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Karina Kelly de Oliveira Luquesi Meça
APOPTOSE NA MATURAÇÃO E ELIMINAÇÃO PLACENTÁRIA DA B RUCELOSE
BOVINA
Belo Horizonte
Faculdade de Medicina
Universidade Federal de Minas Gerais
2006
Livros Grátis
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Karina Kelly de Oliveira Luquesi Meça
APOPTOSE E SUA RELAÇÃO COM A MATURAÇÃO E ELIMINAÇÃO PLACENTÁRIA
NA BRUCELOSE BOVINA
Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Patologia Geral, da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre.
Orientador: Prof. Anilton Cesar Vasconcelos.
Belo Horizonte
Faculdade de Medicina
Universidade Federal de Minas Gerais
2006
Programa de Pós-Graduação em Patologia Geral
Universidade Federal de Minas Gerais
Dissertação intitulada “Apoptose na maturação e eliminação placentária da brucelose bovina”, de
autoria da mestranda Karina Kelly de Oliveira Luquesi Meça, aprovada em 17 de fevereiro de 2006
pela banca examinadora constituída pelos seguintes professores:
Folha de aprovação
Prof. Dr. Anilton Cesar Vasconcelos (Orientador)
Prof. Dr. Humberto Eustáquio Coelho
Prof. Dr. Antônio Marques de Pinho Júnior
Profa. Ana Margarida Miguel Ferreira Nogueira
Coordenadora do programa de Pós-Graduação em Patologia Geral
Belo Horizonte, 17 de fevereiro de 2006
Av. Alfredo Balena 190/ sala 7009
Belo Horizonte, MG – CEP 30130 –100
Fone: (031) 3248.9641 FAX: (031) 3248.9939
Dedico este trabalho ao DEUS TODO PODEROSO, CRIADOR DO UNIVERSO e ao seu filho JESUS CRISTO e ao ESPÍRITO SANTO, aos meus pais, José e Josefa pelo amor, incentivo e apoio incondicional e ao meu namorado João Iury pelo amor e dedicação constantes.
AGRADECIMENTOS
-A Deus, ao Senhor Jesus Cristo e ao Espírito Santo, pela vida, pelo amor, pelo zelo e pela
capacitação e oportunidade.
-Ao Prof. Dr. Anilton Cesar Vasconcelos, pela valiosa e preciosa amizade, pela dedicação, pela
realização deste sonho e também pela experiência e grande aprendizado.
-Ao Prof. Dr. Humberto Eustáquio Coelho, por ter acreditado em mim e me dado esta grande
oportunidade, de mudança de vida, pelos seus ensinamentos preciosos, pela sincera e valiosa
amizade.
-À Profª. Drª. Luciana Moro, pela cooperação na execução do trabalho e pela constante
disponibilidade ao longo dos dias de convivência no laboratório.
- Ao Prof. Dr. Almir de Sousa Martins, pela ajuda, pela confiança e pela sincera amizade.
-À técnica de laboratório Soraia Silva, pela ajuda e cooperação.
-Às pós-graduandas do laboratório de Apoptose: Janaína de Jesus Batista, pelo incentivo e
companheirismo; Helen Lima Del Puerto, minha irmã querida, pela amizade e cooperação e Paula
Peixoto Campos, pela grande ajuda e apoio e pelo companheirismo.
-À minha mãe e ao meu pai, pelo amor derramado em meu coração a cada dia, pela força e
incentivo e por nunca deixarem de acretitar em mim.
-Aos meus irmãos na fé, pelo sustento em orações.
-Ao João Iury, pelo amor e presença constante, pelo incentivo e pela compreensão nos momentos
mais difíceis.
-A todos os professores do curso de pós-graduação em Patologia Geral, pela contribuição na minha
formação acadêmica.
-Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela concessão da
bolsa de estudos, essencial para o desenvolvimento deste trabalho.
“Porque o Senhor dá a sabedoria, da sua boca vem o conhecimento e entendimento. Ele reserva a verdadeira sabedoria para os retos, escudo é para os que caminham na sinceridade” ( Provérbios 2: 6,7)
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1 Pág.
FIGURA 1 Placenta bovina madura, a termo, com diminuição da celularidade. Apoptose
caracterizada morfologicamente por retração celular, anoiquia (seta vasada),
condensação citoplasmática e nuclear, além de fragmentação nuclear (seta
preta) e formação de corpos apoptóticos (seta branca). Hematoxilina-Eosina,
Barra = 10 µm. .......................................
13
FIGURA 2 Placentite necrotizante brucélica em bovino. Áreas de necrose, com debris
celulares (setas brancas) e infiltrado inflamatório composto
predominantemente por polimorfonucleares (setas negras). O tecido
placentário (∗ branco) não evidencia muitas figuras de apoptose.
Hematoxilina-Eosina, Barra = 10 µm. ...........................................................
14
FIGURA 3 Representação esquemática do mecanismo proposto para explicar a retenção
placentária em bovinos brucélicos. .....................................................................
15
CAPÍTULO 2 Pág.
FIGURA 1 Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group NC).
Decreased cellularity of the trophoblasts of the cotiledonary villi with no
inflammatory infiltrate neither necrosis. Intense and diffuse TUNEL-positive
labeling showing genome fragmentation in cells with morphological evidence of
apoptosis (TUNEL, Bar =10µm)……………………………………………………
43
FIGURA 2 Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with
abortion and positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Trophoblasts of the
cotiledonary villi and of the syncityal epithelium of the maternal cripts with no
TUNEL labelling. Maternofetal spaces with evident inflammatory infiltrate and
necrosis, with positive labelling in cellular debris. (TUNEL, Bar =10µm)……………
44
FIGURA 3 Graph showing distribution of the apoptotic indices (mean ± sem) obtained from non
vaccinated healthy cows (Group NC, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged
with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition
(Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with
no abortion and positive bacteriology at parturition (Group B+, n=5) and from B-19
vaccinated cows challenged with Brucella abortus with abortion and positive
bacteriology (Group B++, n=5). .................................................................................
45
FIGURA 4 Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group NC). Thin
layers of the trophoblasts in the cotiledonary villi with shrunken cells and chromatin
condensation, few with apoptotic bodies. No inflammatory infiltrate neither necrosis.
Decreased cellularity.(HE, Bar =10µm). .....................................................................
46
FIGURA 5 Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with
abortion and positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Intense and diffuse
inflammatory infiltrate, composed by mononuclear and some polymorphonuclear
cells (HE, Bar =10µm). ...............................................................................................
47
FIGURA 6 Distribution of the inflammatory indices (mean ± sem) obtained from B-19
vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and
negative bacteriology at parturition (Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows
challenged with Brucella abortus with no abortion and positive bacteriology at
parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged with
Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5)………..
48
FIGURA 7 Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with
abortion and positive bacteriology (Cow 5, Group B++). Large necrotic areas, with
cellular debris filling up the maternofetal spaces. Thicke layers of the trophoblasts in
the cotiledonary villi and of the syncityal epithelium in maternal cripts with few
shrunken cells. Most of trophoblasts and syncityal epithelium show sparse chromatin
in their nuclei. (HE, Bar =10µm). ...............................................................................
49
FIGURA 8 Graph showing distribution of the necrotic indices (mean ± sem) obtained from B-19
vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and
negative bacteriology at parturition (Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows
challenged with Brucella abortus with no abortion and positive bacteriology at
parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged with
Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5). ………..
50
FIGURA 9 Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and
Inflammation in placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged
puerperal cows, with normal gestation and negative bacteriology at parturition (B -,
n=5), from cows challenged with Brucella abortus with no abortion and positive
bacteriology at parturition (B+, n=5) and from cows challenged with Brucella
abortus with abortion and positive bacteriology (B++, n=5)…………………………..
