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Recibido: Mayo, 2005. Aprobado: Agosto, 2006.Publicado como ARTÍCULO en Agrociencia 40: 741-751. 2006.
RESUMEN
Se evaluó la toxicidad aguda del extracto crudo de dos cosechas
de semillas de neem (Azadirachta indica) y del producto comer-
cial a base de neem, PHC Neem®, sobre Varroa destructor y Apis
mellifera, así como la repelencia de dichos productos sólo sobre
V. destructor (varroa). Para determinar toxicidad aguda se apli-
caron diluciones 0.33, 0.67 y 1.32% de los productos citados
sobre hembras de varroa y abejas obreras, por aspersión me-
diante la torre de Burgerjon. Se les incubó a 32±2 °C y 70±10%
HR, provistas del alimento adecuado, y se registró su mortalidad
a 24 y 48 horas. En pruebas de repelencia se trató a pupas de
abejas con las diluciones anotadas y se determinó la capacidad
de las varroas para localizar y alimentarse de pupas con o sin
tratamiento. En la prueba de toxicidad aguda, ninguno de los
productos causó mortalidad de varroa ni de abejas. En las prue-
ba de repelencia, los tres productos mostraron repelencia signifi-
cativa, en relación directa entre concentración y efecto. El ex-
tracto crudo de neem cosecha 2003 a 1.32% presentó la repelencia
más alta y estable, que impidió que 98% de las varroas se posa-
ran sobre pupas de abejas y causó 100% de mortalidad de varroa,
aparentemente por inanición, en 72 h.
Palabras clave: Apis mellifera, abejas, azadiractina, neem.
INTRODUCCIÓN
El ácaro Varroa destructor Anderson y Trueman(2000) se considera como la plaga más impor-tante de la abeja común Apis mellifera L. en el
mundo (Sammataro et al., 2000). El uso indiscrimina-do de productos químicos para controlar la varroasisha favorecido la aparición de resistencia en muchospaíses (Elzen et al., 1999a y b; Mathieu y Faucon,2000; Thompson et al., 2002). México corre ese mis-mo riesgo porque sólo tiene dos piretroides sintéticos:fluvalinato (nombre comercial Apistan®) y flumetrina(nombre comercial Bayvarol®).
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor(ACARI: VARROIDAE)
Azadirachta indica TOXICITY AND REPELLENCE OF Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
Rebeca González-Gómez1, Gabriel Otero-Colina1, J. Antonio Villanueva-Jiménez2,
J. Alberto Pérez-Amaro3 y R. Marcos Soto-Hernández4
1Entomología y Acarología. 4Botánica. Campus Montecillo. Colegio de Postgraduados. 56230.Montecillo, Estado de México. 2Campus Veracruz. Colegio de Postgraduados. 91700. Predio Tepetates,Veracruz, Veracruz. 3Universidad del Papaloapan. 68100. Campus Loma Bonita, Oaxaca.
ABSTRACT
Crude extract of two neem seed (Azadirachta indica) harvests
and the neem-based commercial product PHC NeemTM were
evaluated in terms of their acute toxicity on Varroa destructor
and Apis mellifera as well as their repellence only on V. destructor
(varroa mites). To determine acute toxicity, 0.33, 0.67, and 1.32%
dilutions of the above products were sprayed on varroa mites
and worker bees with a Burgerjon’s tower. They were incubated
at 32±2 °C and 70±10% RH and provided with sufficient food.
Mortality was recorded at 24 and 48 h. In repellency tests, bee
pupae were treated with the same dilutions, and the ability of
varroa mites to locate and feed on the pupae, with or without the
treatment, was determined. In the acute toxicity test, none of the
products caused varroa or bee mortality. In the repellency test,
the three products significantly repelled varroa, in a direct
relationship between concentration and effect. The 1.32% crude
neem extract, 2003 harvest, had the highest and most stable
repellency, impeding 98% of the varroa mites from settling on
bee pupae and caused 100% mortality of varroa mites, apparently
from starvation, in 72 h.
Key words: Apis mellifera, bees, azadirachtin, neem.
INTRODUCTION
The mite Varroa destructor (Anderson andTrueman, 2000) is considered the major pestof common Apis mellifera L. honey bees
worldwide (Sammataro et al., 2000). The indiscriminateuse of chemical products for the control of varroasishas favored resistance in many countries (Milani, 1999;Elzen et al., 1999a and b; Mathieu and Faucon, 2000;Thompson et al., 2002). Mexico runs the same risk,with only two synthetic pyrethroids: fluvalinate(commercial name ApistanTM), and flumetrine(commercial name BayvarolTM).
Botanical products for pest control are veryimportant at present. This is the case of the neem treeAzadirachta indica A. Juss. (Meliaceae), from whicha broad diversity of secondary compounds are extracted.
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
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Los productos botánicos para el manejo de plagastienen gran importancia en la actualidad. Así, del ár-bol de neem Azadirachta indica A. Juss. (Meliaceae)se extraen diversos compuestos secundarios; laazadiractina es el de mayor importancia, pues actúacomo repelente, antialimentario y retarda el crecimientode los insectos (Mordue y Blackwell, 1993). Las sus-tancias contenidas en el neem se pueden considerarcomo una fuente potencial para el control de varroa;su incorporación como producto natural alternativo aluso de sustancias químicas podría contribuir a dismi-nuir la contaminación de los productos de la colmena.
Los efectos subletales pueden ser útiles en el con-trol de varroa; cualquier efecto en este ácaro que inter-fiera con su capacidad para localizar a su huésped pue-de tener un valor práctico como método de control.Colin et al. (1994) desarrollaron una escuela en labúsqueda de efectos subletales para controlar parásitosde las abejas, y propusieron un protocolo para evaluarproductos vegetales.
