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S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines1
Z. Z. HammadiHammadi, J.P. , J.P. AstierAstier, E. , E. RevalorRevalor, R. Morin, , R. Morin, S. S. VeeslerVeesler
Approches Classique et NonApproches Classique et Non--ClassiqueClassiquede la Cristallisation des Protéinesde la Cristallisation des Protéines
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines2
ASSEMBLAGE ET CRISTALLISATION DES BIOMOLÉCULES
2
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ASSEMBLAGE ET CRISTALLISATION DES BIOMOLÉCULES
Interface Physique Interface Physique –– ChimieChimie -- BiologieBiologie
J.P. Astier (IR), N. Ferté(IE), R. Grossier (post-doc), Z. Hammadi (MCf), R. Morin (DR),S. Veesler (DR). Doctorants: E. Revalor, T. Detoisien
Interactions Moléculaires, Structuration, Assemblage et Croissance Cristalline
des Biomolécules
Croissance Cristalline desMolécules Organiques et Propriétés des Matériaux
Etude des Transformations et Transitions de PhasesImportance de la Nucléation:Cela passe par la Maîtrise de la Fréquence de Nucléation et de sa Localisation SpatialeApproche Expérimentale: Méthodologies Développées au Labo Adaptées
à l’étude In situ de la Cristallisation en Solution→ Champ Électrique→ Nucléation Photochimique→ Milieu Confiné
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Cristallisation
Cristallisation en SolutionCristallisation en Solution
Faciès
Morphologie
Polymorphisme
Distribution des Tailles
Qualité
Propriétés d’Usage
Monocristaux
Populationde Cristaux
Mécanismes de CroissanceModèle Cinétique
TemperatureSursaturationMilieuHydrodynamique
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Mécanismes de CristallisationConnaissance du Diagramme de Phases
BPTI/Cl- en Champ Electrique
Classiquement:T, Milieu, β, Hydrodynamique
Non- Classiquement :+ Champ ExterneB, E, hν, Ultrasons,…
-Nucléation-Croissance-Polymorphisme-Séparation de Phases-Murissement
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Cristallisation :Voir et Contrôler
-Nucléation-Croissance-Polymorphisme-Séparation de Phases-MurissementParamètre: TempératureParamètre: Température
1µm
100µm
+
250µm 125µm 50µm
250µm
500µm
4
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MicroscopeMicroscope + + VideoVideo+ PC + PC
Montage développé en 1988 par le Groupe de R. Boistelle à Marseille
Monopuit 0-80°C 15µL-2mL
Contrôle de la TempératureContrôle de la TempératurePar Effet PeltierPar Effet Peltier
Montage ExpérimentalMontage ExpérimentalVisualisation et Contrôle de la Cristallisation Visualisation et Contrôle de la Cristallisation In situIn situ
Cristallisation de 15µL à 2mL
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Montage ExpérimentalMontage ExpérimentalCristallisation de 96x15µL à 24x1mL
Contrôle de la TempératureContrôle de la TempératurePar Effet PeltierPar Effet Peltier
Platine motorisée X-Y
96 Tubes de 15-100µL
48 Tubes de 0,1-1mL24 Tubes de 0,5-2mLMicroscopeMicroscope + + VideoVideo + PC + PC Multpuits 0-80°C 15µL-2mL - Anacrismat
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T
C
Nucléation: Nucléation: balayage des Conditions par Variation de T balayage des Conditions par Variation de T Estimation duEstimation du Diagramme de Phases Diagramme de Phases
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Murissement: Défauts et Qualité Cristalline
*
α-Amylase
Dissolution et Croissance Change le FacièsAstier et Veesler Crystal Growth & Design sous presse
6
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0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40
Concentration mg.mL-1
Temperature /°C
Solution-Mediated PhaseTransition by Increasing T
Solution-Mediated Phase Transition by Decreasing T
Veesler et al. Crystal Growth & Design 2004, 4, 1137.
