacterium•Microfibras•Electroporación



“Pistola Genética”•Partículas microscópicas de oro o de tungsteno se recubren con cientos de copias de ADN•Las células del cultivo de tejidos se ubican en una cámara al vacío•Las partículas de metal son impulsadas por gas a alta presión que es liberado con una explosión súbita parecida a una pistola de aire•Las partículas se disparan sobre cajas de petri con las células vegetales

Las células del callo son bombardeadas con partículas

metálicas recubiertas con ADN

Empleo de Agrobacterium

•Agrobacterium tumefaciens es un ingeniero genético natural•Esta bacteria del suelo logra insertar sus genes en los cromosomas de las plantas y las obliga a producir metabolitos necesarios para el desarrollo de la bacteria•Si se introducen plásmidos recombinantes en Agrobacterium, se pueden insertar genes de interés en las plantas

La bacteria Agrobacteriumtumefaciens se introduce en un

cultivo de callo para que modifique las células

vegetales

Transformación de Plantas con ayuda de Agrobacterium tumefaciens



Microfibras•Se usan fibras microscópicas en forma de finísimas agujas•Se mezclan en un tubo las células del callo, cientos de copias del gen de interés y las microfibras y se agita vigorosamente el sistema•Las agujas “pinchan” las células vegetales y potencialmente envían el gen de interés al núcleo de las células sin matarlas

Electroporación•Se emplean impulsos cortos de electricidad para abrir los pequeños poros de la pared celular de las células vegetales•Al mezclarse el gen con estas células, las moléculas de ADN pueden ser lo suficientemente pequeñas para atravesar la pared celular por los orificios formados

Etapas de la Ingeniería Genética de PlantasEtapa 5. Cultivo Cruzado•El callo se desarrolla y se transforma en una planta transgénica•Las plantas transgénicas se cruzan con una línea de plantas “élite” que hayan demostrado alta productividad y se obtiene una única línea de plantas con buenas características y con el gen de interés•Los descendientes de esta línea se cruzan de nuevo con la línea élite para obtener una línea transgénica de alto rendimiento

Tiempo requerido para completar las cinco etapas: 6-15 años

Cultivo Cruzado

Ejemplos de Modificación Genética de Plantas

n Gen de resistencia a los herbicidas en soya, maíz, trigo y remolacha

n Genes Bt de resistencia a insectos (codifican las toxinas de Bacillus thuringiensis) en maíz, papa y algodón

n Tomates de larga vidan Papas con contenido de almidón modificadon Álamos con contenido alterado de ligninan Genes Bt de resistencia a insectos en tomatesn Gen anticongelante en fresas



ALIMENTOS TRANSGÉNICOSCultivo Característica Fecha

TomateAlgodónCalabacínSoyaColzaTomatePapaMaízTomateAlgodónAlgodónMaízTomateMaízMaízAlgodón

Madurez retardadaTolerancia a herbicidasResistencia a dos virusTolerancia a herbicidasModifica composición aceiteMadurez retardadaResistencia a coleópterosResistencia a LepidópterosMadurez retardadaResistencia a lepidópterosTolerancia a herbicidasResistencia a lepidópterosMadurez retardadaTolerancia a herbicidasResistencia a insectosTolerancia a herbicidas

10/9302/9421/9405/9411/9401/9503/9505/9506/9506/9507/9508/9509/9512/9501/9601/96

ALIMENTOS TRANSGÉNICOS

BENEFICIOS

ü Mayor productividadü Aumento de vida útilü Resistencia a insectosü Aumento de la calidad

nutricionalü Obtención de nuevos

productosü Beneficios ecológicos por

menor uso de pesticidasü Utilización de terrenos

improductivos

RIESGOS

Riesgos para la salud pública (alergias, resit. a antibióticos, efectos desconocidos)Falta de información y transparenciaDisminución de la biodiversidadUso indiscriminado de herbicidasCreación de supermalezasUso del gen terminatorControl económicoConsideraciones éticas y religiosas

