APÉNDICE - UNMSM

BIOTECNOLOGÍA Y METABOLITOS SECUNDARIOS EN Lepidium peruvianum Chacón. “ MACA” Angela Renee Arias Ramírez. Derechos reservados conforme a Ley

Elaboración y diseño en formato PDF, por la Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central UNMSM

APÉNDICE























FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO

FACTORIAL DE MEDIOS DE CULTIVO

KIN REGULADORES DE

CRECIMIENTO 0 ìM 0.1 ìM 0.5 ìM 1 ìM 10 ìM

0 ìM A E I M -

0.1 ìM B F J N -

0.5 ìM C G K O -

1 ìM D H L P -

2.4-D

10 ìM - - - - Q

2,4-D KIN (uM) (uM) A 0.0 0.0 B 0.1 0.0 C 0.5 0.0

D 1.0 0.0 E 0.0 0.1

F 0.1 0.1 G 0.5 0.1 H 1.0 0.1

I 0.0 0.5 J 0.1 0.5 K 0.5 0.5

L 1.0 0.5 M 0.0 1.0 N 0.1 1.0

O 0.5 1.0 P 1.0 1.0 Q 10.0 10.0

t t t

t t t

t t t

t t t



COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG (1962)

CONSTITUYENTES mM Mg/lt

MACRONUTRIENTES

KNO3 18.8000 1900.00

NH4NO3 20.6000 1650.00

CaCl2.2H2O 3.0000 440.00

MgSO4.7H2O 1.5000 370.00

KH2PO4 1.2500 170.00

MICRONUTRIENTES

MnSO4.4H2O 0.1000 22.30

ZnSO4.7H2O 0.0300 8.60

H3BO3 0.1000 6.30

KI 0.0050 0.8300

NA2MoO2.2H2O 0.0010 0.2500

CoSO4.6H2O 0.0001 0.0250

CuSO4.5H2O 0.0001 0.0250

FeSO4.7H2O 0.1000 27.80

Na2EDTA 0.1000 37.30

FUENTE: Laboratorio de Recursos Genéticos y Biotecnología - UNMSM.



COMPOSICION ANALITICA DE MACA

%

Agua 10.4

Proteínas 10.2

Lípidos 2.2

Carbohidratos 59

Fibra 8.5

Ceniza 4.9

FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998.ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI ANDINI. En La

maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa . Serie Scienza 10. Roma

COMPOSICION MINERAL DE MACA ( mg/ 100 g de materia seca)

Mg/100 g

Fe 16.6

Mn 0.8

Cu 5.9

Zn 3.8

Na 18.7

K 2050

Ca 150

FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998.ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI ANDINI. En La

maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa . Serie Scienza 10. Roma



COMPOSICIÓN AMINOACIDICA Y CALIDAD PROTEICA DE “MACA”

Aminoácido (Rt,

min) mg/g proteína

Aminoácidos

esenciales patrón de la

FAO-OMS 1973

Indice

químico mg/g

proteína

Acido Aspártico

(2.7) 91.7 - -

Acido Glutámico

(4.0) 156.5 - -

Serina (10.1) 50.4 - -

Histidina (14.2) 21.9 - -

Glicina (15.1) 68.3 - -

Treonina (15.7) 33.1 40 83

Arginina (22.5) 99.4 - -

Alanina (24.5) 63.1 - -

Tirosina (25.2) 30.6

} 60 143

Fenialanina (37.8) 55.3

Metionina (30.8) 28 35 80

Valían (31.3) 79.3 50 158

Isoleucina (35.7) 47.4 40 118

Leucina (38.1) 91 70 130

Lisina (47.0) 54.5 55 99

Triptofano n.d. 10 n.d.

OH-prolina (33.8) 26.6 - -

Prolina (43.1) 0.5 - -

FUENTE: DE SIMONE, F. y RASTRELLI, L.1998.ITA'NUTRICIONALI DEI TUBERI ANDINI. En La maca "Il Ginseng delle Ande" e Altre Radici e Tuberi Andini. Cuaderni IILa . Serie Scienza 10. Roma



PROTOCOLO DE EXTRACCION Y CROMATOGRAFIA EN PAPEL DE

GLUCOSINOLATOS

Extracción

Macerar las muestras en etanol al 96% por 3 días como mínimo.

