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A M i c r o b i o l o g i c a l A s s a y o f P e n i c i l l i n i n A n i m a l F e e d sR . C . K E R S E Y AND F . V . L E G H O R N

B i o c h e mi c a l R e se a r c h L a b o r a t o r i e s , C h a s . P f i z e r a n d C o . , I n c . , B r o o k l y n 6 , New Y o r kR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n F e b r u a r y 2 0 , 1 9 5 3

T h e u n i v e r s a l a c c e p t a n c e o f t h e a n i m a l g r o w t h - p r o -m o t i n g p r o p e r t i e s o f s o m e a n t i b i o t i c s a n d t h e i r w i d eu s a g e i n f o r m u l a t e d c o m m e r c i a l f e e d s r e q u i r e s t h a ts i m p l e , r a p i d a n d r e l i a b l e a n a l y t i c a l m e t h o d s b e a v a i l -a b l e f o r c o n t r o l p u r p o s e s . O f t h e s e v e r a l a n t i b i o t i c s u s e di n p o u l t r y r a t i o n s , p e n i c i l l i n e x e r t s i t s g r o w t h - p r o m o t i n gp r o p e r t i e s a t l e v e l s c o n s i d e r a b l y l o w e r t h a n o t h e r a n t i -b i o t i c s ( 2 g r a m s p e n i c i l l i n p e r t o n ) , a n d t h u s , t h ea n a l y t i c a l p r o b l e m s a r e a c c e n t u a t e d . F o r p e n i c i l l i n -c o n t a i n i n g f e e d s , t w o p r o b l e m s a r e p r e s e n t e d ( a ) am e t h o d o f p r e p a r i n g s t a b l e e x t r a c t f r o m f e e d s a m p l e sa n d ( b ) a m e t h o d o f m e a s u r i n g q u a n t i t a t i v e l y t h e s m a l la m o u n t o f p e n i c i l l i n i n t h e e x t r a c t .From t h e v o l u m i n o u s i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e o n t h ep r o p e r t i e s o f p e n i c i l l i n , i t i s w e l l k n o w n t h a t t h e a n t i -b i o t i c i s i n c o m p a t i b l e w i t h many s o l v e n t s . I n t h i s r e -p o r t , o n l y t w o s a l t s o f p e n i c i l l i n a r e c o n s i d e r e d , p r o c a i n ea n d d i b e n z y l e t h y l e n e d i a m i n e ( D B E D ) , s i n c e t h e s e a r et h e o n l y f o r m s c u r r e n t l y e m p l o y e d i n c o m m e r c i a l f e e d s .

E X P E R I M E N T A LA s s a y . M i c r o c o c c u s p y o g e n e s v a r . a u r e u s ATCC 9 1 4 4w a s e m p l o y e d a s t h e t e s t o r g a n i s m i n a d i s c - p l a t e a s s a ya n d m a i n t a i n e d o n n u t r i e n t a g a r d e s c r i b e d i n t a b l e 1 .

D a i l y i n o c u l u m w a s p r e p a r e d b y t r a n s f e r r i n g t h e o r g a n -i s m t o b r o t h o f t h e s a m e c o m p o s i t i o n a n d i n c u b a t i n ga t 3 7 C . f o r 1 8 h o u r s . To i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f t h et e s t o r g a n i s m t o a s l i t t l e a s 0 . 0 5 u n i t s o f p e n i c i l l i n p e rm l , a s i n g l e l a y e r o f a s s a y m e d i u m was u s e d i n t h e p l a t e .F i f t y m l o f a s s a y a g a r , d e s c r i b e d i n t a b l e 1 wasm e l t e d a n d c o o l e d t o 4 5 t o 4 8 C . a n d s e e d e d w i t h 0 . 5m l o f t h e a b o v e d e s c r i b e d i n o c u l u m . I t i s e x t r e m e l yi m p o r t a n t t h a t t h e p l a t e b e p r e p a r e d o n a l e v e l s u r f a c ea s v a r i a t i o n s i n t h e t h i c k n e s s o f t h e a g a r a f f e c t t h es e n s i t i v i t y o f t h e t e s t a n d t h u s r e p r o d u c i b i l i t y o f t h ez o n e s i z e s . An a g a r d e p t h o f 1 . 3 mm h a s b e e n f o u n d m o s ts a t i s f a c t o r y . F l a t p y r e x g l a s s p l a t e s , 1 2 " x 6 2 a " w i t h3 4 " p y r e x s t r i p s c e m e n t e d t o s i d e s a n d e n d s o f p l a t ew e r e u s e d i n p l a c e o f t h e c o n v e n t i o n a l P e t r i d i s h e s .F i l t e r p a p e r d i s c s 2 " d i a m e t e r ( N o . 7 4 0 E , S c h l e i c h e ra n d S c h u e l l , K e e n e , N . H . ) s e r v e d a s r e s e r v o i r s f o r t h ea n t i b i o t i c . Z o n e s o f i n h i b i t i o n w e r e m e a s u r e d b y v e r n i e rc a l i p e r s , m i l l i m e t e r r u l e o r b y p r o j e c t i o n o f t h e z o n e sa g a i n s t a c a l i b r a t e d s c r e e n .E x t r a c t i o n . T w e n t y - g r a m s a m p l e s o f f e e d c o n t a i n i n gp e n i c i l l i n w e r e m i x e d w i t h 1 5 0 m l o f t h e e x t r a c t i n ga g e n t a n d a l l o w e d t o s t a n d o n e h o u r w i t h f r e q u e n t

