PRÁTICA 2

EXTRAÇÃO DE PLASMÍDIO DE E. COLI POR LISE ALCALINA MINIPREP

Entre as técnicas de DNA recombinante utilizadas, a purificação de plasmídeos consiste naquela mais básica e fundamental, necessária para quase todos os fins, seja para clonagem, seqüenciamento, transformação de bactérias e plantas, introdução de modificações em sequências, mutagênese sítio-dirigida, entre outras. O princípio básico de isolamento consiste no crescimento da cepa contendo o plasmídeo de interesse em condições que maximize o número de cópias do plasmídeo por célula bacteriana.

O método mais utilizado para o isolamento e purificação de DNA de plasmídeo se baseia na lise alcalina, proposto originalmente por Birboim e Doly (1979). Esse método é muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos sob diversas condições (isolados, meios de crescimento, etc.). Entretanto, o tamanho do plasmídeo não deve ser muito grande (<20 kb). O método de isolamento por lise alcalina baseia-se na diferença em desnaturação, em condições alcalinas (pH ~12) entre o DNA plasmidial circular e o cromossomial de alto peso molecular. Plasmídeos grandes apresentam propriedades mais próximas ao DNA cromossomial dificultando a separação entre eles. O método de extração inicia-se com a lavagem das células, coletadas através de centrifugação, com a solução I (Tris, EDTA e glicose como tampão e osmótico). As células podem ser lisadas incluindo lisozima na Solução I. A solução II contém SDS e NaOH. O SDS (detergente) possui a função de lisar as membranas da célula e desnaturar as proteínas celulares (incluindo enzimas), enquanto que o NaOH eleva o pH do extrato para valores muito alcalinos (pH 12 a 12,5). Nessas condições, ocorre a desnaturação diferencial do DNA, com o DNA cromossomial sendo desnaturado, enquanto que o DNA plasmidial circular e menor permanecendo inalterado. Ao incorporar o Acetato de Potássio (ou Acetato de Sódio) com pH 5,5, o extrato é neutralizado sob condições de alta concentração de sais, fazendo com que o DNA cromossomial precipite, enquanto que o DNA plasmidial permaneça em solução. A adição dessa solução também causa a precipitação de proteínas complexadas ao SDS, incorporado pela adição da solução II. A centrifugação final produz um extrato claro com o DNA plasmidial em solução. Para reduzir a contaminação do DNA purificado com proteínas, pode-se empregar a extração com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e/ou clorofórmio:álcool isoamílico. O DNA é então precipitado através da adição de alcool (0,6-0,8 X volume de isopropanol ou 2,5 x volumes de etanol) na presença de sais. Após a lavagem com etanol 70% para remoção do excesso de sais, o DNA é ressuspenso em TE com RNase para remoção da contaminação por RNAs. Em alguns casos, deve-se realizar a extração com

fenol:clorofórmio:álcool isoamílico para desnaturar e remover o resto da RNAse e re-precipitar o DNA.

Para algumas aplicações, tais como o seqüenciamento empregando marcação fluorescente ou transfecção de células, existe um requerimento alto para pureza do DNA plasmidial. Tradicionalmente, empregava-se a purificação por gradiente com cloreto de césio. Esse método requer uma ultracentrífuga, além de ser oneroso e usar grandes quantidades de brometo de etídeo. Por essas razões, houve uma tendência a usar cada vez menos esse método, passando a utilizar outros métodos que empregam resinas de afinidade com DNA plasmidial e disponíveis em kits comerciais. Outra alternativa viável consiste no emprego de precipitação em polietilenoglicol (PEG).

