Applied Biosystems StepOne および StepOnePlustools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_039294.pdfApplied Biosystems StepOne およびStepOnePlus Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

Applied Biosystems StepOne™

および StepOnePlus™

Real-Time PCR Systems

試薬ガイド

Applied Biosystems StepOne™

および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems

試薬ガイド

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部品番号 4377716 Rev. C 06/2010

目次

iiiApplied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

序章

このガイドの使用方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

詳細に関する参考資料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

サポートの受け方 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii

第 1 章はじめに

StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

使用可能な消耗品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

実験の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

実験タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-8

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-9

第 2 章試薬の概要

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

TaqMan® 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

SYBR® Green 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

適切な試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

DNA 汚染の最小限化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7

第 3 章定量実験

セクション 3.1: 定量実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4

定量方法の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8

シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10

試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12

セクション 3.2: 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15

Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16

iv Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-19

実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

Primer Express® Software を使ったプライマーとプローブの設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

試薬の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-24

推奨サーマルサイクリング条件の使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-27

プライマー濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30

プローブ濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-33

詳細について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35

第 4 章ジェノタイピング実験

セクション 4.1: ジェノタイピング実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6

セクション 4.2: 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

設計済み／検証済みアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . . . . . . . . 4-12

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13

実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16

実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16

第 5 章有無実験

セクション 5.1: 有無実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-3

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6

セクション 5.2: 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9

Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15

実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16

vApplied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

付録 A 計算式

標準曲線法を用いた標準偏差の計算 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

比較法を用いた標準偏差の計算 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-5

比較 CT（∆∆CT）実験用計算式 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-7

付録 B マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限

付録 C アッセイ設計ガイドライン

付録 D 試薬部品番号

定量実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2

Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2

ジェノタイピング実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5

設計済み／検証済みアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5

有無実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7

Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-8

参考文献

用語集

索引

vi Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

viiApplied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

序章

このガイドの使用方法

システム文書について

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems（StepOne™

および StepOnePlus™ システム）には、以下に示したガイドが付属しています。

参考：本ガイドで使用される Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems という表記は、Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR Systemおよび Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-Time PCR System の 2 製品を示します。

ガイド目的と対象 PN 日本語版PN

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Genotyping Experiments

StepOne および StepOnePlus システムで実験を行う方法を解説します。各『入門ガイド』には次の 2つの機能があります。

• Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR Software（StepOne™ ソフトウェア）で提供されている実験データ例を使ったチュートリアル。

• 実際の実験のためのガイド。

StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書かれています。

4376786 4377731

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments

4376787 4377722

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT Experiments

4376785 4377740

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Getting Started Guide for Standard Curve Experiments

4376784 4377734

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Installation, Networking, and Maintenance Guide

StepOne および StepOnePlus システムの設置とメンテナンスの方法を解説します。

StepOne または StepOnePlus システムを設置、メンテナンスする実験室スタッフを対象に書かれています。

4376782 4377796

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Installation Quick Reference Card

4376783 4377790

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Reagent Guide

StepOne および StepOnePlus システムで使用する試薬に関する情報を提供し、以下のものが含まれます。

• TaqMan® および SYBR® Green 試薬に関する序論

• 以下の実験タイプに対する設計ガイドラインの説明

– 定量実験

– ジェノタイピング実験

– 有無実験

StepOne または StepOnePlus システムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書かれています。

4379704 4377716

viii Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

序章

前提条件本書は、次のことを前提に書かれています。

• Microsoft Windows® XP オペレーティングシステムに精通している。

• インターネットとインターネットブラウザに精通している。

• DNA または RNA サンプルの取扱いおよび PCR のための調製方法に関する知識が

ある。

• データ保存、ファイル転送、コピーと貼り付けを理解している。

• 既存の実験データフローへ StepOne または StepOnePlus システムを組み込む場合、

ネットワーク構築の経験がある。

テキスト表記法本書では、次の表記法を採用しています。

• 太字はユーザーが行う操作を示します。次に例を示します。

0 を入力してから、残りの各フィールドで Enter を押します。

• 斜体文字は、新規または重要な用語を示すほか、強調する際にも使われます。次に

例を示します。

解析前に、必ず新しいマトリックスを調製してください。

• 右矢印記号（）は、ドロップダウンまたはショートカットメニューからユーザー

が続けて選択すべきコマンドの区切りとして使われます。次に例を示します。

［File］（ファイル）［Open］（開く）を選びます。

ユーザーの注意を促す語句

Applied Biosystems ユーザー文書では、ユーザーの注意を促す 2 種類の用語が使われて

います。各語句は、次のような注意や対応が必要なことを示します。

参考：－必ずしも製品の使用に不可欠というわけではありませんが、製品を使用する上

で役に立つ情報です。

重要！－装置の適切な操作、試薬キットの正しい使用、化学薬品の安全な使用にとって

必要な情報を提供します。

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlusô Real-Time PCR Systems Site Preparation Guide

StepOne および StepOnePlus システムの受け取りと設置に向けた設置場所の準備作業を解説します。

StepOne または StepOnePlus システムの設置前にしておくべき設置場所の準備作業をスケジュール設定、管理、実施する担当者向けに書かれています。

4376768 4378357

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR Software Help

StepOne ソフトウェアを用いて以下の事項を行う方法を解説します。

• StepOneおよびStepOnePlusシステムで実験のセットアップ、測定、解析。

• ネットワーク上のStepOneおよびStepOnePlus装置の監視。

• StepOne および StepOnePlus 装置のキャリブレーション。

• RNase P測定によるStepOneおよびStepOnePlus装置の性能確認。

対象：

• StepOneまたはStepOnePlusシステムを使って実験を実施する実験室スタッフや研究者。

• StepOne または StepOnePlus システムを設置、メンテナンスする実験室スタッフ。

該当せず該当せず

ガイド目的と対象 PN 日本語版PN

ixApplied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

序章

ユーザーの注意を促す用語の例を下記に示します。

参考：［Calibrate］（キャリブレーション）機能は、コントロールコンソールでも利用で

きます。

重要！クライアント接続を確認するには、有効なユーザー ID が必要です。

詳細に関する参考資料

関連文書 StepOne および StepOnePlus システム文書

下表に示した文書は、StepOne または StepOnePlus 装置に付属していません。以下の文

書は、2007 年 7 月以降入手可能となります。

ジェノタイピング実験関連文書

文書 PN

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Installation Performance Verification Protocol

4376791

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Installation Qualification-Operation Qualification Protocol

4376790

Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems Planned Maintenance Protocol

4376788

文書 PN

Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Quick Reference Card

4312212

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol 4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Ordering TaqMan® SNP Genotyping Assays Quick Reference Card 4374204

Performing a Custom TaqMan® SNP Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card

4371394

Performing a TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well Plates Quick Reference Card

4367636

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

x Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

序章

有無実験関連文書

相対標準曲線および比較 CT 実験関連文書

標準曲線実験関連文書

文書 PN

DNA Isolation from Fresh and Frozen Blood, Tissue Culture Cells, and Buccal Swabs Protocol

4343586

NucPrep® Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue Protocol

4333959

PrepMan® Ultra Sample Preparation Reagent Protocol 4318925

文書 PN

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note

127AP05

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol

4375575

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

文書 PN

Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application Note

127AP05





xiApplied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

序章

試薬ガイド関連文書

参考：その他の文書については、「サポートの受け方」（xii ページ）をご参照ください。

ソフトウェアヘルプ情報の入手

StepOne ソフトウェアヘルプは、ユーザーインターフェースの各機能の使い方を説明し

ます。ソフトウェア内のヘルプにアクセスするには、下記のいずれかを行います。

• F1 を押します。

• ツールバーのをクリックします。

• ［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne ソフトウェアヘルプ）

を選択します。

ヘルプで関心トピックを見つけるには：

• 目次を確認します。

• トピックを指定して検索します。

• アルファベット順の索引を検索します。

文書 PN

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol

4375575


Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 4367218

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214


SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965

SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 4310251

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol 4351891


TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol 4371135

TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol 4371131

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol 4304449


Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note

127AP08

xii Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

序章

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• テクニカルサポートへの質問提出

• Applied Biosystems ユーザー文書、MSDS、その他の関連文書の注文

• PDF 文書のダウンロード

• ユーザートレーニングに関する情報入手

• ソフトウェアのアップデートやパッチのダウンロード

尚、技術的な質問を行うには、Applied Biosystems メンバーシップ会員として入会し、

ログインしていただく必要があります。

重要！本書に指示のある場合やStepOne™ またはStepOnePlus™ 装置のメンテナンス

（年次定期メンテナンスや温度確認／キャリブレーション）をスケジュールする際は、

Applied Biosystems PCR アドミにご連絡ください。 PCR アドミへは、お電話 0120-203-885までお問い合わせください。

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1-1Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

1はじめに

本章の内容：

StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

使用可能な消耗品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

実験の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

実験タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-8

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-9

1-2 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド


StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて

Real-Time PCR システムには、2 つのモデルがあります。

StepOne および StepOnePlus システムでは、蛍光ベースのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）

試薬を使って、次の機能を提供します。

• リアルタイム解析を使ったターゲット核酸配列（ターゲット）の定量検出

• PCR 後（エンドポイント）解析を使ったターゲットの定性検出

• PCR 生成物の定性解析（PCR 後の融解曲線解析による）

データ収集について StepOne および StepOnePlus システムは、実施する測定タイプに応じて、PCR 中に様々

なポイントで生の蛍光データを収集します。

測定タイプに関わらず、StepOne™ またはStepOnePlus™ 装置によるデータ収集ポイント

または読取は、3 相で構成されています。

1. 励起－装置内にある反応プレートのすべてのウェルを照射し、各反応でフルオロフォアを励起します。

2. 放射－装置の光学系は、反応プレートのウェルから放射された残留蛍光を収集します。装置で収集されたイメージは、放射波長の範囲に対応する光だけで構成されています。

3. 収集－装置は、一定時間内に収集された残留蛍光をデジタル表示します。StepOne™ ソフトウェアには、解析向けに生の蛍光イメージが保存されます。

システム特徴

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System（StepOne™ システム）

• 48 ウェルプラットフォーム

• 3 色システム

Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-Time PCR System（StepOnePlus™ システム）

• 96 ウェルプラットフォーム

• 4 色システム

• VeriFlex™ サンプルブロック

測定タイプデータ収集ポイント

リアルタイム測定

標準曲線法装置は、PCR の各伸長ステップ後にデータを収集します。

相対標準曲線法

比較 CT（∆∆CT）

PCR 後（エンドポイント）測定

ジェノタイピング実験

装置は、次のポイントでデータ収集を行います。

• PCR 前（有無実験の場合には、PCR 前のデータ収集はオプションですが、推奨されています。）

• （オプション）PCR 中。装置は、測定中（リアルタイム）にデータを収集できます。測定中のデータ収集は、トラブルシューティングに役立ちます。

• PCR 後

有無実験



測定後、StepOne ソフトウェアは、キャリブレーションデータ（空間、Dye、Background）を使って、各読取における蛍光信号の位置と強度、各蛍光信号に関与する色素、信号の

重要性を特定します。

フィルタについて StepOne および StepOnePlus システムでは、以下のフィルタを使用します。

VeriFlex™ 技術について

StepOnePlus 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、サーマル

サイクリング条件の最適化が容易です。 VeriFlex ブロックは、それぞれ異なる温度設定

をしてサンプルに応じて最高で 6 つのゾーンを作成することも、すべての VeriFlex ブ

ロックを同じ温度にすることも可能です。

詳細について本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™

Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、

ツールバーのをクリックするか、［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne Software ヘルプ）を選択します。

StepOne システム StepOnePlus システム

フィルタ色素フィルタ色素

1 FAM™ 色素 1 FAM™ 色素

SYBR® Green 色素 SYBR® Green 色素

2 JOE™ 色素 2 JOE™ 色素

VIC® 色素 VIC® 色素

3 ROX™ 色素 3 TAMRA™ 色素

NED™ 色素

4 ROX™ 色素



使用可能な消耗品

StepOne システム StepOne システムでは、以下に挙げる消耗品を使用できます。これらの消耗品は、標準

および高速試薬／プロトコルの両方で使用可能です。

重要！標準試薬を用いた実験でも、StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用消耗品（反応プレート、チューブストリップ、チューブ）以外は使用しないでください。

消耗品部品番号

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate• MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film

• 4375816

• 4375323 と4375928

• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

• 4358293• 4323032

• MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap • 4358297

• MicroAmp™ Fast 48-Well Tray• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor• MicroAmp™ 96-Well Support Base

• 4375282• 4375284• 4379590

G

A

C

D

C

F

B

C

# 消耗品

A MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

B MicroAmp™ Fast 48-Well Tray

C MicroAmp™ 96-Well Support Base

D MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

E MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip

F MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap

G MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film

H MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor

E

B

H H



StepOnePlusシステム

StepOnePlus システムでは、以下に挙げる消耗品を使用できます。これらの消耗品は、

標準および高速試薬／プロトコルの両方で使用可能です。

重要！標準試薬を用いた実験でも、StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用消耗品（反応プレート、チューブストリップ、チューブ）以外は使用しないでください。

消耗品部品番号

• MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode

• MicroAmp™ Optical Adhesive Film

• 4346906 と4366932

• 4360954 と4311971

• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

• 4358293• 4323032

• MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap • 4358297

• MicroAmp™ 96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks• MicroAmp™ 96-Well Support Base

• 4379983• 4379590

• MicroAmp™ Adhesive Film Applicator

• MicroAmp™ Cap Installing Tool（ハンドル）

• 4333183• 4330015

G

A

C

F

B

C

# 消耗品

A MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate

B MicroAmp™ 96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks

C MicroAmp™ 96-Well Support Base

D MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

E MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip

F MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap

G MicroAmp™ Optical Adhesive Film

D

C

E

B



実験の準備

一般的なワークフロー

StepOne および StepOnePlus システムで実験を行う前に、以下のように実験の準備を行

います。

1. 実験タイプの選択（1-7 ページ）。

2. 試薬タイプの選択（1-8 ページ）。

3. アッセイタイプの選択（1-9 ページ）。

本書中の情報本章には、StepOne および StepOnePlus システムで使用可能な実験タイプ、試薬タイプ

およびアッセイタイプに関する一般的な情報が記載されています。

続く各章には、具体的な情報が記載されています。

章説明

第 2 章「試薬の概要」 • TaqMan® 試薬と SYBR® Green 試薬に関する説明と比較

• DNA 汚染を最小限に抑える方法に関する情報

第 3 章「定量実験」 • 各実験タイプの機能に関する説明

• 各実験タイプに関する具体的なワークフローの説明

• 各アッセイタイプに関する設計ガイドラインの説明第 4 章「ジェノタイピング実験」

第 5 章「有無実験」



実験タイプの選択

本書では、実験という用語は、StepOne または StepOnePlus システムでの測定実施のプ

ロセス全体を指し、セットアップ、測定、解析を含みます。 StepOne および StepOnePlusシステムを用いて、以下のタイプの実験を実施できます。

• 次の方法による定量実験：

– 標準曲線法

– 相対標準曲線法

– 比較 CT（∆∆CT）

• ジェノタイピング実験

• 有無実験

参考： StepOne および StepOnePlus システムを用いて、融解曲線解析も実施できます。

詳細については、ツールバーのをクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフト

ウェアのヘルプにアクセスしてください。

エンドポイント実験対リアルタイム実験

3 種類の実験タイプは、以下に示すように、リアルタイム実験またはエンドポイント実

験として分類できます。

‡ Kwok and Higuchi, 1989.§ Saiki et al., 1985.

種類特徴実験タイプ

リアルタイム • 装置は、PCR の進捗状況をリアルタイムで監視します。‡

• データは、PCR プロセス全体を通して収集されます。

• サイクリング中にターゲットの増幅が最初に検出された時点で、反応の特徴づけが行われます。§

定量

エンドポイント

• データは、PCR プロセス終了後に収集されます。

• PCR の終了時に蓄積されたターゲット量によって、反応の特徴づけが行われます。

• データポイントは、レポーター色素のノーマライズ済み信号強度、すなわち Rn です。

参考：エンドポイント実験の中には、PCR 前のデータポイントを含むものもあります。その場合には、システムが以下の式により、delta Rn（∆Rn）値を計算します。

∆Rn = Rn（PCR後読み取り）– Rn（PCR前読み取り）

Rn は、ノーマライズ済みレポーター

ジェノタイピング

有無



試薬タイプの選択

StepOne および StepOnePlus システムでは、以下の試薬タイプ（ケミストリ）が使用可

能です。

• TaqMan® 試薬

• SYBR® Green 試薬

• その他の蛍光ベース試薬

TaqMan 試薬 TaqMan 試薬には、Applied Biosystems TaqMan® アッセイ（プローブとプライマーの

セットを含む調製済みミックス）および Applied Biosystems TaqMan® マスターミック

スがあります。TaqMan 試薬を用いて次のタイプの実験を実施できます。


– 標準曲線法




• 有無実験

重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして

StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ

ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。

SYBR Green 試薬 SYBR Green 試薬には、プライマーと SYBR® Green 色素を含有するマスターミックス

とが含まれています。SYBR Green 試薬を用いて、定量実験が実施できます。

• 標準曲線法

• 相対標準曲線法

• 比較 CT（∆∆CT）

参考： SYBR Green 試薬を用いてマルチプレックス PCR を実施することはできません。

詳細については、「シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択」（3-10 ペー

ジ）をご参照ください。

その他の試薬 StepOne および StepOnePlus システムでは、他の蛍光ベース試薬も使用できますが、

StepOne ソフトウェアをご使用の際には、以下の事項にご注意ください。

• ［Design Wizard］（設定ウィザード）ではなく、［Advanced Setup］（高度なセット

アップ）により、実験を設計する必要があります。

• Applied Biosystems TaqMan および SYBR Green 試薬を使用すると、StepOne ソ

フトウェアの［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面で自動的に反応量が計算

されます。



アッセイタイプの選択

StepOne ソフトウェアでは、定量、有無およびジェノタイピング実験で、以下のアッセ

イタイプを選択できます。

‡ 定量実験には、標準曲線法、相対標準曲線および比較 CT 法による実験が含まれます。

定量および有無実験

Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ

定量または有無実験で以下の試薬を使用している場合は、StepOne ソフトウェアで、

Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイタイプを選択します。

• TaqMan® Gene Expression Assays、Inventoried －設計済み FAM™ 色素ラベル

化 TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブとプライマーの既製品

セット。このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。

• TaqMan® Gene Expression Assays、Made to Order －設計済み FAM 色素ラベ

ル化 TaqMan MGB プローブとプライマーのセットで、注文後に製造されるもの。

このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。

• Custom TaqMan® Gene Expression Assays － FAM 色素ラベル化 TaqMan MGBプローブとプライマーのセットで、提示のあった配列情報に基づいて CustomTaqMan® Genomic Assays サービスが設計、合成、調製したもの。このアッセイ

ミックスは、1 本の調製済み 20✕ または 60✕ チューブに入っています。

参考： StepOne ソフトウェアでアッセイタイプを選択するには、［Design Wizard］（設

計ウィザード）または［Advanced Setup］（高度なセットアップ）から［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］（アッセイタイプ）ドロップダウンメ

ニューで［Inventoried/Made to Order］（在庫／注文生産）を選択します。

カスタムアッセイ

Primer Express® SoftwareとTaqManまたはSYBR Green試薬を用いて独自のアッセイ

（プライマーとプローブ）を設計している場合、定量および有無実験には、StepOne ソフ

トウェアで［Custom］（カスタム）アッセイタイプを選択します。独自のアッセイを設

計する際には、最善の結果を得るために Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドライ

ンに従ってください。




参考： StepOne ソフトウェアでアッセイタイプを選択するには、［Design Wizard］（設

計ウィザード）または［Advanced Setup］（高度なセットアップ）から［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］（アッセイタイプ）ドロップダウンメ

ニューで［Custom］（カスタム）を選択します。

実験タイプアッセイタイプ参照

定量 ‡ • Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）

• カスタム

下記

有無

ジェノタイピング • 設計済み／検証済み

• カスタム

• ユーザー設計

1-10 ページ




設計済み／検証済みアッセイ

ジェノタイピング実験では、設計済み／検証済みアッセイタイプには、次の試薬が含ま

れます。

• TaqMan® SNP Genotyping Assays －設計済みFAM™色素およびVIC®色素ラベ

ル化 TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブとプライマーのセッ

トで、TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays として販売されています。

TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assays は、注文後に製造します（Made toOrder）。このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。

• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays －設計済み FAM 色素および VIC色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーの既製品セット（Inventoried）。このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。

• Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination（TaqMan®

PDARs for AD）－設計済み FAM 色素および VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プ

ローブとプライマーの既製品セット（Inventoried）。このアッセイミックスは、1本の調製済み 10✕ チューブに入っています。

参考： StepOne ソフトウェアで SNP アッセイを選択するには、［Design Wizard］（設計

ウィザード）の［SNP Assays］（SNP アッセイ）画面または［Advanced Setup］（高度

なセットアップ）の［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面を開きます。［SNPAssays］（SNP アッセイ）画面または［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面

で、ライブラリからアッセイを選択するか、または新たにアッセイを作成します。


ジェノタイピング実験では、カスタムアッセイタイプには、Custom TaqMan® SNPGenotyping Assays が含まれます。Custom TaqMan SNP Genotyping Assays は、FAM色素および VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーのセットで、提示の

あった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assays サービスが設計、合成、

調製したものです。このアッセイミックスは、1 本の調製済み 40✕ または 80✕ チューブ

に入っています。





ユーザー設計アッセイ

SNP アッセイ用プライマーとプローブを独自に設計したい場合には、『Primer Express®

Software Version 3.0 Getting Started Guide』をご参照ください。





2試薬の概要

本章の内容：

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

TaqMan® 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

SYBR® Green 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

適切な試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6

DNA 汚染の最小限化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7



概要

Applied Biosystems では、Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems で PCR 生成物を検出するために、2 種類の試薬（ケミストリ）を開

発しました。

• TaqMan® 試薬（下記）

• SYBR® Green 試薬（2-4 ページ）

TaqMan® 試薬

実験タイプ TaqMan® 試薬には、Applied Biosystems TaqMan® アッセイ（プローブとプライマーの

セットを含む調製済みミックス）および Applied Biosystems TaqMan® マスターミック

スがあります。アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスに

は、PCR 反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。TaqMan試薬を用いて次のタイプの実験が実施できます。