51
FIGURA 10 Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and Necrosis in
placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged puerperal cows,
with normal gestation and negative bacteriology at parturition (B -, n=5), from cows
challenged with Brucella abortus with no abortion and positive bacteriology at
parturition (B+, n=5) and from cows challenged with Brucella abortus with abortion
and positive bacteriology (B++, n=5)………………………………………………….
52
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AI Do inglês Apoptotic Index
bcl-2 Gene anti- apoptótico (B cell lymphoma 2)
DNA Do inglês Deoxyribonucleic Acid - Ácido desoxirribonucléico
ex Exemplo
Group B - Do inglês B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal
gestation and negative bacteriology at parturition - Vacas vacinadas e
desafiadas sem abortamento e sem bacteriologia positiva
Group B + Do inglês B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no
abortion and positive bacteriology at parturition - Vacas vacinadas e desafiadas
sem abortamento e com bacteriologia positiva
Group B ++ Do inglês B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with abortion
and positive bacteriology – Vacas vacinadas e desafiadas com abortamento e
bacteriologia positiva
Group NC Do inglês Non vaccinated healthy cows – Vacas do grupo controle negativo
HE Hematoxilina e Eosina
H2O2 Peróxido de hidrogênio
IFN-γ Interferon gama
II Do inglês Inflammatory Index
NI Do inglês Necrotic Index
PGF Prostaglandina F
PBS Do inglês Phosphate Buffered Saline - Tampão de salina fosfatada
RP Retenção de placenta
TdT Do inglês Terminal deoxynucleotidyl Transferase - Transferase terminal de
deoxinucleotídio
TNF-α Do inglês Tumor Necrosis Factor alfa - Fator de necrose tumoral alfa
TUNEL Do inglês “Terminal deoxynucleotidyl Transferase Urydine Nick End Labeling”
- Marcação in situ da fragmentação do genoma com transferase terminal de
deoxinucleotídio
UTP Do inglês Urydine Tri Phosphate - Trifosfato de uracila
SUMÁRIO
Página
PREFÁCIO ..................................................................................................................... 01
CAPÍTULO 1. Inibição de apoptose e retardo da maturação placentária: um
provável mecanismo da retenção placentária na brucelose bovina (revisão de
literatura) .......................................................................................................................
02
Resumo............................................................................................................................. 04
Revisão de literatura..................................................................................................... 05
Brucelose................................................................................................................... 05
A placenta bovina e a maturação placentária............................................................ 06
Apoptose.................................................................................................................... 10
Apoptose na maturação e liberação da placenta......................................................... 11
Considerações Finais..................................................................................................... 16
Abstract........................................................................................................................... 17
Referências bibliográficas............................................................................................. 18
CAPÍTULO 2. Apoptosis and placental maturation in cattle with brucellosis......................................................................................................................
26
Abstract………………………………………….……………………………………. 28
Introduction …………………………………………………………………………... 29
Material and methods…………………………..…………………………………….. 33
Samples ……………………………………………………………………………. 30
In situ detection of DNA fragmentation................................................................... 30
Morphometrical and statistical analysis................................................................... 31
Results............................................................................................................................ 33
Discussion....................................................................................................................... 35
Conclusion..................................................................................................................... 38
Acknowledgements......................................................................................................... 38
References....................................................................................................................... 39
Figures and legends......................................................................................................... 43
COMENTÁRIOS FINAIS .............................................................................................. 53
PREFÁCIO
Esta dissertação objetivou avaliar quantitativamente a apoptose em placentomos de bovinos
infectados experimentalmente com Brucella abortus. Adicionalmente analisou-se
morfometricamente a resposta inflamatória e a ocorrência de necrose, procurando-se interelacionar
estas com eventuais conseqüências no processo na maturação e eliminação placentária. Determinou-
se o Índice Apoptótico do trofoblasto no periparto de vacas com e sem infecção brucélica e com e
sem aborto. Avaliou-se a resposta inflamatória e a necrose nos placentomos de vacas no periparto
com e sem infecção brucélica, buscando uma eventual associação entre infecção brucélica,
placentite, atraso na maturação placentária e a ocorrência de aborto.
A dissertação está redigida na forma de capítulos, sendo o primeiro capítulo um artigo de
revisão de literatura no qual se levanta a questão central do tema proposto para a pesquisa. Neste
artigo, além de se situar o leitor com referências recentes sobre apoptose na maturação placentária e
sobre brucelose bovina, se lança a hipótese de que a inibição da apoptose causada pela infecção
brucélica poderia estar envolvida no atraso da maturação placentária, responsável pela retenção
placentária. Este artigo já foi aceito pela revista Bioscience Journal e será publicado na edição do
mês de abril de 2006. O segundo capítulo é um artigo com os resultados e conclusões da abordagem
experimental que foi proposta para estudar morfologicamente e morfometricamente as lesões
placentárias na brucelose bovina. Este segundo artigo foi submetido para a revista Veterinary
Pathology.
Apesar de alguma incoerência no estilo e formato principalmente das citações e referências
bibliográficas quando se compara os dois capítulos, optou-se, nesta dissertação, por manter na
íntegra os capítulos como eles foram redigidos e submetidos. Acredita-se que tais pequenas
diferenças em termos de formato não venham a dificultar a análise do conteúdo científico aqui
reunido.
CAPÍTULO 1
INIBIÇÃO DE APOPTOSE E RETARDO DA MATURAÇÃO PLACENT ÁRIA: UM
PROVÁVEL MECANISMO DA RETENÇÃO PLACENTÁRIA NA BRUCE LOSE BOVINA
(REVISÃO DE LITERATURA)
INIBIÇÃO DE APOPTOSE E RETARDO DA MATURAÇÃO PLACENT ÁRIA: UM
PROVÁVEL MECANISMO DA RETENÇÃO PLACENTÁRIA NA BRUCE LOSE BOVINA
(REVISÃO DE LITERATURA)
APOPTOSIS INHIBITION AND DELAY OF PLACENTAL MATURAT ION: A
PROPOSED MECHANISM OF PLACENTAL RETAINMENT IN BOVIN E
BRUCELLOSIS (REVIEW)
Karina Kelly de Oliveira Luquesi MEÇA*,
Anilton Cesar VASCONCELOS**,
Luciana MORO**
*Mestranda em Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG) Laboratório de Apoptose, Departamento de Patologia Geral do Instituto de Ciências
Biológicas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Caixa
Postal 2486, CEP 31270010, Belo Horizonte, MG.
**Doutor. Professor adjunto do Departamento de Patologia Geral do Instituto de Ciências
Biológicas da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Caixa
Postal 2486, CEP 31270010, Belo Horizonte, MG.
INIBIÇÃO DE APOPTOSE E RETARDO DA MATURAÇÃO PLACENT ÁRIA: UM
PROVÁVEL MECANISMO DA RETENÇÃO PLACENTÁRIA NA BRUCE LOSE BOVINA
(REVISÃO DE LITERATURA)
APOPTOSIS INHIBITION AND DELAY OF PLACENTAL MATURAT ION: A
PROPOSED MECHANISM OF PLACENTAL RETAINMENT IN BOVIN E
BRUCELLOSIS (REVIEW)
RESUMO
A brucelose é uma doença de grande importância em saúde pública, causa grande perda de
produtividade em rebanhos bovinos, além de prejuízos em decorrência das barreiras sanitárias no
mercado internacional. No bovino, a brucelose induz aborto, mortalidade neonatal, placentite
necrotizante e retenção de placenta. Como tecidos em necrose usualmente são friáveis, seria
esperado que a placenta se desprendesse mais rapidamente e não ficasse retida em decorrência da
placentite necrotizante na brucelose. Há evidências de que bactérias do gênero Brucella inibem a
apoptose ao infectar determinados tipos celulares. A Brucella abortus tem a habilidade de infectar e
se multiplicar no trofoblasto. A expulsão adequada da placenta no momento do parto depende da
maturação deste órgão, que decorre da diminuição da celularidade e da ocorrência de apoptose nos
tecidos fetal e materno. Propõe-se aqui que a Brucella abortus, direta ou indiretamente, iniba a
apoptose de células placentárias e, conseqüentemente, retarde a maturação placentária. Esse fato
poderia explicar melhor a retenção placentária que se desenvolve na brucelose bovina.