Por tanto, los objetivos del presente trabajo fueronevaluar la toxicidad aguda del extracto crudo de lassemillas de neem (A. indica) y el producto comercial abase de neem, PHC Neem®, sobre V. destructor y A.mellifera, y evaluar la repelencia de los mismos ex-tractos sobre varroa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las varroas se recolectaron mediante el método del panal tram-
pa (Maul, 1983), usando panales con celdas de tamaño de cría de
zánganos; se colocaron en cajas Petri de plástico (8 cm diámetro) y
cada tapa tenía un agujero (4.5 cm diámetro) cubierto con una ma-
lla. Las varroas se alimentaron con pupas de zánganos. Antes de su
uso y durante un máximo de 2 d, los panales y los ejemplares de
varroa se incubaron a 32±2 °C y 70±10% HR.
Las pupas de abejas obreras se obtuvieron de los panales de la
cámara de cría, se eligió aquéllas de los estados Pw y Pp según
Rembold y Kramer (1980). Pw significa literalmente Pupa white
(ojos blancos), y Pp significa Pupa purple (ojos morados), etapas
que se alcanzan 7-8 d después de que las obreras habían operculado
la celda. En todas las pruebas se utilizaron pupas recolectadas 1 h
antes de realizar los bioensayos.
Las abejas adultas se recolectaron en la cámara de cría y se
seleccionaron aquéllas localizadas a los lados de la cría, para evitar
la captura de abejas nodrizas jóvenes (Felton et al., 1986). Se pusie-
ron en frascos de cristal de 500 mL cuyas tapas tenían un orificio de
ventilación cubierto con malla; se incubaron a 32±2 °C y 70±10%
HR y se les proporcionó miel y agua.
Se evaluó aceite crudo de neem, así como el producto comercial
a base de neem llamado PHC Neem®. El aceite crudo se obtuvo de
las semillas de neem recolectados del Campus Veracruz, Colegio de
Postgraduados, en Tepetates, Veracruz, en agosto de 2002 y 2003.
El aceite se obtuvo a temperatura inferiores a 35 °C, con un extractor
Of these, azadirachtin is the most important, acting asan insect repellant, feeding inhibitor, and insect growthretarder (Mordue and Blackwell, 1993). The substancescontained in neem can be considered potentially usefulin varroa control; their incorporation as a naturalproduct alternative to the use of chemical substancescould contribute to reduce contamination of productsfrom the beehive.
Sublethal effects can be useful in controlling varroa.Any effect that interferes in the mite’s ability to locateits host may have a practical value as a method ofcontrol. Colin et al. (1994) formed a school in thesearch for sublethal effects to control bee parasites andthey proposed a protocol for assessing plant products.
Therefore, the objectives of the present study wereto evaluate acute toxicity of crude neem seed extract(A. indica) and of the neem-based commercial product,PHC NeemTM, on V. destructor and A. mellifera, andto evaluate their repellence of varroa.
MATERIALS AND METHODS
Varroa mites were collected with the method of the honeycomb
trap (Maul, 1983), using honeycombs with drone-rearing-size cells.
The mites were placed in plastic Petri dishes, 8 cm in diameter, with
caps with a 4.5 cm diameter hole covered with a screen, and received
drone pupae as food. Before use, and for a maximum of 2 d, both
honeycomb and varroa specimens were incubated at 32±2 °C and
70±10% RH.
The worker bee pupae were obtained from rearing chamber
combs, and those in Pw and Pp stages, following Rembold and
Kramer (1980) were selected. Pw literally means pupa white (white
eyes), while Pp means pupa purple (purple eyes), stages that are
reached 7-8 d after worker bees have capped the cell. In all of the
tests pupae collected 1 h before performing the bioassays were used.
Adult bees were collected in the rearing chamber and those
that were found outside the brood zone were selected to avoid
capturing young nurses (Felton et al., 1986). The adults were
confined in 500 mL glass jars with caps with a ventilation orifice
covered with screen; they were incubated at 32±2 °C and 70±10%
RH and given honey and water.
Crude neem oil, as well as the commercial neem-based product
PHC NeemTM, was evaluated. The crude oil was obtained from
neem seeds collected in the Veracruz Campus of Colegio de
Postgraduados, Tepetates, Veracruz, in August, 2002 and 2003. Oil
was extracted at temperatures below 35 °C with a stainless steel
extractor by applying 3 t pressure and was stored at −3 °C. Mother
suspensions were prepared from the 2002 and 2003 crude oils and of
PHC Neem and mixed with water and Tween 20 (1:1:1, by weight).
From these, dilutions were made for application on bees and varroa
mites.
The products mentioned were sprayed on varroa or bees with a
Burgerjon’s (1956) pulverization tower, which nebulizes products to
15 µm drops. This tower was calibrated to apply 1 to 2 mg cm−2
743GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
de acero inoxidable, aplicando 3 t de presión, y se almacenó a −3 °C. Se
prepararon suspensiones madre de los aceites crudos de 2002 y 2003
y de PHC Neem, mezclándolos con agua y Tween 20 (1:1:1, por
peso); a partir de ellas se hicieron diluciones para aplicarlas a abejas
o varroas.
Los productos mencionados se aplicaron sobre varroas o abejas
usando la torre de pulverización de Burgerjon (1956), la cual nebuliza
los productos en gotas de 15 µm de diámetro. Esta torre se calibró
para aplicar 1 a 2 mg cm−2 (Colin et al., 1994). Esto se logró
aplicando 15 mL de la solución a una presión de 0.703 kg cm−2, y se
dejó 1 min más para permitir la sedimentación de las gotas sobre los
organismos.