Contrôle du PolymorphismeDu BPTI – 2M NaBr à pH=4,9
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Une Approche PhysicoUne Approche Physico--chimique:chimique:Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution→→ Diffusion de la Lumière Diffusion de la Lumière –– Statique et DynamiqueStatique et Dynamique→→ DDiffusion des RX aux Petits Angles (DXPA)iffusion des RX aux Petits Angles (DXPA)
Besoin de Critères pour Choisir/DéterminerBesoin de Critères pour Choisir/Déterminerde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisationde Manière Rationnelle les Conditions de Cristallisation
«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de Phases
Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)Approche Complémentaire à la Cristallisation à Haut Débit (HTS)
Diffusion des Rayonnements et CristallisationDiffusion des Rayonnements et Cristallisation
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IntensitéIntensité DiffuséDiffusé = = FacteurFacteur de de FormeForme x x FacteurFacteur de Structurede StructureI(c,s) = I(0,s) x S(c,s)
Taille, Forme, Masse et PolydispersitéUnité de Croissance
Interactions moléculairesDiagramme de Phases
Nucléation
Diffusion des RayonnementsDiffusion des Rayonnements
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Hamiaux et al. J. Mol. Biol. (2000) 297, 697-712
Cristallographie : Décamère = Unité de CroissanceBPTI à pH acide
Sel et T°CpH et Sel
UnitéUnité de de CroissanceCroissance CristallographiqueCristallographique
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Atomic Force MicroscopyAtomic Force MicroscopyDXPA DXPA
[BPTI]=21 mg/ml, 20°C [BPTI]=21 mg/ml, 20°C
0.04
S (Å-1)
Ajuster (43% Décamère)
100
Décamère
Best F
Expérience
0.01 0.02 0.030.00
10
1
1000
Monomère
Intensité (a.u)
0.04
Unité de Croissance en Solution:Unité de Croissance en Solution: BPTI 350mM KSCN pH=4.5
Hauteur Marches par AFM = Taille Décamère
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Macromolécule en solution, Detergent + Lipide⊕
Température, pH, Force Ionique et Nature, [PEG],...
Diagramme de Phases / Courbes de SolubilitéDiagramme de Phases / Courbes de Solubilité
Dépletion
van der Waals, Coulombienne,et Hofmeister
+
-+
+
+
+
+
+
- --
--
-
DiagrammeDiagramme de Phasesde Phases Interactions Interactions MoleculairesMoleculaires
9
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5
6
7
8
9
0 20 40 60
1.4 M NaCl1.7M NaCl2M NaCl0.35M KSCN
D 10 7 (cm2/s)×
C (mg/ml)
= 1.25M (NH4)2SO4
Interactions Moléculaires Interactions Moléculaires par DQELpar DQEL
Rh = 23,1 Å
D=D0(1+KDC)
BPTIBPTIpH 4pH 4,,55
En Conditions de En Conditions de CristallisationCristallisation les Interactions les Interactions sontsont AttractivesAttractives
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0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Solubilités (mg/ml)
Force Ionique (M)
KSCN
NaCl
(NH4)2SO4
-40
-30
-20
-10
0
10
0 1 2 3 4 5 6Force Ionique (M)
NaClKSCN
(NH4)2SO4
ΚD
Solubilités Solubilités Interactions MoléculairesInteractions Moléculaires
Lafont et al. J. Cryst. Growth (1997)
BPTIBPTIpH 4pH 4,,55
Très Bonne Très Bonne CorrelationCorrelation entre l’Intensité des Interactionsentre l’Intensité des Interactionset la Solubilité:et la Solubilité:
Plus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est FaiblePlus les Interactions sont Fortes, Plus la Solubilité est Faible
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Demixtion : 2 Liquides 1 Phase Haute C + 1 Phase Faible c
Concentration
Température
Cc
Tc
Solubilité
Binode
Cc
Grouazel et al. Acta Cryst. (2002)
SiSi les Interactions les Interactions sontsont trop trop IntensesIntensesDemixtionDemixtion
cascas dudu BPTIBPTI--KSCNKSCN
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Concentration
Températureou[Cristallisant]-1
Cc
Tc
Séparation de Phases ThermoSéparation de Phases Thermo--InduiteInduiteFacile à RéaliserFacile à Réaliser
Séparation de PhasesSéparation de Phases par Variation de Compositionpar Variation de CompositionBalayage IsothermeBalayage Isotherme
Séparation de Phases LiquideSéparation de Phases Liquide--LiquideLiquide
MeilleursConditions
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Caractérisation des Macromolécules en SolutionCaractérisation des Macromolécules en Solution
Besoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière RationnellBesoin de Critères pour Choisir/Déterminer de Manière Rationnelle les e les Conditions de CristallisationConditions de Cristallisation
La La MonodispersitéMonodispersité est un bon Critère est un bon Critère -- Les Les AgrégatsAgrégats sont à Évitersont à Éviter
«« PrédictionPrédiction » du Diagramme de Phases» du Diagramme de PhasesTrès Bonne Corrélation entre les InteractionsTrès Bonne Corrélation entre les Interactions et les Conditions de et les Conditions de CristallisationCristallisation
Diffusion des Rayonnements et CristallisationDiffusion des Rayonnements et Cristallisation
En Conclusion:En Conclusion:
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Objectifs : Observer, Objectifs : Observer, ControlerControleret Comprendre la Nuclet Comprendre la Nuclééation.ation.
