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Boli. Soc. Me d. Chir. Modena Anno CVI- N. 1-2- 1991
Articoli originali
MARKER IMMUNOISTOCHIMICI DEL CARCINOMA GASTRICO PRECOCE
CARMELA DI GREGORIO, CATERINA SANNICOLA, GIOVANNI FERRARI, CARMELA DE GAETANI
Università di Modena Istituto di Anatomia e Istologia Patologica (Direttore: Prof. G. P. Trentini) Cattedra di Tecnica e Diagnostica Istopatologica (Titolare: Prof. C. De Gaetani)
Riassunto
74 casi di carcinoma gastrico precoce sono stati sottoposti a studio istochimico delle mucine prodotte e a studio immunoistochimico per la ricerca dell'antigene carcina-embrionale (CEA), del lisozima (LYS), dell'alfa-1-antitripsina (AAT) e dell'alfa-1-antichimotripsina (ACT). La positività ai marker esaminati appare indipendente dalla sede di origine della neoplasia, mentre per quanto riguarda l'istotipo neoplastico sono state rilevate diverse modalità di espressione. La percentuale di positività per i marker è tendenzialmente più alta nelle forme ben differenziate: unica eccezione per il CEA, positivo nell'SO% dei carcinomi sigillocellulari. Anche nei casi con simultanea produzione dei 4 marker le forme differenziate risultano le più frequenti. La positività per CEA, L YS ed AAT sembra avere inoltre una correlazione col tipo di mucine prodotte dalle cellule neoplastiche, a differenza dell'ACT che non è risultata correlabile col tipo di mucine. Il follow-up a 5 anni non ha rilevato differenze prognostiche significative tra tumori positivi e negativi per CEA, AAT ed ACT, né tanto ineno tra i diversi istotipi e tra i diversi gradi di differenziazione neoplastica. Solo i carcinomi lisozima-positivi sembrano avere una pro gnosi peggiore rispetto ai carcinomi lisozima-negativi.
Parole chiave: Carcinoma gastrico precoce, Antigene carcina-embrionale, Lisozima, Alfa-1-antitripsina, Alfa-1-antichimotripsina.
Summwy
IMMUNOHISTOCHEMICAL MARKERS OF EARLY GASTRIC CARCINOMA
74 cases of early gastric cancer were studi ed histochemically for tumour mucin content an d immunohistochemically far localization of carcinoembryonic antigen (CEA), lysozyme (L YS), alpha-1-antitrypsin (AA T) and alpha-1-antichymotrypsin (ACT). The positivity of the examined markers appears to be independent of the site of neoplasm, but its expression varies an the basis of the histotype of the neoplasm. The studied markers were more often positive in well-differentiated tumours, except far CEA which resulted positive in more than 80% of the signet ring celi carcinomas. Simultaneous production of the 4 markers was frequently found in the well-differentiated tumours. The positivity far CEA, L YS and AAT appears to be closely correlated with the type of mucin produced by the neoplastic cells, whereas ACT was not correlated with any type of mucin. A 5-year follow-up revealed no significant prognostic differences for the different histological types, o n the basis of neoplasm grading, or positivity or negativity to CEA, AAT and ACT. Lysozyme-positive carcinomas alone had a worse prognosis than lysozyme-negative carcinomas.
Key words: Early gastric cancer, Carcinoembryonic antigen, Lysozyme, Alpha-1-antitrypsin, Alpha-1-antichymotrypsin.
Introduzione
Da tempo la ricerca è indirizzata alla identificazione di nuovi marker da utilizzare
sia per la definizione istologica ed istogenetica delle neoplasie (2, 8, 10, 17), sia come indicatori della prognosi (11, 18, 22, 23, 25) e del monitoraggio terapeutico (7, 13). In par-
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ticolare, nei pazienti con carcinoma gastrico uno dei marker più studiati è l'antigene carcino-embrionale (CEA), la cui presenza viene documentata con metodi immunoistochimici nel tessuto neoplastico (6, 11, 14, 16, 21, 25) e con metodi radioimmunologici nel sangue e nel succo gastrico (1, 5, 24). Recentemente sono stati inoltre identificati con tecnica immunoistochimica anche l'alfa-1-antitripsina (AA T), l'alfa-1-antichimotripsina (ACT) ed il lisozima (L YS) (3, 10, 22, 23, 25) ed è stata suggerita una possibile correlazione tra loro positività nel tessuto neoplastico e prognosi del carcinoma gastrico avanzato.