Prueba de letalidad aguda en varroa y abejas
Con las suspensiones madre descritas se prepararon diluciones
1%, 2% y 4% (0.33, 0.67 y 1.32% del producto concentrado), que
corresponden aproximadamente a las recomendadas por el fabrican-
te del PHC Neem. Para la aplicación en varroa, grupos de 10 hem-
bras adultas se colocaron en una caja Petri (14 cm diámetro) con el
fondo cubierto con un círculo de papel filtro, y enseguida se aplica-
ron las suspensiones. Al terminar la aplicación se transfirieron las
varroas a cajas Petri (8 cm de diámetro) tratadas con una capa de
fluón (politetrafluoruro de etileno) en las paredes laterales, para
impedir que escaparan. Luego se adicionaron pupas de abejas de
ojos rosas a violeta como alimento, y se incubó a 32±2°C y 70±10%
HR. Paralelamente a los tratamientos, hubo grupos testigo, a los que
se aplicó agua destilada más emulsificante, en concentraciones co-
rrespondientes a las usadas para cada tratamiento de las diluciones
(1, 2 y 4%).
Las abejas, antes de la pulverización, se anestesiaron con CO2
durante 15 s. Se seleccionaron grupos de 30 obreras adultas, y se
aplicaron los mismos tratamientos que con los ácaros. Enseguida las
abejas fueron transferidas a jaulas de madera y malla de hierro
galvanizado, de 15×15×15 cm.
Tanto para varroas como para abejas, cada dilución, así como
los testigos, se realizaron en cuatro repeticiones; las lecturas de
mortalidad se registraron a las 24 y 48 h. En pruebas complementa-
rias, sin repeticiones, las concentraciones aplicadas a varroa y a
abejas se elevaron hasta alcanzar 50% del producto concentrado.
Prueba de repelencia con elección
Las arenas de observación fueron cajas Petri de plástico de 8 cm
de diámetro, con tapa con orificio de ventilación como ya se descri-
bió. Cada caja estaba dividida en dos zonas principales (A y B), y
cada zona formada por tres subdivisiones (a, b y c). La zona cero (0)
correspondió al centro de la caja, en la cual se colocaron diez hem-
bras de varroa, mientras que en los extremos de la caja (zonas Ac y
Bc) se colocaron tres pupas de abejas obreras (cuerpo blanco y ojos
rosa a violeta) en cada una (Figura 1). Sólo las pupas colocadas en la
zona Ac habían sido tratadas previamente con 15 mL de las concen-
traciones de 1%, 2% o 4%, mediante la torre de Burgerjon. Se
hicieron cuatro repeticiones por tratamiento y se tomaron lecturas
(Colin et al., 1994). This was accomplished by applying 15 mL of
solution at a pressure of 0.703 kg cm−2, and left for 1 min more to
allow drops to settle on the organisms.
Acute lethality tests in varroa and bees
With the mother suspensions described, 1, 2, and 4% dilutions
(0.33, 0.67, and 1.32% of the concentrated product), corresponding
approximately to those recommended by the manufacturer of PHC
Neem, were prepared. For application on varroa, groups of 10 adult
females were placed in a Petri dish (14 cm in diameter), the bottom
covered with a circle of filter paper, and immediately sprayed with
the solutions. After application, the varroa were transferred to 8 cm
Petri dishes which had been treated with a layer of ethylene
polytetrafluoride on the inner sides to prevent their escape. Later,
pink or purple eye bee pupae were introduced as food, and incubated
at 32±2 °C and 70±% RH. Parallel to the treatments, there were
control groups on which distilled water plus an emulsifier was applied
in concentrations corresponding to the dilutions (1, 2, and 4%) used
for the treatments.
Before being sprayed, the bees were anesthetized with CO2 for
15 s. Groups of 30 adult workers were selected and sprayed with the
same treatments in the same manner as with the mites. Bees were
immediately transferred to galvanized iron screen and wooden cages
15×15×15 cm.
For both varroa and bees, four replications were performed
with each dilution and control. Mortality was recorded after 24 and
48 h. In complementary tests, without replications, the concentrations
applied to varroa and bees were increased up to 50% of the
concentrated product.
Repellency test with choice
The observation arenas were 8 cm diameter plastic Petri dishes,
which had caps with ventilation orifices as described above. Each
dish was divided into two main sections (A and B) and each section
was composed of three subdivisions (a, b, and c). Section zero (0)
was the center of the dish in which ten varroa females were placed,
while three worker bee pupae (white body and pink to purple eyes)
were placed in the outermost parts of each dish (Ac and Bc) (Figure
1). Only the pupae placed in the Ac subdivision had been treated
previously with 15 mL of 1, 2, or 4% concentrations with the
Burgerjon’s tower. Each treatment was replicated four times, and
readings of mite location were taken at 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, and
72 h, quantifying the tendency of the mites to move from one section
to another.
To determine numerically whether the extracts repelled, or even
attracted, the following formula was used (Colin et al., 1994):
VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)−(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S
where, VR=repellency value; Aa, Ab and Ac=number of mites on
sections Aa, Ab, and Ac; Pa=number of mites on side A pupae
(treated); Ba, Bb, and Bc=number of mites on sections Ba, Bb, and
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
744 VOLUMEN 40, NÚMERO 6
de la ubicación de los ácaros a 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48 y 72 h; en ellas
se cuantificó la tendencia de dichos ácaros a desplazarse de una zona
a otra.
Para determinar numéricamente si existió repelencia o atrac-
ción por los extractos, se usó la siguiente fórmula (Colin et al.,
1994):
VR=100+{(Ba+2Bb+3Bc+4Pb)−(Aa+2Ab+3Ac +4Pa)}10/S
donde, VR=valor de repelencia; Aa, Ab y Ac=número de ácaros
sobre las zonas Aa, Ab y Ac; Pa=número de ácaros sobre las pupas
del lado A (tratadas); Ba, Bb y Bc=número de ácaros sobre las
zonas Ba, Bb y Bc; Pb=número de ácaros sobre las pupas del lado
B (no tratadas); S=número de ácaros sobrevivientes al momento de
la observación.