Filtrar

Guardar la solución y con el residuo hacer una nueva extracción con etanol.

Filtrar y guardar con la solución anterior.

Cromatografía en papel

Cortar las hojas de papel de 11 x 29 cm. Hacer tres dobleces a 2, 4 y cm del borde

del papel para que sirvan de soporte de la hoja en el tanque de cromatografía.

A 5 cm del borde hacer una marca con lápiz y hacer pequeñas equis en ella donde

se va a sembrar la muestra.

Colocar una alicuota de cada muestra en cada marca, dejar secar, repetir 40 veces.

Colocar los papeles en las bandejas de soporte del tanque de cromatografía, y

sujetar con las varillas respectivas. Agregar el solvente a las bandejas y tapar

herméticamente el tanque.

Dejar desarrollar durante la noche.

Retirar del tanque de cromatografía y secar.

Pulverizar con una solución de nitrato de plata : acetona 15 mg/ml, dejar secar unos

minutos

Pulverizar con una solución de KOH : Etanol 20 mg/ml, dejar secar unos minutos.

Colocar los cromatogramas en una estufa caliente.



Retirar de la estufa cuando se forman las manchas negras, (indicadoras de la

presencia de glucosinolatos).

Sumergir en una solución de hiposulfito de potasio al 5% por 20 - 24 para

decolorar.

Secar Fotocopiar inmediatamente.

Preparación del solvente Hacer una solución de n-butanol:etanol:agua 4:1:4 en una pera de decantación.

La mezcla se realiza en orden: mezclar primero el n-butanol y el etanol, agitar y

agregar el agua, agitar bien y dejar reposar sin mover 24 hr.

Se obtienen dos fases: una acuosa y una orgánica (superior), desechar la fase

acuosa.

Preparación del revelador Solución de nitrato de plata : acetona (para 100 ml.) Preparar una solución saturada de nitrato de plata y agua: diluir 1.5 gr. de nitrato de

plata en 0.5 ml. de agua destilada, si no se disuelve calentar ligeramente a baño

María

Disolver en 80 ml. de acetona y agregar agua destilada hasta disolver el precipitado

que se haya formado.

Usar inmediatamente.

Solución de hidróxido de potasio : etanol. Solución al 2% (para 100 ml)

Disolver 2 gr de KOH en 0.5 ml de agua destilada y completar a 100 ml con etanol.

Preparación de la solución de hiposulfito de sodio al 5% (decolorante)

Disolver 2 gr de hiposulfito de sodio en 400 ml de agua destilada.



PROTOCOLO DE EXTRACCION Y CROMATOGRAFIA DE ALCALOIDES

Extracción

A.- extracto crudo:

Colocar las muestra estabilizada en un frasco y humedecer con amoniacoy dejar en

oscuridad por 48 hr.

Agregar éter etílico agitar y reposar varios días.

Filtrar o centrifugar.

B.- extracto lavado:

Macerar la muestra con una solución de agua : etanol (4:1).

Acidificar hasta pH 3 ó 4 con HCl.

Centrifugar o filtra para recuperar la fase acuosa.

Alcalinizar la fase acuosa con NaOH u otro álcali, hasta pH 8 ó 9.

Poner en una pera de decantación y agregar una cantidad similar de eter etilico,

agitar y recuperar la fase orgánica.

Repetir esta extracción.

Cromatografía de capa fina ascendente.

Sembrar las muestras en un cromatograma de silicagel

Colocar el solvente en el tanque de cromatografía de capa fina ascendente, cerrar

herméticamente y dejar saturar.

Colocar la cromatoplaca en el tanque, cerrar herméticamente y dejar desarrollar.

Cuando el solvente llega al tope de la placa, sacar la cromatoplaca del tanque, dejar

secar y pulverizar con el revelador.



Preparación del solvente

Mezclar en el tanque de cromatografía cloroformo:metanol u otra sol en las

proporciones adecuadas en nuestro caso la proporción fue 2 : 0.12.

Preparación del revelador

Reactivo de Dragendorff (modificado por Munnier)

SOLUCION I.- Disolver 17 gr de subnitrato de bismuto y 200 gr. de ácido tartárico en

800 ml de agua destilada.