Maîtriser la Fréquence de Nucléation et sa Localisation SpatialeMaîtriser la Fréquence de Nucléation et sa Localisation Spatiale↓↓
RechercheRecherche des Conditions de des Conditions de CristallisationCristallisation -- PolymorphismePolymorphisme
Approches Classique et NonApproches Classique et Non--ClassiqueClassiquede la Cristallisation des Protéinesde la Cristallisation des Protéines
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Modèle Classique en 1 étape
Structure
Densité
Nucléation
Modèle en 2 étapes de Kashchiev
MMéécanismes de canismes de NucleationNucleation??
On s’intéresse a la non PrédictibilitéSpatiale et Temporelle du Premier Nucléi!
Où et quand regarder?
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Comment Mesurer la Fréquence de Nucléation?
Nucléation = Phénomène Stochastique Traitement statistique sur grand nombre de données expérimentales
(1) Mesure du temps d’induction
(2) Décompte des cristaux en fonction du temps
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T
C T
t
1
TN
TN
2
TG
TG
Δt
FréquenceFréquence de de NucléationNucléation
“Double-Thermal-Pulse technique”
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Temps (Δt)
Nombre de Cristaux
Pente = J = ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛−= 2exp
σBACJ
N0
tN
dd
Fréquence de NucléationFréquence de Nucléation
14
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Microfluidique voir Présentation J.B. Salmon
Fréquence de NucléationFréquence de Nucléation
Puce et Moule Fournis par JB Salmon
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Lysozyme 20mg/mL, pH =4,5, 0,7M NaCl, TN = 20°C, Δt = 2h, TG = 25°C
~ 200 gouttes de ~300nL
Fréquence de NucléationFréquence de Nucléation
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0 1 2 3 4 5
Fréquence Normalisée
Nb Cristaux
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 2 4 6 8 10
Nb cristaux
Δ t (h)
Microfluidique: Adaptée à l’Etude de la Nucléation:
15
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NucleationNucleation dans la Zone Métastabledans la Zone Métastable
Non-Classique: Addition d’un Champ ExterneB, E, hν,Ultrasons,…Fluctuation de Densité et Structuration
+
250µm
Champ électrique Point Froid Champ Magnétique Photochimique
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Fort Champ electrique
Fort Gradient de Champ
Cristallisation de Protéines Cristallisation de Protéines induite par un Champ Electrique Localinduite par un Champ Electrique Local
Une pointe Ultra-fine
Pour Induire et Contrôler une Inhomogénéité Locale dans la solution:
On souhaite Nucléer dans cette zone de la Cellule de Cristallisation,
Localisation et sa Reproductibilité.
16
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On mesure le courant:Reproductibilité & Détection des premiers stades.
⊕ Solution :BPTI & NaCl[BPTI] = 20mg/ml[NaCl] = 1.6M à 1.7M
Huile de paraffine prévient l’évaporation
2 électrodes de W
Pointe Ultra fine Electrode ronde
La cellule de cristallisationLa cellule de cristallisation
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Cellule thermostatée à 20°C
Micro-manipulateur Y, Z
125µm
On contrôle la distance entre les 2 électrodes
Montage ExpérimentalMontage Expérimental
17
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Des observations InDes observations In--situ sous microscope optiquesitu sous microscope optique
-- Une tension continue de 0 à Une tension continue de 0 à ±±1V.1V.
-- Expériences menées à 20°C, à différentes valeurs de courant dExpériences menées à 20°C, à différentes valeurs de courant de 0 à 2µA.e 0 à 2µA.
-- Pour chaque valeur de courant, on change les électrodes mais laPour chaque valeur de courant, on change les électrodes mais la géométrie géométrie est conservée.est conservée.
-- Expériences avec le Lysozyme et le BPTI (Tous deux chargés + àExpériences avec le Lysozyme et le BPTI (Tous deux chargés + à pH=4.5).pH=4.5).
On attend une Cristallisation à la Cathode (On attend une Cristallisation à la Cathode (--))
MéthodeMéthode
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BPTI/BPTI/NaClNaCl àà 20°C, 20°C, ßß=1,7=1,7 I=0,6µA (0,7V)I=0,6µA (0,7V)
1.Localisation à l’Anode!2.Temps de Nucléation Réduit3.Vitesses de Croissance Différentes
+
-
Résultats ExpérimentauxRésultats Expérimentaux
Des Cristaux de Différentes Tailles Des Cristaux de Différentes Tailles et une Gangue/Gel …et une Gangue/Gel …
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Experiment december 9th, 2004
+ -
AvantAvant125µm
190µm 240µm
160µm 190µm
AprèsAprès
Dissolution de la Gangue maisDissolution de la Gangue mais
Les Cristaux continuent de CroîtreLes Cristaux continuent de Croître
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+
-
0,40,4µA (µA (0,60,6V)V) [BPTI] =20mg/mL in 1,6M [BPTI] =20mg/mL in 1,6M NaClNaCl ((ββ=1,4)=1,4)
Experiment of june 7th, 2006
A plus Basse Valeur du Courant:A plus Basse Valeur du Courant:
Gradient de Concentration etDifférentes Vitesses de Croissance
0
500
1000
1500
2000
2500
0 2 4 6 8 10 12
volA
volB
volC
Volume du cristal a.u.
