Transferencia de DNA ocurrida durante el contacto celular del factor sexual F mediante conjugación bacteriana

Bacteria donante que contienen JCFL39, un mutante del gen traD sensible a la temperatura del factor sexual F, fueron utilizados en una temperatura no permisiva para acumular pares de acoplamiento estables con las células receptoras. En esta etapa en la conjugación, el pili extracelular F fue quitado por el tratamiento con 0.01% Dodecil sulfato de sodio. Entonces al cambiar la temperatura permisiva para JCFL39, la transferencia del plásmido F fue observada. Los pares de acoplamiento que fueron acumulados con JCFL39 en la temperatura no permisiva fue observada fácilmente por microscopia electrónica en contacto de pared a pared con las bacterias receptoras. Estos resultados demuestran que el producto del gen traD, es requerido para la transferencia del DNA a una bacteria receptora, actúa después de la etapa en la que se requiere el pili extracelular F. Además, concluimos que ocurre la transferencia de DNA mientras que las células donantes y receptoras están en contacto y no necesariamente se necesita el canal extendido del pilus F según lo previsto en algunos modelos de la conjugación bacteriana.

La conjugación es el proceso por el cual el DNA se transfiere de un donante a una bacteria receptora por un mecanismo que implique el contacto entre las células. La mayoría de los estudios sobre la conjugación se han realizado con bacterias Gram (-) y particularmente se han centrado en Escherichia coli y el factor sexual F. Una característica central de F medida en la conjugación es la función del pili F, un filamento extracelular largo y delgado que es producida una o muchas copias por el plásmido F que contiene la bacteria donante (9). Aunque haya prueba evidente de que el pilus F es esencial para la formación del contacto inicial entre la bacteria receptora y la donante (4, 7), sigue existiendo un grado de incertidumbre en cuanto al papel que este organelo desempeña en la transferencia conjugativa del DNA. Las Observaciones más tempranas (5, 16) indicaron la posibilidad del contacto directo de la superficie celular de las bacterias en conjugación, pero puesto que estos estudios precedieron el estudio del pili F, ningún experimento crítico fue realizado en aquel momento para distinguir los papeles posibles del pilus sexual. Los estudios de Brinton en el pili F lo llevo a proponer una clase de modelos en los cuales el pilus F está implicado directamente en la transferencia conjugativa del DNA (6). Sin embargo, no se ha vislumbrado ninguna evidencia directa que muestre una asociación entre el pili F y el DNA que se está transfiriendo conjugativamente en la literatura. Como alternativa, Curtiss (10), Marvin y Hohn (18) han sugerido que el pili F puede funcionar contrayendo y de tal modo dibujando las superficies de las células donante y receptora juntas, en las cuales puede ocurrir el punto de transferencia del DNA. Esta idea es central al modelo actualmente favorecido para la transferencia conjugativa por F como plásmidos. Las características centrales de este modelo han sido repasadas recientemente por Willets y Skurray (26) y se presentan en la FIG. 1.

El modelo prevé la conjugación procediendo como una serie de etapas ordenadas de los acontecimientos de la superficie celular y del metabolismo del DNA. Mucha de la evidencia de este modelo se basa en los fenotipos de los mutantes del plásmido F que son deficientes en la

transferencia (tra) (26). Los mutantes en los genes traA, L, E, K, B, V, C, U, F, G, o la primera parte del gen traG no sintetizan pili F y son defectuosos en todas las etapas de la conjugación. Los mutantes en el gen traN y la segunda parte del gen traG sintetizan pili F y lo hacen inestable, pero no estable (resistente a ser cortado), contacto en la superficie celular (17).

Las bacterias receptoras que carecen de la proteína membranal externa ompA también no pueden formar pares de acoplamiento estables (21). Los mutantes en los genes traM, D, I, Z, (y probablemente traY) están cubiertas por pilis y pueden formar los pares de acoplamiento estables (26); los productos del gene se han implicado en la síntesis y transferencia conjugativa del DNA en la célula donante (15).