La notación citada da un valor ponderado superior a la posición
de un parásito sobre una pupa (×4) o en inmediata proximidad
(×3), en contraste con una posición más alejada de las pupas o más
central (×2 ó ×1). Si todas las varroas permanecen sobre la zona
cero o hay un reparto equitativo sobre ambas zonas, los valores de A
contrarrestarán a los de B; si todos los ácaros permanecen sobre las
pupas de la zona B, los valores de A serán cero y los valores de B
serán 40. El número 100 tiene por función desplazar el origen y
facilitar el análisis estadístico; entonces, los valores fluctuarán de 60
al 140; es decir, desde una fuerte atracción hasta una total repelencia.
El factor 10/S sirve para compensar la mortalidad de los ácaros al
momento de la observación.
Prueba de repelencia sin elección
La finalidad de esta prueba fue determinar el efecto repelente de
los tratamientos a evaluar, en ausencia de pupas no tratadas. En este
caso las pupas que se colocaron en la zona Ac y en la Bc fueron
tratadas con los productos y concentraciones correspondientes, así
como los testigos descritos. En esta prueba también hubo cuatro
repeticiones por tratamiento. El criterio de eficacia fue la posición
del ácaro sobre las zonas marcadas, el número de ácaros sobre las
pupas y la mortalidad de ácaros.
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue completamente al azar, en arreglo
factorial 4×4×8, con cuatro repeticiones. El factor A fue el pro-
ducto aplicado, con cuatro niveles: a1=producto comercial formula-
do (PHC® Neem); a2=aceite de neem cosecha 2002; a3=aceite de
neem cosecha 2003 y a4=emulsificante (Tween 20). El factor B fue
la concentración, con cuatro niveles: b1=concentración 0%, ésto es,
testigos tratados con agua destilada; b2=concentración 1%;
b3=concentración 2%; b4=concentración 4%. El factor C fue el
tiempo, con ocho niveles: c1=30 min; c2=1 h; c3=2 h; c4=4 h;
c5=8 h; c6=24 h; c7=48 h; c8=72 h.
Los datos de analizaron con el procedimiento GLM (SAS, 2000)
y las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (p≤0.05).
Figura 1. Zonas de distribución de la caja experimental, para laspruebas de repelencia.
Figure 1. Distribution zones of the experimental dish forrepellency tests.
Zona A
Zona B
Pa
Ac
Ab
Aa
Ba
Bb
Bc
0
Pb
Bc; Pb=number of mites on pupae on side B (not treated); S=number
of surviving mites at the moment of observation.
The cited notation assigns a higher weighted value to the position
of a parasite on a pupa (×4) or in the immediate vicinity (×3), in
contrast with a more central position or farther from the pupae (×2
or ×1). If all of the varroa remain in Section 0, or there is an equal
distribution over the two sections, the A values counteract B values;
if all the mites remain on the pupae of section B, the values of A are
zero and the values of B are 40. The number 100 has the function of
moving the intercept and facilitating the statistical analysis. Therefore,
the values fluctuate between 60 and 140, that is, from strong attraction
to total repellence. The factor 10/S serves to compensate mortality
of the mites at the moment of observation.
Repellency test without choice
This test was conducted to determine the repellent effect of the
treatments to be evaluated in absence of untreated pupae. In this
case, the pupae that were placed in both sections Ac and Bc were
treated with the respective products and concentrations, as well as
the previously described controls. In this test there were also four
replications per treatment. The criteria of effectiveness were position
of the mite on the marked sections, number of mites on the pupae,
and mite mortality.
Experimental design and statistical analysis
The experimental design was completely randomyzed with a
factorial arrangement of treatments 4×4×8, with four replications.
Factor A was the applied product, with four levels: a1=commercially
formulated product (PHCTM Neem); a2=neem oil, 2002 harvest;
a3=neem oil, 2003 harvest; a4=emulsifier (Tween 20). Factor B
was concentration with four levels: b1=0% concentration, controls
745GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
También se realizaron análisis con una sola fuente de variación
de las variables de respuesta (valor de repelencia, ácaros sobre las
pupas y ácaros muertos) en cada uno de los tiempos (0.5, 2, 4, 8, 24
y 72 h) y concentraciones (1, 2 y 4%).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Prueba de letalidad aguda en varroa y abejas
El producto comercial (PHC® Neem), aceite de neemcosecha 2002 (neem1), cosecha 2003 (neem2) y Tween20 (emulsificante), a concentraciones de 1%, 2% y4%, así como el testigo, no causaron mortalidad devarroa ni de abejas, a 48 h, ni con una concentraciónde 50%, en pruebas complementarias. Estos resulta-dos difieren de los citados por Melathopoulos et al.(2000), quienes evaluaron aceite de neem y Neem-aza®; el primero, al usar aplicación tópica, causó 45%de mortalidad de varroa, mientras que el segundo, conaplicaciones tópica, oral y como vapor causó mortali-dad significativa del ácaro.
Se decidió no aumentar la concentración de los pro-ductos porque hubo problemas para la formación desuspensiones estables; asimismo, se consideró que ele-var la concentración haría poco práctico y económicoel uso de este producto. Para PHC Neem, la recomen-dación del fabricante para control de plagas de frutaleses 0.5-2 L concentrado 100 L−1 agua; contra plagasde hortalizas es 50 mL 15 L−1 agua. Dichos valoresequivalen a 0.5-2% y 0.33% de producto concentra-do; esto es, muy cercanos a las usadas en el presenteestudio.
El contacto directo de neem a concentraciones de20 ppm sobre abejas adultas no produce efectos nega-tivos y se puede lograr un control efectivo de las pla-gas con aplicaciones de 30 a 50 ppm de azadiractina(Larson, 1990; Isman, 1995). Según Atkins (1992) laazadiractina es una sustancia relativamente no tóxicapara las abejas, con una DL50 de 11 µg por abeja.