Os Kits comerciais prontos para extração e purificação de plasmídeo, tais como o Wizard Plus Minipreps da Promega; Concert da Invitrogen, e RPM da BIO101 são baseados no emprego de resinas de sílica, específicas para a purificação dos plasmídeos. De modo geral, esses Kits comerciais iniciam a purificação do plasmídeo utilizando o mesmo protocolo de Lise Alcalina até a obtenção do lisado, seguido de ligação do plasmídeo com uma resina específica [Concert usa sílica empacotada em colunas descartáveis acopláveis em tubos de 1,7 ml] (Fig. 1), que após a lavagem da coluna e remoção das impurezas e contaminantes, o plasmídeo pode ser eluído com água mQ ou TE de forma pura.

Após a purificação de um plasmídeo, é sempre recomendável checar a identidade e características do plasmídeo através da digestão com enzimas de restrição, para confirmar o tamanho dos fragmentos esperados.

ReferênciasBirnboim, H.C. and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening

recombinant plasmud DNA. Nucleic Acids Research 7:1513-1523.Sambrook, J., E.F. Fitsch, e T.M. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory

manual, 2nd ed. CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

PROTOCOLO DE MINI-PREPARAÇÃO DE DE DNA DE PLASMÍDEO USANDO LISE-ALCALINA

1. Crescer a bactéria de interesse, individualmente em 2 a 5 ml meio LB contendo antibiótico de seleção (para pBIN19 com 20 g/ml de kanamicina e para pDAB218 com 100 g/ml de ampicilina) por toda a noite com agitação a 37oC.

2. Transferir a solução de bactérias para tubo de microcentrífuga Eppendorf. Centrifugar na microcentrífuga por 1 minuto, e desprezar a solução sobrenadante (em água sanitária).

3. Ressuspender o pellet em 200 l da Solução I, vortexando. Manter por 10 minutos à temperatura ambiente.

4. Adicionar 200 l da Solução II. Preparar solução fresca antes do uso Misturar por inversão. Incubar no gelo por 5 minutos.

5. Adicionar 150 l da Solução III. Misturar por inversão. Incubar no gêlo por 5 minutos.

6. Microcentrifugar por 5-10 minutos (até o pellet ficar sólido).

7. Decantar a solução sobrenadante (contendo o DNA plasmidial) para outro microtubo Eppendorf.

8. Adicionar 500 l de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), vortexar, e centrifugar por 5 minutos. Tome cuidado, pois fenol e clorofórmio são muito cáusticos. USE LUVAS!

9. Coletar a fase superior aquosa e transferir para um tubo de microcentrífuga novo.

10. Adicionar ao tubo 500 l de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), vortexar, e centrifugar de novo por 1 minuto. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um outro tubo de microcentrífuga.

11. Adicionar 1 ml de etanol absoluto (100%), misturar por inversão, e incubar a -20oC por pelo menos ½ hora.(Esse é um bom ponto de parada, pois DNA é estável sob etanol.)

12. Centrifugar o DNA por 5 minutos numa microcentrífuga. Decantar o etanol e adicionar 500 l de etanol 70%. Vortexar (o pelet não dissolve) e centrifugar por 5 minutos. Decantar o etanol e secar o pellet ao ar, ou no dessecador sob vácuo.

13. Ressuspender o DNA em 50 l de 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM Na2.EDTA (TE), contendo 50 g/ml RNAse A.

SOLUÇÕES

Solução I: Componente Quantidade Concentração Final Glucose 0,9 g 50 mM glucoseTris-HCl 1 M, pH 8,0 2,5ml 25 mM Tris-HCl, pH 8,0EDTA, 0,5 M, pH 8,0 2,0 ml 10 mM Na2.EDTAÁgua mQ destilada para 100 mlAutoclavar por 20 minutos a 121oCArmazenar na geladeiraOpcional: Adicionar 2 mg ml-1 de Lisozima imediatamente antes do uso.

Solução II:Componente Quantidade Concentração Final NaOH 1N 2 ml 0,2 M NaOHSDS 10% p/v 1 ml 1,0% SDSÁgua mQ destilada para 10 ml

Fazer essa solução imediatamente antes de uso; não autoclavar

Solução III:3 M KOAc, pH 5,5 (Ver Apostila 1).