Unitermos: Apoptose, brucelose, retenção de placenta.
Revisão de Literatura
Brucelose
A brucelose bovina ocorre de maneira endêmica e a estimativa de animais soropositivos no
Brasil varia entre 2,5% e 7,5%, dependendo da região. Além da possível contaminação dos
consumidores de produtos de origem animal, a brucelose pode causar até 20% de perda de
produtividade em rebanhos bovinos. Além disso, a brucelose torna a carne, leite e derivados
vulneráveis a barreiras sanitárias no mercado internacional, causando um prejuízo de 32 milhões de
dólares ao ano para a economia brasileira (POESTER; GONÇALVES; PEREIRA, 2002).
Representantes do gênero Brucella são pequenos cocobacilos, Gram negativos, imóveis
(CORBEL; STUART; BREWER, 1984). São muito resistentes e podem sobreviver por grandes
períodos no meio ambiente (CRAWFORD; HUBER; BRUCE, 1990). Sua multiplicação ocorre nas
células do hospedeiro ou em meio de cultura, sendo considerado um parasito intracelular facultativo
(SMITH; FICHT, 1990).
Nos bovinos, a Brucella abortus pode ser encontrada principalmente nos testículos,
glândulas sexuais e útero gestante, onde o eritritol é encontrado em grande concentração. O eritritol
estimula a multiplicação brucélica, já que a energia produzida pelo seu metabolismo é maior do que
a produzida pela utilização da glicose. Assim, a Brucella abortus se concentra nesses locais,
culminando com placentite necrotizante focal, aborto, retenção placentária e infertilidade
(CORBEL, 1997; SMITH; FICHT, 1990).
A placenta bovina e sua maturação
Durante a gestação são formadas entre 70 a 120 carúnculas no endométrio bovino
(MARQUES JÚNIOR; BARRETO FILHO; SATURNINO, 1993). As carúnculas compõem a parte
materna da placenta, sendo recobertas pelas membranas fetais que crescem e se expandem para
dentro do lume uterino, formando estruturas fetais irregulares, que são conhecidas como cotilédones
(SCHAFLER; FISHER; DAVIES, 2000). Os componentes fetais se constituem de endotélio,
mesênquima e trofoblasto. Os maternos são epitélio uterino, tecido conjuntivo e endotélio
(RAMSEY, 1982). Entre os cotilédones há áreas de tecido coriônico liso (RAMSEY, 1982). Assim,
a placenta bovina é classificada como cotiledonária (WOODING, 1992), epiteliocorial ou
sinepiteliocorial, vilosa (RAMSEY, 1982), devido à presença dos vilos; não deciduada, pois as
partes materna e fetal podem ser separadas sem causar danos à mucosa uterina após o parto
(BJORKMAN, 1970; STEVEN, 1975).
Com o crescimento placentário, os cotilédones projetam vilos coriônicos que se interdigitam
com as criptas carunculares formando a unidade funcional da placenta, o placentomo (AMOROSO,
1952; STEVEN, 1975). Essas interdigitações aumentam a superfície de contato entre o tecido fetal e
materno (STEVEN; MORRIS, 1975). Segundo King, Atkinson e Robertson (1982), com a invasão
dos vilos, os placentomos crescem aproximadamente cinco mil vezes, involuindo próximo ao parto.
Vilos coriônicos são cones mesenquimatosos vascularizados, revestidos por células
trofoblásticas cuboidais ou células principais mononucleadas e células gigantes com dois ou mais
núcleos (BJÖRKMAN, 1970; JAINUDEEN; HAFEZ, 1993).
As células trofoblásticas cuboidais mononucleadas possuem núcleos arredondados com
grandes nucléolos. As células gigantes possuem núcleos esféricos, amplamente separados, com
nucléolos evidentes e citoplasma abundante. O epitélio da cripta uterina é cúbico ou achatado. Suas
células possuem núcleos esféricos e nucléolos bem evidentes (BJÖRKMAN, 1969).
Durante a gestação, as células binucleadas coriônicas migram do epitélio coriônico para se
fundir com as células epiteliais uterinas, dando origem às células multinucleadas, o que resulta no
epitélio materno-fetal híbrido, explicando a classificação em placenta sinepiteliocorial
(WOODING, 1992).
A liberação da placenta após o parto envolve a perda da adesão materno-fetal e ocorre
somente após a maturação do placentomo. As contrações uterinas durante o parto ajudam
mecanicamente a eliminação placentária. Um fator determinante na liberação é a desagregação da
vilosidade materno-fetal (BJORKMAN, 1969).
O processo de maturação placentária envolve o achatamento do epitélio nas carúnculas
maternas, que é intensificado 3 a 5 dias antes do parto (GRUNERT, 1984) e a diminuição do
número de células binucleadas do trofoblasto e células epiteliais das carúnculas maternas
(SANTOS, 1995; WANGO, HEAP, WOODING, 1992). O feto aparentemente participa da
manutenção da população de células binucleadas (WOODING, 1992) e as alterações hormonais
antes do parto parecem favorecer a diminuição dessas células (MARTINS, 1999a). O número de
células nas criptas carunculares declina a partir dos 270 dias de gestação (BARRETO FILHO;
MARQUES JÚNIOR, 1993; WOICKE et al., 1986).
A redução do suprimento sangüíneo das carúnculas maternas e da circulação placento-fetal
ajuda na desagregação feto-maternal após o parto. As vilosidades coriônicas tornam-se menos
aderidas às criptas carunculares devido aos períodos alternados de hiperemia e isquemia e às
enzimas proteolíticas, tais como a colagenase, que diminuem a adesão da matriz extracelular na
interface materno-fetal (JEFFREY; EHLICH; ROSWIT, 1991).
A liberação fisiológica da placenta ocorre geralmente entre 3 a 6 horas após o parto. A
proteólise do cotilédone e a diminuição da adesividade na interface carúncula-cotilédone resultam
na liberação da placenta. As colagenases são capazes de reduzir a viscosidade específica do
colágeno. A atividade dessas enzimas durante a liberação da placenta é aumentada nas vilosidades
de vacas saudáveis e diminuída em vacas com retenção placentária (GROSS; WILLIAMS;
MANSPEACKER, 1985).
A progesterona é o antagonista direto das contrações uterinas induzidas tanto pela ocitocina
quanto pelas prostaglandinas. No dia anterior ao parto as concentrações plasmáticas de progesterona
caem acentuadamente (HAFEZ; JAINUDEEN, 1995).
Na semana anterior ao parto, há o aumento rápido nas concentrações do cortisol fetal, que
inibe gradualmente a síntese de progesterona pelo útero e placenta (HUNTER et al., 1977) e induz a
produção de estrogênios (HOFFMANN et al. 1979; MCDIARMID, 1983). Cerca de 7 dias antes do
parto há um aumento abrupto das concentrações plasmáticas de estrógeno (CHEW et al., 1977).