– 標準曲線法




• 有無実験




TaqMan 試薬の開発

当初、リアルタイム PCR 生成物を測定する際には、インターカレータ色素が用いられて

いました。この検出方法の大きな弱点は、蓄積される PCR 生成物は特異的なものも非特

異的なものも、両方検出してしまうことでした。

そこで、Taq DNA ポリメラーゼの 5′ ヌクレアーゼ活性を用いた蛍光ラベルプローブを

導入することによって、PCR 用リアルタイムシステムの改良を行いました。このような

蛍光プローブが利用可能となったことにより、特異的な増幅生成物のみを検出するリア

ルタイム検出法が開発されたのです。

TaqMan 試薬の仕組み

TaqMan 試薬は、蛍光プローブを使って、PCR 中に蓄積する特定の PCR 生成物を検出

します。その仕組みは、以下のとおりです。

ステップ 1 －オリゴヌクレオチドの 5′ 末端に蛍光レポーター色素を、3′ 末端にはクエ

ンチャーを結合させて、オリゴヌクレオチドプローブを作成します。

ステップ 2 －プローブがインタクトな間は、クエンチャーは、その近傍では、蛍光共鳴

エネルギー移動（FRET、Förster 共鳴、Förster, V. T. 1948）により、レポーター色素

から放射される蛍光を吸収します。



ステップ 3 －ターゲットが存在すると、プローブは、プライマーサイト間でアニーリン

グし、伸長反応中に Taq DNA ポリメラーゼの 5′ ヌクレアーゼ活性により遊離します。

プローブの開裂により以下のことが起こります。

• レポーター色素は、クエンチャーから遊離され、レポーター色素信号が増加します。

• ターゲット鎖からプローブが遊離され、鋳型鎖の末端までプライマー伸長が起こり

ます。このように、プローブを入れても、PCRプロセスの抑制は、全く起こりません。

ステップ 4 －各サイクルにおいて、より多くのレポーター色素分子がそれぞれのプロー

ブから遊離するため、その蛍光強度は、生成するアンプリコン量に比例して増加します。

核酸ターゲットの開始コピー数が大きいほど、蛍光の大幅な上昇が早く観察されます。

図 2-1 に、このプロセスを図示します。

図 2-1 TaqMan 試薬の仕組み

TaqMan® プローブ Applied Biosystems は、次の 2 種類の TaqMan® プローブを提供しています。

• 非蛍光クエンチャー（NFQ）を含む TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）

プローブ

• TAMRA™ 色素をクエンチャーとして含む TaqMan® プローブ

重要！ Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして



ステップ 1：レポーター（R）とクエンチャー（Q）が、TaqMan®プローブの5′ および 3′ 末端に結合しています。

ステップ3：各伸長ステップの際に、Taq DNA ポリメラーゼは、レポーター色素をプローブから遊離させます。

ステップ4：クエンチャーから遊離すると、レポーター色素は、特徴的な蛍光を発します。

ステップ 2：両ラベルがプローブに結合しているとき、レポーター色素の蛍光がクエンチされます。



Applied Biosystems では、StepOne および StepOnePlus システム用に、以下の TaqManプローブを提供しています。

TaqMan MGB プローブの推奨

Applied Biosystems では、通常の TaqMan プローブでヌクレオチド数が 30 を超える場

合には、TaqMan MGB プローブの使用をお勧めします。 TaqMan MGB プローブは、以

下を含みます。

• 5′ 末端に結合した蛍光レポーター色素－ Taq DNA ポリメラーゼの 5′ ヌクレアー

ゼ活性により遊離して、信号を発生します。

• 3′ 末端に結合した非蛍光クエンチャー（NFQ）－クエンチャーは蛍光を発生しな

いため、リアルタイム PCR システムにおいて、レポーター色素の作用を TAMRA色素よりも正確に測定することができます。

• 3′ 末端に結合したマイナーグルーブバインダー（MGB）－プローブの長さを増す

ことなく、融解温度（Tm）を高くできるため（Afonina et al., 1997; Kutyavin et al.,1997）、長さが短いプローブの設計が可能となります。その結果、TaqMan MGB プ

ローブによって、一致プローブと不一致プローブで Tm 値に大きな差が生じます。

Tm 値の差が大きいほど、正確なジェノタイピングを行うことができます。

SYBR® Green 試薬

実験タイプ SYBR® Green 試薬には、プライマーと SYBR® Green 色素を含有するマスターミック

スとが含まれています。SYBR Green 試薬を用いて、定量実験が実施できます。

• 標準曲線法



参考： SYBR Green 試薬を用いてマルチプレックス PCR を実施することはできません。

詳細については、「シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択」（3-10 ペー


プローブアッセイ 5′ ラベル色素 3′ ラベル色素 MGB? システム

TaqMan® MGBプローブ

TaqMan® Gene Expression Assays

FAM™ 色素 NFQ あり StepOne およびStepOne Plusシステム

TaqMan® SNP Genotyping Assays

FAM™ およびVIC® 色素

TaqMan® MGBプローブ

Custom TaqMan® Gene Expression Assays

FAM™ 色素

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays

FAM™ およびVIC® 色素

Custom TaqMan® MGB プローブ

カスタムアッセイ FAM™、TET™、NED™ またはVIC® 色素

Custom TaqMan®

プローブカスタムアッセイ FAM™、TET™

またはVIC®色素TAMRA™ 色素なし StepOnePlus

システム



SYBR Green 試薬の開発

二本鎖 DNA に結合する低分子には、DNA にインターカレートするものと DNA マイ

ナーグローブに結合するものの 2 種類があります。ヒグチ（Higuchi et al., 1992）は、

インターカレータである臭化エチジウムを用いて、PCR のリアルタイム検出を行いまし

た。Hoechst 33258 は、二本鎖 DNA に結合すると蛍光が増加するマイナーグローブ結

合色素の一例です（Higuchi et al., 1993）。

PCR 生成物をリアルタイムで検出するために用いる DNA 結合色素に関しては、結合方

法にかかわらず、少なくとも 2 つの要件があります。

• 二本鎖 DNA に結合すると蛍光が増加すること。

• PCR を抑制しないこと。

Applied Biosystems では、SYBR® Green I Dye を用いて、PCR を抑制せず、かつ臭化

エチジウムよりも検出感度が高くなる条件を開発しました。

SYBR Green 試薬の仕組み

SYBR Green 試薬は、SYBR Green I Dye が PCR 中に生成する二本鎖 DNA に結合する

ことによって、PCR 生成物を検出します。その仕組みは、以下のとおりです。

ステップ 1 － SYBR Green I Dye をサンプル中に加えると、すべての二本鎖 DNA と即

座に結合します。

ステップ 2 － PCR 中、AmpliTaq Gold® DNA Polymerase は、ターゲットを増幅し、

PCR 生成物、すなわち、「アンプリコン」を生成します。二本鎖 DNA が変性すると、一

本鎖分子となり、SYBR Green I Dye が解離します。

ステップ 3 －プライマーは一本鎖 DNA とアニーリングして、AmpliTaq Gold DNAPolymerase はターゲットを増幅し、二本鎖 DNA を生成します。PCR が進行するにつれ

て、アンプリコンが更に生成されます。

ステップ 4 － SYBR Green I Dye は、各 PCR サイクル中に生成した新しい二本鎖 DNAの各コピーに結合します。SYBR Green I Dye は全二本鎖 DNA に結合するため、その

結果、生成される二本鎖 PCR 生成物の量に比例して、蛍光強度が増加します。

図 2-2 に、このプロセスを図示します。

図 2-2 SYBR Green 試薬の仕組み



適切な試薬タイプの選択

TaqMan および SYBR Green 試薬は、以下に掲げる実験タイプに使用できます。

‡ 定量実験には、標準曲線法、相対標準曲線法および比較 CT 法による実験が含まれます。




定量実験に際する留意事項

定量実験は、TaqMan 試薬、SYBR Green 試薬のどちらでも行うことができます。2 種

類の試薬タイプを選択するに当たっては、以下の事項に留意してください。

実験タイプ

試薬タイプ定量 ‡

（第 3 章）ジェノタイピング

（第 4 章）有無

（第 5 章）

SYBR® Green 試薬適切推奨しない推奨しない

TaqMan® 試薬適切適切適切

試薬タイプ説明特長制限

TaqMan®

試薬TaqMan 試薬は、蛍光プローブを使って、PCR サイクル中に蓄積する特定の PCR 生成物を検出します。

• 蛍光プローブの追加による高い配列特異性。

• マルチプレックス法に対応。

• 広範なサーマルサイクリング条件に最適化した、調製済みアッセイを使用可能。

• 1 ステップおよび 2 ステップRT-PCR 両方に利用可能。

特異的な蛍光プローブを合成する必要あり。

SYBR® Green試薬

SYBR Green 試薬は、SYBR®

Green I Dye（二本鎖 DNA 結合色素）を使い、PCR サイクル中に蓄積する PCR 生成物を検出します。

• 経済的（プローブ不要）。

• 融解曲線で PCR 生成物の Tmを測定可能。

• 1 ステップおよび 2 ステップRT-PCR 両方に利用可能。

すべての二本鎖 DNA シーケンスに非特異的に結合します。偽陽性信号の発生を避けるため、融解曲線またはゲル解析を使って、非特異的生成物の形成を確認してください。



DNA 汚染の最小限化

PCR プロセスには DNA 増幅作用があるため、TaqMan 試薬や SYBR Green 試薬を用いて実験を行う際には、特別な配慮が必要となります。DNA 濃度が高いサンプルの場合には、DNA テンプレートコントロールや PCR キャリーオーバーによる汚染が発生する可能性があります。

更に、SYBR Green I Dye は非特異的なので、二本鎖 DNA は、すべて検出されます。

SYBR Green 試薬を使用する際には、融解曲線またはゲル解析を使って、非特異的生成

物の形成を確認してください。ターゲット DNA に汚染が生じない配慮が必要です。エ

クソン－エクソン結合部に広がる遺伝子発現アッセイは、gDNA（ゲノム DNA）汚染物

による影響を最小限にします。

UNG によるキャリーオーバー生成物再増幅の

最小限化

AmpErase® ウラシル -N- グリコシラーゼ（UNG）は、26-kDa の遺伝子組み換え酵素で

あって、Escherichia coli ウラシル -N- グリコシラーゼ遺伝子でエンコードされていま

す。この遺伝子は、E. coli ホストに挿入され、この酵素の天然型を発現します（Kwokand Higuchi, 1989）。

UNG は、dU が含まれている一本鎖および二本鎖 DNA に作用します。UNG は、dU を

含む DNA 部位で、ウラシル－グリコシド結合を加水分解します。この酵素によりウラ

シルが遊離し、DNA 中にアルカリ感受性のある無塩基部位が生成されます。この酵素

は、RNA や dT を含む DNA には作用しません（Longo et al., 1990）。

TaqMan アッセイ

TaqMan® アッセイでは、AmpErase® UNG 処理により、前回行った PCR 反応からのキャ

リーオーバー PCR 生成物の再増幅を防止できます。PCR 増幅において dTTP の代わり

に dUTP を用いると、AmpErase UNG 処理によって、アンプリコンを 50 µL 反応液当

たり 200,000 コピーまで除去できます。

参考： AmpErase UNG（ウラシル -DNA- グリコシラーゼ、UDG とも略す）は、一部

の Applied Biosystems TaqMan マスターミックスには含まれていますが、別途購入する

ことも可能です。 TaqMan マスターミックスを購入する場合には、製品情報をチェック

して、マスターミックスに AmpErase UNG が含まれるかどうかを確認してください。

SYBR Green I Dye アッセイ

SYBR Green I Dye アッセイでは、AmpErase UNG 処理により、前回行った PCR 反応

からのキャリーオーバー PCR 生成物の再増幅を防止できます。Power SYBR® GreenPCR Master Mix や SYBR® Green PCR Master Mix には AmpErase UNG が含まれま

せんが、dUTP を含むため AmpErase UNG と互換性があります。PCR キャリーオーバー

による汚染が考えられる場合には、AmpErase UNG を用いて問題の解決を行ってくださ

い。

参考： AmpErase UNG は、単品でお求めになることもできますが、SYBR® Green PCRCore Reagents Kit にも入っています。



PCR 実施上の一般的留意事項

以下の事項に留意して、サンプル汚染や PCR 生成物のキャリーオーバーを防止してください。

• PCR 増幅用サンプルを調製する際には、清潔な実験着と手袋（増幅 PCR 生成物を

取り扱った際やサンプル調製の際に着用していなかったもの）を着用すること。汚

染が疑われる場合には、手袋を必ず交換します。

• 以下の操作用として、専用の区域および機器類を使用すること。

– サンプル調製。

– PCR セットアップ。PCR セットアップ区域には増幅 PCR 生成物を決して持ち

込まないこと。

– PCR 増幅。

– PCR 生成物の解析。

• サンプルチューブの開閉は、細心の注意を払って行うこと。PCR サンプルの飛沫が

飛び散らないように注意すること。

• フィルター付チップを装着するポジティブディスプレイスメントピペッターやエ

アーディスプレイスメントピペッターを使用すること。チップは、使用のたびに交

換すること。

• 反応液やコンポーネントは、できるだけ蓋をすること。

• 実験台や装置は、10% 次亜塩素酸ナトリウム溶液または 70% エタノールで定期的

に拭き取ること。


3定量実験

本章の内容：

セクション 3.1 定量実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

セクション 3.2 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15





セクション 3.1 定量実験について

本セクションの内容：

概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4

定量方法の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8

シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10

試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12



概要

定量実験とは？定量実験とは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の各増幅サイクルにおいて、ターゲット

核酸配列（ターゲット）の量を測定するリアルタイム実験です。ターゲットは、DNA、

cDNA、RNA です。

本書では、次の 3 タイプの定量実験について説明します。

• 標準曲線法（3-5 ページ）

• 相対標準曲線法（3-5 ページ）

• 比較 CT（∆∆CT）法（3-6 ページ）

定量実験の仕組みリアルタイム定量実験では、一定のサイクル終了後までに蓄積した PCR 生成物の最終量

ではなく、サイクル中において PCR 生成物の増幅が所定の蛍光レベルに到達した時点で

反応の特徴づけが行われます。増幅プロットには、実施したサイクル数にわたって検出

された蛍光度の変化が図示されます。

PCR の初期サイクルでは、蛍光信号は、ほとんど変化しません。この一定範囲の PCRサイクルを、ベースラインと呼びます。ソフトウェアは、まず、ノーマライズ済み蛍光

レポーター信号（ベースラインサイクルに対応する Rn 値）に数式を当てはめることに

よって、ベースライン差分増幅プロットを作成します。次に、アルゴリズムによって、

ベースライン修正したノーマライズ済み蛍光レポーター信号（delta Rn［∆Rn］値）が指

定した閾値と増幅プロットにおいてクロスする点を検出します。 ∆Rn 値が閾値とクロス

するサイクル数を CT と定義します。

ワークフロー Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems で定量実

験を行う前に、以下のように実験の準備を行います。

1. 定量方法を選択します（3-5 ページ）。

2. 1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR を選択します（3-8 ページ）。

3. シングルプレックス PCR 反応またはマルチプレックス PCR 反応を選択します（3-10ページ）。

4. 試薬タイプを選択します（3-12 ページ）。

5. アッセイタイプを選択します（3-12 ページ）。

6. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 3.2（15 ページ））。



定量方法の選択

標準曲線実験について

標準曲線法は、サンプルに含まれるターゲットの絶対量を特定する際に用います。標準

曲線法では、StepOne ソフトウェアにより、サンプルおよびスタンダード希釈シリーズ

中に含まれるターゲットの増幅を測定します。標準希釈シリーズのデータを使用して標

準曲線を作成します。ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプル中ターゲットの絶

対量を外挿します。

コンポーネント

標準曲線実験用に PCR 反応をセットアップするには、次のコンポーネントが必要です。

• サンプル – ターゲットの量が未知のサンプル。

• スタンダード – 既知量のスタンダードを含むサンプル。定量実験で使用して標準曲線を作成します。

• スタンダード希釈シリーズ – ある範囲の既知量のスタンダードからなるセット。スタンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。

• 反復 – 同一サンプル、同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。

• ネガティブコントロール – サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりません。

相対標準曲線実験について

相対標準曲線法は、サンプルに含まれるターゲットの相対量を特定する際に用います。

相対標準曲線法では、StepOne ソフトウェアにより、サンプル、リファレンスサンプル、

標準希釈シリーズ中に含まれるターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。

測定結果は、内在性コントロールによりノーマライズされます。標準希釈シリーズのデー

タを使用して標準曲線を作成します。ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプルお

よびリファレンスサンプル中のターゲット量を外挿します。ソフトウェアは、各サンプ

ル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のターゲット量とを比較することによ

り、各サンプル中ターゲットの相対量を決定します。

相対標準曲線実験は、通常以下の目的で使用します。

• 異なる組織に含まれる遺伝子の発現レベルの比較。

• 処置サンプルと未処置サンプルにおける遺伝子の発現レベルの比較。

• 野生型アレルと突然変異したアレルの発現レベルの比較。


相対標準曲線実験用に PCR 反応をセットアップする際には、次のコンポーネントが必要

です。

• サンプル – ターゲット量が未知のサンプル。

• リファレンスサンプル – 相対定量の基準として用いるサンプル。例えば、遺伝子発現に及ぼす薬剤の作用を調べる場合には、未処置の対照サンプルをリファレンスサンプルとします。「キャリブレータ」とも呼ばれます。

• スタンダード – 既知量のスタンダードを含むサンプル。定量実験で使用して標準曲線を作成します。

• スタンダード希釈シリーズ – ある範囲の既知量のスタンダードからなるセット。スタンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。



• 内在性コントロール – 実験中のすべての試験サンプルで、同様のレベルで発現するターゲットまたは遺伝子。内在性コントロールを用いて、定量するターゲットの蛍光シグナルをノーマライズします。ハウスキーピング遺伝子は、内在性コントロールとして使用できます。

• 反復 – 同一サンプル、同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。

• ネガティブコントロール – サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりません。

比較 CT 実験について

比較 CT（∆∆CT）法は、サンプルに含まれるターゲットの相対量を特定する際に用いま

す。比較 CT 法では、StepOne ソフトウェアにより、サンプルやリファレンスサンプル

中のターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コント

ロールによりノーマライズされます。ソフトウェアは、各サンプル中のターゲット量と

リファレンスサンプル中のノーマライズ済みターゲット量とを比較することにより、各

サンプル中ターゲットの相対量を決定します。

比較 CT 実験は、通常以下の目的で使用します。

• 異なる組織に含まれる遺伝子の発現レベルの比較。

• 処置サンプルと未処置サンプルにおける遺伝子の発現レベルの比較。

• 野生型アレルと突然変異したアレルの発現レベルの比較。


比較 CT 実験用に PCR 反応をセットアップする際には、次のコンポーネントが必要です。

• サンプル－ターゲット量が未知のサンプル。

• リファレンスサンプル－相対定量の基準として用いるサンプル。例えば、遺伝子発現に及ぼす薬剤の作用を調べる場合には、未処置の対照サンプルをリファレンスサンプルとします。「キャリブレータ」とも呼ばれます。

• 内在性コントロール－実験中のすべての試験サンプルで、同様のレベルで発現するターゲットまたは遺伝子。内在性コントロールを用いて、定量するターゲットの蛍光シグナルをノーマライズします。ハウスキーピング遺伝子は、内在性コントロールとして使用できます。

• 反復－同一サンプル、同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。

• ネガティブコントロール－サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりません。



定量方法の比較以下の記載に基づいて、標準曲線実験、相対標準曲線実験、比較 CT 実験の選択を行っ

てください。

詳細について定量法の詳細については、『User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression』をご参照ください。

実験タイプ説明特長制限

標準曲線法標準曲線を用いて、サンプル中のターゲットの絶対量を決定します。ウイルス量の定量が代表的な使用例です。

既知のスタンダード量に対して比較を行います。

標準曲線実験では、各ターゲットについて標準曲線の作成が必要となるため、反応プレートに必要となる試薬とスペースが増えます。

相対標準曲線法標準曲線を用いて、リファレンスサンプル中の核酸配列に対して、試験サンプル中のターゲットの発現がどのように変化したかを決定します。PCR 増幅効率が低いアッセイに最適です。

ターゲットと内在性コントロールとで PCR 増幅効率が等しい必要がないため、検証が容易です。

相対標準曲線実験では、各ターゲットについて標準曲線の作成が必要となるため、反応プレートに必要となる試薬とスペースが増えます。

比較 CT（∆∆CT）数式を用いて、リファレンスサンプル中の核酸配列に対して、試験サンプル中のターゲットの発現がどのように変化したかを決定します。実験サンプル数が多く、遺伝子数も多い場合に、相対発現頻度を測定するハイスループット測定に最適です。

• ターゲットと内在性コントロールのPCR増幅効率がほぼ等しい場合には、実験サンプル中のターゲットの相対量を、標準曲線を用いないで決定できます。

• 試薬量を節約できます。

• 反応プレートに空きが増えます。

• PCR 増幅効率が低い場合には、結果が不正確になることがあります。

• 弊社では、比較 CT 法を実施する前に、ターゲットアッセイと内在性コントロールアッセイとでPCR増幅効率がほぼ等しいことを確認されるようお勧めします。



1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択

逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、RNA の定量に用います。PT-PCR は、1ステップおよび 2 ステップで実施できます。

1 ステップ RT-PCRについて

1 ステップ RT-PCR では、逆転写と PCR とを同一のバッファー系で行います（図 3-1）。この反応では、RT ステップと PCR ステップとの間に試薬を追加する必要がありません。

1 ステップ RT-PCR では、RT と PCR 増幅のための調製を 1 本のチューブで行えるため

便利です。ただし、1 ステップ RT-PCR では、キャリーオーバー防止用酵素である

AmpErase® ウラシル -N- グリコシラーゼ（UNG）を使用できません。1 ステップ RT-PCR で UNG が存在すると、cDNA は、生成する一方で分解されてしまいます。UNGの詳細については、「UNG によるキャリーオーバー生成物再増幅の最小限化」（2-7 ペー


図 3-1 1 ステップ RT-PCR の概略図

2 ステップ RT-PCRについて

2 ステップ RT-PCR では、RT と PCR とを別個の反応に分けて実施します（図 3-2）。2ステップ RT-PCR は、1 つの cDNA 反応液から複数のトランスクリプトを検出したり、