TE:10 mM Tris-HCl, pH 8,0

1 mM Na2.EDTA, pH 8,0

AutoclavarAdicionar RNAse A na concentração final de 50 g/ml logo antes do uso.

RNAse:Tradicional (Sambrook et al., 1989)

RNAse pancreática (RNAse A) comercial deve ser dissolvida na concentração de 10 mg ml-1 em acetato de sódio 0,01 M (pH 5,2), seguido de aquecimento a 100oC por 15 minutos. Após resfriar lentamente a temperatura ambiente, ajustar o pH com 0,1 volume de 1 M Tris-HCl pH 7,4. Manter congelado o estoque a –20oC.

RNAse A Sigma (R6513)Dissolver a RNAse A na concentração de 10 mg ml-1 em 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 15 mM NaCl. NÃO É NECESSÁRIO FERVER.

PROTOCOLO DE MINI-PREPARAÇÃO DE DNA DE PLASMÍDEO USANDO KIT COMERCIAL DE PURIFICAÇÃO

Os kits comerciais disponíveis no mercado (Wizard, Concert, NucleoSpin etc.) são desenhados para produzir de forma rápida, DNA plasmidial de alta qualidade numa preparação em pequena escala. Em geral os kits purificam plasmídeos de qualquer tamanho, mas eles são otimizados para purificar de forma mais efetiva plasmídeos de até 15 kbp, com o protocolo padrão. O princípio básico consiste na ressuspensão do pelet de células bacterianas de E. coli num tampão (Ex. tampão A1, G1) contendo RNAse, seguido da liberação do plasmídeo em solução pela lise alcalina/SDS (Ex. tampão A2, G2). O terceiro tampão (Ex. A3, G3) neutraliza o lisado resultante, e cria as condições apropriadas para a ligação do DNA plasmidial na membrana de sílica da coluna empregada. O resto celular e proteínas desnaturadas são peletizadas por centrifugação, enquanto que o sobrenadante é carregado nessa coluna. Os contaminantes (sais, metabólitos e componentes celulares macromoleculares solúveis) são removidos pela simples lavagem com tampão etanólico (Ex. A4, G4). O DNA plasmidial puro é finalmente eluído sob condições de baixa força iônica com tampão levemente alcalino (Ex. 5 mM Tris-HCl, pH 8,5).

1. Crescer a bactéria de interesse, individualmente em 2 a 5 ml meio LB contendo antibiótico de seleção (para pBIN19 com 20 g/ml de kanamicina e para pDAB218 com 100 g/ml de ampicilina) por toda a noite sob agitação a 37oC.

2. Transferir de 1 a 5 ml da solução de bactérias para tubo de microcentrífuga Eppendorf. Centrifugar na microcentrífuga por 30 segundos na maior velocidade, e desprezar a solução sobrenadante (em água sanitária). Usar no máximo 3 ml da cultura para purificação de plasmídeo para seqüenciamento. (volumes > 5 ml tendem a entupir a coluna posteriormente). Remover o máximo de sobrenadante possível para melhorar qualidade da purificação.

3. Adicionar 250 l da Solução A1 (kit Macherey Nagel) ou G1 (Concert), contendo RNAse. Ressuspender o pelet com vigor usando vortex.

4. Adicionar 250 l da Solução A2 ou G2. Misturar por inversão (6 a 8 vêzes). NÃO VORTEXAR (causa quebra de DNA cromossomial e posterior contaminação). Incubar a temperatura ambiente por no máximo 5 minutos.

5. Adicionar 300 l da Solução A3 ou G3. Misturar por inversão (6 a 8 vêzes). NÃO VORTEXAR. Centrifugar por 10 minutos a temperatura ambiente ou a +4ºC. (a precipitação é mais efetiva quando feita a 4ºC).