Modificación Genética de Animalesn Los genes se introducen directamente en el núcleo de las

células animales (inyección pronuclear)n Se usa ADN que contenga el gen de interés y secuencias que

permitan la inserción del gen en los cromosomas, así como su regulación y control n Estas secuencias pueden ser promotores de genes del mismo animal,

p. ej:promotor de proteínas de la leche + gen que codifica la proteína de interés à proteína recombinante en la leche de un mamífero

n La introducción de los genes en células animales se hace generalmente a nivel de embriones durante procedimientos normales de inseminación artificial



Obtención de un ratón transgénico

Los ratones transgénicos se usan en estudios médicos

Clonación de vertebrados

Aplicación de la IG en la Producción de Enzimas Industriales

Empresas como Novozymes han implementado técnicas de Ingeniería Genética para la identificación y clonación de genes que codifican enzimas de uso industrial. Igualmente están en capacidad de utilizar la Ingeniería Genética para la producción industrial de estas enzimas.

Las empresas productoras de enzimas cuentan con grandes genotecas donde se guarda la información correspondiente a miles de enzimas con potencial aplicación industrial.



Ingeniería Genética de EnzimasScreening (rastreo) molecular• Esta técnica usa la información sobre genes de enzimas conocidas para clonar genes similares de otros organismos•Comparando la estructura de los genes, se puede construir un primer que se una a las secuencias de ADN comunes a ambos genes•Con los primers se pueden amplificar y secuenciar nuevas cadenas de ADN de un gen homólogo procedente de otros microorganismos•Con esta técnica Novozymes logró clonar 32 genes de celulasas de los cuatro más grandes tipos de hongos a partir de sólo 4 secuencias de genes homólogos

Ingeniería Genética de EnzimasExpresión Recombinante• Una vez que se ha identificado una enzima específica, se transfiere el gen responsable de esa enzima del organismo en donde se encontró a microorganismos conocidos y que tengan un alto rendimiento en la producción de enzimas•A estos microorganismos se les ha removido la capacidad de producir otras enzimas que pueden representar impurezas en el proceso de aislamiento de la enzima

Microorganismos utilizados:• Escherichia coli•Bacillus subtilis•Saccharomyces cerevisiae•Aspergillus oryzae

Algunas enzimas producidas por Microorganismos Modificados Genéticamente

Fuente: Novozymes

Nombre comercial Tipo de enzima Aplicación

Lipozyme Lipasa Grasas y aceites

Novamyl Amilasa maltogénica

Cervecería

Termamyl α – amilasa Industria del almidón

Pectinex Pectinesterasa Elaboración de jugos

Carezyme Celulasa Industria de detergentes



Aplicaciones de la ingeniería Genética en Medicina: Terapia Génica

La terapia génica consiste en la modificación genética in vivode células enfermas en el ser humano. En general estos procedimientos se encuentran en etapa de experimentación.

Las mayores aplicaciones se orientan al tratamiento del cáncer:•Se utilizan arreglos genéticos (gen + secuencias de regulación) para marcar las células cancerosas para que posteriormente puedan ser tratadas con drogas y eliminadas

Aplicaciones de la ingeniería Genética en Medicina: Terapia Génica Otra aplicación es el diagnóstico y tratamiento de la fibrosis quística•Los pacientes son incapaces de sintetizar una proteína importante para el normal funcionamiento de la pleura y de otros tejidos conectivos del cuerpo•Se administra el gen mediante aspersión nasal con el gen de la proteína incorporado en adenovirus atenuados•Los adenovirus infectan las vías respiratorias y la pleura, insertando el gen en las células•Otra manera menos riesgosa es utilizando liposomas como vector•Mediante screening de las células de los padres, se puede determinar si los hijos pueden desarrollar la enfermedad

Documents

Aplicaciones de la Ingeniería Genética