後日使用するために cDNA の一部を貯蔵しておくのに便利です。dUTP を塩基として用

いて PCR を行う場合には、AmpErase® UNG 酵素を用いて、キャリーオーバー汚染を

防止できます。UNG の詳細については、「UNG によるキャリーオーバー生成物再増幅

の最小限化」（2-7 ページ）をご参照ください。

単一チューブ



図 3-2 2 ステップ RT-PCR の概略図

cDNA 合成に用いるプライマー

1 ステップ RT-PCR では、配列特異的リバースプライマーを cDNA 合成に利用できます。

2 ステップ RT-PCR では、以下のプライマーを cDNA 合成に利用できます。

• オリゴ d(T)16

• ランダムプライマー

• 配列特異的リバースプライマー

最適な逆転写用プライマーは、これらの 3 種類のプライミングシステムを実験により評

価して選ぶことができます。ヘアピンループが存在しない短い RNA 配列の場合には、こ

れらの 3 種類のプライミングシステムは、すべて等しい効果を示します。長い RNA ト

ランスクリプトやヘアピンループを含む配列の場合には、以下のガイドラインに従って

ください。

RT-PCR 法の比較

チューブ 1

チューブ 2 PCR ステップ

オリゴ d(T) またはランダムヘキサマー

プライマー選択ガイドライン

オリゴ d(T)16 • 真核生物のmRNAやpoly-Aテールを有するレトロウイルスの逆転写のみに用いる。

• 長い mRNA トラスクリプトや poly-A 部位から上流 2 キロベースを超えるアンプリコンは避ける。

ランダムプライマー • 先ず、長い逆転写物やヘアピンループを含む逆転写物で試してみる。

• 全 RNA（rRNA、mRNA、tRNA）の転写に用いる。

配列特異的リバースプライマー

• RNA を含む相補的配列の逆転写のみに用いる。

• 1 ステップ RT-PCR で用いる。

方法 cDNA 合成に用いるプライマーコメント

1 ステップRT-PCR

配列特異的リバースプライマー単一の反応ミックスでよい。

AmpErase® UNG は使用不可。

2 ステップRT-PCR

ランダムヘキサマー cDNA を貯蔵して、後で利用可能。

AmpErase® UNG を使用可能。

2 つの反応ミックスが必要。オリゴ d(T)16

配列特異的リバースプライマー



シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択

PCR 反応は、次のいずれかで実施できます。

• シングルプレックス PCR – シングルプレックス PCR では、反応チューブまたはウェルにはプライマーセットが 1 つだけ存在します。反応ごとにターゲットまたは内在性コントロールを 1 つだけ増幅できます。

または

• マルチプレックス PCR – マルチプレックス PCR では、反応チューブまたはウェル

にプライマーセットが複数存在します。各セットが、特定のターゲットまたは内在

性コントロールを増幅します。通常は、FAM™ 色素でラベルしたプローブは、ター

ゲットを検出し、VIC® 色素でラベルしたプローブは、内在性コントロールを検出

します。

重要！ SYBR® Green 試薬は、マルチプレックス PCR には使用できません。

重要！ Applied Biosystemsは、TAMRA™色素をレポーターやクエンチャーとして

StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使えます。

図 3-3 シングルプレックス PCR 対マルチプレックス PCR

マルチプレックスPCR について

マルチプレックス PCR を実施する際には、次の点にご注意ください。

• すべての条件下において、選択した内在性コントロールが定量しようとしている全

てのターゲットと比較して量が多い（CT 値が低い）ことを確認します。

• 内在性コントロールアッセイをプライマー制限アッセイとして測定します。各反応

中の内在性コントロールアッセイ（量が多いテンプレート）については、プライ

マー量を制限して、競合的 PCR によって量が少ないテンプレートの CT に影響が出

ないようにしなければなりません。

マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限

正確なマルチプレックスアッセイを行うためには、ある種類の増幅が他の種類の増幅を

大きく超えないことが重要になります。そうでないと、量の多い種類の増幅によって、

量の少ない種類の増幅がうまく起こらなくなります。

量の少ない種類がうまく増幅しない場合、実験結果が不正確になったり、最悪の場合に

は量の少ない種類がまったく検出されないことも起こります。このような状況を防ぐに

は、量の多い種類を増幅するプライマー濃度を制限して、CT に到達後に増幅を停止する

ことが必要となります。しかし、プライマー制限アッセイは、ノーマライズを行ってい

るプライマー非制限アッセイとくらべて、反応条件が不安定になる恐れがあります。詳

細については、付録 B「マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限」をご参照く

ださい。



シングルプレックス対マルチプレックス

PCR

定量するターゲット数が増加するにつれて、マルチプレックス PCR におけるプライマー

制限の複雑さが増します。複数のターゲットを解析する際、次のような理由からシング

ルプレックス PCR を用いる方が効果的な場合もあります。

• マルチプレックス PCR では、次の条件を満たす適切な内在性コントロールを見つ

けるのが困難です。

– 定量しようとしているどのターゲットよりも量が多い。

– 実験条件やサンプルの違いによって、発現レベルが変化しない。

最初にマルチプレックスおよびシングルプレックスフォーマットでターゲット

アッセイと内在性コントロールアッセイをすべて測定した後、両フォーマットによ

る CT 値の比較を行って、マルチプレックスが CT 値に影響を及ぼしていないかを

調べます。

• シングルプレックス PCR では、実験条件やサンプルの違いによって発現レベルが

変化しないターゲットを、内在性コントロールとして用いることができます。それ

ゆえ、シングルプレックスフォーマットでターゲット数が多いほど、残りのター

ゲットを比ノーマライズするための適切な内在性コントロールが 1 つ以上見つかる

確率が高くなります。

マルチプレックス PCR とシングルプレックス PCR の選択に当たっては、以下の事項に

留意してください。

PCR 説明特長制限

シングルプレックス

反応チューブまたはウェル内で、一種類のターゲットまたは内在性コントロールの増幅が起こる反応。

• TaqMan® アッセイに最適化は不要。

• 実験条件やサンプルの違いによって発現レベルが変化しないターゲットを内在性コントロールとして利用可能。

• TaqMan® 試薬と SYBR® Green 試薬のどちらも選択できる柔軟性。

• ターゲットと内在性コントロールとの両方にサンプルが必要。

マルチプレックス

反応チューブまたはウェル内で、複数のターゲットまたは内在性コントロールの増幅が起こる反応。

• 稼働コストおよび 2 本のチューブにサンプルを分ける際の正確な分注操作に対する依存度を低減。

• 内在性コントロールアッセイをプライマー制限アッセイとして測定する必要あり。

• 最適化と検証の必要あり。

• 複数のターゲットを解析する場合には、シングルプレックス PCR よりも効率が悪い。

• SYBR®Green 試薬の使用は不可。



試薬タイプの選択

TaqMan 試薬対 SYBR Green 試薬

StepOne および StepOnePlus システムでは、以下の試薬を用いて定量実験を実施できま

す。

• TaqMan® 試薬


TaqMan 試薬と SYBR Green 試薬の選択については、「定量実験に際する留意事項」（2-6ページ）をご参照ください。


StepOne ソフトウェアで実験を設計する場合には、定量実験として、以下のアッセイタ

イプを選択できます。

• Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）（3-13 ページ）

• カスタム（3-14 ページ）

本セクションでは、各アッセイタイプに利用可能な製品をリストします。

参考：アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスには、PCR反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。



Inventoried/Madeto Order

（在庫／注文生産）アッセイ




Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイを用いて実験を設計する際のガ

イドラインについては、（3-16 ページ）をご参照ください。

製品属性


• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子用の調製済み遺伝子特異的プライマーとプローブのセット

• プローブは、FAM™ 色素ラベル MGB プローブ

• 便利な単一の 20✕ チューブで提供

• Inventoried（在庫）または Made to Order（注文生産）アッセイとして入手可能

TaqMan® Endogenous Control Assays

参考：FAM™ 色素ラベル化

TaqMan® Endogenous Control Assays は、Inventoried TaqMan Gene Expression Assays として

含まれています。

• 最適化、調製済み、そのまま使用可能な内在性コントロールアッセイ

• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila およびあらゆる真核生物種用のコスト効果が高い遺伝子発現定量

• FAM™ 色素と VIC® 色素ラベルの選択が可能（プライマー制限）


• あらゆる種または生物

• 自由にターゲットを選択



TaqMan® Gene Expression Master Mix

リアルタイム PCR により、通常の実験や特殊な実験で正確な定量を行う場合に使用

• ターゲットの 1 コピーまで検出する優れた検出精度

• 1回の反応中に含まれる2つのターゲットを一緒に増幅するマルチプレックス PCR

• 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特異性

• TaqMan® Gene Expression Assays により検証済み

• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素化

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix （withまたはwithout AmpErase® UNG）

• cDNAまたはDNAをテンプレートに用いるTaqMan®アッセイで最適性能を発揮

• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む

• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施プロセスを簡素化

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• 上記の TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix と同じ属性

• StepOne™ および StepOnePlus™ システムで約 35 分で定量実験が終了







カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、（3-21 ページ）

をご参照ください。

製品属性

カスタム TaqMan® プローブとプライマー


• 色素ラベル、クエンチャーおよび合成スケールを自由に選択

• Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い、Primer Express® Software で使用

Primer Express® Software リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを設計するソフトウェア






• Custom TaqMan® Gene Expression Assays により検証済み





• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施プロセスを簡素化

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• 上記の TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix と同じ属性

• StepOne™ および StepOnePlus™ システムで約 35 分で定量実験が終了

Power SYBR® Green PCR Master Mix

• 高感度定量法により、低コピー数の検出が可能（2 コピーのターゲット遺伝子も検出）

• 二本鎖 DNA を検出、特異的プローブは不要

• 高精製 AmpliTaq Gold® DNA Polymerase LD を含有し、非特異的生成物（プライマーダイマーを含む）の形成を最小限化

• Applied Biosystemsのアッセイ設計ガイドラインに従い、PrimerExpress® Software で使用

SYBR® Green PCR Master Mix

• 二本鎖 DNA を検出、特異的プローブは不要

• 高感度な検出が不要の場合には標準的に使用

• AmpliTaq Gold® DNA Polymerase を含有し、非特異的生成物（プライマーダイマーを含む）の形成を最小限化

• Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い、PrimerExpress® Software で使用



セクション 3.2 設計ガイドライン


Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16

TaqMan® Gene Expression Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-19

実験の設計. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

Primer Express® Software を使ったプライマーとプローブの設計 . . . . . . . . . . 3-21

試薬の選択. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-24

推奨サーマルサイクリング条件の使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-27

プライマー濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30

プローブ濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-33

詳細について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35




ワークフロー StepOne™ ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択する場合、

Applied Biosystems は、以下のワークフローをお勧めします。

1. アッセイを選択します。

• TaqMan® Gene Expression Assays（下記）

• Custom TaqMan® Gene Expression Assays（3-18 ページ）

2. マスターミックスを選択します（3-19 ページ）。

3. StepOne ソフトウェアを用いて実験を設計します（3-20 ページ）。


製品の説明 TaqMan® Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子の定量実験を

行うために開発された、Inventoried/Made to Order のプローブとプライマーのセットを

包括的に含むアッセイです。

このアッセイには、次の特徴があります。

• TaqMan® 試薬を用いて cDNA サンプル中のターゲットを増幅し、検出します。

• 自動化デザインと品質管理されたパイプラインにより設計されています。

Inventoried アッセイは、製造後在庫管理されており、Made to Order アッセイは、

設計済みで注文があった後に製造されます。

• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク

リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。

• 可能な場合には、エクソン－エクソン結合部とクロスするプローブを設計すること

により、ゲノムDNAを増幅することなくターゲット cDNAの増幅が行えます（アッ

セイ ID に m サフィックスが表示される）。

製品の必要条件 TaqMan Gene Expression Assays に必要なものは、以下のとおりです。

• 次の 3 コンポーネント：

– ウェル当たりの cDNA サンプル（RNA から変換）量は 1 ～ 100 ng で、各測定

ウェル中の cDNA 量は同じ。

– 20✕ Gene Expression Assay Mix（各ターゲットに特異的）。各アッセイミック

スは、調製済み 20✕ ミックス中に、2 つの非ラベル PCR プライマーと FAM™ 色

素ラベル TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブを含みます。

1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。

– TaqMan® Gene Expression Master Mix、TaqMan® Universal PCR Master Mix（with または without AmpErase® UNG）、または TaqMan® Fast Universal PCRMaster Mix、No AmpErase® UNG。

• 各 PCR サイクル中に必要となる PCR 増幅ステップは 1 回のみです。同時にリアル

タイム読み取りを行うことにより結果を出します。



利用可能なアッセイ TaqMan Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子用に利用でき

ます。部品番号は、

• Inventoried アッセイは PN 4331182

• Made to Order アッセイは PN 4351372

アッセイ名のプレフィックスは、アッセイ対象種を表しています。Hs は Homo sapiens（ヒト）、Mm は Mus musculus（マウス）、Rn は Rattus norvegicus（ラット）、At は

Arabidopsis thaliana、Dm は Drosophila melanogaster、Ce は C. elegans、Cf はC. familiares（イヌ）、Rh は M. mulatta（アカゲザル）です。

アッセイ名のサフィックスは、以下の表に示すようなアッセイの特徴を示します。


TaqMan® Endogenous Control Assays は、以下により入手可能です。

• Inventoried TaqMan Gene Expression Assays（PN 4331182）－各アッセイは、1本の調製済み 20✕ チューブ中に、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブを含

みます。

• ヒト、マウスおよびラット種用個別コントロールアッセイ（部品番号は多岐）－各アッセイは、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブ、VIC® 色素ラベル

TaqMan® MGBプローブまたはTAMRA™色素ラベルプローブを含みます。VIC色

素ラベルを含む TaqMan Endogenous Controls では、プライマーが制限されます。




サフィックス説明

_m このアッセイのプローブはエクソン結合部に広がるため、ゲノム DNA を検出しません。

_s このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用するよう設計されており、ゲノム DNA を検出します。

_g このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用する可能性があり、ゲノム DNA を検出する可能性があります。

_mH このアッセイは、配列相同性が高い遺伝子ファミリーに属するトランスクリプト用に設計されています。このアッセイでは、ターゲット遺伝子と最も類似した配列相同性を有する遺伝子との間で、10 CT から 15 CT の差が出ます。そのため、サンプル中にターゲットトランスクリプトと最も相同性が高いトランスクリプトに同数のコピーがあった場合、最も相同性が高いトランスクリプトの1000 から 30,000 倍の感度でターゲットトランスクリプトを検出できます。

_sH

_gH

_u このアッセイのアンプリコンはエクソン結合部に広がり、プロ－ブはそのうちの一つのエクソン内に完全に配置されます。



詳細について • 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト

をご覧ください。

http://www.appliedbiosystems.com/

a. ホームページの［TaqMan® Products］（TaqMan® 製品）から、「TaqMan® GeneExpression Assays」を選択します。

b.［Gene Expression Assays & Arrays］のページで、

• ［Individual Assays］（個別のアッセイ）にて「TaqMan® Gene ExpressionAssays」を選択します。このオプションを選択すると、FAM 色素ラベル

化プローブを含む TaqMan Endogenous Control Assays を初めとする、全

TaqMan Gene Expression Assays へリンクされます。

または

• ［Individual Control Assays］（個別のコントロールアッセイ）にて「TaqMan®

Endogenous Control Assays」を選択します。このオプションを選択す

ると、個別の TaqMan Endogenous Control Assays（FAM 色素ラベル化

TaqMan MGB プローブ、VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブ、ま

たは TAMRA 色素ラベル化プローブを含む）へリンクされます。

• Custom TaqMan Endogenous Control Assays についての情報は、『Using TaqMan®

Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for ExperimentalStudies Application Note』をご参照ください。

• TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、

『TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。


製品の説明 Custom TaqMan® Gene Expression Assays は、TaqMan プローブとプライマーのセット

で、お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assaysサービスが設計、合成、調製したものです。Custom TaqMan Gene Expression Assaysを使うと、どのような生物の遺伝子やスプライシング変異でも定量実験を実施できます。



• 独自のアッセイ設計ソフトウェアを用いて開発されています。



製品の必要条件 Custom TaqMan Gene Expression Assays には、以下が必要です。

• ターゲット配列に関する提出用ファイル。無償の File Builder ソフトウェアを使用

して提出用ファイルを作成し、Custom TaqMan® Genomic Assays サービスに当該

ファイルを提示してください。







– 20✕ Gene Expression Assay または 60✕ Gene Expression Assay（各ターゲット

に特異的）。各アッセイは、調製済み 20✕ または 60✕ ミックス中に、2 種類の

ターゲット特異的プライマーと FAM™ 色素ラベル TaqMan MGB プローブを含

みます。1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。

– TaqMan® Gene Expression Master Mix、TaqMan® Universal PCR Master Mix（with または without AmpErase® UNG）、または TaqMan® Fast Universal PCRMaster Mix、No AmpErase® UNG。

• 各 PCR サイクル中に必要となる PCR 増幅ステップは 1 回のみです。同時にリアル

タイム読み取りを行うことにより結果を出します。


をご覧ください：


a. ホームページの［TaqMan® Products］（TaqMan® 製品）から、「TaqMan® GeneExpression Assays」を選択します。

b.［Gene Expression Assays & Arrays］ページの［Individual Assays］（個別の

アッセイ）で［TaqMan® Gene Expression Assays］を選択します。

• Custom TaqMan Gene Expression Assays の注文方法については、『Custom TaqMan®

Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines』をご参照ください。

• Custom TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法につ

いては、『Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。

マスターミックスの選択

利用可能なマスターミックス

Applied Biosystems の定量実験用 Inventoried/Made to Order アッセイは、以下の

TaqMan® マスターミックスを用いるように設計されています。

マスターミックス部品番号

TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL)、200 反応 4369016

TaqMan® Gene Expression Master Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反応

4369542

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)、No AmpErase® UNG、250 反応

4352042

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応 4304437


10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix 4305719

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応

4324018


4326614

10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG

4324020




詳細について TaqMan 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。

• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol

• TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol

• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol

実験の設計

StepOne ソフトウェアの使用

Applied Biosystems の Inventoried/Made to Order アッセイでは、StepOne ソフトウェ

アを用いて定量実験の設計を行います。StepOne ソフトウェアは、自動的に以下の量を

計算します。

• 反応ミックスコンポーネント

• サンプル希釈液

• （標準曲線および相対標準曲線実験の場合のみ）スタンダード希釈シリーズ

参考： StepOneソフトウェアで Inventoried/Made to Orderアッセイタイプを選択するに

は、［Design Wizard］（設計ウィザード）または［Advanced Setup］（高度なセットアッ

プ）で［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］（アッセイタ

イプ）ドロップダウンメニューから［Inventoried/Made to Order］（在庫／注文生産）


詳細について StepOne および StepOnePlus システムによる定量実験の設計および実施については、以

下をご参照ください。

• Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems標準曲線実験入門ガイド

• Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems相対標準曲線と比較 CT 実験入門ガイド




ワークフロー StepOne™ ソフトウェアで定量実験にカスタムアッセイを選択する場合には（すなわち、

独自にプライマーとプローブを設計する場合には）、Applied Biosystems のアッセイ設

計ガイドラインのワークフローに従うことをお勧めします。

1. Primer Express® Software を使って、プライマーとプローブを設計します（下記）。

2. 適切な試薬を選択します（3-24 ページ）。



3. 推奨されたサーマルサイクリング条件を用います（3-27 ページ）。

4. デフォルト設定のプライマーおよびプローブ濃度で開始します。必要に応じて、プ

ライマー濃度（3-30 ページ）およびプローブ濃度（3-33 ページ）を最適化します。

重要！これらの手順に完全に従うと、本システムで迅速にアッセイを設計、最適化でき、

信頼性の高い結果が得られます。実験が高いレベルで成功するために、本システムを包

括的にご利用ください。 Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの詳細につい

ては、付録 C をご覧ください。

参考： StepOne ソフトウェアで［Custom］（カスタム）アッセイタイプを選択するには、

［Design Wizard］（設計ウィザード）または［Advanced Setup］（高度なセットアップ）

から［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］（アッセイタイ

プ）ドロップダウンメニューで［Custom］（カスタム）を選択します。

Primer Express® Software を使ったプライマーとプローブの設計

Primer Express® Software は、お客様が提示した DNA 配列に基づき、推奨パラメータ

を用いてプライマーとプローブを選択します。

ご自分でアッセイの設計を行う場合には、（3-23 ページ）にある定量実験用プライマー

およびプローブの設計ガイドラインの要約に従ってください。これらのガイドラインの

詳細な解説については、「プライマーおよびプローブ設計ガイドラインについて」（3-22ページ）をご覧ください。




参考： SYBR® Green I Dye による検出を行う場合にはプローブは必要ありませんが、

SYBR® Green 試薬用アッセイを設計する際に、Primer Express Software によってプラ

イマーとプローブのセットを選択することをお勧めします。プローブは使用しませんが、

プライマーは必要とされる要件をすべて満たします。高い特異性を得るためにアッセイ

を TaqMan 試薬に変更する必要が生じた場合、作成した Primer Express Software ドキュ

メントを開いて、すぐにプローブを見つけることができます。



定量アッセイ用アンプリコン部位の

選択

アンプリコン部位を適切に選択することで、ゲノム配列、偽遺伝子やその他の関連遺伝

子の共増幅を起こすことなく、ターゲット mRNA ／ cDNA の増幅を行えます。SYBRGreen 試薬は、遺伝子発現用アンプリコン部位をスクリーニングするのに有用です。

ガイドライン

• アンプリコンは、ゲノム DNA 中のターゲット遺伝子の増幅を防止するために、1つ以上のイントロンに及ぶスパンが必要です。

• プライマーペアは、偽遺伝子やその他の関連遺伝子の増幅を防止するために、ター

ゲット遺伝子に特異的であることが必要です。

• プライマーを設計する際には、Primer Express Software ガイドラインを用います。

• 適当な配列が見つからない場合には、配列を検討してアンプリコンの再設計を行う

か、あるいは他の部位のスクリーニングを行う必要があります。

試験中の遺伝子にイントロンが含まれない場合には、ゲノム配列を増幅することなく

mRNA 配列を増幅するアンプリコンの設計はできません。その場合には、逆転写を行っ

ていない RNA サンプルをコントロールとして測定してください（RT マイナスコント

ロール）。

プライマーおよびプローブ設計ガイド

ラインについて

短いアンプリコンの選択

Primer Express Software パラメータのデフォルト設定で重要な点は、レンジが 50 から

150 塩基対のアンプリコンが選択されていることです。短いアンプリコンには、効率の

高い増幅ができるという利点があります。

また、効率の高いアッセイにより、比較 CT（∆∆CT）法を用いた相対定量を行うことが

できます（Livak and Schmittgen, 2001）。この方法では、標準曲線の必要がないため、サ

ンプルスループットが高くなります。

G/C 含量

できる限り、G/C 含量が 30 から 80％の領域で、プライマーとプローブを選択してくだ

さい。G/C 含量が >80% の領域は、サーマルサイクリング中に十分な変性が起こらず、

反応効率の低下につながります。G/C 含量が高い配列は、非特異的相互作用の影響によ

り、反応効率が低下し、SYBR Green 試薬を用いたアッセイで非特異的信号が発生する

可能性があります。G 塩基が 4 個以上連続しているプライマーやプローブは避けてくだ

さい。

融解温度

推奨融解温度（Tm）を有するプライマーやプローブを選択した場合には、広範囲なサー

マルサイクリング条件を使用できます。Applied Biosystems は、プローブ Tm がプライ

マー Tm より 10°C 高いことをお勧めします。

プローブの 5′ 末端

Primer Express Software では、5′ 末端に G があるプローブは選択されません。この位

置にある G 塩基のクエンチ作用は、プローブ開裂後も残ります。 G 塩基の存在により、

蛍光値（∆Rn）が低下し、アッセイ性能に影響が出ます。 5′ 末端近傍（末端以外）の位

置にある G 塩基では、アッセイ性能の低下は認められていません。



プライマーの 3′ 末端

非特異的生成物が形成される可能性を抑えるため、プライマーの 3′ 末端側の最後の 5 塩

基には、C や G 塩基が 3 個以上含まれないようにしてください。G/C 含有率が高いテン

プレートの場合など一定の条件下では、アンプリコンの長さが 150 塩基対以下という推

奨条件を緩和する必要がある場合もあります。一般論として、3′ 末端に G や C 塩基を

極端に多く含むプライマーは避けてください。

プライマーおよびMGB プローブ設計ガイドラインの要約

プローブガイドラインプライマーガイドライン

プローブを最初に選び、次にプローブに重ならない範囲でできるだけプローブに近いプライマーを設計します（50 から 150 塩基対のアンプリコンを強くお勧めします）。