6. Colocar a coluna do kit num tubo de coleta de 2 ml e carregar o sobrenadante na coluna. Microcentrifugar por 1 minuto. Descartar o eluato do fundo do tubo. [Se o DNA plasmidial for preparado de cepas de E. coli com alto nível de nuclease (HB101 e série JM) recomenda-se utilizar uma lavagem adicional].

7. Colocar a coluna de novo no tubo de coleta de 2 ml e adicionar 600 l do tampão A4 ou G4), contendo etanol. Centrifugar por 1 minuto. Descartar o eluato do fundo do tubo.

8. Secar a membrana de sílica, re-inserindo a coluna no tubo de coleta de 2 ml. Centrifugar por mais 2 min.

9. Colocar a coluna num microtubo de 1,5 ml e adicionar 50 l de tampão AE (5 mM Tris-HCl, pH 8,5). Incubar por 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugar por 1 minuto. Alternativamente, pode ser feita a eluição do DNA plasmidial usando TE ou água. O kit da Macherey-Nagel recomenda usar tampão AE por ser levemente tamponado, e levemente alcalino e não possuir EDTA, e é recomendado para reações de seqüenciamento. O kit CONCERT usa TE aquecido diretamente para eluição.

Figura 1. Método de extração de purificação de plasmídeo usando Kit comercial com resina de Sílica.

OBTENÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DE E. COLI PARA

TRANSFORMAÇÃO COM PEG

(Avi Levy, 1991)

1- Autoclave frascos contendo 5, 10, 40 e 200ml de meio TYM

2- Inocule uma única colônia em 5 ml de meio TYM e deixe crescer overnight a 37 oC sob agitação em Shaker

3- Dilua 1:100 (100 l) em 10 ml de meio TYM e deixe crescer até O.D.600 = 0.2-0.6

4- Verta este volume em 40 ml de meio TYM e cresça os 50 ml de cultura até

O.D.600 = 0.5-0.9

5- Verta este volume em 200 ml de meio TYM

6- Cresça os 250ml de cultura até O.D.600 = 0.6

7- Resfrie rapidamente em gelo

8- Centrifugue as células a 4200 rpm por 15 min. a 4 oC

9- Ressuspenda gentilmente em 100 ml de meio TBF1 gelado

10- Centrifugue as células a 4200 rpm por 8 min. a 4 oC

11- Ressuspenda gentilmente em 10 ml de meio TBF2 gelado

12- Pipete alíquotas de 100 l em eppendorfs mantidos em gelo, congele em N2

líquido e armazene a –80oC.

Nota: protocolo suficiente para 100 transformações.

Meios

TBF1 100ml TBF2 100 ml TYM 350ml

KOAc 0.03M 0,294 g MOPS pH

7

0.01M 2ml (estoque

0.5M)

Tryptona 7g

MnCl2 0.05M 0.99 g CaCl2 0.075M 1.10 g Ext. leved. 1,75 g

KCl 0.10M 0.746 g KCl 0.01M 0.075 g NaCl 2.03 g

CaCl2 0.01M 0.147 g Glycerol 15% 15 g MgSO4 0.875g

Glicerol 15% 15 g

Esterilize em filtro Autoclave Autoclave

Transformação

1- Tirar células competentes (100 l) do freezer –80 oC e colocar em isopor com

gelo dentro do fluxo laminar;

*** seja rápido, pois ao descongelar as células perdem a competência

2- Adicionar ao tubo com as células 2 l da ligação (dar um spin antes) e 8 l de

tranfo buffer (manter sempre a proporção 1:4). Ressuspender cuidadosamente

com a ponteira, manter no gelo por 15 a 30 min (*15 min);

3- Tirar o tubo do gelo e deixar a temperatura ambiente por 10 min dentro do fluxo;

4- Adicionar 450 l de meio SOC pré-amornado e incubar a 37 oC por 50 min (não

precisa agitar);

5- Ressuspender com ponteira e plaquear 100 l por placa, contendo LB +

ampicilina (50g/ml) + X-Gal + IPTG;

pipetar o volume de bactéria, X-Gal e IPTG e posições opostas na placa e

esparramar tudo junto

usar em cada placa 100l de IPTG (100 mM) e 20 l X-Gal (50 mg/ml).