O aumento de estrógeno e a diminuição de progesterona no final da gestação estimulam a
secreção da PGF2α (LINDELL; KINDAHL; EDQVIST, 1977), que começa a aumentar 24 a 36
horas antes do parto atingindo o pico no momento do mesmo (GOFF; HORST, 1997). A PGF2α
causa a luteólise (KORDTS; JOCHLE, 1975; LEWING; PROULX; MAPLETOFT, 1985), aumenta
o número de receptores para ocitocina e inibe a síntese de progesterona no útero (GOFF; HORST,
1997), desencadeando o parto (HADLEY, 1996).
Segundo Gross, Williams e Moreland. (1986), a administração de PGF2α uma hora antes do
parto previne a retenção de placenta. As células binucleadas dos vilos coriônicos são a principal
fonte de produção de prostaglandinas na placenta, a partir do ácido araquidônico (GROSS;
WILLIAMS, 1986).
Com o aparecimento das contrações uterinas há a compressão mecânica dos placentomos
induzindo o relaxamento das vilosidades coriônicas o qual favorece o desprendimento dos
cotilédones (CHALLIS; LYE, 1994). Em seguida, com a presença de contrações abdominais, o feto
é forçado para o interior da pelve e os placentomos são comprimidos contra o feto pela pressão da
parede abdominal e contrações uterinas. Após a expulsão fetal o fluxo sangüíneo umbilical é
interrompido. Com isso há isquemia dos vilos coriônicos e contração dos capilares facilitando a
separação entre os vilos e as criptas. Nesse estágio, as contrações uterinas diminuem de amplitude,
mas permitem a liberação da placenta (HAFEZ; JAINUDEEN, 1995).
Segundo Woicke et al. (1986), distúrbios no processo de maturação podem resultar na
retenção placentária. Esses autores demonstraram experimentalmente que vacas com parto normal
apresentavam o epitélio materno descontínuo com intenso achatamento e diminuição do número de
células maternas. Por outro lado, animais com retenção apresentaram o epitélio das criptas
carunculares contínuo e com células cuboidais, indicando ausência de maturação.
A retenção de placenta (RP) ou retenção das membranas fetais é conceituada como a
ausência da separação da carúncula materna (retenção primária), ou a dificuldade mecânica em
expelir a membrana fetal já separada (retenção secundária) (EILER, 1997).
Em bovinos, a recuperação do trato reprodutivo no período pós-parto permite o aumento da
eficiência reprodutiva e conseqüentemente melhor desempenho da atividade pecuária. A expulsão
placentária no tempo normal e a adequada involução uterina possibilitam, juntamente com outros
fatores, o retorno à atividade ovariana luteínica cíclica pós-parto. Com isso há um rápido
restabelecimento do ambiente uterino para uma nova gestação (MARTINS, 1999a).
É difícil definir precisamente a retenção patológica da placenta considerando-se o tempo
decorrido após o parto (LAVEN; PETERS, 1996). As escalas de tempo usadas variam entre 6 e 71
horas (VAN WERVEN et al., 1992). Segundo Eiler (1997), os efeitos danosos à performance
reprodutiva, produção de leite, doença pós-parto e taxa de abate são principalmente detectados
quando a retenção excede o período de 12 horas.
A incidência da RP em bovinos é muito variável, pois depende de como é definida e do país
de origem (LAVEN; PETERS, 1996). Segundo Paisley, Mickelsen e Anderson (1986) ela
normalmente varia de 3 a 12 %. Em alguns países subdesenvolvidos a incidência pode chegar a 30
% (ex.: Bangladesh) (PUTRO, 1988; SAMAD; RAHMAN; ISLAM, 1989).
A RP ocorre com freqüência em vacas leiteiras levando a transtornos reprodutivos no
período pós-parto. Os efeitos da RP na fertilidade podem ser divididos em efeitos diretos e
indiretos. O principal efeito direto da RP é o aumento no intervalo entre partos (BORSBERRY;
DOBSON, 1989; ERB et al., 1981). Os efeitos indiretos da RP na fertilidade estão associados com o
desenvolvimento de metrite (CURTIS et al., 1985).
A placenta retida é isquêmica, hipóxica e carente de nutrientes. No entanto, ela continua
metabolicamente ativa por vários dias. Na presença de estresse metabólico, liberam-se mediadores
bioquímicos que causam imunossupressão no útero (PGE2), aumento da permeabilidade vascular
(histamina e prostaglandinas), aumento da atividade lisossômica (proteólise), danos endometriais
(liberação de histaminas por mastócitos) e redução da quimiotaxia e migração de leucócitos. A
associação desses fatores pode levar à metrite e à conseqüente diminuição da fertilidade (EILER,
1997).
Segundo Holm, Salvatore e Zeek-Mining (1964), a gestação prolongada pode levar à RP por
ocasionar mudanças proliferativas no epitélio caruncular que, mecanicamente, impediriam a
liberação da placenta. Da mesma forma, por deficiência mecânica de liberação, a placentite e a
cotiledonite podem favorecer a RP. Metrite aguda pós-parto (ex.: pelo Actinomyces pyogenes) pode
levar à inércia uterina, RP e placentite (LAVEN; PETERS, 1996).
Apoptose
Apoptose ou morte celular programada é um tipo de morte celular ativa que requer energia,
síntese (KERR; WYLLIE; CURRIE, 1972) e degradação protéicas. Trata-se de um mecanismo
fisiológico de controle celular que regula o tamanho dos tecidos, exercendo um papel oposto ao da
mitose (VASCONCELOS, 1995).
A ausência ou a exacerbação do fenômeno de apoptose podem resultar em conseqüências
desastrosas para os tecidos (MILLER; MARX, 1998). Dessa forma, a inibição da apoptose contribui
para o desenvolvimento de tumores, já a indução excessiva pode acarretar imunossupressão
(WYLLIE; KERR; CURRIE, 1980) e várias doenças neuro-degenerativas, tais como a Doença de
Alzheimer (BARINAGA, 1998).
À microscopia óptica, as células apoptóticas são retraídas (tipicamente circundadas por um
halo claro) e possuem citoplasma acidofílico. Os núcleos dessas células sofrem uma série de
alterações incluindo marginação da cromatina, condensação e fragmentação, seguidas pela
fragmentação da célula em corpos apoptóticos (WYLLIE, 1980). A morte celular por apoptose não
altera as células circunjacentes, diferentemente da célula necrótica que induz inflamação. Assim, a
célula em apoptose se fragmenta silenciosamente, empacotando seus constituintes e os oferece às
células adjacentes que os fagocitam e os reciclam (BORISENKO et al., 2003).
Apoptose na maturação e liberação da placenta
Tanto a proliferação celular quanto a apoptose desempenham papel importante na função
placentária. Ambos os processos são inversamente proporcionais ao longo da gestação (BOOS;
JANSSEN; MÜLLING, 2003). Segundo Smith, Baker e Symonds (1997), a apoptose atinge células
de todos os tipos na placenta humana. A sua ocorrência aumenta consideravelmente no terço final
da gestação (BOOS; JANSSEN; MÜLLING, 2003; SMITH; BAKER; SYMONDS, 1997). Nesse
caso, a apoptose parece estar relacionada com o mecanismo de remodelação placentária auxiliando
na manutenção adequada das proporções teciduais (SMITH; BAKER; SYMONDS, 1997).