G/C 含量を 30 から 80% の範囲とします。

同一のヌクレオチド、特にグアニンが連続しないようにし、G が 4 個以上連続するのは避けてください。

Primer Express® Software を使用する場合には、Tm を 68 から 70 °C とします。

Primer Express® Software を使用する場合には、Tm を 58 から 60 °C とします。

G が 5′ 末端に来てはいけません。 3′ 末端側の 5 個のヌクレオチドには、G や C塩基が 3 個以上含まれてはいけません。

ヌクレオチドが 13 個より短くならない範囲で、TaqMan® MGB プローブをできるだけ短くします。



試薬の選択

定量実験用に、数種類の TaqMan および SYBR Green 試薬が利用可能です。使用する試

薬は、ターゲットに応じて変わります。

• DNA または cDNA 定量（下記）。

• 1 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量（3-25 ページ）。


参考： SYBR Green 試薬を用いる場合には、Applied Biosystems は Power SYBR Green色素の使用を強くお勧めします。

DNA または cDNAの定量

試薬キット部品番号

TaqMan® 試薬 TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応

4369016


4369542

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)、No AmpErase® UNG、250 反応

4352042





4324018


4326614


4324020

TaqMan® PCR Core Reagents Kit、200 反応 N808-0228



1 ステップ RT-PCRを用いる RNA 定量

SYBR® Green 試薬 Power SYBR® Green PCR Master Mix（1 mL）、40 反応

4368577

Power SYBR® Green PCR Master Mix（5-mL）、200 反応

4367659

Power SYBR® Green PCR Master Mix（10 × 5-mL）、2000 反応

4368708

Power SYBR® Green PCR Master Mix（50 mL）、2000 反応

4367660

SYBR® Green PCR Master Mix（1-mL）、40 反応 4344463

SYBR® Green PCR Master Mix（5-mL）、200 反応 4309155

SYBR® Green PCR Master Mix（50-mL）、2000 反応

4334973

SYBR® Green PCR Core Reagents、200 反応 4304886



TaqMan® 試薬 TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit

4309169

TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents

参考：高温 RT ステップが必要な場合には、TaqMan®

EZ RT-PCR Core Reagents を使用してください。

N808-0236

SYBR® Green 試薬 Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit 4368711

SYBR® Green RT-PCR Reagents 4310179




AmpliTaq GoldDNA Polymerase に

ついて

ホットスタート酵素である AmpliTaq Gold® DNA Polymerase の使用は、TaqMan およ

び SYBR Green 試薬に関する Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの重要

事項です。AmpliTaq Gold DNA Polymerase によって、確実な反応が行われ、生じる非

特異的生成物の量を大幅に低減できます。また、アッセイのセットアップが簡素化され、

室温で測定可能であることも利点に数えられます。

参考： TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase UNG に含まれて

いる DNA ポリメラーゼは、迅速なホットスタート PCR が可能です。性能は AmpliTaqGold DNA Polymerase に劣りません。

MultiScribe ReverseTranscriptase に

ついて

MultiScribe™ Reverse Transcriptase は、RNA を相補 DNA（cDNA）に逆転写する、遺

伝子組み換え Moloney マウス白血病ウイルス（MuLV）逆転写酵素です。

試薬ステップキット部品番号

TaqMan®

試薬PCR ステップのみ

TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応

4369016


4369542

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix

4304437

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase® UNG

4352042

RT ステップのみ

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

4374966

TaqMan® Reverse Transcription Reagents

N808-234

RT ステップとPCR ステップの両方

TaqMan® Gold RT PCR Kit N808-232

SYBR® Green試薬

PCR ステップのみ

Power SYBR® Green PCR Master Mix 4367659

SYBR® Green PCR Master Mix 4309155



4374966


N808-234


Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit

4368711




推奨サーマルサイクリング条件の使用

サンプルに応じて推奨されるサーマルサイクリング条件を用います。

• DNA または cDNA 定量（3-28 ページ）。



参考： Fast 試薬用のサーマルサイクリング条件は、標準試薬用のサーマルサイクリング

条件と異なります。

VeriFlex™ 技術について

StepOnePlus 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、サーマル

サイクリング条件の最適化が容易です。

StepOnePlus 装置で実験を測定するときに、VeriFlex ブロックは、それぞれ異なる温度

設定をしてサンプルに応じて最高で 6 つのゾーンを作成することも、すべての VeriFlexブロックを同じ温度にすることも可能です。

VeriFlex サンプルブロックの使用に関する詳細については、ツールバーのをクリッ

クするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。



DNA またはcDNA の定量

TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2✕)、No AmpErase UNG については、以下の条件に従います。

‡ AmpErase® UNG を反応に加えた場合にのみ必要。

TaqMan Gene Expression Master Mix、TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mixおよび Power SYBR Green PCR Master Mix については、以下の条件に従います。

‡ AmpErase® UNG を反応に加えた場合またはマスターミックスに含まれている場合にのみ必要。


TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit および Power SYBR GreenRT-PCR Reagents Kit については、以下の条件に従います。

参考：この条件は、TaqMan EZ RT-PCR Kit 用ではありません。適切な条件については、

『TaqMan® EZ RT-PCR Kit Protocol』をご覧ください。

時間と温度

初期ステップ PCR（40 サイクル）

AmpErase® UNGの活性化 ‡ 活性化融解アニール／伸長

ホールドホールドサイクル

50 °C で 2 分 95 °C で 20 秒 95 °C で 1 秒 60 °C で 20 秒

時間と温度


AmpErase® UNGの活性化 ‡

AmpliTaq Gold® DNA Polymerase

の活性化融解アニール／伸長


50 °C で 2 分 95 °C で 10 分 95 °C で 15 秒 60 °C で 1 分

時間と温度


逆転写

AmpliTaq Gold® DNA Polymerase

の活性化融解アニール／伸長

ホールドホールド 40 サイクル

48 °C で 30 分 95 °C で 10 分 95 °C で 15 秒 60 °C で 1 分




High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit については、以下の条件に従います。

重要！ほとんどの使用例や大量の cDNA が必要な場合、Applied Biosystems は、最適

な変換が行われるよう 37 °C で 120 分、逆転写を行うことをお勧めします。

TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase UNG については、以下の条件に従います。

‡ AmpErase® UNG を反応に加えた場合にのみ必要。

TaqMan Gene Expression Master Mix、TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix（with AmpErase UNG）および Power SYBR Green PCR Master Mix については、以下の条件に従います。

ステップ時間と温度

1. RT ステップ

ステップ 1 ステップ 2

ホールドホールド

25 °C で 10 分 37 °C で 120 分

RNA を cDNA に逆転写した（RT ステップ）後、サンプルを貯蔵したり、続いて行う PCR ステップ（下記）に使うことができます。


2. PCR ステップ


AmpErase® UNG の活性化 ‡

AmpliTaq Gold® DNA

Polymerase の

活性化

融解アニール／伸長


50 °C で 2 分 95 °C で 20 秒 95 °C で 1 秒 60 °C で 20 秒


2. PCR ステップ


AmpErase® UNG の活性化

AmpliTaq Gold® DNA

Polymerase の

活性化

融解アニール／伸長


50 °C で 2 分 95 °C で 10 分 95 °C で 15 秒 60 °C で 1 分



プライマー濃度の最適化

フォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度を個別に変更することによっ

て、最適なアッセイ性能が得られる濃度を特定することができます。プライマーは、PCR増幅の指数関数的領域では、モル数が常に大幅な余剰の状態にあります。

TaqMan Gene Expression Master MixまたはTaqMan 2✕ Universal PCR Master Mixを

使用する場合には、Applied Biosystems は、プライマー濃度を下記の「プライマー濃度

のデフォルト値」に示す濃度とすることをお勧めします。次の事項に関する詳細な説明

を以下に記します。

• プライマー最適化マトリックス（下記）

• TaqMan 試薬（下記）

• SYBR Green 試薬（3-31 ページ）

プライマー濃度のデフォルト値

下記の表に示した推奨開始プライマー濃度は、DNA および cDNA 定量アッセイ用です。

プライマー最適化マトリックス

プライマー最適化マトリックスを行うと、最小の CT 値と最大の ∆Rn 値を生じる最小の

プライマー濃度を決定することができます。

プライマー最適化マトリックスによって、非特異的プライマー結合の補正を行います。

非特異的結合は、特定の部位に結合するプライマー量を低下させる可能性があります。

TaqMan 試薬 TaqMan 試薬を用いた定量アッセイでは、一定量のターゲットテンプレートに対して最

小の CT 値と最大の ∆Rn 値を生じるプライマー濃度を選択することによって、最適な性

能が得られます。

参考： CT 値はリアルタイム定量アッセイにおいて数値で表されるパラメータですが、

∆Rn 値も最大の感度と再現性を得る上で重要です。

TaqMan試薬プライマー最適化マトリックスによる実験結果の具体例を図3-4（3-31ペー

ジ）に示します。

• 図 3-4a には、各プライマー濃度の組み合わせに対する増幅プロットを線形表示で

示しました。

• 図 3-4b には、同じデータを対数表示で示しました。

フォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ50nMである組み合わせ（プロッ

トグループ C）の場合に、∆Rn が最小で、CT が最大になっています。フォワードプライ

マーまたはリバースプライマーのいずれかが 150nM の組み合わせ（プロットグループ

B）でも、∆Rn 値が低下しています。フォワードプライマーとリバースプライマーがそ

れぞれ少なくとも 300nM の組み合わせ（プロットグループ A）の場合に、∆Rn が最大

で、CT が最小になっています。結果として、プロットグループ A または B の組み合わ

せのときに、最適性能が得られます。

試薬

濃度（nM)

フォワードプライマーリバースプライマー

TaqMan® 試薬 900 900

SYBR® Green 試薬 50 50



図 3-4 プライマー濃度を組み合わせて行ったプライマー最適化実験による増幅結果のプロット（線形および対数表示）プロットグループ名：A：フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 300nM 含む組み合わせB：フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 150nM 含む組み合わせC：フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 50nM 含む組み合わせ

SYBR Green 試薬 SYBR Green 試薬を用いた定量アッセイの場合には、プライマー濃度の最適化は、若干

複雑になります。TaqMan 試薬と同じプライマー最適化マトリックスを行いますが、

SYBR Green 試薬の場合にはネガティブコントロールを加えなければなりません。選択

するプライマー濃度は、ターゲットテンプレートに対して低い CT 値と高い ∆Rn 値を示

す必要がありますが、ネガティブコントロールに対して非特異的生成物が形成してはい

けません。

a）線形表示

b）対数表示

サイクル

サイクル

プロットグループ A

プロットグループ B

プロットグループ C

プロットグループ Aプロットグループ B

プロットグループ C



SYBR Green 試薬を用いた定量アッセイに最適なプライマー濃度を選択する場合、融解

曲線やゲル解析が極めて有用になります。図 3-5（3-32 ページ）に、900nM のフォワー

ドプライマーおよびリバースプライマーのプライマー最適化マトリックスの結果を示し

ます。

• 図 3-5a では、ネガティブコントロールウェルで強い増幅が起こっています。これ

は、非特異的増幅がかなりの程度発生していることを表します。

• 図 3-5b では、テンプレートを加えずに得られた生成物の融解温度が、テンプレー

トを加えて得られた生成物の融解温度よりも低くなっています。これは、非特異的

増幅がかなりの程度発生していることを表します。

図 3-5 に示した結果は、プライマーダイマー形成に典型的なものです。これらの結果か

ら、プライマー濃度が低いと一層最適な結果が得られることがわかります。また、目的

とするターゲットに対して別のプライマーセットを再設計することもできます。

図 3-5 SYBR® Green 試薬を用いた増幅データ（a）ネガティブコントロール（NC）ウェルで非特異的増幅が起こっている可能性があることを示す増幅プロット（線形表示）

（b）NC ウェル中の生成物が特定の生成物とは異なる融解温度を有することを表す融解曲線解析

ターゲット増幅

ターゲット増幅

NC（非特異的増幅）

NC（非特異的増幅）

a）増幅プロット（線形表示）

b）融解曲線解析



プローブ濃度の最適化 TaqMan® プローブによる検出を行う場合には、推奨プローブ濃度である 250nM で優れ

たアッセイ性能が得られます。しかし、アッセイの要件によっては、プローブ最適化実

験が有用な場合もあります。

参考： SYBR Green I Dye による検出を行う場合には、プローブは不要です。

推奨プローブ濃度 TaqMan 試薬を用いて実施する DNA および cDNA の定量アッセイに対して推奨される

プローブ濃度は 250nM です。図 3-6 に、プローブ濃度を 50nM から 250nM まで変化さ

せて行ったプローブ最適化実験の結果を示します。

• 図 3-6a では、プローブ濃度が増加するにつれて ∆Rn 値が上昇していることがわか

ります。

• 図 3-6b は、プローブ濃度が十分な場合の CT 値の変化を示します。

最大の再現性を確保するため、特にコピー数が小さいターゲットを検出しようとする場

合など、低いプローブ濃度を避けてください。アッセイは、プローブ濃度を 250nM に

して測定してください。濃度を 250nM とすると、プローブ制限を回避することができ、

∆Rn 値が大きくなります。∆Rn 値が大きい場合には、反応が強力であって増幅効率が良

いため、生成物の収率が高くピーク測定が正確になります。



図 3-6 50nM から 250nM までプローブ濃度を変化させた場合の増幅プロット（線形および対数表示）

a）線形表示

b）対数表示

サイクル

250 nM プローブ

150 nM プローブ

100 nM プローブ

50 nM プローブ

サイクル

250 nM プローブ

150 nM プローブ100 nM プローブ

50 nM プローブ



詳細について

詳細については：

• TaqMan 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。

– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol

– TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol

– TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol

• SYBR Green 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。

– Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol

– SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol

– SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol

• StepOne および StepOnePlus システムで行う定量実験に関しては、以下をご参照く

ださい。

– Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems標準曲線実験入門ガイド

– Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems相対標準曲線と比較 CT 実験入門ガイド

• StepOneおよびStepOnePlusシステムで行う有無実験については、『Applied BiosystemsStepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 有無実験入門ガイド』を

ご参照ください。




4ジェノタイピング実験

本章の内容：

セクション 4.1 ジェノタイピング実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3

セクション 4.2 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9





セクション 4.1 ジェノタイピング実験について


概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6



概要

ジェノタイピング実験とは？

ジェノタイピング実験とは、未知のサンプルのジェノタイプを決定するエンドポイント

実験です。この実験タイプでは、一塩基多型（SNP）の区別が可能です。

ジェノタイピング実験では、未知のサンプルが以下に該当するかどうかを決定します。

• ホモ接合体（アレル 1 のみを含むサンプル）

• ホモ接合体（アレル 2 のみを含むサンプル）

• ヘテロ接合体（アレル 1 およびアレル 2 の両方を含むサンプル）


ジェノタイピング実験用の PCR 反応には、以下のコンポーネントが含まれます。

• サンプル－ターゲットのジェノタイプが未知のサンプル。

• （オプション）反復－同じコンポーネントと容量を含む同一の反応。

• ネガティブコントロール－テンプレートの代わりに蒸留水か緩衝液を含むサンプル。テンプレートを含まないコントロール（NTC）ともいう。ネガティブコントロールでは増幅しません。

• （オプション）ポジティブコントロール－既知のジェノタイプ（アレル 1 のホモ接

合体、アレル 2 のホモ接合体、アレル 1 および 2 のヘテロ接合体）を含むサンプル。

装置ジェノタイピング実験には、二つのステップが必要であり、サーマルサイクリング（PCR増幅）の後に、発生する蛍光信号のエンドポイント検出が行われます。サーマルサイク

リングステップ（PCR 増幅）は、Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™

Real-Time PCR Systems またはスタンドアロンサーマルサイクラーで実施できます。

StepOne™ および StepOnePlus™ システムを使用すると、

• PCR の解析を行うことができ、トラブルシューティングに役立ちます。

• エンドポイントプレート読み取りを個別に行えます。

ジェノタイピング実験の仕組み

ジェノタイピング実験では、PCR には各アレルに特異的な蛍光色素でラベルしたプロー

ブが含まれます。プローブには、各アレルを区別する、様々な蛍光レポーター色素が含

まれています。

StepOne および StepOnePlus システムでは、TaqMan® マイナーグルーブバインダー

（MGB）プローブを使用できます。各 TaqMan® MGB プローブは、以下を含みます。

• 各プローブの 5′ 末端に結合したレポーター色素

– VIC® 色素は、アレル 1 プローブの 5′ 末端に結合しています。

– FAM™ 色素は、アレル 2 プローブの 5′ 末端に結合しています。

• マイナーグルーブバインダー（MGB）

この修飾により、プローブ長を増すことなく溶融温度（Tm）を高くすることが可

能となり（Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997）、短いプローブの設計がで

きます。その結果、TaqMan MGB プローブによって、一致プローブと不一致プロー

ブで Tm 値に大きな差が生じます。Tm 値の差が大きいほど、正確なジェノタイピ

ングを行うことができます。



• プローブの 3′ 末端に結合した非蛍光クエンチャー（NFQ）

クエンチャーは蛍光を発生しないため、リアルタイム PCR システムにおいて、レ

ポーター色素の作用をより正確に測定することができます。

PCR 中、各プローブは、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位との間で、

相補的な配列に対して特異的にアニーリングします。AmpliTaq Gold® DNA Polymeraseは、アレル配列にハイブリダイズ（一致）するプローブのみ開裂します。開裂により、

レポーター色素は、クエンチャー色素から分離し、レポーター色素の蛍光が増加します。

このように、PCR 増幅中に発生する蛍光信号は、サンプル中に存在するアレルを示しま

す。

プローブとアレル配列の不一致

プローブとアレルとの不一致により、プローブのハイブリダイゼーション効率が低下し

ます（図 4-1）。また、AmpliTaq Gold DNA Polymerase は、不一致プローブを開裂する

のではなく、不一致プローブを取り除いて、リポーター色素を生じる作用があると考え

られています。

図 4-1 ジェノタイピング実験におけるアレルとプローブ配列の一致および不一致による結果

表 4-1 に、上記のジェノタイピング実験例で考えられる結果を要約しました。

ワークフロー StepOne システムおよび StepOnePlus システムでジェノタイピング実験を行う前に、以

下のように実験の準備を行います。

1. アッセイタイプを選択します（下記）。

2. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 4.2（4-9 ページ））。

表 4-1 ジェノタイピング実験結果

以下のシグナルが大幅に増加した場合意味

VIC® 色素の蛍光のみアレル 1 のホモ接合性

FAM™ 色素の蛍光のみアレル 2 のホモ接合性

両方の蛍光シグナルヘテロ接合性




StepOne ソフトウェアで実験を設計する場合には、ジェノタイピング実験として、以下

のアッセイタイプを選択できます。

• 設計済み／検証済み（下記）





参考：ジェノタイピング実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロ

トコルは使用できません。

設計済み／検証済みアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、

4-10 ページをご参照ください。

製品属性


• 高密度でゲノムワイドなマーカー範囲用設計済みアッセイ。 • スクリーニング、関連解析、候補領域、候補遺伝子やファイン

マッピング研究用。

• 便利な単一チューブ形式。

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays

• 各種の薬物代謝酵素や薬物トランスポーターをコードする220 種類に及ぶ遺伝子の多型を検出。

• 一塩基多型（SNP）、挿入／欠失（in/del）や多塩基多型（MNP）の研究用。

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination

• ジェノタイプに応じて精製した、特異的な突然変異用 DNA サンプル。ほとんどのアッセイで 2 つのアレル間の一塩基多型（SNP）の判別が可能。

• ジェノタイピングの精度を高めるため、マイナーグルーブバインダー（MGB）を添加。

• アレル 1 および 2 コントロール DNA を含み、各測定において各ホモ接合体信号が発生するように設計。

• 密閉チューブシステムにより、PCR 後の操作やゲルが不要。

TaqMan® Genotyping Master Mix

SNPジェノタイピングアプリケーションでエンドポイント蛍光検出に最適化されています。

• 特異的なクラスターと高いコール率により、明確なアレル識別が可能。

• 優れたPCR前および後の安定性により、ハイスループットセットアップと解析を実現。

• TaqMan® SNP Genotyping Assays により検証済み。

• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素化。

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix （withまたは without AmpErase® UNG）

• cDNAまたはDNAをテンプレートに用いるTaqMan®アッセイで最適性能を発揮。

• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む。







カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、4-14 ページを


製品属性


• いかなる生物体でも一塩基多型（SNP）の検出が可能。

• 6 塩基までの挿入／欠失（in/del）を検出。

• 6 塩基までの多塩基多型（MNP）を検出。

• 便利な単一チューブ形式。

TaqMan® Genotyping Master Mix

SNPジェノタイピングアプリケーションでエンドポイント蛍光検出に最適化されています。

• 特異的なクラスターと高いコール率により、明確なアレル識別が可能。

• 優れたPCR前および後の安定性により、ハイスループットセットアップと解析を実現。

• TaqMan® SNP Genotyping Assays により検証済み。


TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix （withまたは without AmpErase® UNG）

• cDNAまたはDNAをテンプレートに用いるTaqMan®アッセイで最適性能を発揮。

• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む。








設計済み／検証済みアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® SNP Genotyping Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . 4-12