Transfo Buffer

Para 10 ml:

1 ml 10X KCM, 1.5 ml 10% PEG, 7.5 ml água mili Q autoclavada

10X KCM = 1M KCl; 0.3M CaCl2; 0.5M MgCl2

10% PEG (6000, 4000, 3335 w/v)

Esterilize as soluções em filtro.

PREPARAÇÃO E CONGELAMENTO DE CÉLULAS ELETROCOMPETENTES DE ESCHERICHIA COLI

O êxito na preparação das células competentes depende da rapidez nas operações descritas até o congelamento final, e na qualidade da cultura. A vidraria utilizada deve ser limpa e sem resíduos de detergente ou sabão. Contaminantes de outras culturas (ex. sais, metais pesados etc.) podem afetar a eficiência das células competentes. É recomendável possuir uma vidraria dedicada apenas para esse fim. Eletroporação consiste num método de transformação de E. coli com eficiência de até 109 a 1010

transformantes/ mg, muiot superior ao que é possível usando o melhor método químico.

1 Inocular as células de DH5 em 25 ml de meio LB (SEM ANTIBIÓTICO) para crescer por toda noite (ca. 16 horas) a 37oC sob agitação;

2 Usar 5 ml dessa cultura para inocular 500 ml de meio LB, e cultivar sob alta agitação até atingir Abs600 = 0,5 (cerca de 3 horas). O número de células não deve ultrapassar 108 ml-1;

3 Resfriar a cultura em água gelada sob agitação (mínimo de 20 minutos). Para todos os passos seguintes, recomenda-se manter as células mais próximas de 0ºC possível, resfriando as soluções e recipientes;

4 Centrifugar por 15 min a 4.000 g a 4oC. Descartar o sobrenadante e inverter o tubo durante 20 seg para eliminar todo meio;

5 Ressuspender o pellet em 500 ml de dH2O estéril gelada. - Realizar essas operações no fluxo laminar.

6 Centrifugar por 15 min a 4.000 g a 4oC;

7 Ressuspender o pellet em 250 ml de dH2O estéril gelada;

8 Centrifugar por 15 min a 4.000 g a 4oC;

9 Ressuspender o pellet em 250 ml de dH2O estéril gelada;

10 Centrifugar por 15 min a 4.000 g a 4oC;

11 Ressuspender o pellet em 10 ml de dH2O estéril gelada;

12 Centrifugar por 15 min a 4.000 g a 4oC;

13 Ressuspender o pellet em 1-1,5 ml de 10% glicerol estéril filtrado gelado;

14 Retirar alíquotas de 40 l em microtubos pré-esfriados, e congelar imediatamente mergulhando os tubos em nitrogênio líquido. Armazenar no ultra-freezer –80oC;

Eletroporação de E. coli

1. Derreter as células de células competentes de E. coli DH5em gelo. Para cada amostra, colocar um microtubo de 1,5 ml e uma cubeta no gelo;

2. No microtubo de 1,5 ml estéril com parede fina no gelo, mistura 40 l da suspensão de células eletrocompetentes com 1 a 2 l de DNA da preparação de plasmídio. O DNA DEVE ESTAR EM TAMPÃO DE BAIXA FORÇA IÔNICA, TAL COMO TE). Misturas bem ambas a soluções e incubar no gelo por cerca de 1 minuto;

3. Ajustar o equipamento Eletroporador "MicroPulser"para "Ec1" quando estiver usando cubeta de 0,1 cm. Para cubetas de 0,2 cm usar programa "Ec2" ou "Ec3". Ver Instruções de operação do equipamento!;

4. Transferir a mistura de células e DNA para a cubeta resfriada e fazer a suspensão alcançar o fundo da cubeta. Coloque a cubeta na câmara de eletroporação. Empurre a cubeta até encaixar entre eletrodos. Pulse apenas uma vez!