Temps (h)
19
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Experiment of june 30th, 2006
+
-
Même solution mais un courant de Même solution mais un courant de 1µA (1V)1µA (1V)
A plus Haute Valeur du Courant:A plus Haute Valeur du Courant:
Pas de Pas de Cristaux mais Cristaux mais
une Gangue/Gelune Gangue/Gel
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines38
Experiment of October 2, 2006 :
Gel
DémixtionLa Gangue ?La Gangue ?
Gel = Séparation liquide-liquide(LLPS):
Solution de BPTI = décamères et monomèresLLPS = décamères de BPTI [JPCB, 2006]
+
20
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines39
Concentration
Température
Cc
Tc
Solubilité
Binode
+
+
250µm
cC
Demixtion : 2 Liquides 1 Phase Haute C + 1 Phase Faible c
Cristallisation du BPTI/Cristallisation du BPTI/NaCl NaCl induite par un Champ Electrique Localinduite par un Champ Electrique Local
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines40
U~10−3 V, I~2 µA
lysozyme
Sans E
Avec E
Electrodes dans la Solution, moins de Cristaux et Plus gros. (Moreno et al. 2004, Mirkin et al. 2003)
+ -
Pourquoi le BPTI Cristallise à l’AnodePourquoi le BPTI Cristallise à l’AnodeAu lieu de la Cathode?Au lieu de la Cathode?
21
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines41
Vitesse des MonomèresVitesse des Décamères
Pourquoi le BPTI Cristallise à l’Anode ?Pourquoi le BPTI Cristallise à l’Anode ?
-
MonomèresCristal & LLPS
= Association de décamères
+
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines42
Aujourd’hui, on contrôle Aujourd’hui, on contrôle
Gangue/GelGangue/GelCroissance et Croissance et Nucléation Nucléation sur la sur la
pointe:pointe:(+) = BPTI & Lysozyme(+) = BPTI & Lysozyme
Cristaux Cristaux Croissance et Croissance et localisationlocalisation près de la près de la
pointe:pointe:(+) = BPTI & ((+) = BPTI & (--) = Lysozyme) = Lysozyme
NucléationNucléation ??
Contrôler le Transfert de MatièreContrôler le Transfert de Matière
Visualiser les Lignes de Courant (Protéines Fluorescentes).Visualiser les Lignes de Courant (Protéines Fluorescentes).
Changer la Géométrie pour Comprendre comment les Lignes de Changer la Géométrie pour Comprendre comment les Lignes de Courant peuvent influencer la Nucléation/Croissance. Courant peuvent influencer la Nucléation/Croissance.
Expériences avec la Diffusion de la Lumière et/ou des RX Expériences avec la Diffusion de la Lumière et/ou des RX →→espespéérer rer détecter les premiers stades de la nucléation.détecter les premiers stades de la nucléation.
Hammadi et al. Crystal Growth and design (2007)
ConclusionConclusion
22
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines43
PERSPECTIVESPERSPECTIVESApproches Classique et NonApproches Classique et Non--ClassiqueClassique
de la Cristallisation de la Cristallisation :Augmenter le Nombre d’expériences et Diminuer la
Quantité de Matière Première
Classique
• Cristallisation Batch Multi-puits thermostaté ( µL)+ videomicroscopie
• Nouvelles Technologies Microfluidique (nL)Milieux Confinés (pL and fL?)
Non -Classique
• Champ ElectriqueLocalisation
• lumière
S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines44
Approches Classique et NonApproches Classique et Non--ClassiqueClassiquede la Cristallisation des Protéinesde la Cristallisation des Protéines
Jean-Pierre Astier,Thirou Bactivelane,Brice Detailleur,Thibaud Detoisien, Natalie Ferté,Romain Grossier,Zoubida Hammadi,Vasile Heresanu,Roger Morin,Eve Revalor
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S. S. VeeslerVeesler CINaMCINaM, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non, CRISTECH 2008 Approches Classique et Non--Classique de la Cristallisation des ProtéinesClassique de la Cristallisation des Protéines45
Approches Classique et NonApproches Classique et Non--ClassiqueClassiquede la Cristallisation des Protéinesde la Cristallisation des Protéines
Jean-Pierre Astier,Thirou Bactivelane,Brice Detailleur,Thibaud Detoisien, Natalie Ferté,Romain Grossier,Zoubida Hammadi,Vasile Heresanu,Roger Morin,Eve Revalor