a g i t a t i o n . T h e m i x t u r e w a s d i l u t e d w i t h 1 p e r c e n tp h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 6 , t o c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y0 . 0 7 5 u n i t s / m l . F o r f e e d s c o n t a i n i n g 2 g r a m s p e n i c i l l i n /t o n , i t w a s c o n v e n i e n t t o c o n d u c t t h e e x t r a c t i o n a n ds u b s e q u e n t d i l u t i o n s i n l i t e r v o l u m e t r i c f l a s k s .A 1 u n i t / m l s t o c k s o l u t i o n o f p e n i c i l l i n G s o d i u m w a sp r e p a r e d i n p h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 6 . T h e s t a n d a r dc u r v e w a s p r e p a r e d b y f u r t h e r d i l u t i n g t h i s s t a n d a r ds o t h a t s o l u t i o n s c o n t a i n i n g 0 . 0 5 , 0 . 0 6 , 0 . 0 7 , 0 . 0 9 , 0 . 1 0a n d 0 . 1 2 u n i t s / m l w e r e o b t a i n e d . F i l t e r p a p e r d i s c s w e r es a t u r a t e d w i t h t h e s t a n d a r d s o l u t i o n s e r i e s , t h e e x c e s ss o l u t i o n w a s r e m o v e d f r o m t h e d i s c b y b r i n g i n g i t i nc o n t a c t w i t h t h e l i p o f t h e t e s t t u b e c o n t a i n i n g t h e d i l u t e ds t a n d a r d s . O n e d i s c o f e a c h d i l u t i o n o f s t a n d a r d w a sp l a c e d o n t h e s u r f a c e o f t h e a g a r p l a t e . S i x r e p l i c a t ed i s c s w e r e s a t u r a t e d w i t h t h e f o r m a m i d e - b u f f e r f e e de x t r a c t a n d c a r e f u l l y p l a c e d o n e i t h e r s i d e o f t h e s t a n d -a r d d i s c s . Tw o s a m p l e s w e r e a s s a y e d p e r p l a t e . A f l a tp y r e x g l a s s c o v e r w a s p l a c e d o n t h e p l a t e a n d i t w a st h e n i n c u b a t e d f o r 1 8 t o 2 4 h o u r s a t 3 7 C . A t y p i c a la s s a y p l a t e i s p i c t u r e d i n f i g u r e 1 .T h e i n h i b i t i o n z o n e s o f t h e s t a n d a r d d i s c s w e r em e a s u r e d a n d a d o s e r e s p o n s e c u r v e p l o t t e d o n t w o c y c l es e m i - l o g p a p e r w i t h t h e d o s e a s t h e o r d i n a t e , w h i l e t h ez o n e d i a m e t e r i n m i l l i m e t e r s w a s p l o t t e d a s t h e a b s c i s s a .T h e s i x r e a d i n g s o b t a i n e d f r o m t h e s a m p l e d i s c s w e r ea v e r a g e d a n d t h e p o t e n c y c a l c u l a t e d f r o m t h e s t a n d a r dc u r v e . T h i s v a l u e t i m e s t h e d i l u t i o n , d i v i d e d b y t h ew e i g h t o f t h e s a m p l e g a v e t h e p o t e n c y o f t h e s a m p l e o na w e i g h t b a s i s .