Un defecto de estos estudios es que no permiten ordenar definitivamente las etapas deducidas de la conjugación. Según lo descrito anteriormente, un área de preocupación especial es la colocación del paso de la transferencia del DNA en un momento en el que las células donante y receptora están en contacto, y en que amplio punto el pili F probablemente no se requiere más. Quizás la mejor tentativa de demostrar este punto implico el tratar mezclas de acoplamiento con concentraciones bajas de detergente Dodecil sulfato de sodio (SDS), que des polimeriza filamentos del pilus F (24) Achtman y otros (3) encontraron que el tratamiento con SDS no causo la desagregación de los pares de acoplamiento realizados incluyendo al donante Hfr, y que el numero de recombinantes continuo aumentando durante la incubación adicional en presencia de SDS. Este resultado es claramente constante con la noción de que el pili F no es esencial para la transferencia del DNA, una vez que se establece el contacto de la superficie celular. Sin embargo, los pares de acoplamiento estables no fueron aislados como intermedio, ni era demostrada la transferencia subsecuente de DNA. El uso de la formación recombinante como el análisis para la transferencia del DNA mas futura introdujo una complicación no presente en un acoplamiento del plásmido F.

Desde un punto de vista genético, el método de mayor alcance para analizar el orden de acontecimientos en la vía biológica es el ideado por Jarvik y Botstein (13). Su prueba emplea un par de mutantes condicionales, uno sensible a altas temperaturas y otro sensible al frio; con cambio en la temperatura apropiada es posible que se experimente un cambio para determinar inequívocamente los tiempos relativos en los cuales se requieren las funciones correspondientes del gene. Para aplicar esta teoría en la conjugación bacteriana de F, se ah empleado SDS y el mutante lac traD (Ts) de F como los pares indispensables de bloques condicionales. Como en los experimentos de Achtman y otros (3), el SDS fue empleado para eliminar los filamentos extendidos del pili F. El análisis de los fenotipos de varios mutantes del gene tra que afectan el metabolismo conjugativo del DNA sugiere que el producto de traD desempeña un papel directo en la transferencia del DNA (15). Hemos utilizado SDS y el mutante traD (Ts) para demostrar que el producto del gene traD puede actuar en la conjugación en una etapa después de que se requiera la función del pili extendido F. Los resultados futuros consolidan la sugerencia (3, 26) de que la transferencia de DNA ocurre normalmente durante una etapa de la conjugación en la cual las superficies de las células donante y receptora están en contacto real.

FIG. 1. Modelo para la transferencia conjugativa de plásmidos como el F. La figura se modifica de Willets y Skurray (26) y los puntos culminantes son el contacto del pili F en la superficie de la célula del ciclo de acoplamiento y el requisito de la función del gen traD para la transferencia del DNA. El pili F es extremadamente sensible a bajas concentraciones de SDS (24), y el filamento extendido del pili F desaparece rápidamente de la superficie de la célula bacteriana tratada con detergente, destruyendo de tal manera la eficacia de la actividad de la célula donante (3). Los detalles del metabolismo conjugativo del DNA se han simplificado considerablemente en la figura, y los lectores interesados deben consultar la revisión de Willets y Wilkins (27). Para

simplificarlo, se indica la bacteria donante como una barra mientras que la receptora es esférica. El factor sexual F se indica como un círculo en la bacteria donante y el DNA cromosómico no se muestra para ninguna bacteria.

MATERIALES Y METODOSPlásmidos y cepas. Los plásmidos usados serán JCFLO (F lac tra+) JCFL8 [F lac traD8 (Am)], y JCFL39 [F lac traD39 (Ts)] de la colección de Achtman y otros (4). Estos fueron usados en un fondo de JC3272 (F- lactosa galactosa histidina triptófano lisina λr dtr) para dar al donante cepas JC3273, JC6129 y JC6140 respectivamente (4). La cepa receptora usada es XK1502 (F- ∆lacU169 nalA) (19).