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13

実験の設計. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16

実験の設計. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16




ワークフロー Applied Biosystems の設計済み／検証済みアッセイを用いてジェノタイピング実験を設

計する際、Applied Biosystems は、以下のワークフローに従うようお勧めします。


• TaqMan® SNP Genotyping Assays（下記）

• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays（4-11 ページ）

• TaqMan® Pre-Developed Assays Reagents for Allelic Discrimination（4-12ページ）


3. StepOne™ ソフトウェアを用いて実験を設計します（4-14 ページ）。


製品の説明 TaqMan® SNP Genotyping Assays は、ヒト一塩基多型（SNP）のジェノタイピング研

究用のプライマーとプローブのセットを包括的に含むアッセイです。


• TaqMan® 試薬を用いて、精製したゲノム DNA サンプル中の特定の SNP アレルを

増幅、検出します。

• アッセイはすべて、Applied Biosystems のインフォマティックスパイプラインとソ

フトウェアの他、Celera Genomics 社や公共のデータベースを用いて設計されてい

ます。



製品の必要条件 TaqMan SNP Genotyping Assays では、以下が必要です。


– 1 から 20ng の精製したゲノム DNA サンプル。

– 20✕、40✕、または 80✕ の SNP Genotyping Assay Mix（各多型に固有）。各アッ

セイは、対象の SNP を増幅する配列特異的なフォワードプライマーとリバース

プライマーに加え、2 種類の TaqMan MGB プローブを含みます。一方のプロー

ブは VIC® 色素でラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプロー

ブは FAM™ 色素でラベルされており、アレル 2 配列を検出します。

– TaqMan® Genotyping Master Mix または TaqMan® 2✕ Universal PCR MasterMix（with または without AmpErase® UNG）。

• 結果を得るための PCR 増幅およびエンドポイント読み取り。



利用可能なアッセイ TaqMan SNP Genotyping Assays は、TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assaysとして入手可能です。

• 450 万を超える種類の設計済みのゲノムワイドなアッセイがあり、そのうち 350 万

がヒト HapMap SNP アッセイ、70,000 がヒト cSNP アッセイ、160,000 が検証済

みヒトアッセイおよび 10,000 がマウスアッセイです。

• 小、中、大サイズあり。

• Made to Order（すなわち、注文後に製造）。



http://www.allsnps.com/

または


a. ホームページの［TaqMan® Products］（TaqMan® 製品）から、［TaqMan® SNPGenotyping Assays］を選択します。

b. ［SNP Genotyping Assays］ページの［Pre-Designed/Validated Assays］（設計

済み／検証済みアッセイ）で、［TaqMan® SNP Genotyping Assays］を選択

します。

• TaqMan SNP Genotyping Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、

『TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol』をご参照ください。


製品の説明 TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays は、薬物代謝関連遺伝子の SNP、挿入

や欠損（インデル）、多塩基多型（MNP）のジェノタイピング研究用のプライマーとプ

ローブのセットを包括的に含む Inventoried アッセイです。


• TaqMan 試薬を用いて、精製したゲノム DNA サンプル中の特定の多型を増幅、検

出します。

• Applied Biosystems のインフォマティックスパイプラインとソフトウェアの他、公

共の SNP データベースによるゲノム情報や公共のゲノムアセンブリーデータを用

いて設計されています。

• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、最適な性能を発揮する

ように設計されています。

製品の必要条件 TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays には、以下が必要です。


– 3 から 30ng の精製したゲノム DNA サンプル。

– 20✕ の Drug Metabolism Genotyping Assay Mix（各多型に固有）。各アッセイ

は、対象の多型配列を増幅する配列特異的なフォワードプライマーとリバースプ

ライマーに加え、2 種類の TaqMan MGB プローブを含みます。一方のプローブ

は VIC 色素でラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプローブ

は FAM 色素でラベルされており、アレル 2 配列を検出します。





– TaqMan® Genotyping Master Mix または TaqMan® 2✕ Universal PCR MasterMix（with または without AmpErase® UNG）。





または




済み／検証済みアッセイ）で、［TaqMan® Drug Metabolism GenotypingAssays］を選択します。

• TaqMan SNP Genotyping Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、

『TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol』をご参照ください。

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination

製品の説明 Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination（TaqMan® PDARsfor AD）は、特異的なアレル識別用に最適化された Inventoried アッセイです。


• TaqMan 試薬を用いて、精製したゲノム DNA サンプル中の特定の多型を増幅、検

出します。



製品の必要条件 TaqMan PDARs for AD には、次の 3 つのコンポーネントが含まれます。

• 2 から 20ng の精製したゲノム DNA サンプル。

• 10✕ の Allelic Discrimination Assay Mix（各多型に固有）。各アッセイは、対象の

多型配列を増幅する配列特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーに

加え、2 種類の TaqMan MGB プローブを含みます。一方のプローブは VIC 色素で

ラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプローブは FAM 色素でラ

ベルされており、アレル 2 配列を検出します。

• TaqMan® Genotyping Master MixまたはTaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix（with または without AmpErase® UNG）。

参考：各アッセイは、アレル 1 および 2 コントロール DNA を含み、各測定において各

ホモ接合体信号が発生するように設計されています。









または




済み／検証済みアッセイ）で、［TaqMan® Pre-Developed Assay Reagentsfor Allelic Discrimination (TaqMan® PDARs for AD)］を選択します。

• TaqMan PDARs for Allelic Discrimination を使って PCR 反応を調製する方法につ

いては、『Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic DiscriminationProtocol』をご参照ください。



ジェノタイピング実験用 Applied Biosystems 調製済み／検証済みアッセイは、以下のマ

スターミックスを用いるように設計されています。

• TaqMan PDARs for AD には、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix（withAmpErase® UNG）が含まれています。

• TaqMan SNP Genotyping AssaysおよびCustom TaqMan SNP Genotyping Assaysは、以下の試薬と一緒に使用できます。



詳細について TaqMan マスターミックスの使用に関しては、以下をご参照ください。

• TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol



TaqMan® Genotyping Master Mix、1-Pack（1 × 10 mL）、400 反応

4371355

TaqMan® Genotyping Master Mix、1 Bulk Pack（1 × 50 mL）、2000 反応

4371357





4324018


4326614

10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix,No AmpErase® UNG

4324020




実験の設計


Applied Biosystems 設計済み／検証済みアッセイでは、StepOne ソフトウェアを用いて

ジェノタイピング試験の設計を行ってください。StepOne ソフトウェアは、自動的に以

下の量を計算します。







詳細について StepOneおよび StepOnePlusシステムで行うジェノタイピング実験の設計や実施の方法

については、『 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCRSystems ジェノタイピング実験入門ガイド』をご参照ください。


ワークフロー Applied Biosystems カスタムアッセイを用いてジェノタイピング実験を設計する際、

Applied Biosystems は、以下のワークフローに従うことをお勧めします。

1. アッセイとして Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays（下記）を注文します。




製品の説明 Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays は、TaqMan プローブとプライマーのセット

で、お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assaysサービスが設計、合成、調製したものです。Custom TaqMan SNP Genotyping Assaysによって、以下が可能となります。

操作具体例

いかなる生物体でも一塩基多型（SNP）に関するジェノタイピング試験を実施

AGTTCATCCATGGTCA --> AGTTCATACATGGTCA

AGTTCAT[C/A]CATGGTCA と表記

ジェノタイピング試験で 6 塩基までの挿入／欠失（in/del）を検出

AGTTCATCCATGGTCA --> AGTTCATGGTCA

AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA と表記

ジェノタイピング試験で 6 塩基までの多塩基多型（MNP）を検出

AGTTCATCCGGTCA --> AGTTCATATGGTCA

AGTTCAT[CC/AT]GGTCA と表記




• TaqMan 試薬を用いて、精製したゲノム DNA（gDNA）中の特定の多型を増幅、検

出します。




製品の必要条件 Custom TaqMan SNP Genotyping Assays では、以下が必要です。

• ターゲット SNP 配列に関する提出用ファイル。無償の File Builder ソフトウェアを

使用して提出用ファイルを作成し、Custom TaqMan® Genomic Assays サービスに

当該ファイルを提示してください。


– ウェル当たり 1 から 20ng の精製した gDNA サンプル。

– 40✕ SNP Genotyping Assay または 80✕ SNP Genotyping Assay（各多型に固

有）。各アッセイは、対象の SNP を増幅する配列特異的なフォワードプライマー

とリバースプライマーに加え、2 種類の TaqMan MGB を含みます。一方のプ

ローブは VIC 色素でラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプ

ローブは FAM 色素でラベルされており、アレル 2 配列を検出します。

– TaqMan® Genotyping Master Mix または TaqMan® Universal PCR Master Mix（with または without AmpErase® UNG）。





または



b. ［SNP Genotyping Assays］ページの［Custom Assays］（カスタムアッセイ）

から、［Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays］を選択します。

• Custom TaqMan SNP Genotyping Assays の注文方法については、『Custom TaqMan®


• Custom TaqMan SNP Genotyping Assays を使って PCR 反応を調製する方法につ

いては、『Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol』をご参照ください。







ジェノタイピング実験用の Applied Biosystems Made to Order アッセイは、以下のマス

ターミックスを用いるように設計されています。



詳細について TaqMan マスターミックスの使用に関しては、以下をご参照ください。

• TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol


実験の設計


Applied Biosystems カスタムアッセイでは、StepOne ソフトウェアを用いてジェノタイ

ピング試験の設計を行ってください。StepOne ソフトウェアは、自動的に以下の量を計

算します。







詳細について StepOneおよびStepOnePlusシステムで行うジェノタイピング実験の設計や実施の方法に

ついては、『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systemsジェノタイピング実験入門ガイド』をご参照ください。


TaqMan® Genotyping Master Mix、1-Pack（1 × 10 mL）、400 反応 4371355

TaqMan® Genotyping Master Mix、1 Bulk Pack（1 × 50 mL）、2000 反応 4371357




TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応 4324018


10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG 4324020


5有無実験

本章の内容：

セクション 5.1 有無実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-3

セクション 5.2 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9





セクション 5.1 有無実験について


概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4

アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6



概要

有無実験とは？有無実験とは、特定の核酸配列（ターゲット）がサンプル中に存在するか、しないかを

決定するエンドポイントアッセイです。ターゲットの実際の量は定量できません。

有無実験は、ウイルスやバクテリアなどの病原体が存在するか、しないかを検出するた

めに広く使用されています。例えば、有無実験を用いて、ハンバーガー肉中に Salmonella菌が存在するかどうかを調べることができます。結果は、Salmonella 菌が存在するか、

しないかであって、菌の定量は行えません。


有無実験用の PCR 反応には、以下のコンポーネントが含まれます。

• サンプル－ターゲットの存在が未知のサンプル。

• 反復－同じコンポーネントと容量を含む同一の反応。

• 内在性ポジティブコントロール（IPC）－ PCR 反応に添加する短い合成 DNA テン

プレート。IPC を使用して、真の陰性結果と、PCR 阻害剤や不適切なアッセイセッ

トアップ、試薬や装置の不具合が影響した反応とを区別できます。

参考：有無実験は、IPC を加えなくとも行えます。しかし、IPC によって、PCR の

失敗を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。

• ネガティブコントロール－サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーを含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりません。

有無実験用の PCR 反応液は、StepOne ソフトウェアによって、3 種類の方法でセット

アップができます。

セットアップウェルタイプ

IPCセットアップ 3 種類のウェルがあります。

• Unknown-IPC wells（未知の IPC ウェル）－ウェルには、サンプルテンプレートと IPC テンプレートが含まれます。ターゲットの存在は不明です。

• Negative control-IPC wells（ネガティブコントロール IPC ウェル）－ウェルには、PCR 反応液中にサンプルテンプレートの代わりに IPC テンプレートと蒸留水または緩衝液が含まれます。ネガティブコントロールIPC ウェルでは IPC テンプレートのみが増幅します。反応にサンプルテンプレートが含まれないからです。別称「IPC+」です。

• Negative control-blocked IPC wells（ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェル）－ウェルには、PCR 反応液中にサンプルテンプレートの代わりに IPC 遮断剤が含まれます。増幅はネガティブコントロールブロック済み IPC ウェルでは起きません。反応にサンプルテンプレートが含まれず、IPC の増幅が遮断されるからです。別称「no amplificationcontrol（NAC）（増幅しないコントロール）」です。

IPC なしのシングルプレックスセットアップ

2 種類のウェルがあります。

• Unknown wells（未知のウェル）－ウェルには、サンプルテンプレートが含まれます。ターゲットの存在は不明です。

• Negative controls（ネガティブコントロール）－ウェルには、サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファーが含まれます。



エンドポイント検出と

PCR 後プレート読み取り

有無実験は、エンドポイント実験であって、PCR が完了した後に蛍光データが収集され

ます。

有無実験のトラブルシューティングを行うため、Applied Biosystems StepOne™ および

StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems を用いてリアルタイム PCR を実施することが

できます。 PCR増幅にStepOne™およびStepOnePlus™システムを用いる場合には、PCR前読み取りと PCR 後読み取りとを個別に実施してください。

有無実験の仕組み PCR 中、蛍光プローブは、テンプレート DNA 上のフォワードプライマー部位とリバー

スプライマー部位との間にある相補的なターゲットに対して、特異的にアニーリングし

ます。その後伸長中に、AmpliTaq Gold® DNA Polymerase は、ターゲットを含む各サ

ンプル中のハイブリダイズしたプローブを開裂します。各一致プローブの開裂により、

レポーター色素は、クエンチャー色素から分離し、レポーター色素の蛍光が増加します。

PCR サイクリング後に、StepOne™ および StepOnePlus™ 装置は、PCR 増幅中に発生し

た蛍光を読み取ります。この蛍光信号を用いて、各サンプル中にターゲットが存在する

か、しないかを決定します。レポーター信号は、以下の式により、パッシブリファレン

スの蛍光に対してノーマライズが行われます。

IPC の取り込み

IPC は、低コピー数の構成核酸を検出するために反応プレートに加えられる、もう一つ

の TaqMan® プローブとプライマーのセットです。同じ反応ウェル中の IPC とターゲッ

トは、同時に増幅されます。ウェルに増幅が起こらない場合には、StepOne™ ソフトウェ

アは、IPC の陽性信号を用いて、ウェルに増幅が起こらなかったのはターゲットテンプ

レートが存在しなかったからであって、分注時の誤操作や抑制によるものではないこと

を確認します。

参考：有無実験は、IPC を加えなくとも行えます。しかし、IPC によって、PCR の失敗

を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。

IPC なしのマルチプレックスセットアップ

2 種類のウェルがあります。

• Unknown-Unknown wells（未知－未知ウェル）－ウェルには、サンプルテンプレートが含まれます。ターゲットの存在は不明です。

• Negative control-Negative control wells（ネガティブコントロール－ネガティブコントロールウェル）－ウェルには、サンプルテンプレートの代わりに蒸留水や緩衝液が含まれます。

セットアップウェルタイプ

Rn (TT) = ターゲットテンプレート配列の蛍光強度

パッシブリファレンスの蛍光強度

Rn (IPC) = 内在性ポジティブコントロールの蛍光強度

パッシブリファレンスの蛍光強度



ワークフロー StepOne システムおよび StepOnePlus システムで実験を行う前に、以下のように実験の

準備を行います。

1. アッセイタイプを選択します（下記）。

2. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 5.2（5-9 ページ））。


StepOne ソフトウェアで実験を設計する場合には、有無実験として、以下のアッセイタ

イプを選択できます。

• Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）（5-7 ページ）






Inventoried/Madeto Order

（在庫／注文生産）アッセイ




参考：有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用

できません。

Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイを用いて実験を設計する際のガ

イドラインについては、（5-10 ページ）をご参照ください。

製品属性


• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子用の調製済み遺伝子特異的プライマーとプローブのセット



• Inventoried（在庫）または Made to Order（注文生産）アッセイとして入手可能


参考：FAM™ 色素ラベル化

TaqMan® Endogenous Control Assays は、Inventoried TaqMan Gene Expression Assays として

含まれています。

• 最適化、調製済み、そのまま使用可能な内在性コントロールアッセイ

• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila およびあらゆる真核生物種用のコスト効果が高い遺伝子発現定量

• FAM™ 色素と VIC® 色素ラベルの選択が可能（プライマー制限）



• 自由にターゲットを選択





















できません。

カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、（5-16 ページ）

をご参照ください。

製品属性

カスタム TaqMan® プローブとプライマー


• 色素ラベル、クエンチャーおよび合成スケールを自由に選択

• Applied Biosystemsのアッセイ設計ガイドラインに従い、PrimerExpress® Software で使用

Primer Express® Software リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを設計するソフトウェア
















Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

TaqMan® Gene Expression Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents. . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13

マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15

実験の設計. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16

カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16




ワークフロー StepOne™ ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択する場合に

は、Applied Biosystems は、以下のワークフローによることをお勧めします。


• TaqMan® Gene Expression Assays（下記）

• Custom TaqMan® Gene Expression Assays（5-12 ページ）

2. TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents を使用します（5-13 ペー

ジ）。

参考：有無実験は、IPC を加えなくとも行えます。しかし、IPC によって、PCR の

失敗を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。




製品の説明 TaqMan® Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子の有無実験を

行うために開発された、Inventoried/Made to Order のプローブとプライマーのセットを

包括的に含むアッセイです。


• このアッセイは、TaqMan® 試薬を用いて cDNA サンプル中のターゲットを増幅し、

検出します。

• このアッセイは、自動化デザインと品質管理されたパイプラインにより設計されて

います。Inventoried アッセイは、製造後在庫管理されており、Made to Order アッ

セイは、設計済みで注文があった後に製造されます。



• 可能な場合には、エクソン－エクソン結合部とクロスするプローブを設計すること

により、ゲノムDNAを増幅することなくターゲット cDNAの増幅が行えます（アッ

セイ ID に m サフィックスが表示される）。

製品の必要条件 TaqMan Gene Expression Assays には、以下が必要です。




– 20✕ Gene Expression Assay Mix（各ターゲットに特異的）。各アッセイミック

スは、調製済み 20✕ ミックス中に、2 つの非ラベル PCR プライマーと FAM™ 色

素ラベル TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブを含みます。

1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。

– TaqMan® Gene Expression Master Mix または TaqMan Universal PCR MasterMix（with または without AmpErase UNG）。



利用可能なアッセイ TaqMan Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子用に利用でき

ます。部品番号は、

• Inventoried アッセイは PN 4331182

• Made to Order アッセイは PN 4351372

アッセイ名のプレフィックスは、アッセイ対象種を表しています。Hs は Homo sapiens（ヒト）、Mm は Mus musculus（マウス）、Rn は Rattus norvegicus（ラット）、At は

Arabidopsis thaliana、Dm は Drosophila melanogaster、Ce は C. elegans、Cf はC. familiares（イヌ）、Rh は M. mulatta（アカゲザル）です。

アッセイ名のサフィックスは、以下の表に示すようなアッセイの特徴を示します。


TaqMan® Endogenous Control Assays は、以下により入手可能です。

• Inventoried TaqMan Gene Expression Assays（PN 4331182）－各アッセイには、

1 本の調製済み 20✕ チューブ中に、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブを

含みます。

• ヒト、マウスおよびラット種用個別コントロールアッセイ（部品番号は多岐）－各アッセイには、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブ、VIC® 色素ラベル

TaqMan® MGBプローブまたはTAMRA™色素ラベルプローブを含みます。VIC色

素ラベルを含む TaqMan Endogenous Controls では、プライマーが制限されます。




サフィックス説明

_m このアッセイのプローブはエクソン結合部に広がるため、ゲノム DNA を検出しません。

_s このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用するよう設計されており、ゲノム DNA を検出します。

_g このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用する可能性があり、ゲノム DNA を検出する可能性があります。

_mH このアッセイは、配列相同性が高い遺伝子ファミリーに属するトランスクリプト用に設計されています。このアッセイでは、ターゲット遺伝子と最も類似した配列相同性を有する遺伝子との間で、10 CT から 15 CT の差が出ます。そのため、サンプル中にターゲットトランスクリプトと最も相同性が高いトランスクリプトに同数のコピーがあった場合、最も相同性が高いトランスクリプトの1000 から 30,000 倍の感度でターゲットトランスクリプトを検出できます。

_sH

_gH

_u このアッセイのアンプリコンはエクソン結合部に広がり、プロ－ブはそのうちの一つのエクソン内に完全に配置されます。






a. ホームページの［TaqMan® Products］（TaqMan® 製品）から、［TaqMan® GeneExpression Assays］を選択します。

b. ［Gene Expression Assays & Arrays］のページで、

• ［Individual Assays］（個別のアッセイ）にて TaqMan® Gene ExpressionAssays を選択します。このオプションを選択すると、FAM 色素ラベル化

プローブを含むTaqMan Endogenous Control Assaysをはじめとして、全

TaqMan Gene Expression Assays へリンクされます。

または

• ［Individual Control Assays］（個別のコントロールアッセイ）にて

「TaqMan® Endogenous Control Assays」を選択します。このオプショ

ンを選択すると、個別の TaqMan Endogenous Control Assays（FAM 色素

ラベル化 TaqMan MGB プローブ、VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プ

ローブ、または TAMRA 色素ラベル化プローブを含む）へリンクされます。

• Custom TaqMan Endogenous Control Assays についての情報は、『Using TaqMan®

Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for ExperimentalStudies Application Note』をご参照ください。

• TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、

『TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。


製品の説明 Custom TaqMan® Gene Expression Assays は、TaqMan プローブとプライマーのセット

で、お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assaysサービスが設計、合成、調製したものです。Custom TaqMan Gene Expression Assaysを使うと、どのような生物の遺伝子やスプライシング変異でも有無実験を実施できます。






製品の必要条件 Custom TaqMan Gene Expression Assays には、以下が必要です。

• ターゲット配列に関する提出用ファイル。無償の File Builder ソフトウェアを使用

して提出用ファイルを作成し、Custom TaqMan® Genomic Assays サービスに当該

ファイルを提示してください。




– 20✕ Gene Expression Assay または 60✕ Gene Expression Assay（各ターゲット

に特異的）。各アッセイは、調製済み 20✕ または 60✕ ミックス中に、2 種類の

ターゲット特異的プライマーと FAM™ 色素ラベル TaqMan MGB プローブを含

みます。1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。




– TaqMan® Gene Expression Master Mix または TaqMan Universal PCR MasterMix（with または without AmpErase UNG）。




a. ホームページの［TaqMan® Products］（TaqMan® 製品）から、［TaqMan® GeneExpression Assays］を選択します。

b. ［Gene Expression Assays & Arrays］ページの［Individual Assays］（個別の

アッセイ）で［TaqMan® Gene Expression Assays］を選択します。

• Custom TaqMan Gene Expression Assays の注文方法については、『Custom TaqMan®


• Custom TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法につ

いては、『Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents

製品の説明 Applied Biosystems TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents には、以