R E S U L T SV a r i o u s s o l v e n t s w e r e c o m p a r e d f o r e x t r a c t i o n e f f i -c i e n c y , c o m p a t i b i l i t y w i t h p e n i c i l l i n , a n d t h e i r a b i l i t y t or e j e c t n o n - s p e c i f i c s u b s t a n c e s i n f l u e n c i n g t h e g r o w t h o ft h e t e s t o r g a n i s m . W a t e r , p h o s p h a t e b u f f e r pH 6 . 6 ,m e t h a n o l , d i m e t h y l f o r m a m i d e a n d f o r m a m i d e ( 9 9 p e r

c e n t p u r i t y ) w e r e i n v e s t i g a t e d a s e x t r a c t i n g a g e n t s f o rp r o c a i n e a n d DBED f r o m f e e d s . I n c o m p l e t e e x t r a c t i o n so r o t h e r i n t e r f e r e n c e s w e r e e n c o u n t e r e d w i t h a l l s o l v e n ts y s t e m s e x c e p t f o r m a m i d e . E x t r a c t i o n s w i t h f o r m a m i d ew e r e c o m p l e t e . T h e u s e o f m e t h a n o l w a s s u g g e s t e d i n ap r e l i m i n a r y r e p o r t o f E s p o s i t o a n d W i l l i a m s ( 1 9 5 2 a ) f o re x t r a c t i n g p e n i c i l l i n f r o m f e e d s . H o w e v e r , i n v i e w o fs e v e r a l r e p o r t s o f t h e i n s t a b i l i t y o f p e n i c i l l i n i n t h ep r e s e n c e o f p r i m a r y a l c o h o l s ( C h a i n , 1 9 4 9 ; C l a r k , e t a l ,1 9 4 9 ) s o m e o f t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d . T a b l e 2

1 5 0

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MICROBIOLOGICAL ASSAY OF PENICILLIN IN FEEDST A B L E 1 . C u l t u r e m e d i a

ASSAY MEDIUMt INOCULUM M E D I U M tg / l g l i

P e p t o n e ................ 6 P e p t o n e ............. 5P a n c r e a t i c d i g e s t o f Y e a s t e x t r a c t... 5C a s e i n ............... 4 B e e f e x t r a c t ......... 1 . 5Y e a s t e x t r a c t .......... 3 S o d i u m C h l o r i d e ...... 3 . 5B e e f e x t r a c t ........... 1 . 5 G l u c o s e.......... 1G l u c o s e ................ 1 D i p o t a s s i u m p h o s -A g a r . 1 5 p h a t e............. 3 . 6 8P o t a s s i u m d i h y d r o -

g e n p h o s p h a t e . . . . . . 1 . 3 2A g a r ** 1 . 5 p e r c e n t a g a r a d d e d f o r s t o c k s l a n t c u l t u r e .t pH 6 . 5 - 6 . 6 a f t e r s t e r i l i z a t i o n .p H 7 . 0 a f t e r s t e r i l i z a t i o n .

s o l v e n t s f o r p e n i c i l l i n , t h e y were c o m p a r e d f o r t h e i ra b i l i t y t o e x t r a c t n o n - s p e c i f i c s u b s t a n c e s f r o m f e e d sw h i c h w o u l d i n f l u e n c e a s s a y s . An a n t i b i o t i c - f r e e f e e dwas e x t r a c t e d w i t h f o r m a m i d e a n d m e t h a n o l . Th e e x-t r a c t s w e r e f o r t i f i e d w i t h p e n i c i l l i n t o a c o n c e n t r a t i o n o f0 . 0 6 0 u / m l a n d a s s a y e d . C o m p a r a b l e assays were madeon f o r t i f i e d b l a n k s o l v e n t s . Th e r e s u l t s a r e s h o w n i nt a b l e 4 .