Naumann et al. (1994) encontraron que el extractode semillas de neem es un insecticida seguro cuando almomento de usarlo hay abejas melíferas presentes. Dehecho, los tratamientos que ellos usaron no repelieronlas abejas, y sugieren que el neem puede usarse paracontrolar plagas en cultivos en floración, incluso cuan-do se requieren abejas para la polinización.
Prueba de repelencia con elección
Hubo diferencias significativas en el valor derepelencia, atribuibles a las interacciones dobles de lasvariables tipo de producto, concentración y tiempo delectura, pero no a la triple interacción (Cuadro 1).Además hubo diferencias significativas debidas a la
treated with distilled water; b2=1% concentration; b3=2%
concentration; b4=4% concentration. Factor C was time, with eight
levels: c1=30 min; c2=1 h; c3=2 h; c4=4 h; c5=8 h; c6=24 h;
c7=48 h; c8=72 h.
Data were analyzed with GLM procedure (SAS, 2000) and means
were compared with Tukey test (p≤0.05).
Analyses were also performed with a single source of variation
of the response variables (repellency value, mites on pupae and dead
mites) at each of the times (0.5, 2, 4, 8, 24, and 72 h) and
concentrations (1, 2, and 4%).
RESULTS AND DISCUSSION
Acute lethality test in varroa and bees
With the commercial product (PHCTM Neem), neemoil 2002 harvest (neem1), 2003 harvest (neem2) andTween 20 (emulsifier), at concentrations of 1%, 2%,and 4%, as well as 0% (control), no mortality of varroaor bees was observed at 48 h, neither with a 50% incomplementary tests. These results differ from thosereported by Melathopoulos et al. (2000), who evaluatedneem oil and Neem-azaTM; the former, using topicalapplication, caused 45% mortality in varroa, while thelatter used topical, oral and vapor applications andcaused significant mite mortality.
It was decided not to increase the concentration of theproducts because there were problems in forming stablesuspensions were encountered; also, it was consideredthat elevating the concentration would make use of theproduct impractical or costly. For PHC Neem, therecommendation of the manufacturer for pest control onfruit trees is 0.5-2 L concentrate 100 L−1 water, and onvegetables 50 mL 15 L−1 water is recommended. Thesevalues are equivalent to 0.5-2% and 0.33% of productconcentrate; that is, very close to those used in our study.
Direct contact of bees with neem at concentrationsof 20 ppm does not produce negative effects, andeffective pest control can be achieved with applicationsof 30 to 50 ppm of azadirachtin (Larson, 1990; Isman,1995). According to Atkins (1992), azadirachtin is arelatively non-toxic substance for bees, with a LD50 of11 µg per bee.
Naumann et al. (1994) found that neem seed extractis a safe insecticide to use when there are honey beespresent at the moment of use. In fact, the treatmentsthey used did not repel the bees and suggest that neemcan be used for pest control in crops at the floweringstage even when bees are required for pollination.
Repellency test with choice
There were significant differences in repellencyvalues attributable to double interactions of the variables
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
746 VOLUMEN 40, NÚMERO 6
acción individual de cada variable. Por tanto, las va-riables producto y concentración son de interés en ladiscusión, mientras que la variable tiempo, aunque fueanalizada, representa sólo la diferencia atribuible a lasfluctuaciones en las lecturas, por lo que es pertinenteomitirla de la discusión.
En la Figura 2 se muestra la tendencia en los valo-res de repelencia (VR) a lo largo del tiempo. Primeropuede apreciarse la tendencia estable (de 98 a 110.3)que presentó el testigo (tratado con agua) durante las72 h de observaciones. El tratamiento a base deemulsificante pareció mostrar un ligero efecto repelen-te durante las primeras 4 h, pero sólo tuvo diferenciasignificativa respecto al testigo a los 30 min y a con-centración de 1%; el VR del emulsificante no fue su-perior a 114. Estos valores de repelencia concuerdancon los citados por Colin et al. (1994), VR alrededorde 100 para el agua y el emulsificante, los que mues-tran que las hembras de varroa se distribuyen unifor-memente en las arenas de observación.
Para el aceite de neem el efecto repelente varió enlas dos cosechas; en la de 2002 (neem1), los VR en lasdiferentes concentraciones fueron significativamente másaltos que en el testigo, con un valor máximo de 132 alas 4 h (concentración 2%). Pero el efecto se redujo entodas las concentraciones al pasar el tiempo, y a las72 h el VR mínimo fue 101, igual al testigo. Lacosecha de 2003 (neem2) tuvo altos VR en todas lasconcentraciones, que se separaron de los testigos (aguay emulsificante); a la concentración más alta (4%) hubodiferencias significativas (p≤0.05) desde 30 min hasta72 h, y los VR oscilaron entre 128 y 139, lo cual estámuy cercano a la repulsión total (140). Colin et al.(1994) encontraron que el extracto de Thymus vulgaristuvo el VR más alto, 124 a las 24 h, el cual disminuyócon el tiempo. Estos resultados contrastan con los VRy estabilidad que de neem2 en la presente investiga-ción.
Dado que los extractos de neem de 2002 y 2003 seobtuvieron de la misma plantación y se extrajeron de
Cuadro 1. Análisis de varianza de la prueba de repelencia de extractos de neem con elección, donde la variable de respuesta es el valorde repelencia (VR).
Table 1. Analysis of variance of the repellency test of neem extracts with choice, in which the response variable is the repellency value(RV).