下が含まれます。

• 設計済みのプライマーとプローブを含む内在性ポジティブコントロール（IPC）

• IPC DNA テンプレート

• IPC 遮断コントロール

試薬は、以下の作用を示すように設計されています。

• 陰性結果のタイプを区別します。

– ターゲットが陰性で、IPC が陽性の場合、ターゲットは存在していません。

– ターゲットが陰性で、IPC も陰性の場合、PCR の抑制が起こっていることを示

します。

• 内在性コントロールの増幅が起こらないようにします。

• ターゲットの増幅を低下することなく、IPC とターゲットの共増幅を可能にします。

• VIC® 色素ラベルプローブにより IPC を検出します。

• FAM™ 色素ラベルプローブによりターゲットを検出します。

• 広範なサーマルサイクリング条件で、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix（with または without AmpErase® UNG）を用います。

製品の必要条件 TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Kit には、次のコンポーネントが

必要です。

• DNA サンプル

• 目的のターゲット用 TaqMan アッセイ

• TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix（with または without AmpErase UNG）




利用可能なキット Applied Biosystems から、以下の TaqMan Exogenous Internal Positive Control ReagentKit が発売されています。

重要！上記のキットには、TAMRA™ 色素ラベル化プローブが含まれていますが、

Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne シ

ステムで使うことはお勧めしません。当該キットは、StepOnePlus システムで使用でき

ます。TAMRA 色素は、StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使え

ます。

詳細について TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagent を使って PCR 反応を調製する方

法については、『TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol』を


キット部品番号

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕Universal PCR Master Mix (with VIC® dye)

4308320


参考：このキットを使っている場合は、次の TaqMan® 試薬のいずれかを別途購入する必要があります。

• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (PN 4304437)• TaqMan® PCR Core Reagents Kit (PN N808-0228)

4308323





有無実験用の Applied Biosystems の Inventoried/Made to Order アッセイは、以下のマ

スターミックスを用いるように設計されています。

参考： TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕

Universal PCR Master Mix kit（PN 4308320）を購入になる場合は、マスターミックス

を別途購入する必要はありません。


できません。

詳細について TaqMan 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。

• TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol



TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応 4369016







10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG 4324020

TaqMan® PCR Core Reagents Kit N808-0228



実験の設計


Applied Biosystems の Inventoried/Made to Order アッセイは、StepOne ソフトウェア

を用いて有無実験の設計を行います。StepOne ソフトウェアは、自動的に以下の量を計

算します。


• コントロールとサンプル


参考： StepOneソフトウェアで Inventoried/Made to Orderアッセイタイプを選択するに

は、［Design Wizard］（設計ウィザード）または［Advanced Setup］（高度なセットアッ

プ）で［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］（アッセイタ

イプ）ドロップダウンメニューから［Inventoried/Made to Order］（在庫／注文生産）


詳細について StepOneおよびStepOnePlusシステムによる有無実験の設計と実施については、『AppliedBiosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 有無実験入門ガイ

ド』をご参照ください。


ワークフロー StepOne™ ソフトウェアで有無実験にカスタムアッセイを選択する場合には（すなわち、

独自にプライマーとプローブを設計する場合には）、Applied Biosystems のアッセイ設

計ガイドラインのワークフローに従うことをお勧めします。

1. Primer Express® Software を使って、プライマーとプローブを設計します（3-21ページ）。

2. 適切な試薬を選択します（3-24 ページ）。



有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用で

きません。

3. 推奨されたサーマルサイクリング条件を用います（3-27 ページ）。

4. デフォルト設定のプライマーおよびプローブ濃度で開始します。必要に応じて、プ

ライマー濃度（3-30 ページ）およびプローブ濃度（3-33 ページ）を最適化します。



括的にご利用ください。Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの詳細につい

ては、付録 C をご覧ください。

参考： StepOne ソフトウェアで［Custom］（カスタム）アッセイタイプを選択するには、

［Design Wizard］（設計ウィザード）または［Advanced Setup］（高度なセットアップ）

から［Reaction Setup］（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］（アッセイタイ

プ）ドロップダウンメニューで［Custom］（カスタム）を選択します。

A-1Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

A計算式 A

本付録の内容：

標準曲線法を用いた標準偏差の計算 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2

比較法を用いた標準偏差の計算. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-5

比較 CT（∆∆CT）実験用計算式 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-7

A-2 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

付録 A 計算式

標準曲線法を用いた標準偏差の計算

具体例サンプルとリファレンスサンプルの比較

ノーマライズ済みターゲット量（下表の c-mycN）は、単位がない数値で、異なるサンプ

ル中に含まれるターゲットの相対量を比較するために用いることができます。この比較

を行う一つの方法は、サンプルの一つをリファレンスサンプルに指定することです。下表では、脳をリファレンスサンプルとして指定しています。脳は、ターゲットの発現レ

ベルが最も低かったため、恣意的に選択しました。

相対標準曲線実験結果

下表の各 c-mycN 値を脳の c-mycN 値で割って、最終列の数値が得られます。この結果に

より、腎臓サンプルは脳サンプルと比較して、c-myc mRNA の量が 5.5×、肝臓では

34.2×、肺では 15.7× であることが分かります。

相対値を決定するためには、以下のステップを行います。

1. 下表より c-myc および GAPDH の平均値を出します。

2. c-myc の平均値を GAPDH の平均値で割ります。

3. リファレンスサンプルを指定します。

4. サンプルの平均値をリファレンスサンプルの平均値で割ります。

組織総 c-myc Raji RNA 量

（ng）総 GAPDH Raji RNA 量

（ng）

c-mycN（GAPDH に対しノーマライズ）‡

c-mycN（脳に対する相対値）§

脳 0.033 0.51

0.043 0.56

0.036 0.59

0.043 0.53

0.039 0.51

0.040 0.52

平均 0.039±0.004 0.54±0.034 0.07±0.008 1.0±0.12

腎臓 0.40 0.96

0.41 1.06

0.41 1.05

0.39 1.07

0.42 1.06

0.43 0.96

平均 0.41±0.016 1.02±0.052 0.40±0.025 5.5±0.35


付録 A 計算式

‡ c-mycN値は、c-mycの平均値をGAPDHの平均値で割って求めます。商の標準偏差は、c-mycおよびGAPDH値の標準偏差から計算しま

す。「計算式」（A-4 ページ）をご参照ください。

§ 脳に対する c-mycN の相対値を計算するには、リファレンスサンプル値による割り算を行います。この割り算は、任意定数による割り

算なので、この結果の cv は c-mycN の cv と同じです。

肝臓 0.67 0.29

0.66 0.28

0.70 0.28

0.76 0.29

0.70 0.26

0.68 0.27

平均 0.70±0.036 0.28±0.013 2.49±0.173 34.2±2.37

肺 0.97 0.82

0.92 0.88

0.86 0.78

0.89 0.77

0.94 0.79

0.97 0.80

平均 0.93±0.044 0.81±0.041 1.15±0.079 15.7±1.09

組織総 c-myc Raji RNA 量

（ng）総 GAPDH Raji RNA 量

（ng）

c-mycN（GAPDH に対しノーマライズ）‡

c-mycN（脳に対する相対値）§


付録 A 計算式

計算式 c-mycN 値は、c-myc の平均値を GAPDH の平均値で割って求めます。商の標準偏差は、

次の式により、c-myc および GAPDH 値の標準偏差から計算します。

ここで、

例として、A-2 ページにある表の脳サンプルを使うと、

および

次の関係が成立するので、

cv cv12

cv22+=

cv sX--- stddev

meanvalue----------------------------= =

cv10.0040.039-------------=

cv20.0340.54

-------------=

cv0.0040.039-------------⎝ ⎠

⎛ ⎞ 2 0.0340.54-------------⎝ ⎠

⎛ ⎞ 2+ 0.12==

cv sX---=

s cv( ) X( )=

s 0.12( ) 0.07( )=

s 0.008=


付録 A 計算式

比較法を用いた標準偏差の計算

具体例 A-2 ページの表に示す c-myc および GAPDH mRNA 量を求めるために用いた CT デー

タを使って、∆∆CT の計算方法を説明します。下表に、ヒトの脳、腎臓、肝臓および肺サ

ンプルによる CT 平均値を示すとともに、これらの CT 値を用いて ∆CT、∆∆CT および c-myc mRNA の相対量を決定する方法を示します。これらの結果は、標準曲線法により求

めた c-myc の相対量にほぼ合致します。

‡ ∆CT 値は、GAPDH の CT 平均値を c-myc の CT 平均値から差し引いて求めます。差の標準偏差は、c-myc および GAPDH 値の標準偏

差から計算します。「計算式」（A-6 ページ）をご参照ください。

§ ∆∆CT の計算には、リファレンスサンプルの ∆CT 値による引き算が含まれます。この引き算は、任意定数による引き算なので、∆∆CTの標準偏差は、∆CT 値の標準偏差と同じです。

# 脳に対する c-mycN の範囲は、2 –∆∆CT に ∆∆CT + s および ∆∆CT – s を代入して求めることができます。ここで、s は、∆∆CT 値の標準偏差です。

組織c-myc のCT 平均値

GAPDH のCT 平均値

∆CTc-myc–GAPDH‡

∆∆CT∆CT–∆CT, 脳

§c-mycN

（脳に対する相対値）#

脳 30.49±0.15 23.63±0.09 6.86±0.17 0.00±0.17 1.0(0.9–1.1)

腎臓 27.03±0.06 22.66±0.08 4.37±0.10 –2.50±0.10 5.6(5.3–6.0)

肝臓 26.25±0.07 24.60±0.07 1.65±0.10 –5.21±0.10 37.0 (34.5–39.7)

肺 25.83±0.07 23.01±0.07 2.81±0.10 –4.05±0.10 16.5 (15.4–17.7)


付録 A 計算式

計算式 ∆CΤ 値は、GAPDH の CT 平均値を c-myc の CT 平均値から差し引いて求めます。差の標

準偏差は、次の式により、c-myc および GAPDH 値の標準偏差から計算します。

ここで、

s は標準偏差です。

例として、A-5 ページの表にある脳サンプルを使うと、

および

s s12

s22

+=

s1 0.15=

s2 0.09=

s 0.15( )20.09( )2

+ 0.17==


付録 A 計算式

比較 CT（∆∆CT）実験用計算式

計算式内在性コントロールに対してノーマライズしたターゲット量のリファレンスサンプル量

に対する相対比率は、以下により計算されます。

2 –∆∆CT

計算式の導出 PCR の指数関数的増幅を示す式は、

ここで、

• xn = n サイクルにおけるターゲット分子数

• xo = 最初のターゲット分子の数

• Ex = ターゲット増幅効率

• n = サイクル数

• Xo = 最初のターゲット分子の数

threshold cycle（CT）は、増幅したターゲット量が特定の閾値に達するサイクル数です。

よって、

ここで、

• xT = ターゲット分子の閾値数

• CT, X = ターゲット増幅の threshold cycle

• KX = 定数

内在性コントロール反応に対しても同じようにして、

ここで、

• RT = リファレンス分子の閾値数

• Ro = 最初のリファレンス分子の数

• ER = リファレンス増幅効率

• CT, R = リファレンス増幅の threshold cycle

• KR = 定数

XT を RT で割ると、次の式が得られます。

Xn Xo 1( EX )+× n=

XT Xo 1( EX )+× CT X, KX= =

RT Ro 1( ER )+× CT R, KR= =

XT

RT

------Xo 1( EX )

CT X,+×

Ro 1( ER )CT R,+×

------------------------------------------ KX

KR

------ K===


付録 A 計算式

XT および RT の正確な値は、以下の要素によって変わります。

• プローブに使用したレポーター色素

• 配列がプローブの蛍光特性に及ぼす影響

• プローブの開裂効率

• プローブの純度

• 蛍光の閾値の設定

そのため、定数 K は 1 であるとは限りません。

ターゲットとリファレンスとで増幅効率が等しいと仮定すると、

EX = ER = E

すなわち、

ここで、

• XN = XO/RO（ノーマライズしたターゲット量）

• ∆CT = CT, X – CT, R（ターゲットとリファレンスの threshold cycle 数の差）

上式を変換すると、次の式が得られます。

最後に、サンプル（q）に対する XN をリファレンスサンプル（cb）に対する XN で割ると、

ここで、

• ∆∆CT = ∆CT, q – ∆CT, cb

Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従って設計、最適化を行ったアンプ

リコン（サイズ <150 bp）では、増幅効率がほぼ 1 となります。それゆえ、内在性コン

トロールに対してノーマライズしたターゲット量のリファレンスサンプル量に対する相

対比率は、次の式で表されることになります。

2 –∆∆CT

Xo

Ro

----- 1( E ) K=CT X, C– T R,+×

XN 1( E )CT∆

+× K=

XN K 1 E+( )CT∆–

×=

XN q,

XN cb,------------- K 1( E )

CT q,∆–+×

K 1( E )CT cb,∆–

+×------------------------------------------- 1(= E )

CT∆∆–+= =

B-1Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

Bマルチプレックス PCR における

プライマーの制限 B

正確なマルチプレックスアッセイを行うためには、ある種類の増幅が他の増幅を大きく

超えないことが重要になります。そうでないと、量の多い種類の増幅によって、量の少

ない種類の増幅がうまく起こらなくなります。量の少ない種類が効率よく増幅しない場

合、実験が不正確な結果となります。また、極端な場合には、量の少ない種類が全く検

出されないこともあります。このような状況を防ぐには、量の多い種類を増幅するプラ

イマー濃度を制限して、CT に到達後に増幅を停止することが必要となります。

プライマーの制限によって、両方のアッセイに共通する反応コンポーネントを使い切る

ことがないので、量の少ない種類が効率よく増幅できます。量の多い種類が不明な場合

には、マルチプレックス PCR を行う前に、両ターゲットを別のチューブに入れて測定し

て、量の多い種類を特定する必要があります。いずれの種類も一貫して量が多いわけで

はない場合には、両方の増幅に対してプライマーの制限を行うべきです。

ターゲットおよびリファレンスの

相対量に関する検討

ターゲットおよび内在性コントロールの増幅に対してプライマー制限を行う場合には、

両種の相対量を考慮しなければなりません。定量実験では、rRNA を内在性コントロー

ルとして使用することができます。全 RNA 中の rRNA 濃度は、ターゲット mRNA 濃度

よりも常に高いので、ターゲットと rRNA の両方を増幅するマルチプレックス反応では、

rRNA プライマーの濃度だけを制限する必要があります。

プライマー制限マトリックス

プライマー制限濃度を決定するため、テンプレートの初期量を最小にして、フォワード

プライマーおよびリバースプライマー濃度の組み合わせ（マトリックス）により測定を

行います。その目的は、CT 値に影響を及ぼすことなく、アッセイの ∆Rn 値を低下させ

るプライマー濃度を特定することです。以下の表に、フォワードプライマーおよびリバー

スプライマー濃度を20から100 nMまで変化させた推奨組み合わせパターンを示します。

参考：設計基準に従うことによって、プライマー制限濃度を見つけやすくなりますが、

アッセイによっては見つからない場合もあります。プライマー制限マトリックス実験に

よってプライマー制限濃度を決定できない場合には、プライマーを少なくとも 1 つ再設

計するか、別のチューブで反応を測定することが必要となります。

フォワードプライマー：リバースプライマー：

100 nM100 nM

100 nM80 nM

100 nM60 nM

100 nM40 nM

100 nM20 nM


80 nM100 nM

80 nM80 nM

80 nM60 nM

80 nM40 nM

80 nM20 nM


60 nM100 nM

60 nM80 nM

60 nM60 nM

60 nM40 nM

60 nM20 nM

B-2 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド


具体例プライマー制限マトリックス実験結果を図 B-1（B-3 ページ）に示します。

• 図 B-1a では、プライマー濃度を約 50 nM 以下にした場合にのみ、CT 値に影響が

見られます。プラトー領域は、適切なプライマー制限濃度を見つけることができる

領域です。この領域では、CT 値（およびそれに対応する定量値）は変化しません

が、∆Rn 値とそれに対応した生成物の収率は大きく低下します。

• 図 B-1b は、プライマー濃度と ∆Rn 値との対応関係を示します。図から、フォワー

ドプライマーおよびリバースプライマー濃度を減少することによって、生成物の収

率が低下することが分かります。

この例では、プライマー制限濃度として、フォワードプライマーおよびリバースプライ

マー濃度を 50 nM 以上とすることが適当です。強い発生信号によってソフトウェアがマ

ルチコンポーネンティングを正確に行えるようアッセイがプライマー制限をしている場

合でも、プローブ濃度は最適レベルに保つことが必要です。


40 nM100 nM

40 nM80 nM

40 nM60 nM

40 nM40 nM

40 nM20 nM


20 nM100 nM

20 nM80 nM

20 nM60 nM

20 nM40 nM

20 nM20 nM


100 nM100 nM

100 nM80 nM

100 nM60 nM

100 nM40 nM

100 nM20 nM

B-3Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド


図 B-1 プライマー制限マトリックス実験の結果

(a) は、フォワードプライマーおよびリバースプライマー濃度によって CT 値が変化する

様子を示します。図示したプラトー領域は、CT 値が一定になる領域です。 (b) は、値がプライマー濃度の減少により低下する様子を示します。 ∆Rn

B-4 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド


C-1Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

Cアッセイ設計ガイドライン C

アッセイ設計ガイドラインについて

独自にアッセイ（プライマーとプローブ）を設計する際には、Applied Biosystems の

アッセイ設計ガイドラインに従うことをお勧めします。アッセイ設計ガイドラインに

よって、以下のことが可能となります。

1. Primer Express® Software を用いたプライマーとプローブの設計－ Primer ExpressSoftware は、デフォルト設定のパラメータを用いて、自動的にプライマーとプロー

ブのセットを選びます。

2. 適切な試薬の選択－数種類のTaqMan®およびSYBR® Green試薬が利用可能です。

使用する試薬は、アッセイタイプに応じて変わります。

3. 推奨サーマルサイクリング条件の使用－サンプル（DNA/cDNA、1 ステップ PCR用 RNA、2 ステップ PCR 用 RNA）に対して推奨されるサーマルサイクリング条

件を使用します。

参考： Fast 試薬用のサーマルサイクリング条件は、標準試薬用のサーマルサイクリ

ング条件と異なります。

4. デフォルト設定によるプライマーとプローブ濃度の使用またはプライマーとプ

ローブ濃度の最適化－ Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインを使用す

ると、デフォルト設定による非マルチプレックス最適化アッセイ用プライマーとプ

ローブ濃度を使用したり、プライマーとプローブ濃度を最適化することができま

す。



括的にご利用ください。

参考： Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従った場合でも、すべての

アッセイで同じレベルの性能と感度が保証されるわけではありません。最も綿密に設定

された設計パラメータであっても、異なる 2 アッセイシステム間の違いに対応できない

場合があります。

定量実験の総括一般論として、定量実験にアッセイ設計ガイドラインを使用する場合には、次のように

総括できます。

• TaqMan アッセイでは、DNA または cDNA をテンプレートに使用する際、プライ

マー濃度を 900nM、プローブ濃度を 250nM とすると、ほとんどの場合に再現性の

ある高感度のアッセイが行えます。

• SYBR® Green I Dye は、検出反応が非特異的なので、最適化を行わない場合には

注意が必要です。しかし、ガイドラインに完全に準拠し、DNA または cDNA をテ

ンプレートに使用する際には、フォワードプライマーおよびリバースプライマー濃

度をそれぞれ 50nM とすると、特異性が高く、強い増幅が行われます。融解曲線ま

たはゲル解析を使って、非特異的生成物の形成をチェックして、この確認を行って

ください。

C-2 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

付録 C アッセイ設計ガイドライン

• TaqMan アッセイでは、ほとんどの場合にターゲット数が 50 コピー未満でも正確

に検出、定量ができ、更に高い感度も可能です。

• SYBR Green 試薬も性能は同等ですが、非特異的生成物が形成することによって、

検出限界が上昇する可能性があります。

ジェノタイピング実験の総括

一般論として、ジェノタイピング実験にアッセイ設計ガイドラインを使用する場合には、

次のように総括できます。

プライマー濃度を 900nM、プローブ濃度を 200nM、ゲノム DNA 量を 1 から 20ng とす

ることによって、再現性があり感度が高いアッセイ結果が得られます。

D-1Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

D試薬部品番号 D

本付録の内容：

定量実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2

ジェノタイピング実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5

有無実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7

D-2 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド


定量実験


アッセイ

マスターミックス


アッセイ

製品部品番号

TaqMan® Gene Expression Assays 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください：



参考：FAM™ 色素ラベル化 TaqMan® EndogenousControl Assays は、Inventoried TaqMan GeneExpression Assays として含まれています。





TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase® UNG、250 反応

4352042







製品部品番号

カスタム TaqMan® プローブとプライマー最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください：








TaqMan® 試薬 TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応

4369016


4369542

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase® UNG、250 反応

4352042





4324018


4326614


4324020


SYBR® Green 試薬 Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL)、40 反応

4368577

Power SYBR® Green PCR Master Mix (5 mL)、200 反応

4367659

Power SYBR® Green PCR Master Mix（10 × 5 mL)、2000 反応

4368708

Power SYBR® Green PCR Master Mix（50 mL）、2000 反応

4367660

SYBR® Green PCR Master Mix（1 mL）40 反応 4344463

SYBR® Green PCR Master Mix（5 mL）、200 反応 4309155

SYBR® Green PCR Master Mix（50 mL）、2000 反応

4334973

SYBR® Green PCR Core Reagents、200 反応 4304886






TaqMan® 試薬 TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix ReagentsKit

4309169


参考：高温 RT ステップが必要な場合には、TaqMan®

EZ RT-PCR Core Reagents を使用してください。

N808-0236

SYBR® Green 試薬 Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit 4368711


試薬ステップキット部品番号

TaqMan®

試薬PCR ステップのみ


4369016


4369542

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix

4304437

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase® UNG

4352042



4374966


N808-234



SYBR® Green試薬

PCR ステップのみ

Power SYBR® Green PCR Master Mix 4367659

SYBR® Green PCR Master Mix 4309155



4374966


N808-234


Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit

4368711






アッセイ





アッセイ

製品部品番号

TaqMan® SNP Genotyping Assays 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください：



Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for AllelicDiscrimination










製品部品番号

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください：




















有無実験


アッセイ

TaqManExogenous IPC

試薬

重要！上記のキットには、TAMRA™ 色素ラベル化プローブが含まれていますが、

Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne シ

ステムで使うことはお勧めしません。当該キットは、StepOnePlus システムで使用でき

ます。TAMRA 色素は、StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使え

ます。

製品部品番号

TaqMan® Gene Expression Assays 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください：



参考：FAM™ 色素ラベル化 TaqMan® EndogenousControl Assays は、Inventoried TaqMan GeneExpression Assays として含まれています。



TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕

Universal PCR Master Mix（with VIC® dye）4308320


参考：このキットを使っている場合は、次の TaqMan® 試薬のいずれかを別途購入する必要があります。

• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix（PN 4304437）• TaqMan® PCR Core Reagents Kit（PN N808-0228）

4308323





参考： TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕

Universal PCR Master Mix kit（PN 4308320）を購入になる場合は、マスターミックス

を別途購入する必要はありません。


できません。


アッセイ










TaqMan® PCR Core Reagents Kit N808-0228

製品部品番号

カスタム TaqMan® プローブとプライマー最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイトをご覧ください：







できません。



できません。



できません。












TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit 4309169


参考：高温 RT ステップが必要な場合には、TaqMan® EZ RT-PCR CoreReagents を使用してください。

N808-0236

ステップキット部品番号

PCR ステップのみ TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack （1 × 5 mL）、200 反応

4369016


4369542

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix 4304437

RT ステップのみ High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit 4374966

TaqMan® Reverse Transcription Reagents N808-234





参考文献- 1Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

参考文献

Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., et al. 1997. Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res. 25:2657–2660.