SOLUCION II.- Disolver 160 gr de yoduro de potasio en 400 ml de agua destilada.

Mezclar las soluciones I y II en una proporción 1 : 1

PARA USAR: disolver 100 gr. De ácido tartárico en 50 ml de esta mezcla y 500 ml

de agua destilada.

El stock puede almacenarse durante meses. La solución diluida puede almacenarse

por unas semanas.

Reactivo Yodoplatinado

Diluir 3ml de ácido cloroplatínico al 10% en 97 ml de agua destilada.

Agregar 100 ml de solución de yoduro de potasio al 6%.

Este reactivo puede almacenarse por largo tiempo.



ANÁLISIS ESTADÍSTICO

ANÁLISIS DE VARIANZA PARA EFECTOS FIJO CON MEDIDAS

REPETIDAS

DISEÑO DE DOS FACTORES

PARA EL EFECTO DE LOS MEDIOS EN LA MASA TOTAL DE CALLOS OBTENIDOS τ i Para el factor 2,4-D

Ho :τ 1=:τ 2=:τ 3=:τ 4=0 H1:Al menos un τ i diferente de cero i = 1, 2, 3, 4

β i Para el factor KIN

Ho β 1 = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i = 1, 2,3,4

Para el factor 2,4-D * KIN

Ho : (τ β )ij = 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero

Nivel de significancia α =0.05 F crítico =9.36

Región crítica Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto *estadísticamente significativo existe efecto

scua gl mcua F ss2,4-D 36338061 3 12112687 156* ssKIN 3835449 31278483.13 16* ssinter 5971750 91990583.17 26* sserrores 2491388 32 77855.875 sst 48636647.81 47



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D

Ho :τ 1=:τ 2=:τ 3=:τ 4=0 H1:Al menos un τ i diferente de cero i =1, 2, 3, 4


Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3,4


Ho : (τ β )ij= 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero



Scua gl mcua f

ss2,4-D 3071 3 1024 29.3*

ssKIN 112.5625 3 37.52083333 17*

ssinter 284 9 94.673611112.705639747

sserrores 11197 32 349.9121094

sst 14665 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Hipótesis

τ i Para el factor 2,4-D



Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4




Región crítica Fcal >Critico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto *estadísticamente significativo existe efecto

scua gl mcua F

ss2,4-D 206 3 69 10*

ssKIN 6.7375 3 2 0

ssinter 17 9 6 1

sserrores 211 32 7

sst 440 47



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D


β i Para el factor KIN Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4 Para el factor 2,4-D * KIN

Ho : (τ β )ij= 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero Nivel de significancia α =0.05 F crítico =9.36

Regios crítica Fcal >F crítico el tratamiento estadísticamente significativo existe efecto *estadísticamente significativo existe efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 2350703 3 783568 13*

SsKIN 399929 3 133310 2

ssinter 542059 9 180686 3

sserrores 3988904.4 64 62326.6313 Sst 7281595.55 47



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D



Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4 Para el factor 2,4-D * KIN

Ho : (τ β )ij= 0 H1 Al menos una (τ β )ij diferente a cero Nivel de significancia α =0.05 F crítico =9.36


scua gl mcua f ss2,4-D 213 3 71 31*

ssKIN 8 3 3 1

ssinter 50 9 17 7

sserrores 148 32 2 sst 419 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN EL ECOTIPO MORADO Hipótesis

τ i Para el factor 2,4-D


β i Para el factor KIN Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4




Región crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 3E+06 3 875861 14*

ssKIN 1E+05 3 49762 1

ssinter 6E+05 9 189788 3

sserrores4E+06 64 64090 sst 7E+06 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL NUMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D



Ho β 1= = β 2 = β 3 = β 4=0 H1 Al menos una βi diferente a cero i =1, 2, 3, 4




Region crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 207 3 69 38*

ssKIN 13 3 4 15*

ssinter 17 9 6 4

sserrores 927 64 14 sst 1165 47

t t t



EFECTO DE LOS MEDIOS SOBRE EL ÁREA OCUPADA POR LOS CALLOS EN EL ECOTIPO NEGRO Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D






Region crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto.