Fisiologicamente, a apoptose possibilita a eliminação de células desnecessárias a fim de se
manter a homeostase tecidual (WÖHRL; HÄCKER, 1999). Nos momentos que antecedem o parto a
placenta precisa já estar hipocelularizada para que seja liberada normalmente (BARRETO FILHO;
MARQUES JÚNIOR, 1993). Vacas com retenção placentária apresentam um aumento de células
epiteliais maternas (SANTOS; MARQUES JÚNIOR, 1998). Estudos morfológicos demonstraram
que a maturação placentária está relacionada com a diminuição da população celular dos tecidos
fetal e materna no placentomo (BARRETO FILHO; MARQUES JÚNIOR, 1993; MALARD et al.,
1996; MARQUES JÚNIOR, 1988; SANTOS, 1995; SANTOS; MARQUES JÚNIOR; BARRETO
FILHO, 1997) e com a ocorrência de apoptose (MARTINS, E., 1999; MARTINS, V. M. V., 1999;
NUNES et al., 2000a, 2000b). A apoptose é um evento fisiológico ativo que parece ser requerido
tanto para a maturação, quanto para a liberação normal da placenta após o parto (MARTINS, E.,
1999; MARTINS et al., 2004; MARTINS, V. M. V., 1999; NUNES et al., 2001;). Martins, (1999)
especulou que as mudanças hormonais envolvidas com o parto estimulariam a apoptose nas células
trofoectodermais e maternas, uma vez que a apoptose é mais intensa no momento do parto. Além
disso, observou-se que o número de células apoptóticas em placentomos de vacas que pariram e
liberaram normalmente a placenta foi significativamente maior do que nas que tiveram parto a
termo com RP. Contrariamente, Boos, Janssen e Mülling, (2003) encontraram maior número de
células apoptóticas em placentomos de vacas que apresentaram RP. Possivelmente, o achado de
Boos, Janssen e Mülling (2003) tenha sido diferente em decorrência da técnica de marcação
utilizada na contagem de células e corpos apoptóticos, uma vez que os autores utilizaram-se da
reação de TUNEL. A reação de TUNEL não deve ser utilizada na quantificação de apoptose, uma
vez que dá muito falso negativo, principalmente em alguns tecidos, tais como a placenta. Martins,
(1999) e Martins, (1999) utilizou a coloração de HE, baseando-se nos aspectos morfológicos de
apoptose, para a quantificação. Além disso, a apoptose foi também investigada via teste
imunoenzimático ELISA e eletroforese de DNA em gel de agarose, corroborando a avaliação
microscópica.
Figura 1. Placenta bovina madura, a termo, com diminuição da celularidade. Apoptose
caracterizada morfologicamente por retração celular, anoiquia (seta vasada), condensação
citoplasmática e nuclear, além de fragmentação nuclear (seta preta) e formação de corpos
apoptóticos (seta branca). Hematoxilina-Eosina, Barra = 10 µm.
Figura 2. Placentite necrotizante brucélica em bovino. Áreas de necrose, com debris
celulares (setas brancas) e infiltrado inflamatório composto predominantemente por
polimorfonucleares (setas negras). O tecido placentário (∗ branco) não evidencia figuras de
apoptose. Hematoxilina-Eosina, Barra = 10 µm.
Figura 3. Representação esquemática do mecanismo proposto para explicar a retenção
placentária em bovinos brucélicos.
Os macrófagos presentes na placenta retida apresentam a mesma distribuição que na
placenta normal, porém sua atividade de fosfatase ácida é reduzida em relação à placenta não retida.
Esses macrófagos poderiam estar desempenhando um papel de células de limpeza dos corpos
apoptóticos na placenta não retida, daí estarem mais ativos. Por outro lado, como a placenta retida
apresenta um número menor de células em apoptose, o grau de atividade dos macrófagos seria
menor (MIYOSHI; SAWAMUKAI; IWAGA, 2002)
Na brucelose, apesar de se verificar placentite necrotizante, é comum a retenção placentária
que acaba por promover metrite e infertilidade. O paradoxo aparente é de como um órgão em
necrose ainda se mantém retido, já que o esperado – pela friabilidade característica dos tecidos em
necrose – era que se desprendesse ainda mais rapidamente. Quando a bactéria do gênero Brucella
infecta o macrófago, ela impede a fusão do fagolisossomo e inibe a secreção de TNF-α e a apoptose
(MARIA-PILAR et al., 2005). Gross et al. (2000) relataram que monócitos humanos infectados por
Brucella suis apresentam superexpressão do gene Al, um membro da família bcl-2 implicado na
sobrevivência de células hematopoiéticas. Evidenciaram ainda que a infecção pela B. suis torna as
células semelhantes a macrófagos resistentes à apoptose induzida por Fas ligante e por IFN-γ,
sugerindo que a infecção pela Brucella protege a célula de vários processos citotóxicos que ocorrem
na resposta imune. Tanto as células infectadas, quanto as não infectadas são protegidas, indicando
haver a participação de mediadores solúveis liberados durante a infecção (GROSS et al., 2000).
Considerando o fato de que a B. abortus infecta e se multiplica no retículo endoplasmático rugoso
do trofoblasto (RAMIREZ-ROMERO, 1998), é possível que esse microorganismo possa estar
inibindo a apoptose e, conseqüentemente, a maturação placentária. Indiretamente, poderia também
haver a inibição da maturação placentária através da liberação de mediadores solúveis pelos
macrófagos infectados e presentes na placenta.
Considerando a importância da apoptose no processo de maturação e liberação placentária
normais, postula-se que a infecção brucélica e a inflamação dela decorrente inibam a via apoptótica.
Consequentemente haveria retardo da maturação e liberação placentárias normais com conseqüente
RP.
Considerações Finais
Propõem-se aqui que a infecção brucélica e a inflamação dela decorrente inibam a
ocorrência de apoptose, levando ao retardo da maturação e da liberação placentárias com sua
conseqüente retenção.
Assim, a retenção de placenta que se desenvolve na brucelose bovina parece se associar à
inibição direta e/ou indireta da apoptose nas células placentárias.
ABSTRACT
Brucellosis is an important disease in public health, causing significant decrease in
productivity of affected bovine flocks and also justifying sanitary barriers in the international
market. Brucella bovis commonly induces abortion, neonatal death, necrotizing placentitis and
retention of placenta in cattle. Since necrotic tissues are usually friable, one should not expect
placenta with necrotizing placentitis to be retained. Apoptosis seems to play an important role in
placental maturation and release. There are some evidences that bacteria of the genus Brucella can
inhibit apoptosis when infecting some specific cells. Brucella abortus infect and multiply in
trophoblastic cells. Placental expulsion at the moment of the birth depends on the decrease in
cellularity and on the occurrence of apoptosis in fetal and maternal placental tissues. It is proposed
here that Brucella abortus, directly or indirectly, can inhibit apoptosis of placental cells e,
consequently, delay the placental maturation. This fact could better explain the retained placenta
usually seen in cattle brucellosis.
Uniterms: Apoptosis, brucellosis, retained placenta
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CAPÍTULO 2
APOPTOSIS AND PLACENTAL MATURATION IN CATTLE WITH BRUCELLOSIS
APOPTOSIS AND PLACENTAL MATURATION IN CATTLE BRUCELLOSIS
Karina Kelly de Oliveira Luquesi MEÇA;
Anilton Cesar VASCONCELO;
Luciana MORO;
Fernando Padilla POESTER;
Renato Lima SANTOS;
Andrey Pereira LAGE;
Tatiana Alves da PAIXÃO
Laboratory of Apoptosis, Department of General Pathology, Institute of Biological Sciences,
Federal University of Minas Gerais, Postal Box 2486 - 31270-010 – Belo Horizonte, MG. BRAZIL,
Phone: +5531 3499 2887 (KKOLM, ACV, LM)
School of Veterinary, Federal University of Minas Gerais, 31270-010 – Belo Horizonte, MG.
BRAZIL (RLS; APL; TAP)
(Apoptosis in brucellic placentitis...)