Förster, V. T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physics (Leipzig) 2:55–75.

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10:413–417.

Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Kinetic PCR:Real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11:1026–1030.

Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997. Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base composition and backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res. 25:3718–3723.

Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature 339:237–238.

Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2–∆∆CT Method. Methods 25:402–408.

Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125–128.

Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350–1354.

参考文献- 2 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

参考文献

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド用語集- 1

用語集

Advanced Setup（高度なセットアップ）

StepOne™ ソフトウェアの機能で、実験を自分の実験設計に従ってセットアップできま

す。Advanced Setup（高度なセットアップ）により、実験の設計やセットアップが自由

に行えます。

AIF 「アッセイ情報ファイル（AIF）」をご参照ください。

Assay ID（アッセイ ID）

Applied Biosystems が TaqMan® Gene Expression Assay や TaqMan® SNP GenotypingAssay に割り当てる識別名。

AutoDelta（オートデルタ）

サイクリングステージ内のその後の各サイクルでステップの温度や時間を増減する測定

方法の設定。AutoDelta がサイクリングステージで有効の場合、設定はサーマルプロファ

イル内のアイコンで示されます。

• AutoDelta オン：

• AutoDelta オフ：

CT 「Threshold cycle（CT）」をご参照ください。

delta Rn（∆Rn）「ベースライン修正したノーマライズ済みレポーター（∆Rn）」をご参照ください。

Design Wizard（設計ウィザード）

実験のセットアップを補助する StepOne™ ソフトウェアの機能で、希望の実験設計を入

力すると、最良の実施法を表示します。

Diluted Sample Concentration （10✕ for Reaction Mix）（希釈サンプル濃度（反応ミックスでは 10 倍））

StepOne™ ソフトウェアでは、このソフトウェアフィールドは、［Reaction Setup］（反応

セットアップ）画面の［Sample Dilution Calculations］（サンプル希釈計算）タブに表

示されます。このフィールドに、すべての実験サンプルについて、反応ミックスに添加

するサンプルの濃度を入力します。“10✕ for Reaction Mix”（反応ミックスでは 10 倍）

は、反応ミックスのサンプルまたはスタンダード成分が 10✕ 濃度であるとソフトウェア

が仮定することを示します。例えば、希釈サンプル濃度 50.0 ng/µL（10✕）の場合、反

応の最終サンプル濃度は 5 ng/µL（1✕）です。

EFF% 「増幅効率（EFF%）」をご参照ください。

Inventoried アッセイ過去に製造され、品質管理仕様に合格し、在庫保管される TaqMan® Gene ExpressionAssays および TaqMan® SNP Genotyping Assays。

用語集- 2 Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

用語集

IPC 有無実験における内在性ポジティブコントロール（IPC）の略語。StepOne™ ソフトウェ

アでは、IPC を含むが IPC 遮断剤を含まないウェル内の IPC ターゲットのタスク。「内

在性ポジティブコントロール（Internal positive control：IPC）」をご参照ください。

IPC+ 「ネガティブコントロール IPC ウェル」をご参照ください。

IPC 遮断剤 PCR 反応に添加して内在性ポジティブコントロール（IPC）の増幅をブロックする試薬。

Made-to-orderアッセイ

注文後に製造する TaqMan® Gene Expression Assay または TaqMan® SNP GenotypingAssay。製造品質管理仕様に合格したアッセイのみ出荷されます。

PCR 後の読み取りジェノタイピングおよび有無実験で使用する装置での測定の一部で、増幅後に行われま

す。ジェノタイピング実験では、PCR 後の読み取り時に収集した蛍光データをアレル識

別プロットに表示し、アレルコールに使用します。有無実験では、PCR 後の読み取り時

に収集した蛍光データを有無プロットに表示し、検出コールに使用します。別称「エン

ドポイント読み取り」。

PCR 前の読み取りジェノタイピングおよび有無実験で使用する装置での測定の一部で、増幅前に行われま

す。PCR 前の読み取りは、オプションですが、選択することをお勧めします。PCR 前

の読み取りで収集した蛍光データを使用して、PCR 後の読み取りで収集した蛍光データ

をノーマライズすることができます。

Pure Dye 「カスタム色素」および「システム色素」参照。

QuickStart（クイックスタート）

StepOne™ および StepOnePlus™ システムの機能で、プレートセットアップ情報を入力し

なくても実験を実施できます。QuickStart には、装置の電源がオンであり、装置コン

ピュータ間の接続を変更していないコロケーションレイアウトが必要となります。

R2 値回帰係数。標準曲線内の回帰直線から計算します。R2 値は、標準曲線回帰直線と、スタ

ンダード反応の各 CT データポイントとのフィットの近似を示します。値が 1.00 なら、

回帰直線とデータポイントとの完全フィットを示します。

refSNP ID リファレンス SNP（refSNP）クラスタ ID を識別する数字。国立バイオテクノロジー情

報センター（NCBI）にあるヌクレオチド配列変異の一塩基多型データベース（dbSNP）により作成されます。 refSNP ID は、Applied Biosystems Store で Applied BiosystemsSNP Genotyping Assay の検索に使用できます。別称「rs 番号」。

Remote Monitor（遠隔監視）

StepOne™ソフトウェアの機能で、StepOne™またはStepOnePlus™装置を監視できます。

遠隔監視により、装置のステータスを監視したり、実験を装置に転送したり、リアルタ

イムで増幅プロットや温度プロットを監視したり、結果をコンピュータにダウンロード

できます。 StepOne または StepOnePlus 装置は、［Remote Monitor］（遠隔監視）では操

作できません。

用語集- 3Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

用語集

Rn 「ノーマライズ済みレポーター（Rn）」をご参照ください。

ROX™ 色素 Applied Biosystems が製造し、StepOne™ および StepOnePlus™ システムで事前キャリ

ブレーションされている色素。ROX 色素は、パッシブリファレンスとして使用されます。

rs 番号「refSNP ID」をご参照ください。

Sample Library（サンプルライブラリ）

StepOne™ ソフトウェアでのサンプルのコレクション。サンプルライブラリには、サンプ

ル名とサンプルの色が含まれます。

Sample or Standard（10✕）（サンプルまたはスタンダード（10 倍））

StepOne™ ソフトウェアでは、この反応コンポーネントは、［Reaction Setup］（反応セッ

トアップ）画面の［Reaction Mix Calculations］（反応ミックス計算）タブに表示されま

す。本ソフトウェアは、反応ミックスへ添加するサンプルまたはスタンダードが 10✕ 濃

度であると仮定します。例えば、反応量 20 µL の場合、1 反応の計算サンプルまたはス

タンダード量は 2 µL です。

SNP 「一塩基多型」の略語。SNP は、一塩基の違いや一塩基の挿入や欠失などです。

SNP Assay Library（SNP アッセイライブラリ）

StepOne™ソフトウェアで、ジェノタイピング実験に追加するSNPアッセイのコレクショ

ン。ライブラリの SNP アッセイには、SNP アッセイ名や SNP アッセイカラーの他、各

アレルに対してアレル名や塩基、レポーター、クエンチャーおよびアレルカラーが含ま

れます。ライブラリ中の SNP アッセイには、アッセイ ID や SNP アッセイに関するコ

メントを追加することができます。

SNP アッセイジェノタイピング実験で使用する、SNP 増幅用プライマーと、異なるアレルの検出用の

2 プローブを含む PCR 反応。

SYBR® Green 試薬ターゲット増幅用の 2 つのプライマーと、二本鎖 DNA 検出用 SYBR® Green 色素から

なる PCR 反応コンポーネント。

TaqMan® 試薬ターゲット増幅用プライマーと、ターゲット増幅検出用TaqMan®プローブからなるPCR反応コンポーネント。

Target Library（ターゲットライブラリ）

StepOne™ ソフトウェアで、実験に追加するターゲットのコレクション。ライブラリの

ターゲットには、ターゲット名、レポーター、クエンチャーとサンプルの色が含まれま

す。ライブラリのターゲットには、さらにターゲットに関するコメントを追加すること

ができます。

Threshold cycle（CT）

蛍光レベルが増幅プロットの閾値と一致する PCR サイクル数。

Tm 「融解温度（Tm）」をご参照ください。


用語集

VeriFlex™ 技術 StepOnePlus™ 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、96 サン

プルウェルに対して温度の異なる6つのゾーンを設定できます。 StepOne™ソフトウェア

で VeriFlex ブロックを有効にすると、各 VeriFlex ブロックに異なる温度を設定できるよ

うになります。

y 切片標準曲線で、回帰直線が y 軸と交わる点。y 切片は、量が 1 のサンプルに対する期待

Threshold cycle（CT）を示します。

アッセイ StepOne™ および StepOnePlus™ システムにおいて、ターゲット増幅用プライマーと、増

幅したターゲットを検出する試薬を含む PCR 反応ミックス。

アッセイミックス Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assay や TaqMan® SNP GenotypingAssay に含まれる PCR 反応コンポーネント。アッセイミックスには、ターゲット増幅用

プライマーと、ターゲット増幅検出用 TaqMan® プローブが含まれます。

アッセイ情報ファイル（AIF）

各アッセイのご注文ごとに CD で発送されるデータファイル。ファイル名には、プレー

ト上のバーコード番号が含まれます。AIF 内の情報は、タブ区切りフォーマットで提供

されます。

アレルあるターゲットで、集団内に見られる異なる複数のシーケンス。

アレル識別プロット PCR 後の読み取りで収集したデータの表示。アレル識別プロットはアレル 1 プローブか

らのノーマライズ済みレポーター信号を、アレル 2 プローブからのノーマライズ済みレ

ポーター信号に対してプロットしたグラフです。

アンプリコン PCR で増幅する DNA セグメント。

域外値あるデータセットで、その他より有意に小さいか大きいデータポイント。

ウェル拒絶ソフトウェアが解析時に実行し、特定フラッグがウェルに適用された場合に、それらの

ウェルを以後の解析から除外する操作。拒絶したウェルは、拒絶の時点までの結果を示

します。

ウェル削除再解析前に、1 つ以上のウェルを解析から削除する操作。削除したウェルにはアルゴリ

ズムが適用されないので、削除したウェルの結果は出ません。

エンドポイント読み取り

「PCR 後の読み取り」をご参照ください。

温度プロット StepOne™ソフトウェアによる、StepOne™またはStepOnePlus™装置測定時のサンプル、

装置カバー、装置ブロックの温度表示。

回帰係数標準曲線での回帰直線からの計算値。R2 値、傾き、y 切片があります。回帰係数を使用

し、スタンダードからの結果品質を評価できます。「標準曲線」も参照。


用語集

回帰直線標準曲線および相対標準曲線実験で、標準曲線の最も良くフィットするライン。回帰直

線の計算式：

CT = m [log (Qty)] + b

m は傾き、b は y 切片、Qty はスタンダード量です。

「回帰係数」をご参照ください。

開始量 StepOne™ ソフトウェアで標準曲線を設定する際の、最大または最小の量に相当します。

解離曲線「融解曲線」をご参照ください。

カスタム色素提供元が Applied Biosystems でない色素。StepOne™ および StepOnePlus™ システムで

は、カスタム色素を実験に使用できます。カスタム色素を使用する場合には、そのカス

タム色素を Dye Library に追加し、カスタム Dye キャリブレーションを行う必要があり

ます。


StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ シス

テムでレポーターやクエンチャーとして使えます。

傾き回帰係数。標準曲線内の回帰直線から計算します。傾きは、アッセイの PCR 増幅効率を

示します。傾きが –3.32 の場合、100% の増幅効率を示します。「増幅効率（EFF%）」お

よび「回帰直線」をご参照ください。

希釈液サンプルやスタンダードを PCR 反応に添加する前の希釈に使用する試薬。希釈液には、

水やバッファーが使われます。

希釈係数「シリアル係数」をご参照ください。

逆転写酵素 RNA を cDNA に変換する酵素。逆転写酵素の PCR 反応への添加により、1 ステップ

RT-PCR を実施できます。

キャリブレータ「リファレンスサンプル」をご参照ください。

空間キャリブレーション StepOne™ および StepOnePlus™ システムのキャリブレーションの 1 タイプで、システム

がサンプルブロック中のウェル位置をマッピングします。空間キャリブレーションの

データによって、ソフトウェアは測定中に、蛍光の増加を反応プレートの特定ウェルに

関連付けできます。


用語集

クエンチャー TaqMan® プローブの 3′ 末端に結合する分子。これにより、レポーターの蛍光信号放射

は、プローブがインタクトな時は阻止されます。TaqMan® 試薬には、非蛍光クエンチャー

- マイナーグルーブバインダー（NFQ-MGB）をクエンチャーとして使用できます。

SYBR®Green 試薬には、クエンチャーは使用しません。




ケミストリ「試薬」をご参照ください。

コロケーションレイアウト

このシステムレイアウトでは、StepOne™またはStepOnePlus™装置を黄色いケーブルで、

近接するコンピュータに直接接続します。このレイアウトでは、近接するコンピュータ

や装置のタッチスクリーンから StepOne™ ソフトウェアによる装置のコントロールがで

きます。

サーマルプロファイル StepOne™またはStepOnePlus™装置測定のすべてのステップおよびステージにおける温

度、時間、ランプ、データ収集ポイントを指定する測定方法の一部。

サイクリングステージサーマルプロファイル内で繰り返されるステージ。増幅ステージとも呼ばれます。サイ

クリングステージでは、AutoDelta 設定が可能です。「増幅ステージ」をご参照ください。

サイクル閾値「Threshold cycle（CT）」をご参照ください。

サンプルテストするテンプレート。

サンプル DNA（10✕） StepOne™ ソフトウェアでは、この反応コンポーネントは、［Reaction Setup］（反応セッ

トアップ）画面の［Reaction Mix Calculations］（反応ミックス計算）タブに表示されま

す。本ソフトウェアは、反応ミックスへの添加サンプル DNA が 10✕ 濃度であると仮定

します。例えば、反応量 20 µL の場合、1 反応の計算サンプル量は 2 µL です。

サンプル／SNP アッセイ反応

ジェノタイピング実験の 1 つの PCR 反応でテストするサンプルと実施する SNP のアッ

セイの組み合わせ。各 PCR 反応には、サンプルと SNP の各 1 アッセイのみ含めること

ができます。

サンプル／ターゲット反応

定量実験の 1 つの PCR 反応でテストするサンプルと実施する SNP のアッセイの組み合

わせ。［Design Wizard］（設計ウィザード）で、1 回の PCR 反応には、1 つのターゲッ

トのみ検出と定量ができます。［Advanced Setup］（高度なセットアップ）により、1 回

の PCR 反応において、複数のターゲットの検出と定量ができます。


用語集

閾値 1. 増幅プロットでベースラインよりも高く、指数増幅領域内の蛍光レベル。閾値は、

自動で（「自動 CT」参照）、また手動で（「手動 CT」参照）設定できます。

2. 有無実験で、StepOne™ ソフトウェアが検出コールを発信する蛍光レベル。

システム色素 Applied Biosystems が製造し、StepOne™ または StepOnePlus™ システムで事前キャリ

ブレーションされている色素。実験にシステム色素を使用する前に、［InstrumentMaintenance Manager］（装置メンテナンスマネージャ）でシステム Dye キャリブレー

ションが最新であることを確認してください。

StepOne システム用システム色素：

• FAM™ 色素

• JOE™ 色素

• ROX™ 色素

• SYBR® Green 色素

• VIC® 色素

StepOnePlus システム用システム色素：

• FAM™ 色素

• JOE™ 色素

• NED™ 色素

• ROX™ 色素

• SYBR® Green 色素

• TAMRA™ 色素

• VIC® 色素




実験 StepOne™ または StepOnePlus™ システムでの測定実施のプロセス全体を指し、セット

アップ、測定、解析を含みます。 StepOne および StepOnePlus システムを用いて実施で

きる実験のタイプ：

• 定量 - 標準曲線

• 定量 - 相対標準曲線

• 定量 - 比較 CT（∆∆CT）

• 融解曲線


• 有無実験


用語集

実験タイプ StepOne™ または StepOnePlus™ システムを用いて実施できる実験のタイプ：

• 標準曲線法



• 融解曲線（［Design Wizard］（設計ウィザード）では使用できません）


• 有無実験

実験タイプの選択は、セットアップ、測定、解析の画面に影響します。

実験名実験セットアップ時に入力する名前で、実験の識別に使用します。実験名は 100 文字以

内とし、下記の文字は使用できません。スラッシュ（/）、バックスラッシュ（\）、大なり

記号（>）、小なり記号（<）、アスタリスク（*）、クエスチョンマーク（?）、引用符（"）、バー（|）、コロン（:）、セミコロン（;）

自動 CT この解析設定では、ソフトウェアが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値

や閾値を計算します。ソフトウェアは、ベースラインと閾値を使用して Threshold cycle（CT）を計算します。「Threshold cycle（CT）」をご参照ください。

自動ベースラインこの解析設定では、ソフトウェアが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値

を計算します。反応プレート中の特定のウェルに対して自動ベースライン設定を行えま

す。「ベースライン」をご参照ください。

試薬ターゲット増幅と増幅検出に使用する PCR 反応コンポーネント。StepOne™ および

StepOnePlus™ システムで使用する試薬のタイプ：

• TaqMan® 試薬


• その他の試薬

手動 CT この解析設定では、ユーザーが閾値を入力し、自動ベースラインまたは手動ベースライ

ン値のどちらかを選択します。ソフトウェアは、ベースラインと閾値を使用して

Threshold cycle（CT）を計算します。

手動ベースラインこの解析設定では、ユーザーが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値を入

力します。反応プレート中の特定のウェルに対して手動ベースライン設定を行えます。

シリーズ「スタンダード希釈シリーズ」をご参照ください。

シリアル係数 StepOne™ ソフトウェアで、標準曲線における量のシーケンスを設定する数値。シリアル

係数と開始量から、標準曲線の各ポイントのスタンダード量が計算されます。例えば、

標準曲線の定義シリアル係数が 1：10 か 10✕ のときは、曲線での隣接 2 ポイント間の差

は 10 倍です。


用語集

スタンダード既知の標準量を含むサンプル。スタンダード反応は、定量実験で使用して標準曲線を作

成します。「標準曲線」および「スタンダード希釈シリーズ」をご参照ください。

スタンダード希釈シリーズ

標準曲線および相対標準曲線実験で、ある範囲の既知量を含むスタンダードのセット。

スタンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。例えば、

スタンダード原液から第一希釈ポイントを調製し、第一希釈ポイントから第二希釈ポイ

ントを調製します。スタンダード希釈シリーズの調製に必要な量は、StepOne™ ソフト

ウェアによって、希釈ポイント数、スタンダードの反復数、開始量、シリアル係数、ス

タンダード原液濃度から計算されます。「標準曲線」をご参照ください。

スタンドアロンレイアウト

このシステムレイアウトでは、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置は、黄色いケーブル

でコンピュータに接続されません。このレイアウトの場合、装置のコントロールは、装

置のタッチスクリーンのみ可能です。USB ドライブやネットワーク接続により装置とコ

ンピュータ間のデータ転送を行います。

ステージサーマルプロファイル内で、1 つ以上のステップを含むステージ。3 種類のステージがあ

ります。ホールディングステージ（PCR 前の読み取りおよび PCR 後の読み取りを含む）、

サイクリングステージ（増幅ステージとも呼ばれる）および融解曲線ステージです。

ステップサーマルプロファイルのコンポーネント。サーマルプロファイル中の各ステップでは、

ランプ速度（融解曲線ステップのランプ増分）、ホールド温度、ホールド時間（時間幅）

の設定ができ、ステップのランプまたはホールド部分に関しデータ収集をオンまたはオ

フに設定できます。サイクリングステージのステップは AutoDelta ステータスによって

も定義されます。StepOnePlus™ システムには、VeriFlex™ ブロックが含まれており、各

ステップで 6 種類の温度（各 VeriFlex ブロックに一つ）を設定できます。

生データプロット各光学フィルタの（ノーマライズしていない）生の蛍光シグナルによるプロット。

ゾーン StepOnePlus™ 装置での測定中、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックに設定できる、