A s s a y s o f p e n i c i l l i n i n t h e presence o f f o r m a m i d e orf o r m a m i d e e x t r a c t s o f b l a n k f e e d s f o r t i f i e d w i t h p e n i c i l -l i n ar e w i t h i n t h e n o r m a l l i m i t s o f t h e a s s a y . W i t hm e t h a n o l , t h e a d d e d p e n i c i l l i n was c o m p l e t e l y i n a c t i -v a t e d . F o r t i f i e d m e t h a n o l e x t r a c t s o f f e e d s on t h e o t h e rh a n d , a s s a y e d >0.12 u / m l a s i s s h o w n i n t a b l e 4 , o rg r e a t e r t h a n t w i c e t h e c o n c e n t r a t i o n a d d e d . T h u s , t h e

F I G . 1 . A t y p i c a l as s ay p l a t e

p r e s e n t s c o m p a r a t i v e s t a b i l i t i e s o f p r o c a i n e a n d DBEDp e n i c i l l i n i n m e t h a n o l a n d f o r m a m i d e a t c o n c e n t r a t i o n so f 5 0 0 , 5 0 a n d 2 0 u n i t s pe r m l .A s s a y s w e r e p e r f o r m e d i m me d i a t e l y a f t e r p r e p a r a t i o no f t h e t e s t s o l u t i o n s and a f t e r two h o u r s ' c o n t a c t a troom t e m p e r a t u r e . The e x c e l l e n t s t a b i l i t y o f b o t h p e n i -c i l l i n s a l t s i n f o r m a m i d e s o l u t i o n s a t t h e t h r e e concen-t r a t i o n s t e s t e d was r e a d i l y a p p a r e n t . T h i s i s f u r t h e rs u b s t a n t i a t e d b y d a t a i n t a b l e 3 s h o w i n g t h e h i g h d e g r e eo f s t a b i l i t y o f t h e s e s a l t s i n f o r m a m i d e a t assay concen-t r a t i o n s ( a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 7 5 u / m l ) f o r as l o n g as t h r e eh o u r s . On t h e o t h e r h a n d , a s d e m o n s t r a t e d i n t a b l e 2 ,m e t h a n o l i c s o l u t i o n s were s t a b l e a t 5 0 0 u / m l f o r twoh o u r s . P r o c a i n e s o l u t i o n s a t 5 0 u / m l w e r e i n a c t i v e a ttwo h o u r s ; 2 0 u / m l s o l u t i o n s w e r e i n a c t i v a t e d i m m e d i -a t e l y . DBED p e n i c i l l i n was even l e s s s t a b l e i n m e t h a n o l .

I n a d d i t i o n t o t h e c o m p a r a t i v e s t a b i l i t y o f t h e t w o

T A B L E 2 . T h e s t a b i l i t y o f p e n i c i l l i n i n f o r m a m i d e andm e t h a n o lPROCAINE PEMCIIN 0 HOURS 2 HOURS

5 0 0 u / m l MeOH 5 6 5 5 6 05 0 0 u / m l f o r m a m i d e . 5 3 5 5 3 05 0 u / m l MeOH 5 2 T r a c e5 0 u / m l f o r m a m i d e . 6 1 5 12 0 u / m l MeOH .Zeroe r o2 0 u / m l f o r m a m i d e . 1 8 2 3

DIBENZYL ETHYLENE DIAXINE PENICILLIN

5 0 0 u / m l MeOH . . . . . . . . . . 3 5 0 Z e r o5 0 0 u / m l f o r m a m i d e . 5 3 5 4 7 55 0 u / m l MeOH .Zeroe r o5 0 u / m l f o r m a m i d e . 4 6 5 02 0 u / m l MeOH. Z e r o Z e r o2 0 u / m l f o r m a m i d e . 2 1 2 3

l 1 5

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R . C . KERSEY AND F . V . LEGHORNu s e o f m e t h a n o l f o r p e n i c i l l i n f e e d e x t r a c t i o n s i s n o to n l y c o m p l i c a t e d b y t h e l a b i l i t y o f p e n i c i l l i n i nm e t h a n o l , b u t a l s o b y t h e f a c t t h a t m e t h a n o l i c f e e de x t r a c t s c o n t a i n n o n - s p e c i f i c s u b s t a n c e s e n h a n c i n g t h ea c t i v i t y o f a d d e d p e n i c i l l i n .