Corresponding author: Anilton C. Vasconcelos Laboratory of Apoptosis, Department of General
Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais, Postal Box 2486 -
31270-010 – Belo Horizonte, MG. BRAZIL, Phone: +5531 3499 2887, FAX: +5531 3499 2879,
Email: [email protected]
APOPTOSIS AND PLACENTAL MATURATION IN CATTLE BRUCELLOSIS
(Apoptosis in brucellic placentitis...)
Abstract
Placentomes of 20 puerperal cows were studied in a double blind assay, distributed (n=5/group) in
four groups: Group NC (non vaccinated healthy cows); Group B - (B-19 vaccinated cows
challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition),
Group B+ (vaccinated and challenged with no abortion and positive bacteriology) and Group B++
(vaccinated and challenged with abortion and positive bacteriology). Placentome samples were
analyzed to quantify inflammatory infiltrate, necrosis and apoptosis. Apoptotic index was higher in
group NC (54,70±7,78) than in challenged animals (P<0,0001). In infected animals, apoptosis was
more intense in group B- (47,21±7,88), intermediate in B+ (42,98±9,33) and smaller in B++
(38,20±7,86). No inflammation neither necrosis were detected in Group NC. Inflammatory
infiltrates were more intense in Group B++ (22,28±6,27), decreasing in B+ (7,65±5,28) being
minimal in B- (1,61±3,32). Necrosis was also more intense in Group B++ (35,43±13,11) than in B+
(7,44±2,22) and B- (0,50±0,94). Absence of difference in necrosis between B- and B+ indicates that
the isolation of the Brucella abortus presents low previtive value. Pearson´s test showed a negative
correlation between inflammatory infiltrate and apoptotic index (r=-0,7404) and between necrotic
area and apoptotic index (r=-0,7528). The more intense the inflammatory and necrotic area in
placenta, the smaller the apoptotic index and the placental maturation. Thus, brucellic infection and
consequent inflammation and necrosis seem to delay placental maturation. These data may help
explaining the placental retention, usually seen in bovine brucellosis.
Key Words: Apoptosis, Bovine, Brucella, Placenta
Introduction
Brucellosis is a worldwide human zoonosis caused by intracellular gram-negative bacteria of
the genus Brucella. Virulence factors play an important role in allowing Brucella infection and
proliferation within macrophages 24. Brucella enters macrophages through lipid raft microdomains,
avoids phagolysosome fusion, and inhibits TNF-alpha secretion and apoptosis 8,19. Both invaded
and noninvaded cells were protected, indicating that soluble mediators released during infection
were involved in the phenomenon 13.
In cattle, Brucella bovis causes a genital disease manifested in males by orchitis and
epididymitis and lymphadenitis, and in females abortion, neonatal death, necrotizing placentitis, and
retention of placenta with reduced fertility in the flock 1. Since necrotic tissues are usually friable,
one should not expect placenta with necrotizing placentitis to be retained.
Apoptosis seems to play an important role in placental maturation and release 3, 4, 20, 32.
There are some evidences that bacteria of the genus Brucella can inhibit apoptosis when infecting
some specific cells 8, 19 . Brucella abortus infect and multiply in trophoblastic cells. Placental
expulsion at the moment of the birth depends on the decrease in cellularity and on the occurrence of
apoptosis in fetal and maternal placental tissues 3, 4, 20, 32 . It is proposed here that Brucella abortus,
directly or indirectly, can inhibit apoptosis of placental cells and, consequently, delay the placental
maturation. This fact could better explain the retained placenta usually seen in cattle with
brucellosis.
The aim of this paper is to evaluate the occurrence of apoptosis, inflammation and necrosis
in placentomes of cows infected or not with Brucella abortus, and correlate the findings in a way to
detect an eventual association between brucelic infection, placentitis, delay in placental maturation
and aborption.
Material and Methods
Samples
Placentomes of 20 puerperal cows were studied in a double blind assay, distributed
(n=5/group) in four groups: Group NC (non vaccinated healthy cows); Group B - (B-19 vaccinated
cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at
parturition), Group B+ (B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion
and positive bacteriology at parturition) and Group B++ (B-19 vaccinated cows challenged with
Brucella abortus with abortion and positive bacteriology). Most of these 20 cows were crossbred,
young and primipara. Placentome sampling was performed imediately after fetal expulsion. One
placentome was collected from the distal region of the uterus, acording to technique previously
described 20 . From each collected placentome, three fragments were removed for light microscopy
and fixed by immersion in Bouin solution for 24 hours after what they were immersed in 70%
methanol. Placentome samples were processed reoutinely for histology. Slides with 4µm thick
sections were stained with hematoxylin–eosin and others were submitted to TUNEL reaction (in situ
detection of DNA fragmentation).
In situ detection of DNA fragmentation
The TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated-UTP nick end-labelling)
technique was applied for detection of in situ genome fragmentation, using a commercial Oncogene
kit (Cat # QIA33, Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA). Reactions were carried out
as described by the manufacturer. Briefly, slides were incubated with 20µg/ml of proteinase K (Cat
# P5568, Sigma, St. Louis, MO, USA) and endogenous peroxidase was quenched three times with
3% H2O2 in methanol. TdT and deoxynucleotides were applied and slides were placed in humid
atmospere at 37º C for about 2-6 hours. The reaction was stopped by a blocking buffer, and then
slides were treated with peroxidase streptavidin conjugate, placed in humid atmospere at 37º C for
0,5-1 hours. Finally they were washed and treated with diaminobenzidine and counterstained with
light green or Harris Hematoxiline.
Morphometrical and Statistical analysis
All morphometric evaluations were done in a double blind assay by the same observer, using
a specific software (Kontron KS300, v. 2.0). Morphometry of the areas of inflammatory infiltrates
and necrosis within the placentomes were performed with images obtained from a 10x
planapochromatic objective. Infiltrates and necrotic debris were surrounded and quantified.
The Inflammatory Index was obtained by following fórmula:
Inflammatory Index (II) = (Σ areas of inflammation/ total area of the field) x 100
The necrotic Index was obtained by following fórmula:
Necrotic Index (NI) = (Σ areas of necrosis/ total area of the field) x 100
Morphometry of the apoptotic cells within the placentomes were performed with images
obtained from a 40x planapochromatic objective. Apoptotic cells were counted considering
morphological characteristics of apoptosis in HE sections and TUNEL labeling. Cells were
considered apoptotic only when showing at least three of the following criteria: 1). Anoikia (cellular
retraction and loss of adhesions between cells and matrix); 2). Condensation of the cytoplasm; 3).
Nuclear condensation (nuclear chromatin dense, sometimes lined up in the nuclear membrane, with
a “crescent” pattern); 4). Nuclear fragmentation; 5). Formation of apoptotic bodies.
The Apoptotic Index was obtained by following fórmula:
Apoptotic Index (AI) = (Σ Apoptotic cells /Σ Total cells) x 100
A cut-off value of the minimal representative number of microscopical fields was
established to perform the morphometry, as described elsewhere 24 . The number of microscopical
fields was considered representative when increase in the sampling size did not result in
considerable decrease in the value of the variation coefficient. By using this approach, ten
microscopical fields per slide were used to quantify areas of inflammation, of necrosis and the
apoptotic index.
An entirely random experimental design was used in a double blind essay. Morphometric
data were submitted to one-way analysis of variance and the averages of each treatment were
contrasted by Newman-Keuls Multiple Comparison Test. Results were expressed as mean ±
standard error of the mean. Averages of the Apoptotic Indices of each animal were correlated with
the other parameters (inflammatory and necrotic indices) and a linear regression was also used to
obtain graphs showing the association of Apoptotic and Inflammatory Indices and of Apoptotic and
Necrotic Indices. All statistical analyses were performed using GraphPad Prism version 3.0
software.