scua gl mcua f ss2,4-D 2E+06 3E+00 8E+05 60*

ssKIN 3E+05 3E+00 1E+05 70*

ssinter 2E+06 9E+00 8E+05 50*

sserrores 9E+05 6E+01 1E+04 sst 6E+06 5E+01

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA4 Tukey HSD

* Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05

Mean Differenc

e (I-J)

Std. Error

(I) N (J) NE1 E2 1.0625 .7611 .632

E3 -.4375 .7611 .978E4 -.6250 .7611 .923E5 -1.5625 .7611 .005

E2 E1 -1.0625 .7611 .632E3. -1.5000 .7611 .290E4. -1.6875 .7611 .185E5. -2.6250 .7611 .008

E3 E1. .4375 .7611 .978E2. 1.5000 .7611 .290E4. -.1875 .7611 .999E5. -1.1250 .7611 .000

E4 E1. .6250 .7611 .923E2. 1.6875 .7611 .185E3. .1875 .7611 .999E5. -.9375 .7611 .000

E5 E1. 1.5625 .7611 .005E2. 2.6250 .7611 .008E3. 1.1250 .7611 .000E4 .9375 .7611 .000

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO AMARILLO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA5 Tukey HSD si p

Estadísticamente significativo existe diferencias si p<0.05

Mean Difference

(I-J)

Std. Error p.

(I) N (J) NE1 E2 29.4375 91.8309 .998

E3 -92.5625 91.8309 .851E4 -302.5625 91.8309 .013E5 -390.0000 91.8309 .001

E2 E1 -29.4375 91.8309 .998E3. -122.0000 91.8309 .674E4. -332.0000 91.8309 .005E5. -419.4375 91.8309 .000

E3 E1. 92.5625 91.8309 .851E2. 122.0000 91.8309 .674E4. -210.0000 91.8309 .161E5. -297.4375 91.8309 .015

E4 E1. 302.5625 91.8309 .013E2. 332.0000 91.8309 .005E3. 210.0000 91.8309 .161E5. -87.4375 91.8309 .875

E5 E1. 390.0000 91.8309 .001E2. 419.4375 91.8309 .000E3. 297.4375 91.8309 .015E4 87.4375 91.8309 .875

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA6 Tukey HSD

Mean Differenc

e (I-J)

Std. Error

p

(I) N (J) NE1 E2 -.4375 .7739 .980

E3 -1.4375 .7739 .349E4 -1.7500 .7739 .169E5 -2.3750 .7739 .024

E2 E1 .4375 .7739 .980E3. -1.0000 .7739 .697E4. -1.3125 .7739 .443E5. -1.9375 .7739 .000

E3 E1. 1.4375 .7739 .349E2. 1.0000 .7739 .697E4. -.3125 .7739 .994E5. -.9375 .7739 .002

E4 E1. 1.7500 .7739 .169E2. 1.3125 .7739 .443E3. .3125 .7739 .994E5. -.6250 .7739 .003

E5 E1. 2.3750 .7739 .024E2. 1.9375 .7739 .000E3. .9375 .7739 .002E4 .6250 .7739 .003

Estadísticamente significativo existe diferencias <0.05



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO MORADO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA7 Tukey HSD

Mean Difference

(I-J)

Std. Error p

(I) N (J) NE1 E2 19.1250 88.6138 1.000

E3 -144.2500 88.6138 .485E4 -298.7500 88.6138 .010E5 -419.3125 88.6138 .000

E2 E1 -19.1250 88.6138 1.000E3. -163.3750 88.6138 .357E4. -317.8750 88.6138 .005E5. -438.4375 88.6138 .000

E3 E1. 144.2500 88.6138 .485E2. 163.3750 88.6138 .357E4. -154.5000 88.6138 .414E5. -275.0625 88.6138 .022

E4 E1. 298.7500 88.6138 .010E2. 317.8750 88.6138 .005E3. 154.5000 88.6138 .414E5. -120.5625 88.6138 .654

E5 E1. 419.3125 88.6138 .000E2. 438.4375 88.6138 .000E3. 275.0625 88.6138 .022E4 120.5625 88.6138 .654




EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL NÚMERO DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA8 Tukey HSD

Mean Differenc

e (I-J)

Std. Error

Sig.