T A B L E 3 . S t a b i l i t y o f p r o c a i n e a n d DBED p e n i c i l l i ni n f o r m a m i d e a n d f o r m a m i d e f e e d e x t r a c t s

FEED SUPPLEMYENTED FEED SUPPLE - N tWITH'*EDSPPEETDBED P r o c a i n eF e e d S u p - F e e d S u p - DBED P r o c a i n ep l e m e n t p l e m e n tg m / t o n g m / t o n g m / l b g m / l b

I m m e d i a t e ............ 2 . 4 2 . 5 2 . 5 2 . 81 h o u r ............... 2 . 8 2 . 5 2 . 8 2 . 92 h o u r s . . . . ..... 2 . 3 2 . 5 2 . 8 3 . 33 h o u r s ............... 2 . 7 2 . 5 2 . 6 2 . 8

* F e e d s u p p l e me n t e d a t a l e v e l o f 2 . 8 g r a m s p e r t o n c a l c u -l a t e d a s S o d i u m G P e n i c i l l i n .t F e e d s u p p l e m e n t t h e o r y 2 . 6 g r a m s p e r p o u n d c a l c u l a t e das S o d i u m G P e n i c i l l i n .

T A B L E 4 . T h e e f f e c t o f f o r m a m i d e , m e t h a n o l , f o r m a m i d ea n d m e t h a n o l f e e d e x t r a c t s o n p e n i c i l l i nSOLVENT D B 1 D ' PROCAINZ*

u / m l u / m lF o r m a m i d e . . 0 6 4 0 . 0 7 0F o r m a m i d e f e e d e x -

t r a c t . . 0 5 9 0 . 0 6 1M e t h a n o l . 0 . 1 2 0 > 0 . 1 2 0* S a m p l e s made u p a t 0 . 0 6 0 u / m l c o n c e n t r a t i o n s .

D I S C U S S I O NT h e a s s a y o f p e n i c i l l i n p r o d u c t s i n f e e d s p r e s e n t s

p r o b l e m s n o t e n c o u n t e r e d i n p h a r m a c e u t i c a l prepara-t i o n s . T h e s e n s i t i v i t y o f t h e as s ay must b e i n c r e a s e d ,a n d t h i s h a s b e e n a c c o m p l i s h e d w i t h o u t u n d u e s a c r i f i c eo f p r e c i s i o n . T h e p r o b l e m o f a r e l i a b l e e x t r a c t i n g a g e n ti n w h i c h p e n i c i l l i n s a l t s ar e s t a b l e was o f e q u a l i m -p o r t a n c e . P e n i c i l l i n i s n o t c o m p a t i b l e w i t h a l l s o l v e n t s .C h a i n ( 1 9 4 9 ) , r e v i e w i n g t h e a v i l a b l e d a t a , c l e a r l y s h o w st h a t s o l u t i o n s o f p e i n c i l l i n i n m e t h a n o l a n d o t h e r a l c o -h o l s possess i r r e g u l a r s t a b i l i t i e s a n d t h a t a l l i n v e s t i -g a t o r s agree t h a t d e g r a d a t i o n occurs. E s p o s i t o a n dW i l l i a m s ( 1 9 5 2 b ) c o n t e n d t h a t p e n i c i l l i n i s r e l a t i v e l ys t a b l e i n m e t h a n o l . T h e i r d a t a was o b t a i n e d on s o l u -t i o n s c o n t a i n i n g 2 5 0 u / m l . S i m i l a r d a t a a t 5 0 0 u / m l was