Scopo di questa ricerca è di valutare la presenza di questi marker nel carcinoma gastrico precoce per stabilirne un'eventuale correlazione con la prognosi, specie in considerazione del fatto che circa il 20% di questi casi, nonostante la diagnosi di precocità, evolve in maniera infausta a 5 anni dall'intervento.
Materiali e metodi
Lo studio è stato condotto su 74 casi di carcinoma gastrico precoce diagnosticati nel nostro Istituto nel periodo 1972-1985. Quattro di essi erano localizzati al cardias, 18 al corpo, 10 all'angulus, 32 all'antro e 10 al piloro. La neoplasia era limitata alla mucosa in 64 casi mentre in 10 era estesa alla sottomucosa.
La diagnosi istopatologica, integrata anche dallo studio istochimico delle mucine elaborate dalla neoplasia, è stata formulata in accordo con la classificazione di Mulligan (15), che distingue 4 istotipi principali: il carcinoma di tipo mucocellulare o gastrico (MC), il carcinoma di tipo intestinale (IC), il carcinoma di tipo pilocardiale (PC) ed il carcinoma di tipo misto, caratterizzato dal combinarsi dei vari aspetti istologici. La valutazione del grado istologico ha portato inoltre alla suddivisione di ogni istotipo in forme ben differenziate, moderatamente e scarsamente differenziate e sigillocellulari.
Il materiale, prelevato da pezzi operatori, è stato fissato in formalina calcica al 10% ed
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incluso in paraffina alla maniera convenzionale. Le sezioni di 4 micron sono state colorate con ematossilina-eosina e sottoposte inoltre alle seguenti reazioni: l) alcian blu pH 2,5-PAS (AB-PAS) per evidenziare le mucine neutre ed acide; 2) periodato boroidruro-idrossido di potassio-PAS (PB-KOHPAS) sec. Culling ( 4) per le sialomucine-0-acetilate; 3) high iran diamine (HID)-alcian blu pH 2,5 sec. Spicer (19) per le mucine acide solfate e non solfa te; 4) metacromasia da blu di toluidina pH 3 alcool-resistente sec. Lison (12) per le solfomucine.
La dimostrazione di CEA, L YS, AAT, ACT è stata effettuata su sezioni seriate mediante la tecnica dell'immunoperossidasi (PAP) di Sternberger (20). Dopo sparaffinatura, le sezioni venivano poste in alcool a 90° e trattate per 30' con una soluzione al 3% di H20 2 in m etanolo assoluto per bloccare le perossidasi endogene. In seguito erano trattate con acido periodico al 2,28%, poi con sodio boroidruro allo 0,02% ed infine con siero normale di suino 1:10 secondo Heyderman e Munroe Neville (9), al fine di ridurre la colorazione aspecifica di fondo e la cross-reattività degli antisieri specifici con altri peptidi presenti nel tessuto. Le sezioni venivano poi incubate a 4o C per 24 ore con sieri anti-CEA (1:5.000), anti-LYS (1:2.000), anti-ACT (1:1.500) e anti-AAT (1:1.500) prodotti in coniglio (DAKOPATT, Denmark) e successivamente trattate con IgG di suino an ti-coniglio diluite 1:50, poi con P AP l: 100 per 30' in camera umida a temperatura ambiente. Il prodotto di reazione veniva evidenziato mediante trattamento per 5' in camera oscura con diaminobenzidina O, 075% e perossido 0,05% in PBS pH7,6.
La specificità delle reazioni è stata determinata come descritto da Wittekind et al. (25).
Risultati
La distribuzione per localizzazione, istotipo e grado istologico dei 74 casi di carcinoma gastrico precoce, oggetto del nostro studio, è riprodotta nella tab. I. Da essa risulta
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T ab. I. Sede, istotipo e grado istologico di 74 casi di carcinoma gastrico precoce.