Determinación de la eficacia del acoplamiento a 32 y 42 °C. JC6140, JC3273, y XK1502 fueron crecidos por duplicado en 32 y 42°C colocándose durante toda la noche en cultivo de 10 mL de caldo LB en matraces Erlenmeyer de 125 mL. Las muestras (0.1 mL) del cultivo del donante (JC6140 o JC3273) fueron subcultivadas en 2.4 mL de caldo LB y se le permitió acoplarse por 2 hrs. a cualquier temperatura. Luego 0.4 mL de las muestras de cultivo de células donantes fueron mezcladas suavemente con 0.4 mL de los cultivos que estuvieron incubándose durante toda la noche de XK1502 (creciendo en 32 o 42 °C), y la mezcla de acoplamiento se le permitió acoplarse por 2 hrs. a 32 o 42°C. Al principio del acoplamiento, las muestras fueron diluidas y sembradas sobre placas de agra MacConkey lactosa que contenían 100 µg/mL de estreptomicina sulfato para las cuentas de células donantes. En el final del acoplamiento, las muestras de la mezcla de acoplamiento fueron diluidas y sembradas sobre placas de agar lactosa mínimo que contenían 20 µg/mL de acido naldixico para determinar el número de transconjugantes.

Cinética de la inactivación y reactivación del gene traD39. Para seguir el curso del tiempo de inactivación del producto del gen traD39 en términos de capacidad para transferir, un cultivo de los que se dejaron toda la noche de las bacterias donantes JC6140 fue crecido a 32°C, diluido 25 veces en 10 mL de caldo LB en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, y sacudido suavemente en un baño de agua a 32°C. Cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) del cultivo alcanzo 0.4, una muestra de 0.4 mL fue mezclada con 0.4 mL de un cultivo de toda la noche de receptoras XK1502 que habían sido crecidos a 32°C, y a las bacterias se les permitió acoplarse por 30 min a 32°C con agitación suave. Mientras tanto, el resto del cultivo de donantes fue cambiado y puesto a 42°C, y una segunda muestra de 0.4 mL fue agregada inmediatamente a 0.4 mL de un cultivo de XK1502 que había sido crecido a 42°C durante toda la noche; a estos se les permitió acoplarse durante 30 min a 42 °C. En varios de los intervalos después del cambio de la temperatura, muestras de JC6140 fueron tomadas y el procedimiento de acoplamiento fue repetido. Siempre que el OD550 del cultivo de donantes alcanzara 0.8, se diluía dos veces en caldo LB precalentado para mantener el crecimiento exponencial. Los acoplamientos

fueron detenidos después del minuto 30 de flujo turbulento y enfriados en hielo. Las mezclas fueron diluidas y sembradas en placas de agar lactosa minimo que contenían acido naldixico para probar los transconjugantes y sobre placas de agar MacConkey lactosa que contenían estreptomicina sulfato para las cuentas de donantes.

La reactivación de traD39 fue seguida de una manera similar, usando un cultivo de JC6140 crecida durante la noche a 42°C y después cambiada de puesto a 32°C.

Experimentos de cambio de temperatura. Las bacterias JC6140 (donante) y XK1502 (receptora) fueron crecidas en 2.5 mL de cultivos que se colocaron toda la noche a 42°C en 18 tubos de cultivo de 150 mm. Una muestra de 0.1 mL del cultivo de JC6140 fue subcultivada en 2.5 mL de caldo LB en un tubo similar al del cultivo e incubada a 42°C por 1 hr. Una muestra de 0.25 mL de este cultivo de donantes fue agregada a 0.25 mL del cultivo de XK1502 de toda la noche, mezclada suavemente, e incubada a 42°C por 30 min sin agitación. En este tiempo, los cultivos fueron diluidos diez veces en caldo LB que contenía SDS 0.01% y 20 µg/mL de acido naldixico fue agregado a algunas de las mezclas de acoplamiento. Los cultivos eran incubados a 32 o 42°C durante 2 hrs. Los números de transconjugantes fueron obtenidos sembrando varias diluciones sobre las placas de agar lactosa mínimo que contenían 20 µg/mL de acido naldixico.

Microscopia Electrónica. Las cepas de JC6140 y XK1502 fueron crecidas en 2.5 mL de caldo LB que se colocaba en 18 tubos de 150 mm a 42°C durante toda la noche. Cada uno de estos era diluido 25 veces en caldo LB y crecido a 42°C durante 1 hr. Muestras del donante, receptora o una mezcla igual de donante y recipiente fue incubada a 42°C durante 20 min, después del cual 9 volúmenes de caldo LB que contenían SDS 0.01% y 1% de glutaraldehido (recién preparado) fueron agregados a cada tubo con agitación suave. Los cultivos fueron incubados a 42°C por 20 min adicionales y centrifugados a 5100 x g por 10 min, y las pastillas celulares fueron suspendidas en 0.5 mL de solución salina. Las células eran preparadas para microscopia electrónica manchando una muestra sobre los 300 acoplamientos, 0.2% de rejilla de carbón revestida de Formvar. Las rejillas fueron manchadas con el acetato acuoso de uranilo al 1% y examinadas en un microscopio electrónico de Philips 300 a 60 kV. Se utilizaron dos rejillas por muestra, y más de 200 células fueron examinadas para determinar el grado de agregación.