Fuente de variación GL Suma de cuadrados Cuadrados medios Fcal Significancia F
Producto 3 24606.125 8202.042 109.87 <0.001Concentración 3 29805.750 9935.250 133.08 <0.001Tiempo 7 3050.031 435.719 5.84 <0.001Producto*concentración 9 9572.812 1063.646 14.25 <0.001Producto*tiempo 21 4669.219 222.344 2.98 <0.001Concentración*tiempo 21 5654.094 269.242 3.61 <0.001Producto*concentración*tiempo 63 3536.469 56.134 0.75 0.92
type of product, concentration and observation time,but not to triple interactions (Table 1). Besides, therewere significant differences due to the action of eachof the variables individually. Therefore, the variablesproduct and concentration are of interest in thediscussion, while the variable time, although it wasanalyzed, represents only the difference attributable tofluctuations in the observations, and so it is pertinentto omit it in the discussion.
The trend of repellency values (RV) over time isshown in Figure 2. Firstly, it can be seen that thecontrol (treated with water) maintained a stable trend(98 to 110.3) over the 72 h that the observations lasted.The treatment based on the emulsifier seemed to exhibita slight repellent effect during the first 4 h, even thoughit was only significantly different from the control at30 min at 1% concentration; the emulsifier RV wasnot above 114. These repellency values coincide withthose reported by Colin et al. (1994), RV around 100for water and emulsifier, showing that the female varroadistribute themselves uniformly on the observationarenas.
For neem oil, the repellant effect varied betweenthe two harvests: in the 2002 harvest (neem1) RV inthe different concentrations were significantly higherthan those of the control, with a maximum value of132 at 4 h (2% concentration). But the effect decreasedwith time in all of the concentrations and at 72 h, thelowest RV was 101, the same as the control. The 2003harvest (neem 2) had high RV in all of the concentrationsthat differed from the controls (water and emulsifier).At the highest concentration (4%) there were significantdifferences (p≤0.05) from 30 min up to 72 h, and RVoscillated between 128 and 139, which was very nearlytotal repellency (140). Colin et al. (1994) found thatthe extract of Thymus vulgaris had the highest RV,124 at 24 h, decreasing over time. These results contrastwith the RV and stability of neem2 in this study.
The fact that the 2002 and 2003 neem extracts wereobtained from the same plantation and were extracted
747GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
la misma forma, se sugiere que la diferencia en efectopuede deberse a la degradación de los posibles ingre-dientes activos en el tiempo.
El producto comercial PHC Neem® presentó unefecto similar al del neem1, pues VR no fue significa-tivamente diferente entre ambos productos, si bien mos-tró un efecto más estable y a 4% fue significativamen-te diferente del testigo aun a 72 h.
En la Figura 3 se muestra la preferencia de lashembras de varroa para elegir las pupas tratadas de lasno tratadas, y posarse en ellas, en todas las lecturas.La tendencia de los ácaros para posarse en pupas trata-das con agua y con emulsificante fue indistinta o equi-valente, es decir, no mostraron preferencia por unazona particular. En contraste, fue clara la tendencia delos ácaros a posarse sobre pupas no tratadas con cual-quiera de los productos a base de neem; sin embargo,destacó el neem2 porque se posaron significativamentemás hembras de varroa sobre las pupas no tratadas(7.05 varroas/pupas).
Prueba de repelencia sin elección
Respecto al número de ácaros que se posaron sobrelas pupas, hubo efecto significativo de todas las fuen-tes de variación y sus interacciones (Cuadro 2). Comoen el experimento con posibilidad de elección, sólo sediscuten las variables de producto y concentración.
En la Figura 4 se muestra la tendencia de las hem-bras de varroa a posarse sobre las pupas de abejas,todas tratadas, en el tiempo. Se aprecia que en laspupas tratadas con agua y con emulsificante, aproxi-madamente 60% de las hembras de varroa pudieronlocalizarlas y posarse sobre ellas 30 min después de laaplicación; gradualmente este porcentaje aumentó a másde 80%, lo cual se observó en la última lectura a las 72 h.Sólo se contabilizaron las varroas que estaban sobrelas pupas en el momento de la observación, lo cual noexcluye que varroas cercanas pudieran tener acceso alas pupas en otro momento.
Todos los tratamientos con neem tuvieron un nú-mero significativamente menor (p≤≤≤≤≤0.05) de varroassobre las pupas respecto al testigo. Sólo en la concen-tración 1%, en la lectura a las 4 h, no hubo diferenciasignificativa respecto al testigo.
En el Cuadro 3 se presenta los promedios del nú-mero de varroas posadas sobre las pupas. Hubo unefecto significativo del producto y de la concentración;sorprendentemente, el neem2 a 4% sólo permitió queun promedio de 0.2 varroas se posaran sobre las pupastratadas.
El número promedio de varroas muertas en las lec-turas sucesivas; se muestra en la Figura 5. Se presen-tan sólo los valores observados a partir de las 24 h
140
140
140
130
130
130
120
120
120
110
110
110
a
A
B
C
a
a
ab
bc
bc
bc
bcabc
abc abc
ab
ab
ab
ab
ab
ab
bc
ab
ab
ab ab
ab
bc
bc
bc
bc
ab
ab
ab
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b
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c
c
c
c
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c
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b b
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a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
100
100
100
90
90
90NEEM1NEEM2
EMULTestigo
Val
or d
e re
pele
ncia
Val
or d
e re
pele
ncia
Val
or d
e re
pele
ncia
80
80
800.5
Tiempo (horas)1 2 4 8 24 48 72
PHC
Figura 2. Valor de repelencia en los intervalos de tiempo. A)concentración 1%; B) concentración 2%; C) concen-tración 4%. PHC=PHC® Neem (producto comercial);NEEM1=extracto de aceite crudo de las semillas deneem cosecha 2002; NEEM2=extracto de aceite crudode las semillas de neem cosecha 2003; EMUL= Tween20; Testigo=agua. Las intersecciones marcadas condiferente letra, para las lecturas tomadas en un mismotiempo, son significativamente diferentes (p≤≤≤≤≤0.05).