Istotipo N°casi
cardias MC 15 l IC 26 l PC 18 3
MISTO 15 l
TOTALE 74 4
MC: carcinoma di tipo mucocellulare IC: carcinoma di tipo intestinale PC: carcinoma di tipo pilorocardiale
Sede
corpo angulus 3 3 5 5 3 l 7 2
18 lO
che la localizzazione prevalente, tranne che per gli istotipi misti, è quella antro-pilorica e che la sede meno colpita è quella cardiale, dove la maggioranza dei tumori (3 su 4) è rappresentata dall'istotipo pilorocardiale.
Relativamente al grado di differenziazione, appaiono prevalenti le forme ben differenziate, ad eccezione del tipo misto, nel quale prevalgono quelle sigillocellulari. Queste ultime sono state ricondotte ai diversi istotipi per mezzo della valutazione istochimica del contenuto mucinico, che risultava ora di un solo tipo (neutro o acido), ora di più tipi combinati, come nelle forme miste.
La positività per i 4 marker esaminati, pur non presentando correlazioni significative, appare tendenzialmente più alta nelle forme ben differenziate, con l'unica eccezione del CEA che risulta positivo in oltre 1'80% dei carcinomi sigillocellulari.
Nella tab. II è riportata la distribuzione dei 4 marker in rapporto alla localizzazione della neoplasia. Il CEA, positivo in 51 casi, non presenta alcun apparente rapporto con la sede della neoplasia, mentre chiara predilezione per la regione antropilorica è dimostrata dalle neoplasie positive per L YS, AATeACT.
In rapporto all'istotipo, il CEA è presente in tutti i carcinomi di tipo misto e nella larga maggioranza di quelli di tipo intestinale. Il L YS, a sua volta, appare più frequente nei carcinomi di tipo mucocellulare e di tipo misto, mentre l'ACT prevale nettamente in
Differenziazione
antro p i loro ben dit'f. scars. diff. sigillocell. 6 3 7 3 5
13 2 12 6 8 lO 2 8 7 3 3 3 l 2 12
32 lO 28 18 28
Tab. II. Positività immunoistochimica per CEA, L YS, AA T, ACT in rapporto alla localizzazione del carcino-ma.
Sede del Totale Numero dei casi positivi tumore casi CEA LYS AAT ACT
Cardias 4 4 l Corpo 18 14 l 2 6 Angulus 10 6 5 l 2 Antro 32 20 15 11 17 Piloro 10 7 4 3 6
Totale 74 51 26 17 32
quelli di tipo misto e di tipo pilorocardiale. L'AAT presenta in assoluto le percentuali più basse di positività e non ha significative correlazioni con l'istotipo neoplastico (tab . III).
I 4 marker si presentano variamente com-
Tab. III. Positività immunoistochimica per CEA, L YS, AA T , ACT in rapporto all'istotipo del carcinoma.
Istotipo Totale Numero dei casi positivi casi CEA LYS AAT ACT
MC 15 4 (27%) 8(53%) 3(30%) 3(20%) re 26 22(85%) 7 (27%) 5 (19%)10 (38%) PC 18 lO (56%) 4(22%) 6(33%)10(56%) MISTO 15 15(100%) 7(47%) 3(20%) 9 (60%)
Totale 74 51 (69%) 26 (35 %) 17 (23 % )32 ( 43%)
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binati nelle singole neoplasie: il 44% è positivo per più di un marker; il 18% per tutti e quattro. In quest'ultimo caso la maggioranza è rappresentata da adenocarcinomi ben differenziati.
Dei casi positivi per un solo marker, ben il 27% dimostra positività per il CEA. L'immunoreattività per il CEA presenta una localizzazione citoplasmatica variabile a seconda del grado di differenziazione rieoplastica: all'apice cellulare, delimitante il lume ghiandolare, negli adenocarcinomi ben differenziati; in forma diffusa o con alone citoplasmatico periferico nei carcinomi scarsamente differenziati e nei sigillocellulari (Fig. 1).
Fig. 1. Carcinoma di tipo intestinale, sigillocellulare. Cellule neoplastiche intensamente positive per il CEA, distribuite tra preesistenti strutture ghiandolari negative alla reazione immunoistochimica (P AP x 250).