96 ウェル内の最高 6 つのサンプル温度領域の一つ。 VeriFlex ブロックはそれぞれ異なる

温度設定をすることも、すべての VeriFlex ブロックを同じ温度にすることも可能です。

参考：溶解曲線ステップでは、すべての VeriFlex ブロックを同じ温度に設定する必要が

あります

ゾーン境界線個別に熱制御可能な 6 つの VeriFlex™ ブロックによって形成されるサンプルのゾーンの

境界。ゾーン境界線は、StepOne™ ソフトウェアのプレートレイアウトに濃赤色で表示さ

れます。

相対標準曲線法サンプル中ターゲットの相対量を決定する方法。相対標準曲線法では、StepOne™ ソフト

ウェアにより、サンプル、リファレンスサンプル、標準希釈シリーズ中に含まれるター

ゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コントロールに

よりノーマライズされます。標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成しま

す。ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプルおよびリファレンスサンプル中のター

ゲット量を外挿します。ソフトウェアは、各サンプル中のターゲット量とリファレンス

サンプル中のターゲット量とを比較することにより、各サンプル中ターゲットの相対量

を決定します。


用語集

増幅装置での測定の一部分で、PCR によりターゲットを増幅します。定量実験では、増幅時

に収集した蛍光データを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用します。ジェノ

タイピング実験や有無実験では、増幅時に収集した蛍光データを増幅プロット表示し、

データを結果計算に使用することができます。

増幅効率（EFF%） PCR 増幅の効率計算。増幅効率は、標準曲線での回帰直線の傾きを使って計算します。

傾きが −3.32 に近いとき、最適な 100% PCR 増幅効率を示します。増幅効率に影響する

要因には、次のものがあります。

• 標準量の範囲 – より精密度 • 正確度の高い効率測定を行うには、広範囲の標準量す

なわち 5 ～ 6 log（105 ～ 106）をご使用ください。

• スタンダードの反復数 – 不正確な分注の影響を低減し、より正確な効率測定を行う

ためには、反復を行います。

• PCR 阻害剤 – 反応中の PCR 阻害剤により、増幅効率が低下し、効率測定に影響が

生じる可能性があります。

増幅しないコントロール（NAC：No amplification control）

「ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェル」参照。

増幅ステージ装置での測定の一部分で、PCR によりターゲットを増幅します。増幅ステージは、サー

マルプロファイルのサイクリングステージとも呼ばれ、変性、プライマーのアニーリン

グ、重合反応の各ステップを繰り返します。

定量実験では、増幅ステージで収集した蛍光データを増幅プロット表示し、データを結

果計算に使用します。ジェノタイピング実験や有無実験では、増幅ステージで収集した

蛍光データを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用することができます。「サイ

クリングステージ」をご参照ください。

増幅プロット PCR 増幅のサイクリングステージで収集したデータの表示。以下の形で表示できます。

• ベースライン修正したノーマライズ済みレポーター（∆Rn）対サイクル

• ノーマライズ済みレポーター（Rn）対サイクル

• Threshold cycle（CT）対ウェル

測定方法 StepOne™ または StepOnePlus™ 装置が実行する反応量とサーマルプロファイルの定義。

ターゲット増幅および検出の対象となる核酸配列。

ターゲットカラー StepOne™ システムで、ターゲットに割り当て、ターゲットをプレートレイアウトや解析

プロットで同定する色。


用語集

タスク StepOne™ ソフトウェアで、ターゲット／ SNP アッセイのウェルで実施する反応のタイ

プ。実施可能なタスク：

• 未知のサンプル

• ネガティブコントロール

• スタンダード（標準曲線および相対標準曲線実験）

• ポジティブコントロール（ジェノタイピング実験）

• IPC（有無実験）

• ブロック IPC（有無実験）

タッチスクリーン StepOne™またはStepOnePlus™装置をコントロールするためにタッチする装置のディス

プレイ。

定量方法定量実験で、サンプルに含まれるターゲットの量を特定する方法。StepOne™ および

StepOnePlus™ システムでは、3 種類の定量方法が可能です。標準曲線法、相対標準曲線

法および比較 CT（∆∆CT）法。

テンプレート StepOne™ ソフトウェアの［Design Wizard］（設定ウィザード）（および定量実験の

［QuickStart］（クイックスタート））で、PCR 反応に追加する核酸の種類。推奨テンプ

レートは、実験タイプにより異なります。

• 定量実験（標準曲線法、相対標準曲線および比較 CT 法）－ cDNA（相補 DNA）、

RNA、gDNA（ゲノム DNA）。

定量実験では、テンプレートの選択により、測定方法、反応セットアップ、物品リ

ストが変わります。

• ジェノタイピング実験－湿潤 DNA（gDNA もしくは cDNA）または乾燥 DNA（gDNA もしくは cDNA）。

ジェノタイピング実験では、テンプレートの選択により、反応セットアップが変わ

ります。

• 有無実験－ DNA

Applied Biosystems は、有無実験で、DNA テンプレートを PCR 反応に添加する

ことをお勧めします。

テンプレートを含まないコントロール（NTC：No template control）

「ネガティブコントロール（NC）」をご参照ください。

データ収集装置のコンポーネントが、反応プレートの各ウェルからの蛍光データを検出する装置の

測定プロセス。装置が信号を電子データに変換し、データは実験ファイルに保存されま

す。StepOne™ システムでは、データ収集ポイントは、サーマルプロファイル内のアイコ

ンで示されます。

• データ収集がオン：

• データ収集がオフ：


用語集

内在性コントロール実験中のすべての試験サンプルで、同様のレベルで発現すべきターゲットまたは遺伝子。

相対標準曲線および比較 CT（∆∆CT）実験では、内在性コントロールを用いて定量中の

ターゲットの蛍光シグナルをノーマライズします。ハウスキーピング遺伝子は、内在性

コントロールとして使用できます。「ハウスキーピング遺伝子」をご参照ください。

内在性ポジティブコントロール（Internal positive control：IPC）

有無実験で、PCR 反応に添加する短い合成 DNA テンプレート。IPC を使用して、真の

陰性結果（すなわち、サンプル中にターゲットが存在しない）と、PCR 阻害剤や不適切

なアッセイセットアップ、試薬や装置の不具合が影響した反応とを区別できます。

ネガティブコントロールIPC ウェル

有無実験で、IPC テンプレートおよびバッファーまたは水をサンプルの代わりに含む

ウェル。ネガティブコントロール IPC ウェルでは、IPC テンプレートのみが増幅します。

反応にサンプルが含まれないからです。別称「IPC+」。

ネガティブコントロール（NC）

StepOne™ ソフトウェアで、サンプルの代わりに水やバッファーを含むウェル内のター

ゲットや SNP アッセイに割り当てられるタスク。ターゲットの増幅は、ネガティブコン

トロールウェルでは起こりません。別称、「テンプレートを含まないコントロール（NTC：No template control）」。

ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェル

有無実験で、PCR 反応のサンプルの代わりに IPC 遮断剤を含むウェル。増幅はネガティ

ブコントロールブロック済み IPC ウェルでは起きません。反応にサンプルが含まれず、

IPC の増幅が遮断されるからです。別称「増幅しないコントロール（NAC：Noamplification control）」。

ノーマライズ済みレポーター（Rn）

パッシブリファレンスの蛍光信号にノーマライズした、レポーター色素からの蛍光信号。

ノーマライズ量ターゲット量を内在性コントロールの量で除したもの。

ハウスキーピング遺伝子

細胞の基本的な機能に関与し構成的に発現する遺伝子。ハウスキーピング遺伝子は、内

在性コントロールとして使用できます。「内在性コントロール」をご参照ください。

パッシブリファレンス蛍光シグナルを生成する色素。パッシブリファレンス信号はすべてのウェルで一定なの

で、レポーター色素信号をノーマライズし、わずかなウェル間の濃度や量の違いによる

PCR に関連しない蛍光変動を補正するために使用されます。パッシブリファレンス信号

への正規化により、データ精度が高まります。

反応ミックステンプレート（サンプル、スタンダード、またはコントロール）以外のすべての PCR 反

応測定コンポーネントを含む溶液。

反復グループ実験での同一反応のセット。

反復数同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。


用語集

比較 CT（∆∆CT）法サンプル中ターゲットの相対量を決定する方法。比較 CT（∆∆CT）法では、StepOne™ ソ

フトウェアにより、サンプルやリファレンスサンプル中のターゲットや内在性コント

ロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コントロールによりノーマライズされ

ます。ソフトウェアは、各サンプル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のノー

マライズ済みターゲット量とを比較することにより、各サンプル中ターゲットの相対量

を決定します。

非蛍光クエンチャー -マイナーグループバインダー（NFQ-MGB）

TaqMan® プローブの 3′ 末端に結合する分子。プローブがインタクトな時は、非蛍光ク

エンチャー（NFQ）は、レポーター色素からの蛍光信号の放射を阻止します。NFQ は

蛍光を出さないので、生成されるバックグラウンド信号は低く、その結果、定量精度が

向上します。マイナーグループバインダー（MGB）は融解温度（Tm）を上げますが、

プローブ長は増えません。また、短いプローブも設計できます。

微分レポーター（−Rn′ ）

PCR 増幅でレポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナル強度の負の一次微分。

微分レポーター（–Rn′ ）vs 温度融解曲線では、ノーマライズした、微分レポーターシグ

ナルは y 軸に表示されます。

標準曲線標準曲線および相対標準曲線実験で：

• 標準量に対してプロットしたスタンダード反応からの CT 値のプロットで最も良く

フィットするライン。「回帰直線」も参照。

• ある範囲の既知量を含むスタンダードのセット。標準曲線反応からのデータを使用

して標準曲線を作成します。標準曲線は、希釈シリーズのポイント数、スタンダー

ドの反復数、開始量、シリアル係数で定義されます。「スタンダード希釈シリーズ」

も参照。

標準曲線法サンプル中ターゲットの絶対量を決定する方法。標準曲線法では、StepOne™ ソフトウェ

アにより、サンプル、リファレンスサンプル、標準希釈シリーズ中に含まれるターゲッ

トの増幅を測定します。標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成します。

ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプル中ターゲットの絶対量を外挿します。「ス

タンダード」および「標準曲線」をご参照ください。

標準量 PCR 反応での既知量。

• 標準曲線実験では、スタンダードにおけるターゲット量。StepOne™ ソフトウェア

では、標準量の単位は、質量、コピー数、ウイルス量、その他のターゲット量など

の測定単位です。

• 相対標準曲線実験では、スタンダードにおける既知量。例えば、標準量は、cDNA量や PCR 反応中の標準原液量などです。単位は相対標準曲線実験では無関係で、計

算では無効です。

フォワードプライマーアンプリコンの 5′ 末端に隣接するオリゴヌクレオチド。PCR 反応ではリバースプライ

マーとフォワードプライマーを併用してターゲットを増幅します。

ブロックされた IPC 有無実験で、IPC 遮断剤（内在性ポジティブコントロール、IPC の増幅を遮断する）を

含む反応。StepOne™ ソフトウェアでは、IPC 遮断剤を含むウェル内の IPC ターゲット

のタスク。「ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェル」をご参照ください。

プライマー／プローブミックス

ターゲット増幅用プライマーと、ターゲット増幅検出用TaqMan®プローブからなるPCR反応コンポーネント。


用語集

プライマーミックスターゲットを増幅するよう設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーを含

む PCR 反応コンポーネント。

プレートレイアウト反応プレートのグリッドの各ウェルと、割り当てられた内容物の図。StepOne™ システム

の場合、グリッドは 6 行 8 列です。StepOnePlus™ システムの場合、グリッドは 8 行 12列です。

StepOne™ ソフトウェアでは、プレートレイアウトを選択ツールとして使用し、ウェル内

容物を割り当てたり、ウェル割り当ての表示や結果の表示ができます。プレートレイア

ウトは、印刷、レポートへの表示、エクスポートや、プレゼンテーション用のスライド

としての保存ができます。

ベースライン増幅プロットにおいて、蛍光シグナルの変化が小さい PCR 初期サイクル中の蛍光レベル

に該当するライン。

ベースライン修正したノーマライズ済みレポーター（∆Rn）

レポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナルの強度。

1. リアルタイムPCRデータを含む実験では、PCR増幅の各サイクルでレポーターが生

成したノーマライズ済み蛍光シグナルの強度。∆Rn vs. Cycle 増幅プロットでは、各

サイクルの ∆Rn は次式により計算されます。

∆Rn（サイクル） = Rn（サイクル）− Rn（ベースライン）で、Rn = ノーマライズ済

みレポーター

2. ジェノタイピング実験や有無実験では、ノーマライズしたレポーター蛍光シグナル

値の、PCR 前読み取りと PCR 後読み取り間の差。アレル識別プロット（ジェノタ

イピング実験）や有無プロット（有無実験）では、∆Rn は、次式で計算します。

∆Rn = Rn（PCR 後読み取り）− Rn（PCR 前読み取り）で、Rn = ノーマライズ済み

レポーター

「ノーマライズ済みレポーター（Rn）」をご参照ください。

ホールディングステージ

サーマルプロファイル内で、1 つ以上のステップを含むステージ。ホールディングステー

ジは、酵素の活性化や不活性化、反応物の培養のためサーマルプロファイルに追加でき

ます。

ポイント標準曲線内の 1 つのスタンダード。標準曲線の各ポイントのスタンダード量は、開始量

とシリアル係数に基づいて計算されます。

ポジティブコントロールジェノタイピング実験で、ジェノタイプが既知であるホモ接合性またはヘテロ接合性の

DNA サンプル。StepOne™ ソフトウェアで、既知ジェノタイプのサンプルを含むウェル

内の SNP アッセイに割り当てたタスク。

マルチコンポーネントプロット

指定したウェル内の各色素の全スペクトル構成を PCR 測定中表示するプロット。

未知－ IPC ウェル有無実験で、未知のサンプルと内在性ポジティブコントロール（IPC）を含むウェル。


用語集

未知の StepOne™ソフトウェアで、テストするサンプルを含むウェル内のターゲットまたはSNPアッセイに割り当てたタスク。

• 定量実験では、ターゲット量不明のサンプルを含むウェル内のターゲット用のタス

ク。

• ジェノタイピング実験では、ジェノタイプが不明のサンプルを含むウェル内の SNPアッセイ用のタスク。

• 有無実験では、ターゲットの有無不明のサンプルを含むウェル内のターゲット用の

タスク。

融解温度（Tm）融解曲線実験で、DNA の 50% が二本鎖であり、50% が一本鎖に解離する温度。Tm は

溶解曲線に表示されます。

融解曲線融解曲線ステージで収集したデータのプロット。融解曲線のピークはターゲットの融解

温度（Tm）を示す場合があり、非特異的 PCR 増幅を特定できる場合もあります。

StepOne™ ソフトウェアでは、融解曲線は、ノーマライズ済みレポーター（Rn）対温度

か、微分レポーター（−Rn′ ）対温度で表示できます。別称「解離曲線」。

融解曲線ステージサーマルプロファイル内で、温度を段階的に上げて融解曲線を作成するステージ。

ランプ装置実行時の温度変更レート。融解曲線ステップ以外では、ランプはパーセントで定義

します。融解曲線ステップでは、ランプは温度増分で定義します。サーマルプロファイ

ルのグラフィック表示では、ランプは対角線で示されます。

ランプ速度装置実行中に発生する温度ランプの速度。使用できるランプ速度は Fast（高速）とスタ

ンダードです。

• Fast ランプ速度により最適な結果を得るために、Applied Biosystems は、TaqMan®

Fast 試薬を PCR 反応に使用することをお勧めします。

• 標準ランプ速度で最適な結果を得るためには、Applied Biosystems は、標準試薬を

PCR 反応に使用することをお勧めします。

重要！ジェノタイピングまたは有無実験では、TaqMan Fast 試薬は使用できません。

リアルタイム PCR PCR 時の蛍光データの収集プロセス。リアルタイム PCR データは、定量実験の結果計

算や、ジェノタイピング／有無実験結果のトラブルシューティングに使用します。

リバースプライマーアンプリコンの 3′ 末端に隣接するオリゴヌクレオチド。PCR 反応ではリバースプライ

マーとフォワードプライマーを併用してターゲットを増幅します。

リファレンスサンプル相対標準曲線および比較 CT（∆∆CT）実験で、相対定量結果の基礎とするサンプル。別

称「キャリブレータ」。

量定量実験でサンプルに含まれるターゲットの量。絶対量には、コピー数、質量、モル濃

度、またはウイルス量があります。相対量は、サンプル中ノーマライズ済みターゲット

量と、リファレンスサンプル中ノーマライズ済みターゲット量との発現差です。

レポーター増幅を検出する蛍光色素。TaqMan® 試薬では、レポーター色素は 5′ 末端に結合します。

SYBR® Green 試薬では、レポーター色素は SYBR® Green 色素です。


用語集

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド索引 - 1

索引

記号アンプリコン部位

プライマーの 3 猪亦 3-23プローブの 5 猪亦 3-22

数字1 ステップ RT-PCR

RNA 定量 3-25, D-4, D-9使用プライマー 3-9説明 3-8

2 ステップ RT-PCRRNA 定量 3-26, D-4, D-9使用プライマー 3-9説明 3-8

A［Advanced Setup］（高度なセットアップ）ワークフ

ロー 1-9, 1-10Applied Biosystems

テクニカルサポート xii問い合わせ xii文書に関するユーザーのフィードバック xii

CCustom TaqMan Gene Expression Assays 3-18, 5-12

Custom TaqMan SNP Genotyping Assays 4-14

［Custom］（カスタム）アッセイタイプ 1-9, 1-10

DDDCT 実験。「比較 CT 実験」参照。

［Design Wizard］（設計ウィザード）ワークフロー 1-9, 1-10

DNA/cDNA 定量、サーマルサイクリング条件 3-28

GG/C 含量、およびアンプリコン部位 3-22

IInventoried アッセイタイプ 1-9IPC 5-4, 5-5

MMade to Order アッセイタイプ 1-9

MSDS、入手 xiiMultiScribe Reverse Transcriptase、定義 3-26

PPCR、一般的留意事項 2-8Primer Express Software

有無実験 5-16定量実験 3-21短いアンプリコン 3-22

Primer Express ソフトウェア

SNP アッセイ 1-10

RRNA 定量

1 ステップ RT-PCR 3-25, D-4, D-92 ステップ RT-PCR 3-26, D-4, D-9サーマルサイクリング条件 3-28, 3-29

RT-PCR1 ステップ 3-82 ステップ 3-8方法の比較 3-7, 3-9

SStepOne システム

アッセイタイプ 1-9実験タイプ 1-7試薬タイプ 1-8消耗品 1-4データ収集 1-2フィルタ 1-3

SYBR Green 試薬 1-3開発 2-5仕組み 2-5選択に際する留意事項 2-6定量実験の最適化 3-31

TTaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays 4-11

TaqMan Endogenous Control Assays 3-17TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents 5-13

TaqMan Gene Expression Assays 3-16, 5-10

Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド

索引

索引 -2

TaqMan MGB プローブ 2-3使用 2-4

TaqMan PDARs for AD 4-12TaqMan SNP Genotyping Assays 4-10

TaqMan 試薬 1-3開発 2-2仕組み 2-2実験タイプ 2-2選択に際する留意事項 2-6

UUNG、キャリーオーバーの最小限化 2-7

Universal Master Mix 試薬

ポリメラーゼの利点 3-26

あアッセイ設計ガイドライン

有無実験 5-16サーマルサイクリング条件 3-27ジェノタイピング実験 C-2試薬の選択 3-24説明 C-1定量実験 3-21, C-1プライマーとプローブ 3-21, 3-23プライマー濃度の最適化 3-30プローブ濃度の最適化 3-33

アッセイタイプ

［Custom］（カスタム）アッセイ 1-9, 1-10Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセ

イ 1-9有無実験 5-6ジェノタイピング実験 4-6設計済み／検証済みアッセイ 1-10選択 1-9定量実験 3-12

アンプリコンの選択、短い 3-22アンプリコン部位

G/C 含量 3-22スクリーニング 3-22選択 3-22融解温度 3-22

う有無実験

IPC の取り込み 5-5IPC 無添加で実施 5-4TaqMan 試薬 2-2アッセイタイプ 5-6カスタムアッセイタイプ用アッセイ設計ガイドライ

ン 5-16カスタムアッセイタイプ用試薬の選択 3-24, D-3, D-9コンポーネント 5-4仕組み 5-5設計 5-16

定義 5-4マスターミックスの選択 5-15

えエンドポイント実験

有無 5-5ジェノタイピング 4-4

おオンラインヘルプ。「ヘルプシステム」参照。

かカスタムアッセイタイプ

有無実験 5-16定量実験 3-21

きキャリーオーバー、UNG で最小限化 2-7

さサーマルサイクリング条件

1 ステップ RT-PCR 3-282 ステップ RT-PCR 3-29DNA/cDNA 定量 3-28RNA 定量 3-28

最小限、DNA 汚染 2-7最適化 3-33サンプル 4-4, 5-4

実験のコンポーネント 3-5, 3-6

しジェノタイピング実験

TaqMan 試薬 2-2アッセイ設計ガイドラインの総括 C-2アッセイタイプ 4-6コンポーネント 4-4仕組み 4-4設計 4-14, 4-16説明 4-4装置 4-4不一致 4-5マスターミックスの選択 4-13, 4-16

色素結合、方法 2-5実験の設計

有無 5-16ジェノタイピング 4-14, 4-16定量 3-20, 3-21

試薬

SYBR Green 試薬 1-8TaqMan 試薬 1-8, 2-2


索引

索引 - 3

カスタムアッセイタイプの選択 D-3, D-9カスタムアッセイタイプ用の選択 3-24選択 1-8, 2-6その他の蛍光ベース 1-8留意事項 2-6

消耗品

使用可能な 1-4「必要な物品」も参照。 1-4

すスタンダード

実験のコンポーネント 3-5スタンダード希釈シリーズ

実験のコンポーネント 3-5

せ設計済み／検証済みアッセイタイプ 1-10

そ相対標準曲線実験

コンポーネント 3-5説明 3-5

「定量実験」も参照。 3-5その他の蛍光ベース試薬 1-8

て定量実験

SYBR Green 試薬 2-4, 3-31TaqMan 試薬 2-2アッセイ設計ガイドラインの総括 C-1アッセイタイプ 3-12解説 3-4カスタムアッセイタイプ用アッセイ設計ガイドライ

ン 3-21カスタムアッセイタイプ用試薬の選択 3-24, D-3, D-9試薬タイプの選択 3-12設計 3-20, 3-21相対標準曲線 3-5定量方法の選択 3-5比較 3-7比較 CT 3-6標準曲線 3-5マスターミックスの選択 3-19リアルタイム PCR 3-4

データ

データ収集について 1-2テキスト表記法 viiiテクニカルサポート、問い合わせ xii

とトレーニング、情報 xii

な内在性コントロール

実験のコンポーネント 3-6

ねネガティブコントロール 4-4ネガティブコントロール、実験のコンポーネント 3-5, 3-6,

5-4

は反復 4-4, 5-4反復、実験のコンポーネント 3-5, 3-6

ひ比較 CT 実験


「定量実験」も参照。 3-6非特異的生成物、SYBR Green 色素使用に伴う汚染 2-7標準曲線実験


「定量実験」も参照。 3-5

ふ不一致、ジェノタイピング実験における 4-5プライマー

1 ステップ RT-PCR 3-92 ステップ RT-PCR 3-9設計ガイドラインの要約 3-23濃度のデフォルト値 3-30ヘアピンループ 3-9

プライマーの制限、マルチプレックスアッセイ 3-10プライマーマトリックス

使用方法 3-30制限の定義 B-1制限例 B-2

プローブ

設計ガイドラインの要約 3-23プローブ濃度の最適化 3-33利用可能な TaqMan MGB プローブ 2-4

文書、関連 ix

へヘアピンループ、プライマー選択 3-9ヘルプシステム、アクセス xi

ほポジティブコントロール 4-4


索引

索引 -4

本ガイドを使用する際の前提 viii本書で使用する表記法 viii

まマスターミックス

有無実験用の選択 5-15ジェノタイピング実験用に選択 4-13, 4-16定量実験に選択 3-19

マルチプレックス PCRrRNA プライマー B-1シングルプレックスとの比較 3-10説明 3-10プライマーの制限 3-10

み短いアンプリコン、選択 3-22

ゆ融解温度、およびアンプリコン部位 3-22ユーザーの注意を促す語句、説明 viiiユーザーのフィードバック、Applied Biosystems の文書に

関する xii

りリアルタイム PCR

TaqMan 検出プロセス 2-2定量実験 3-4

リファレンスサンプル

実験のコンポーネント 3-5, 3-6

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Applied Biosystems StepOne および StepOnePlustools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_039294.pdfApplied Biosystems StepOne およびStepOnePlus Real-Time PCR Systems 試薬ガイド