Figure 2. Repellency value at of time intervals. A) 1%concentration; B) 2% concentration; C) 4%concentration. PHC=PHCTM Neem (commercialproduct); NEEM1=extract of crude neem seed oil from2002 neem harvest; NEEM2=extract of crude neemseed oil from 2003 neem harvest; EMUL=Tween 20;Control=water. The intersections marked withdifferent letter, for readings taken at the same time,are significantly different (p≤0.05).
in the same way, suggests that the difference in effectcould be due to degradation of the possible activeingredients over time.
AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
748 VOLUMEN 40, NÚMERO 6
Figura 3. Número promedio de ácaros posados sobre las pupasde abejas en la prueba de repelencia con elección, lue-go de la aplicación de los productos probados. Lasletras mayúsculas hacen comparaciones entre barrasgrises, y las minúsculas entre barras negras. Pa=pupastratadas. Pb= pupas no tratadas.
Figure 3. Average number of mites settled on bee pupae in therepellency test with choice, after application of testedproducts. Upper case letters are comparisons betweenbars and thin lines, and lower case letters betweenbars and thick lines. Pa=treated pupae. Pb=non-treated pupae.
8
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Núm
ero
de á
caro
s so
bre
la p
ulpa
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A
PaPb
cc
bb
a
A
B B B1
0Testigo EMUL NEEM1 PHC NEEM2
Cuadro 2. Análisis de varianza de la prueba de repelencia de extractos de neem sin elección; la variable de respuesta es el número deácaros sobre las pupas.
Table 2. Analysis of variance of the repellency test of neem extracts without choice; the response variable is the number of mites onpupae.
Fuente de variación GL Suma de cuadrados Cuadrados medios F Pr > F
Producto 3 1388.687 462.896 474.64 <0.0011Concentración 3 2160.641 720.213 738.48 <0.0011Tiempo 7 187.719 26.817 27.50 <0.0011Producto*concentración 9 540.828 60.092 61.62 <0.0011Producto*tiempo 21 124.312 5.920 6.07 <0.0011concentración*tiempo 21 178.734 8.511 8.73 <0.0011Producto*concentración*tiempo 63 128.2969 2.036 2.09 <0.0011
porque antes de esta lectura todas las varroas estabanvivas. Tanto en el testigo como en el emulsificantetodas las varroas sobrevivieron hasta el final del estu-dio, mientras que en los tratamientos con neem se ob-servó mortalidad desde 24 h. El PHC Neem no fuediferente del testigo, aun a 72 h, mientras que el neem1y el neem2 sí lo fueron. El efecto de neem2 fue másrápido, pues la mortalidad de varroa se inició a las 24 h,y a 2 y 4% murieron todos los ejemplares. Tanto enneem1 como en neem2 hubo una relación positiva en-tre la concentración y la mortalidad.
Estos resultados concuerdan con los de Colin et al.(1994), quienes evaluaron la efectividad biológica deThymus vulgaris, Salvia officinalis, Anonna spp. y
The commercial product PHC NeemTM had an effectsimilar to that of neem1 since no significant differenceswere found between the two products for VR, eventhough the effect of the commercial product was morestable and at 4% was significantly different from thecontrol even at 72 h.
Female varroa preference in selecting treated oruntreated pupae, and setthing in them in all readings,is shown in Figure 3. The tendency of the mites tosettle on pupae treated with water and with emulsifierwas indistinct or equivalent, that is, they showed nopreference for a particular section. In contrast, thetendency of the mites to settle on non-treated pupaewas clear, regardless of the neem-based product used;however, the neem2 was outstanding becausesignificantly more female varroa settled on non-treatedpupae (7.05 varroa/pupa).
Repellency test without choice
Regarding the number of mites settled on pupae,there was significant effect for all of the sources ofvariation and their interactions (Table 2). As in theexperiment with choice, only the variables product andconcentration are discussed.
The tendency of female varroa to settle on bee pupae,all treated, over time is shown in Figure 4. It can beseen that approximately 60% of the female varroa wereable to locate and settle on the pupae treated with waterand with emulsifier as of 30 min after application; thispercentage gradually increased to over 80%, observedin the last reading at 72 h. It should be noted that onlythose varroa found on the pupae at the moment ofobservation were counted, a fact that does not excludenearby varroa that could have had access to the pupaeat another time.
All of the neem treatments had a significantly lower(p≤0.05) number of varroa on pupae than the control.Only with the 1% concentration, in the reading taken at4 h, there was no significant difference from the control.
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NEEM1NEEM2
EMULTestigo
Núm
. de
var
roas
sob
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pup
asN
úm. de
var
roas
sob
re las
pup
asN
úm. de
var
roas
sob
re las
pup
as
0
0
00.5
Tiempo (horas)1 2 4 8 24 48 72
PHC
A
A
B
C
Figura 4. Número de ácaros sobre las pupas en la prueba sinelección en los intervalos de tiempo. A) concentración1%; B) concentración 2%; C) concentración 4%.PHC=PHC® Neem (producto comercial);NEEM1=extracto de aceite crudo de las semillas deneem cosecha 2002; NEEM2=extracto de aceite cru-do de las semillas de neem cosecha 2003;EMUL=Tween 20; Testigo=agua. Las interseccionesmarcadas con diferente letra, para las lecturas toma-das en un mismo tiempo, son significativamente dife-rentes (p≤0.05).
Figure 4. Number of mites on pupae in the test without choiceat time intervals. A) 1% concentration; B) 2%concentration; C) 4% concentration. PHC= PHCTM
Neem (commercial product); NEEM1=extract of crudeneem seed oil from 2002 neem harvest;NEEM2=extract of crude neem seed oil from 2003neem harvest; EMUL=Tween 20; Control=water.Intersections marked with different letter, for readingstaken at the same time, are significantly different(p≤≤≤≤≤0.05).