L YS, AA T e ACT presentano invece una reattività di tipo granulare nel citoplasma sopranucleare nelle neoplasie ben differenziate; diffusa in tutto il citoplasma nei carcinomi scarsamente differenziati e nei sigillocellulari (Fig. 2-3).
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Fig. 2. Carcinoma di tipo mucocellulare, ben differenziato. Reattività per illisozima di tipo granulare in sede sopra nucleare (P AP x 560).
Fig. 3. Carcinoma di tipo misto, sigillocellulare. Positività citoplasmatica uniforme o finemente granulare della reazione immunoistochimica per l'ACT (PAP x 560).
Dall'analisi del rapporto tra positività per i diversi marker e tipo di mucine elaborate dalle cellule neoplastiche appare una significativa correlazione tra presenza di CEA e
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mucine acide e tra presenza di LYS e AAT e mucine neutre. L'ACT invece, pur prevalendo nelle forme con sole mucine neutre, è talora reperibile anche in quelle con sole mucine acide (tab. IV).
Tab. IV. Positività immunoistochimica per CEA, L YS, AA T, ACT e tipo di mucine elaborate dal carcinoma.
W casi Tipo di mucine CEA LYS AATACT
20 neutre 5 8 5 7 sialomucine N-acetilate l l l
19 neutre, sialomucine N-acetilate 14 4 4 5
2 sialomucine N-acetilate, solfomucine 2
8 neutre, sialomucine N-acetilate, solfomucine 6 6 2 4
l. neutre, sialomucine N- ed 0-acetilate
3 sialomucine N- ed 0-acetilate, solfomucine 3
20 neutre, sialomucine N- ed 0 -acetilate, solfomucine 19 3 6 14
Relativamente alla prognosi, la sopravvivenza a 5 anni è al momento valutabile in 40 casi ed è pari a 30 casi (75% ); nei 10 pazienti deceduti, il carcinoma era intramucoso in 7 ed esteso alla sottomucosa in 3. Considerando l'istotipo ed il grado di differenziazione, non sono state rilevate differenze prognostiche significative, anche se una prognosi verosimilmente peggiore sembra p·oter essere ascritta al carcinoma di tipo misto, che ha presentato una mortalità del36%. Analogamente, non sono state rilevate differenze prognostiche significative tra neoplasie positive o negative per CEA, AAT e ACT. Significativa invece (P < O, 05), pur nell'esiguità della casistica, è la diversa sopravvivenza presentata dal carcinoma gastrico precoce in rapporto alla ricerca del L YS: i casi L YS-negativi hanno dimostrato infatti una sopravvivenza a 5 anni dell '88%, che scende al 53% nei casi L YS-positivi.
Carcinom a gastrico precoce
Discussione
È stato precedentemente dimostrato come nel carcinoma gastrico avanzato la positività immunoistochimica per L YS, AA T e ACT differisca a seconda della sede di origine della neoplasia e come questo profilo immunoistochimico rifletta in parte la distribuzione dei tre marker nell'epitelio gastrico normale (10). In contrasto con questo risultato, Tahara et al. .(23) e più recentemente Wittekind et al. (25) hanno segnalato nel carcinoma del corpo gastrico la presenza di numerose cellule neoplastiche positive per AAT e ACT, marker normalmente assenti in questa sede.
Nel presente studio la positività dei quattro marker esaminati è apparsa indipendente dalla sede di origine della neoplasia, con l'unica eccezione forse della regione antropilorica, che sembra essere più spesso interessata dalle neoplasie positive per L YS, AATeACT.
Nielsen e Teglbjoerg (16), nei loro studi sulla distribuzione immunoistochimica del CEA nel carcinoma gastrico, classificato secondo lo schema di Mulligan (15), hanno dimostrato una significativa correlazione tra carcinoma di tipo intestinale e positività al CEA. Ciò trova conferma nella nostra ricerca, dove il CEA, presente nella totalità dei carcinomi di tipo misto, è risultato espresso nella larga maggioranza dei carcinomi di tipo intestinale. Il L YS, a sua volta, è sempre stato più frequente nei carcinomi di tipo mucocellulare e di tipo misto, mentre l'ACT è prevalso nettamente in quelli di tipo misto ed in quelli di tipo pilorocardiale. L' AA T non ha mostrato correlazioni con alcun istotipo neoplastico.