(I) N (J) NE1 E2 -.1875 .7752 .999

E3 -.9375 .7752 .746E4 -1.0625 .7752 .648E5 -2.1250 .7752 .000

E2 E1 .1875 .7752 .999E3. -.7500 .7752 .869E4. -.8750 .7752 .791E5. -1.9375 .7752 .006

E3 E1. .9375 .7752 .746E2. .7500 .7752 .869E4. -.1250 .7752 1.000E5. -1.1875 .7752 .050

E4 E1. 1.0625 .7752 .648E2. .8750 .7752 .791E3. .1250 .7752 1.000E5. -1.0625 .7752 .030

E5 E1. 2.1250 .7752 .000E2. 1.9375 .7752 .050E3. 1.1875 .7752 .030E4 1.0625 .7752 .002




EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE SOBRE EL ÁREA DE CALLOS OBTENIDOS EN EL ECOTIPO NEGRO Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA9 Tukey HSD

Mean Difference

(I-J)

Std. Error Sig.

(I) N (J) NE1 E2 23.8750 87.2393 .999

E3 -65.3750 87.2393 .944E4 -197.1875 87.2393 .170E5 -339.3750 87.2393 .002

E2 E1 -23.8750 87.2393 .999E3. -89.2500 87.2393 .844E4. -221.0625 87.2393 .094E5. -363.2500 87.2393 .001

E3 E1. 65.3750 87.2393 .944E2. 89.2500 87.2393 .844E4. -131.8125 87.2393 .559E5. -274.0000 87.2393 .020

E4 E1. 197.1875 87.2393 .170E2. 221.0625 87.2393 .094E3. 131.8125 87.2393 .559E5. -142.1875 87.2393 .483

E5 E1. 339.3750 87.2393 .002E2. 363.2500 87.2393 .001E3. 274.0000 87.2393 .020E4 142.1875 87.2393 .483




ANALISIS EDE VARIANZA PARA DOS EFECTOS FIJOS EFECTO DEL MEDIO DE CULTIVO EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FRIALES Hipótesis τ i Para el factor 2,4-D






Region crítica Fcal >F crítico el tratamiemto estadísticamente significativo exlste efecto *estadísticamente significativo exlste efecto

scua gl mcua f ss2,4-D 80 3 48.7430556 12*

ssKIN 14 3 34.57638889 11*

ssinter 87 9 45.8402778 15*

sserrores 119. 32 3.72916667 sst 299.8125 47

t t t



EFECTO DEL COLOR EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FRIABLES

Multiple Comparisons Dependent Variable: tabla 10 Tukey HSD


Mean

Difference

(I-J)

Std.

Error

.

(I) (J)

Amarillo Morado .8125 .9009 .002

Negro .8750 .9009 .006

Morado Amarillo -.8125 .9009 .002

Negro 6.250E-02 .9009 .997

t t t



EFECTO DEL TIPO DE EXPLANTE EN LA PRODUCCIÓN DE CALLOS FIABLES Multiple Comparisons Dependent Variable: TABLA9 Tukey HSD


Mean Difference

(I-J)

Sig.

(I) N (J) NE1 E2 23.8750 .999

E3 -65.3750 .944E4 -197.1875 .170E5 -339.3750 .002

E2 E1 -23.8750 .999E3. -89.2500 .44E4. -221.0625 .094E5. -363.2500 .003

E3 E1. 65.3750 .944E2. 89.2500 .044E4. -131.8125 .049E5. -274.0000 .024

E4 E1. 197.1875 .170E2. 221.0625 .094E3. 131.8125 .049E5. -142.1875 .483

E5 E1. 339.3750 .002E2. 363.2500 .003E3. 274.0000 .024E4 142.1875 .483

t t t



COEFICIENTE DE VARIABILIDAD DE LA PRESENCIA DE GLUCOSINELATOS

EN HIPOCOTILOS Y CALLOS DE MACA

Ho Exite variabilidad

H1 No existe variabilidad

Si p<0.05 se rechaza la hipótesis nula En el presente problema p=0.6>0.05 entonces se concluye que exite variabilidad

Fraccion 1 Fraccion2

Fraccion 1 Correlation

Coefficient

1.000 .650

Sig. (2-

tailed)

. .600

N 80 80

Fraccion 2 Correlation

Coefficient

.650 1.000

Sig. (2-

tailed)

.600 .

N 16 16

t t t

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APÉNDICE - UNMSM