The average numbers of varroa settled on pupaeare shown in Table 3. There was a significant effect ofboth the product and the concentration can be seen;surprisingly neem2 at 4% allowed an average of only0.2 varroa to settle on treated pupae.
The average number of dead varroa in successivereadings is shown in Figure 5. Only values observedas of 24 h are presented since before this reading all ofthe varroa were alive. In both the control and theemulsifier, all of the varroa survived to the end of thestudy, while in the neem treatments mortality wasobserved as of 24 h. PHC Neem was not differentfrom the control, even at 72 h, while neem1 and neem2were. The effect of neem2 was more rapid; varroamortality began at 24 h and at 2 and 4% all of thespecimens died. In both neem1 and neem2 treatmentsthere was a positive relationship between concentrationand mortality.
These results coincide with those of Colin et al.(1994), who evaluated the biological effectiveness ofThymus vulgaris, Salvia officinalis, Annona spp. andChenopodium spp. These authors observed a repellencyeffect that prevented the female varroa from settlingon bee pupae. As a result of the application of essentialoils of S. officinalis and Chenopodium spp., there was90% mortality of varroa 16 h after application.
The effects of essential oils in the behavior of varroahave been defined as attraction, repellency or toxicity(Rickli et al., 1991). In the present experiment thesum of the results of the tests of repellency with orwithout choice proves that neem2 at 4% had the greatestrepellant effect and that, in the end, led to the death ofthe varroa specimens. It is suggested that this was dueto the interference of the neem extracts in the behaviorof the varroa and in their ability to locate bee pupae tofeed on. Their death would therefore be from starvation.
CONCLUSIONS
At the concentrations used, there was no acute toxiceffect of any of the neem extracts on varroa or bees.An important repellant effect was observed with neemextracts, which interfered with the ability of femalevarroa to locate bee pupae to feed on.
Neem-based products used in this study had apersistent repellency effect that lasted at least 48 h.Among these, the neem2, 2003 harvest, was outstanding;this had an effect that persisted at least 72 h, sufficienttime to cause 100% mortality of the varroa.
It is postulated that death of female varroa was dueto starvation caused by the inability of the mites tofeed on the offered pupae.
—End of the English version—
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AGROCIENCIA, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2006
750 VOLUMEN 40, NÚMERO 6
Cuadro 3. Promedio de varroas posadas sobre las pupas en lainteracción producto-concentración. Prueba derepelencia de extractos de neem sin elección.
Table 3. Average number of varroa settled on pupae in theinteraction product-concentration. Test of repellencyof neem extracts without choice.
Tratamiento Ácaros sobre las pupas
Testigo 7.8 aEmulsificante 1% 7.3 a
2% 7.0 a4% 7.1 a
PHC 1% 3.8 c2% 2.4 d4% 1.5 ef
Neem1 1% 3.7 c2% 1.9 de4% 1.0 f
Neem2 1% 2.5 d2% 1.9 de4% 0.2 g
Medias con diferente literal son diferentes (p≤0.05).
Figura 5. Número de ácaros muertos en la prueba sin elección alas 24, 48 y 72 horas. A) concentración 1%; B) con-centración 2%; C) concentración 4%. Las compara-ciones se hacen entre números, literales minúsculas ymayúsculas para 24, 48 y 72 h.
Figure 5. Number of dead mites in the test without choice at 24,48, and 72 hours. A) 1% concentration; B) 2%concentration; C) 4% concentration. Comparisons aremade between numerals, lower case letters and uppercase letters for 24, 48 and 72 h.
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Núm
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Núm
.de
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24 h48 h72 h
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b
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b b
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B
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B
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A
A
A
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EMUL
EMUL
EMUL
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NEEM1
NEEM1
PHC
PHC
PHC
NEEM2
NEEM2
NEEM2
Chenopodium spp. Dichos autores observaron un efec-to de repelencia que impidió que las hembras de varroase posaran sobre las pupas de abejas. Como resultadode la aplicación de aceites esenciales de S. officinalis yChenopodium spp., hubo 90% de mortalidad de varroa16 h después de la aplicación.
Los efectos de los aceites esenciales en la conductade varroa han sido definidos como de atracción,repelencia o toxicidad (Rickli et al., 1991). En el pre-sente experimento la suma de los resultados de laspruebas de repelencia con o sin elección compruebanque el neem2 a 4% tuvo el mayor efecto repelente, ycondujo al final a la muerte de los ejemplares de varroa.Se sugiere que esto se debió a la interferencia quetuvieron los extractos de neem en el comportamientode varroa y en su incapacidad para localizar las pupasde abejas y alimentarse de ellas. La muerte sería en-tonces por inanición.
CONCLUSIONES
A las concentraciones usadas, no hubo efecto tóxi-co agudo de ningún extracto de neem, sobre varroa yabejas.
Se observó un importante efecto repelente de ex-tractos de neem que interfirió con la capacidad de lashembras de varroa para localizar las pupas de abejas yalimentarse de ellas.
Los productos a base de neem usados en este estu-dio tuvieron un efecto persistente de repelencia que
duró al menos 48 h. Entre ellos destacó el neem2 cose-cha de 2003; éste tuvo un efecto que persistió al menospor 72 h, tiempo suficiente para causar la muerte de100% de las varroas.
Se postula que la muerte de las hembras de varroase debe a inanición, causada por la incapacidad de losácaros para alimentarse de las pupas ofrecidas.
751GONZÁLEZ-GÓMEZ et al.
TOXICIDAD Y REPELENCIA DE Azadirachta indica CONTRA Varroa destructor (ACARI: VARROIDAE)
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