5. Remover a cubeta da câmara de eletroporação e adicionar 1 ml de meio SOC-Broth pré-amornado a 37ºC na cubeta. Rapidamente mas com cuidado ressupenda as células com pipeta. O período entre a aplicação do pulso e a transferência das células para meio de crescimento é crucial para a recuperação de transformantes de E. coli. O atraso nessa transferência por mesmo 1 minuto causa uma queda de eficiência de até 3 vêzes. Essa queda atinge 20 vêzes em 10 minutos.

6. Transferir as células para um tubo e incubar a 37o.C por 1 hora com agitação.

7. Plaquear 100 l em meio LB em meio contendo kanamicina ou ampicilina e controles sem antibiótico. Incubar por toda a noite (“overnight”) a 37oC, com placas invertidas.

Obs. Recomenda-se a remoção de excesso de sais das reações de ligação de foram a melhorar a eficiência na transformação. Para isso, após a reação de ligação (10 l), precipite o DNA adicionando mais 10 l l de água mQ estéril e 70 l de Etanol 100% gelado. Mantenha o tubo a -80ºC por 20 minutos e centrifugue a 13.000 rpm por 8 min. Verta o tubo e descrate sobrenadante. Lave o pellet (invisível) com 100 l de Etanol 70%, centrifugue e deixe secar por 30 min. Ressuspenda em 5 l de água mQ estéril. Use essa solução na eletroporação.

LAVAGEM DE CUBETAS DE ELETROPORAÇÃO

Recomenda-se o uso de cubetas de eletroporação novas. Entretanto, o alto custo impede

que esa prática seja realizada rotineiramente. Experimentos críticos devem usar cubetas

novas, mas em alguns casos, as cubetas podem ser re-utilziadas após tratamento

adequado.

1. Logo após o uso lavar as cubetas com água para remover as bactérias;

2. Adicionar 1 M NaOH até cobrir a parte metálica interna;

3. Complete com etanol e deixe por 10 min;

4. Enxaguar bem com água corrente, e depois com água MilliQ;

5. Secar em estufa a 37oC;

6. Imediatamente antes do uso, esterilizar por 10 minutos em luz UV (ou irradiar com

raios por 20 min);

Obs.: Se a parte externa da cubeta estiver oxidada, deixar de molho em solução de 1M

NaOH e etanol.

PREPARAÇÃO E CONGELAMENTO DE CÉLULAS COMPETENTES DE ESCHERICHIA COLI

O êxito na preparação das células competentes depende da qualidade da cultura e

da rapidez nas operações descritas até o congelamento final. A vidraria utilizada deve

estar limpa e sem resíduos de detergente ou sabão. Contaminantes de outras culturas (ex.

metais pesados etc.) podem afetar a eficiência das células competentes. É recomendável

possuir uma vidraria dedicada apenas para esse fim.

1. Inocular as células de DH5 em 25 ml de meio LB (SEM ANTIBIÓTICO) para

crescer por toda noite (ca. 16 horas) a 37oC sob agitação;

2. Usar 5 ml dessa cultura para inocular 250 ml de meio LB, e cultivar sob agitação até

atingir Abs600 = 0,5 (cerca de 3 horas). O número de células não deve ultrapassar 108

ml-1;

3. Resfriar a cultura em água gelada sob agitação;

4. Centrifugar por 8 minutos a 8.000 rpm (rotor GSA) a 4oC. Descartar o sobrenadante

e inverter o tubo durante 20 seg para eliminar todo meio;