o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t s t u d i e s . H o w e v e r , i n d e c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n s , m e t h a n o l i c i n a c t i v a t i o n b e c a m e v e r ye v i d e n t , a n d a t c o n c e n t r a t i o n s o f 2 0 u / m l p e n i c i l l i n w a sc o m p l e t e l y i n a c t i v a t e d i m m e d i a t e l y u p o n d i s s o l u t i o n .T h i s i s a t a c o n s i d e r a b l y h i g h e r c o n c e n t r a t i o n t h a nl e v e l s o f 0 . 0 7 5 u / m l . T h u s , r e s u l t s a t h i g h e r c o n c e n -t r a t i o n s i n m e t h a n o l c a n n o t b e e x t r a p o l a t e d t o l o w e rc o n c e n t r a t i o n s .F o r m a m i d e , o n t h e o t h e r h a n d , w a s d e m o n s t r a t e dn o t t o i n a c t i v a t e a d d e d p e n i c i l l i n o v e r a p e r i o d o f t h r e eh o u r s a t a n y c o n c e n t r a t i o n R e c o v e r y e x p e r i m e n t s f r o mf o r m a m i d e e x t r a c t s o f f e e d s w e r e w i t h i n t h e n o r m a la s s a y l i m i t s i n c o n t r a s t t o t h e e r r a t i c r e s u l t s o b t a i n e dw i t h m e t h a n o l . F u r t h e r m o r e , s i n c e t h e d i l u t e d f o r m -a m i d e s o l u t i o n s w e r e w i t h o u t e f f e c t o n a s s a y o r g a n i s m s ,i t w a s n o t n e c e s s a r y t o d r y t h e d i s c s b e f o r e p l a c e m e n to n t h e a g a r t e s t p l a t e s , t h u s s i m p l i f y i n g t h e m e c h a n i c so f t h e a s s a y . A s s a y s w e r e c o n d u c t e d u s i n g a q u e o u sc r y s t a l l i n e s o d i u m p e n i c i l l i n s t a n d a r d s o l u t i o n s a s o p -p o s e d t o t h e a r t i f i c i a l l y e n r i c h e d f e e d s e m p l o y e d b yE s p o s i t o a n d W i l l i a m s ( 1 9 5 2 b ) f o r a s s a y s t a n d a r d s .

SUMMARYD a t a a r e p r e s e n t e d w h i c h s h o w t h a t p e n i c i l l i n i s u n -s t a b l e i n m e t h a n o l a t t h e l e v e l e n c o u n t e r e d i n p e i n c i l l i n

a s s a y o f a n i m a l f e e d s . W h i l e s o m e v a r i a b l e s t a b i l i t y i si m p a r t e d t o p e n i c i l l i n b y m e t h a n o l e x t r a c t s , t h e p i c t u r ei s c o m p l i c a t e d b y t h e p r e s e n c e o f c e r t a i n p e n i c i l l i np o t e n t i a t i n g s u b s t a n c e s p r e s e n t i n m e t h a n o l i c e x t r a c t so f f e e d s .An a s s a y m e t h o d i s d e s c r i b e d w h i c h e m p l o y s a s t a b l ep e n i c i l l i n f o r m a m i d e e x t r a c t o f f e e d s a m p l e s . T h e a s s a yp e r m i t s t h e u s e o f p e n i c i l l i n G s o d i u m a s t h e s t a n d a r df o r b o t h d i b e n z y l e t h y l e n e d i a m i n e a n d p r o c a i n e p e n i -c i l l i n , a n d d o e s n o t r e q u i r e a n u n s u p p l e m e n t e d f e e ds i m i l a r t o t h a t b e i n g a n a l y z e d f o r p r e p a r a t i o n o f t h es t a n d a r d .

REFERENCESC H A I N , E . 1 9 4 9 P h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h ep e n i c i l l i n s . A n t i b i o t i c s , O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , 2 , 8 1 4 -8 1 5 .C L A R K E , HANS T . , J O H N S O N , J O H N R . , AN D R O B I N S O N , S I RR O B T . ( E d i t o r s ) 1 9 4 9 T h e C h e m i s t r y o f P e n i c i l l i n . P r i n c e -

t o n U n i v e r s i t y P r e s s , P r i n c e t o n , N . J . , p p . 6 0 , 9 2 , 5 8 2 , 6 1 2 .E S P o S I T O , R . G . , AN D W I L L I A M S , W. L . 1 9 5 2 a S t a b i l i t y o fv a r i o u s p e n i c i l l i n s a l t s u s e d f o r g r o w t h p r o m o t i o n i na n m i a l f e e d s . F e d e r a t i o n P r o c . , 1 1 , 2 0 8 - 9 .E S P O S I T o , R . G . , AND W I L L I A M S , W. L . 1 9 5 2 b A m e t h o d f o rt h e a s s a y o f p e n i c i l l i n i n a n i m a l f e e d s . P r o c . S o c . E x p .B i o l . M e d . , 8 1 , 6 6 0 - 6 6 5 .

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