Análisis Immunoblot. Anti proteína traD (traDp) el suero inmune fue criado en conejos blancos femeninos de Nueva Zelanda usando traDp purificado (descrito en la preparación): las cepa individuales para el immunoblot fueron crecidas colocando los cultivos en caldo LB y después diluidas 50 veces en caldo LB para obtener las células en crecimiento exponencial. Se recogieron muestras de 3 mL cuando la OD550 alcanzo 0.6 a 0.8. Las células eran recogidas por centrifugación y suspendidas en gel

SDS amortiguador e incubados en agua hirviendo por 3 minutos. Cantidades equivalentes de material fueron cargadas sobre 11 a 14 cm de SDS poliacrilamida al 9.5% y se realizo electroforesis según lo descrito anteriormente (19). El immunoblot fue realizado por una modificación del procedimiento de Burnette (8). Las proteínas fueron transferidas electroforéticamente a 11.5 por 14.5 cm en hoja de nitrocelulosa a 50mA durante toda la noche en un aparato Hoeffer Transphor con un amortiguador de la transferencia de 25 mM de clorhidrato de Tris (pH 8.4) 192 mM metanol glicina 20%. La hoja de nitrocelulosa fue lavada con agua destilada e incubada por 1 hr con 50 mL de albumina de suero vacuno con 3% de PBSa (10 g de NaCl, 0.25g de KCl, 2.71g de Na2HPO4 por litro de agua destilada con un pH final de 7.6), seguido de otra incubación de 1 hr con suero normal vacuno y 1% de albumina normal de cabra en PBSa. Inmunoglobulina G (IgG) enriquecida con el suero anti traDp fue utilizada en una dilución 1:50 para eliminar el amortiguador (véase abajo) y 2 mL de suero por cada cm de anchura del carril en el gel, se les permitió incubarse durante 2 hrs. Esto fue seguido por 4 lavados en el minuto 15 cada uno para eliminar el amortiguador. El anticuerpo del conejo Fc el de la cabra conjugado con la peroxidasa de rábano picante fue diluido 1:200 para eliminar el amortiguador y 2 mL por carril en el gel fueron incubados en el papel por 2 hrs. La hoja de nitrocelulosa entonces fue lavada 3 veces para borrar el amortiguador a los 15 min cada uno seguido con 5 lavadas mínimo con PBSa. El amortiguador de la peroxidasa contenía el sustrato cromogenico 4-cloro-1naphtol (véase abajo) entonces fue agregado sobre la nitrocelulosa. Después de que las bandas corrieran el papel fue aclarado en agua destilada permitiéndole secarse a temperatura ambiente.

RESULTADOSFutura caracterización de JCFL39. El plásmido JCFL39 fue aislado por Achtman y otros (4) es un derivado no suprimible que transfiere el derivado de un tipo de F lac (JCFL0) silvestre, y el defecto de la mutación fue trazado en el gene traD (traD39) de F. En su acoplamiento mínimo de los 40 min estándar, JCFL39 tenía una eficacia de transferencia de 10 a 2 a 42°C y de 100 a 32°C, concerniente a JCFL0 como 100 (4). En primer lugar al usar su mutante, determinamos la eficacia de la transferencia de JCFL39 bajo condiciones que serian utilizadas en los experimentos del cambio de temperatura. Los datos demostraron que en la transferencia de un JC3272 anfitrión a una receptora de XK1502, JCFL39 era 6 veces menos eficiente que JCFL0 a 32°C y 7.8 x 104

veces menos eficiente que JCFL0 a 42°C. Así existe una diferencia de 3.2 x 104 veces en la capacidad de transferencia de JCFL39 a 32 y 42°C.