5. Ressuspender o pellet em 62,5 ml de 0,1 M MgCl2 gelado – realizar essas operações

no fluxo laminar;

6. Centrifugar por 8 minutos a 8.000 rpm (rotor GSA) a 4oC.

7. Ressuspender o pellet em 62,5 ml de 0,1 M CaCl2 gelado, e colocar no gelo por 20

minutos;

8. Centrifugar por 8 minutos a 8000 rpm rotor GSA;

9. Ressuspender o pellet em 10,8 ml de 0,1 M CaCl2 mais 1,7 ml de glicerol estéril

gelado;

10. Retirar alíquotas de 500 l em microtubos pré-esfriados, e congelar imediatamente

mergulhando os tubos em nitrogênio líquido. Armazenar no ultra-freezer –80oC.

Transformação de E. coli DH5

1. Derreter em gelo um tubo de células competentes de E. coli DH5

2. Colocar um tubo plástico estéril com parede fina no gelo. Dentro dele, colocar 100 l de células de bactéria competente e 1 l da preparação de plasmídio. Incubar no gelo por 1 hora;

3. Dar um choque térmico (“heat shock”) no tubo a 42oC por 45 segundos. Recolocar o tubo no gelo por 2 minutos;

4. Adicionar 0,9 ml de meio SOC-Broth pré-amornado a 37oC. Incubar a 37oC por 1 hora sem agitação.

5. Plaquear 100 l em meio LB em meio contendo kanamicina ou ampicilina e controles sem antibiótico. Em caso de baixa eficiência, centrifugar a cultura rapidamente, descartar sobrenadante ou parte dele, e ressupender o pelet em volume menor. Plaquear o memso volume 100 l. Incubar por toda a noite (“overnight”) a 37oC, com placas invertidas. Isso dará uma idéia sobre a eficiência de transformação desses plasmídio nessas células de bactéria, e também dará uma idéia sobre a taxa de mutação espontânea para resistência a kanamicina dessa bactéria.

L Broth:10 g Bactotriptona5 g extrato de levedura)10 g NaClCompletar o volume para 1 litro com água, e pH para 7,0; autoclavar.

Meio SOBBacto triptona 20 gExtrato de levedura 5 gNaCl 0,5 g

Adicionar água até 950 ml. Agitar até dissolver. Adicionar 10 ml de uma solução de 250 mM de KCl (dissolver 1,86 g KCl em 100 ml de água destilada). Ajustar o pH para 7,0 com NaOH, e acertar o volume para 1 litro. Autoclavar. Pouco antes de usar, acrescentar 5 ml de uma solução estéril de 2 M MgCl2 (dissolver 19 g de MgCl2

em 90 ml de água destilada, ajustar o volume para 100 ml com água estéril e autoclavar por 20 minutos).

Meio SOCEsse meio é idêntico ao meio SOB, exceto que contém 20 mM de glucose. Após o meio SOB ter sido autoclavado, esperar esfriar abaixo de 60oC, e acrescentar 20 ml de uma solução estéril de 1 M glucose (preparar essa solução dissolvendo 18 g de

glucose em 90 ml de água destilada, dissolver, ajustar o volume para 100 ml com água destilada, e esterelizar por filtração através de filtro de 0,22 m).

Célula Competente com Cloreto de Rubídio(Protocolo fornecido pela Dra. Dirce Carraro - CEBTEC, ESALQ, USP)

1) Inocular uma colônia isolada em 10 ml de SOB a 37ºC sob agitação (250 rpm);

2) Inocular 1 ml de pré cultura em 100 ml de meio SOB (Erlenmeyer de 500 ml). O meio deve ser pré aquecido a 37ºC. Incubar a 37ºC sob agitação (250 rpm) até atingir OD=0.45 a 0.55. Esse valor é muito importante.