Results
Apoptosis was easily recognized in most of the microscopical fields and in all processed
samples. Even in HE-stained sections of groups NC and B-, images of cellular retraction with loss
of adhesions between cells, cytoplasmic and nuclear condensation, nuclear fragmentation and
formation of apoptotic bodies were evident. Placentomes of non vaccinated healthy puerperal cows
(Group NC) usually showed decreased cellularity of the trophoblasts of the cotiledonary villi with
no inflammatory infiltrate neither necrosis. Evident maternofetal spaces suggested well-matured
placenta. Also, there were intense and diffuse TUNEL-positive labeling showing genome
fragmentation in cells with morphological evidence of apoptosis (Fig. 1).
Placentomes of B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal
gestation and negative bacteriology at parturition (Group B -) had less decreased cellularity of the
trophoblasts in the cotiledonary villi. Inflammatory infiltrate and necrosis were absent or minimal,
and only evident in a few slides. Maternofetal spaces were still evident, supporting that placentas
were all well-matured. Less intense TUNEL-positive labeling but still diffuse and evident indicated
that apoptosis occurred in all samples of that group.
Placentomes from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion
and positive bacteriology at parturition (Group B+) and from B-19 vaccinated cows challenged with
Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++) showed higher cellularity of
the trophoblasts of the cotiledonary villi and of the syncityal epithelium of the maternal cripts.
Maternofetal spaces were less evident, sometimes filled with necrotic debris and inflammatory
cells. Underlining mesenchyma usually showed stronger leukocyte infiltrate and necrosis than
groups control and B-. By and large, placentas of groups B+ and B++ gave the impression of being
less mature than those of other groups. TUNEL-positive labeling and morphological evidence of
apoptosis were decreased when compared to groups controls and B-. TUNEL labeling patterns of
groups NC and B++ are showed on Fig. 1 and 2, respectively.
The apoptotic index was higher in group NC (54,70± 7,78) than in challenged animals
(P<0,0001). In infected animals, apoptosis was more intense in group B- (47,21± 7,88),
intermediate in B+ (42,98± 9,33) and smaller in B++ (38,20± 7,86) (Fig. 3).
Placental lesions were present in all infected cows, but no significant inflammation neither
necrosis were detected in Group NC (Fig. 4). Placentomes from cows of groups B-, B+ and B++
showed a suppurative necrotizing placentitis sometimes associated with bacterial clusters. When
present, maternofetal spaces were filled with necrotic debris and inflammatory cells. Neutrophils
and mononuclear cells were predominant. Underlining mesenchyma usually showed stronger
leukocyte infiltrate and necrosis than groups control and B-. Inflammatory infiltrates were more
intense in Group B++ (22,28± 6,27), decreasing in B+ (7,65± 5,28) being minimal in B- (1,61±
3,32) (Fig. 6). Morphological evidence of the inflammatory infiltrates within the placentomes of a
B++ cow is showed on Fig. 5.
Areas of necrosis were easily identified and quantified by morphometry. Cellular debris,
pyknosis, karyorrhexis, karyolysis and absence of nuclei were considered evident signs of necrosis
during morphometry. Similarly to inflammatory indice, necrosis was also more intense in Group
B++ (35,43± 13,11) than in B+ (7,44± 2,22) and B- (0,50± 0,94) (Fig. 8), and absent in Group NC.
Morphological evidence of the necrotic foci within the placentomes of a B++ cow are showed on
Fig. 7.
Pearson´s test showed a negative correlation between inflammatory infiltrate and apoptotic
index (r= -0,7404) (Fig. 9) and necrotic area and apoptotic index (r=-0,7528) (Fig.10). Linear
regression graphs were plotted to show the inverse relationship.
Discussion
In this study, apoptosis was more intense in group NC than in Brucella challenged animals
(P<0,0001). Placental growth, resizing and maturation involving both cellular proliferation and
apoptosis have an important role in placental function 4 . Physiologically, apoptosis allows the
elimination of unnecessary cells in order to keep tissular homeostasis 36 . Apoptosis is important in
placental remodelling, in order to keep an adequated ratio of tissular components during pregnancy
32 . Apoptosis occurs in all types of cells in human placenta, increasing significantly at the final third
of pregnancy 4, 32 . In cows, apoptosis has an important role in placental maturation and release.
Placental detachment and expulsion at the moment of the birth depends on the decrease in
cellularity and on the occurrence of apoptosis in fetal and maternal placental tissues 3, 5, 17, 18, 20, 27, 30,
31, 32. Apoptotic cells were more frequent in placentomos of cows with normal parturition and
placental release than in placentomes of cows with retained placenta 20, 27 . Cows with placental
retention usually show an increase in maternal epitelial cells 31 . Even though macrophages showed
the same distribution in both retained and released placenta, the acid phosphatase activity is
decreased in retained placenta 22 . Higher acid phosphatase activity in released placenta may be
associated with higher phagocytic activity 22 and apoptotic bodies removal in non retained placenta.
Therefore, it seems to be acceptable that placenta from cows of group NC could be considered more
mature than those of Brucella challenged animals.
In this paper apoptosis was quantified using morphological criteria and TUNEL labelling.
Labelled cells in TUNEL slides occurred mostly at the same regions as in sections stained with HE.
Also, most of the labelled cells showed morphological characteristics of apoptosis. Few cells with
morphology of apoptosis were not labelled as described elsewhere 29 . TUNEL reaction is a
technique that allows the in situ detection of DNA fragmentation, which happens in apoptosis 10, 12
but also in necrosis and autolysis 2, 16, 23, 25, 26 . The enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase
does not discriminate the type of genomic fragmentation, either internucleosomal (apoptosis) or
randomic (necrosis and/or autolysis) therefore false positive with necrosis is expected 21 . Despite
this fact, it is a well-accepted laboratorial approach to apoptosis although may present some
problems with sensibility and specificity 16 . Protein crosslinking due to fixation process can
decrease sensibility of TUNEL reaction 12 . Sensibility of TUNEL reaction should always be
evaluated using morphological criteria to confirm apoptosis on light microscopy 26 . Apoptotic cells
show cellular and nuclear shrinkage, chromatin condensation and celular and nuclear fragmentation,
and that these morphological features are consistent enough to define apoptotic cell death on
histological sections 14, 15, 23 .
In Brucella challenged animals, apoptosis decreased from group B- to B+ and was smaller in
B++. Brucellosis is an important disease of cattle and causes several reproductive problems with
abortion, neonatal death, retention of placenta and reduced fertility in the flock 6 . Several in vitro
studies have showed Brucella s abillity to inhibit apoptosis, preventing its host cell elimination and
permitting intracellular survival of the bacterium 7, 8, 9, 13, 19, 35, 36 . Apoptosis can be a host protective
mechanism against intracellular bacteria, therefore inhibiting apoptosis may promote intracellular
survival of Brucella 35, 36 . When Brucella infects macrophages, it impairs the fusion of
fagolysossome and inhibit the secretion of TNF-α and concomitantly inhibits apoptosis 18 .
Interestingly, both invaded and noninvaded monocytes were protected from apoptosis, indicating
that soluble mediators released during infection were involved in the phenomena 13 . Brucella seems
to modulate the monocyte/macrophage's apoptotic response to the advantage of the pathogen 13, 34 .
During the early phase of infection, lymphocytes and monocytes of naturally infected animals show
a delay of apoptosis in vitro compared to the same cells coming from healthy controls and
vaccinated animals 9, 34 . B. abortus can alter macrophage pathways to recruit additional
macrophages for future infection while simultaneously inhibiting apoptosis and innate immune
mechanisms within the macrophage 8 . Despite all these in vitro evidences of Brucella inhibiting
apoptosis, so far no one has shown the direct in vivo involvement of apoptosis in brucellic
necrotizing placentitis. Inhibition of apoptosis and consequently a delay in placental maturation
may be a mechanism of placental retention in brucellic infection. Since necrotic tissues are usually
friable, one should not expect placenta with necrotizing placentitis to be retained.