Relativamente al grado di differenziazione, in analogia con l'osservazione di Tahara et al. (23) che la presenza immunoistochimica dell 'AA T nel carcinoma gastrico può essere usata come marker tessutale della forma ben differenziata, il nostro studio ha dimostrato che la percentuale di positività per tutti i quattro marker esaminati è tendenzialmente più alta nelle forme ben differenziate; unica eccezione il CEA, che predilige, in percentuale superiore all 'SO%, i car-
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cinomi sigillocellulari. Analoga elevata positività per il CEA nei carcinomi gastrici sigillocellulari era stata descritta da Wittekind et al. (25) e da Mori et al. (14). Anche nelle neoplasie con simultanea produzione di L YS, CEA, AA T, ACT, le forme ben differenziate risultano le più frequenti. Questo dato, mentre da un lato conferma la presenza contemporanea dell'AAT e dell'ACT negli adenocarcinomi gastrici ben differenziati osservata da Tahara et al. (23), contrasta con quanto da loro precedentemente sostenuto: che il carcinoma gastrico scarsamente differenziato esprimerebbe con maggior frequenza più marker associati (21).
La positività immunoistochimica per il CEA, per il LYS e per l'AAT sembra avere una stretta correlazione col tipo di mucine elaborate dalle cellule neoplastiche (3, 17, 22). Infatti il CEA si ritrova significativamente associato a carcinomi con ricca componente mucinica acida, ed in particolar modo a sialomucine-0-acetilate e solfomucine, piuttosto che a carcinomi producenti solo mucine neutre. Il LYS e l'AAT sono invece sempre assenti quando il carcinoma secerne mucine acide, mentre sono intensamente positivi quando le cellule neoplastiche producono o solo mucine neutre o mucine neutre ed acide associate. L'ACT infine non sembra essere correlabile con alcun tipo di mucine.
La presenza di inibitori di proteasi come l'AAT e l'ACT, di LYS e di CEA nelle cellule del carcinoma gastrico solleva il problema di loro possibili relazioni con la diffusione metastatica ed in generale con la prognQsi.
E stato riportato recentemente (23) che la prognosi dei carcinomi gastrici avanzati positivi all'AAT sembra peggiore di quella dei carcinomi AAT-negativi. Wittekind et al. (25) sostengono invece che i carcinomi gastrici avanzati AAT-positivi hanno prognosi migliore dei carcinomi AA T -negativi. Per gli stessi AA., peraltro, la positività immunoistochimica per il CEA, l'ACT ed il L YS non dimostra correlazioni significative con la soprawivenza.
Kojima et al. (11), in uno studio condotto su 162 carcinomi gastrici avanzati, hanno
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trovato invece che la soprawivenza a 5 anni era notevolmente ridotta nelle forme positive al CEA rispetto alle negative. Inoltre, un follow-up condotto da Tahara et al. (22) su 27 carcinomi gastrici avanzati ha mostrato che la soprawivenza è ridotta a meno di due anni per i carcinomi che producono lisozima.
Nel nostro studio il follow-up a 5 anni condotto su 40 casi di carcinoma gastrico precoce non ha rivelato differenze prognostiche significative tra tumori positivi e tumori negativi per CEA, AA T ed ACT, né tanto meno tra i diversi istotipi ed i gradi di differenziazione neoplastica.
La differenza è invece risultata statisticamente significativa (P < O, 05) confrontando la soprawivenza di 15 pazienti affetti da carcinoma lisozima-positivo con quella di 25 pazienti con carcinoma lisozima-negativo: nei primi la soprawivenza era del 53%, mentre nei secondi saliva all'88%. Così come sostenuto da Tahara et al. (22) per il carcinoma gastrico avanzato, anche il carcinoma gastrico precoce sembra avere pertanto una prognosi peggiore quando produce lisozima.
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Corrispondenza
Prof. Carmela De Gaetani Istituto di Anatomia Patologica Policlinico Universitario Largo del Pozzo 71 Tel. 059/364210 41100 Modena (MO)
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