3) Transferir a cultura para 2 tubos falcon de 50 ml estéreis, resfriar a cultura por 10 min em gelo e centrifugar 3000 rpm por 10 min a 4ºC. Descartar o sobrenadante e manter os tubos invertidos por alguns seg.

4) Ressuspender as células em 1/3 do volume inicial (33 ml) em solução RF1. Transferir as suspensões para único tubo Falcon. Incubar em gelo por 15 min.

5) Centrifugar 3000 rpm por 10 min a 4ºC. Descartar o sobrenadante.

6) Ressupender as células em 1/12,5 de RF2, do volume inicial (8 ml). Incubar a suspensão em gelo por 15 min;

7) Aliquotar 200 l em tubos eppendorfs previamente resfriados. (Coloque as estantes com os tubos em um bandeja de gelo, e mantenha em gelo até a estocagem);

8) Congelar as alíquotas em banho de gelo seco em álcool ou N2 líquido e armazenar a -70ºC;

9) Remover os tubos de -70ºC e descongelar em gelo.

10) Adicionar a a solução contendo o DNA (até 20 l de ligação). Misturar e incubar em gelo por 10-60 min. (sugestão 20 min);

11) Incubar a 42ºC por 90 s. Transferir imediatamente para o gelo.

12) Adicionar 800 l de SOC e incubar por 1 hora a 37ºC sob agitação moderada (180 rpm)

13) Espalhar uma 150 ml de células em placa LB contendo o antibiótico (Ampicilina 100 g/ ml).

SOB Bacto triptona - 2%Extrato de levedura - 0.5%NaCl - 10 mMKCl - 2.5 mMautoclavaracrescentar: Mg Cl2 10 mM MgSO4 10 mM

SOC= SOB e 20 mM glicose

RF1 RbCl (100mM)MnCl2 (50mM)CaCl2 (10 mM)glicerol (15%)Acetato de K 1M pH 7.5 (30mM)

RF2MOPS 10mMRbCl 10mMCaCl2 75 mMglicerol 15%Ajustar o ph para 6,8 com NaOH

Esterilizar RF1 e RF2 em membrana de 0.22 MArmazenar em geladeira

PREPARAÇÃO E CONGELAMENTO DE CÉLULAS COMPETENTES DE AGROBACTERIUM E TRANSFORMAÇÃO

1. Riscar uma placa, com meio novo contendo os antibióticos com a cepa, e crescer por 2-3 dias;

2. Inocular a bactéria em meio YEP e crescer sob agitação (100 a 150 rpm) a 28oC por 12 a 16 horas;

3. Transferir 2 ml da cultura para 50 ml de meio YEP em Erlenmeyer de 250 ml. Incubar sob agitação (100 a 150 rpm) a 28oC por 12 a 16 horas. A eficiência da transformação é maior com absorbância Abs600 = 0,5 a 1,0;

4. Incubar no gelo por 15 minutos;5. Centrifugar as células por 5 minutos a 5000 rpm a 4oC. Lavar o pellet com 10 mM de

Tris-HCl pH 7,5, e repeletizar por centifugação por 5 minutos a 5000 rpm6. Ressuspender o pelet com cuidado em 1ml de 20 mM CaCl2 gelado;7. Caso for preparar estoque congelado, incorporar glicerol com concentração final de

10%. Congelar alíquotas de 100 l em microtubos tubos em banho de alcóol com gêlo seco. Armazenar os tubos no ultra-freezer –80 oC.

Protocolo adaptado de Brasileiro et al. (1998). Recomenda uso de YEB.

MeiosYEP líquido

10 g Bactotriptona5 g NaCl5 g extrato de levedura

completar o volume para 1 litro com água destilada. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH.

YEB5 g extrato de carne1 g de extrato de levedura5 g de peptona5 g de sacarose240 mg de MgSO4

Completar volume para 1 litro e ajustar o pH para 6,8 com gotas de NaOH 0,1 N. Esterelizar em autoclave por 20 minutos a 121oC.