No inflammation neither necrosis were detected in Group NC. Inflammatory infiltrates were
more intense in Group B++, decreasing in B+, being minimal in B-. Quite similar to inflammatory
indice, necrosis were also more intense in Group B++ than in B+ and B-. Microscopically, there
was a moderate, sometimes severe, multifocal, lymphocytic and histiocytic, necrosuppurative
placentitis with marked loss of trophoblastic epithelial cells. The superficial chorioallantoic stroma
contained abundant necrotic debris as well as numerous swollen capillaries protruding multifocally
from the denuded surface. These findings were similar to previous studies 1, 11, 28, 33 . Trophoblast
necrosis and ulceration of chorioallantoic membranes are common findings in brucellosis.
Placentomal trophoblasts become separated from maternal syncytial epithelium and when lining
chorionic villi were separated from B. abortus by intact basement membranes 1 . The tips of
maternal septa had a lymphoplasmacytic infiltrate with small multifocal erosions and ulcerations of
maternal epithelium 28 .
In this paper results of a morphometrical approach to apoptosis, necrosis and inflammation
in control and in infected placenta shows that Brucella abortus, directly or indirectly, can inhibit
apoptosis of placental cells and, consequently, delay the placental maturation. This fact could better
explain the retained placenta usually seen in cattle with brucellosis. Abscence of difference in
necrosis between B- and B+ indicates that the isolation and identification of the Brucella abortus
presents low preventive value in relation to the injuries. Pearson´s test showed a negative
correlation between inflammatory infiltrate and apoptotic index and between necrotic area and
apoptotic index. Therefore, apoptosis is decreased in placentome when inflammation and necrosis
are occurring as a consequence of Brucella abortus infection. Decrease in apoptosis is related to
delay in placental maturation, which may help explaining placental retention in Brucellosis.
Conclusion
Apoptosis play a role in placental maturation, decreasing cellularity previously to parturition,
preparing the detachment of the organ after birth.
Brucellic infection causes necrosis and inflammation in placentomes and also somehow decreases
the occurrence of apoptosis, delaying placental maturation.
Acknowledgements
Funds in support of this work have been provided by FAPEMIG (CDS 1216/95) and CNPq
(Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). KKOL Meça was the recipient
of master´s program grant. The authors thank Santiago Oliva, for technical assistance and support.
Correspondence and reprint requests: Laboratório de Apoptose, Departamento de Patologia Geral,
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG Caixa Postal 2486, Belo Horizonte, MG Brazil - E-mail:
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Figures and legends
Fig. 1. Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group Negative Control).
Decreased cellularity of the trophoblasts of the cotiledonary villi with no inflammatory infiltrate
neither necrosis. Intense and diffuse TUNEL-positive labeling showing genome fragmentation in
cells with morphological evidence of apoptosis (TUNEL, Bar =10µm).
Fig. 2. Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with abortion and
positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Trophoblasts of the cotiledonary villi and of the
syncityal epithelium of the maternal cripts with no TUNEL labelling. Maternofetal spaces with
evident inflammatory infiltrate and necrosis, with positive labelling in cellular debris. (TUNEL, Bar
=10µm).
Fig. 3. Graph showing distribution of the apoptotic indices (mean ± sem) obtained from non
vaccinated healthy cows (Group NC, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella
abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition (Group B -, n=5), from B-19
vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion and positive bacteriology at
parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with
abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5).
Fig. 4. Placentome of a non vaccinated healthy puerperal cow (Cow 20, Group NC). Thin layers of
the trophoblasts in the cotiledonary villi with shrunken cells and chromatin condensation, few
apoptotic bodies. No inflammatory infiltrate neither necrosis. (HE, Bar =10µm).
Fig. 5. Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with abortion and
positive bacteriology (Cow 9, Group B++). Intense and diffuse inflammatory infiltrate, composed
by mononuclear and some polymorphonuclear cells (HE, Bar =10µm).
Fig. 6. Distribution of the inflammatory indices (mean ± sem) obtained from B-19 vaccinated cows
challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology at parturition
(Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with no abortion
and positive bacteriology at parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated cows challenged
with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5).
Fig. 7. Placentome of a B-19 vaccinated cow challenged with Brucella abortus, with abortion and
positive bacteriology (Cow 5, Group B++). Large necrotic areas, with cellular debris filling up the
maternofetal spaces. Thicke layers of the trophoblasts in the cotiledonary villi and of the syncityal
epithelium in maternal cripts with few shrunken cells. Most of trophoblasts and syncityal epithelium
show sparse chromatin in their nuclei. (HE, Bar =10µm).
Fig. 8. Graph showing distribution of the necrotic indices (mean ± sem) obtained from B-19
vaccinated cows challenged with Brucella abortus with normal gestation and negative bacteriology
at parturition (Group B -, n=5), from B-19 vaccinated cows challenged with Brucella abortus with
no abortion and positive bacteriology at parturition (Group B+, n=5) and from B-19 vaccinated
cows challenged with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (Group B++, n=5).
Fig. 9 . Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and Inflammation in
placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged puerperal cows, with normal
gestation and negative bacteriology at parturition (B -, n=5), from cows challenged with Brucella
abortus with no abortion and positive bacteriology at parturition (B+, n=5) and from cows
challenged with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (B++, n=5).
Fig. 10 . Linear Regression showing inverse relationship between Apoptosis and Necrosis in
placentomes of healthy (NC, n=5) and Brucella abortus challenged puerperal cows, with normal
gestation and negative bacteriology at parturition (B -, n=5), from cows challenged with Brucella
abortus with no abortion and positive bacteriology at parturition (B+, n=5) and from cows
challenged with Brucella abortus with abortion and positive bacteriology (B++, n=5).
COMENTÁRIOS FINAIS
Nesta dissertação se caracterizou morfologicamente a apoptose em placentomos de vacas
saudáveis e infectadas com Brucella abortus. A quantificação morfométrica da apoptose, assim
como da inflamação e necrose, permitiu inferir que a apoptose, como mecanismo de redução da
celularidade placentária durante o processo de maturação e preparação para o parto, é reprimida
quando ocorrem inflamação e necrose – conseqüências comuns da infecção brucélica.
A apoptose tem um papel importante na redução da celularidade durante o processo de
maturação placentária. A infecção brucélica causa inflamação e necrose nos placentomos e inibe a
ocorrência da apoptose, atrasando a maturação placentária e consequentemente a liberação. Isto
ajuda a explicar a retenção placentária que ocorre freqüentemente na brucelose.
Assim, esta dissertação acaba por trazer nova informação, contribuindo para explicar o
paradoxo - de como a placenta em necrose ainda se mantém retida, já que o esperado – pela
friabilidade característica dos tecidos em necrose – era que se desprendesse ainda mais rapidamente.
Considerando a importância da apoptose no processo de maturação e liberação placentária normal,
confirmou-se que o processo infeccioso e inflamatório atrasa a ocorrência da apoptose nesse
processo e conseqüentemente a maturação e a liberação placentária normal causando a retenção da
placenta e suas conseqüências. Na brucelose, apesar de se verificar placentite necrotizante, é
comum a retenção placentária que acaba por promover metrite e infertilidade.
Em termos de perspectivas futuras, um próximo desafio passa a ser compreender como o
processo ocorre, quais as vias metabólicas e os genes que são expressos, durante a maturação
placentária normal e durante a infecção brucélica.
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