Para realizar los experimentos de cambio de temperatura, era también necesario determinar el tiempo en el cual un JCFL39 donante contenía actividad cuando es

cambiado de lugar de 42°C a 32°C. Para aumentar la sensibilidad de este experimento cinético, un tiempo de acoplamiento de 30 min fue utilizado. La eficiencia de acoplamiento de JCFL39 aumento exponencialmente sobre el desplazamiento a la temperatura permisiva, levantándose aproximadamente 100 veces en 4 hrs. (FIG. 2A). En este punto todavía no había alcanzado el valor para las células crecidas continuamente a 32°C. El índice de aumento inicial correspondió a doblar cada53 minutos, comparado con el doble de tiempo de 50 a 60 minutos de crecimiento de las células. De acuerdo con este resultado, elegimos 2 hrs. como el periodo de acoplamiento para el experimento de cambio de temperatura descrito más abajo (y el experimento de la tabla 1).

a JCFL0 es F lac tra. JCFL39 es F lac traD39 (Ts).b El recipiente fue XK1502. anotaron a las colonias como transconjugantes después de acoplar por 2 horas en la temperatura indicada.c La Eficacia del acoplamiento fue calculada como número de transconjugantes obtenidos por 100 donantes.

Como corolario a este experimento, determinamos el índice de inactivación de la actividad traD39 cuando se cambio de lugar a un donante JCFL39 de 32 a 42°C. La cinética diferencia substancialmente de la activación (FIG. 2B). El incremento inicial de la eficacia del acoplamiento era reproductivo y podía ser debido a la transferencia conjugativa que es intrínsecamente más eficiente a 42°C. Esto fue seguido por un rápido declina miento en la actividad exponencial durante la primera hora (t1/2 del minuto 8 al 10) y quizás una declinación más lenta después de eso. El valor alcanzado después de 2 a 4 hrs de acuerdo con la eficacia del acoplamiento para el donante JCFL39 crecido continuamente a 42°C. Así del 95 al 99% del producto traD39 parece ser inactivado rápidamente como una solo especie con el cambio de temperatura; puede ser una fracción activa residual que se diluye hacia fuera más lentamente.Etapa especifica de la implicación de traD en la conjugación bacteriana. Ahora nos encontrábamos en una posición para preguntar si la etapa de la conjugación en la cual la función extendida del pili F se podía separar físicamente de la etapa en la cual ocurre la transferencia conjugativa del DNA. Usando la adición de SDS y el alelo termo sensible traD39 como el aire indispensable de bloques condicionales. Para hacer esto, JCFL39 que contenían donantes y a Lac-, receptora resistente al acido naldixico, ambos crecidos continuamente a 42°C, eran

FIG. 2. (A) Cinética de la reactivación de la actividad traD39 (Ts) en un cultivo en crecimiento exponencial de JC6140 que se cambio de 42 a 32°C. (B) Cinética de la inactivación de la actividad traD39 (Ts) de un cultivo en crecimiento exponencial de los donantes JC6140 cambiados de 32 a 42°C. Los cultivos fueron crecidos y los transconjugantes fueron probados según lo descrito en el texto. El cuadrado en el panel B es el valor obtenido por 30 minutos que se acopla entre JC6140 y XK1502 crecido continuamente y acoplado a 32°C.

mezclados e incubados a 42°C por 30 minutos. Entonces fue agregado SDS 0.01% para quitar el pili extracelular F (3) y para prevenir la formación posterior de pares de acoplamiento estables. Una porción del cultivo fue cambiada a 32°C y otra mantenida en 42°C. Después de 2

hrs estos cultivos fueron probados para transconjugantes de Lac+ y Nalr. El producto traD se puede reactivar y puede funcionar después de la adición de SDS; Los transconjugantes aumentan 100 veces en la incubación continua en relación la temperatura permisiva con la temperatura no permisiva (Tabla 2). En un experimento de

control, el SDS estaba presente a través del periodo inicial de 30 min (tabla 2). Esto demostró la importancia del paso de pre incubación y confirmo la sensibilidad al SDS de una etapa en la conjugación en la cual el pili extracelular F actúa en la formación de un par de acoplamiento estable. El acido naldixico inhibe la DNA girasa (22) y se sabe parar para la transferencia de DNA inmediatamente cuando esta agregado a una mezcla de acoplamiento (12), pero no afectara a la receptora que es resistente al acido naldixico. Constante con el papel de traD en la transferencia de DNA, cuando el acido naldixico fue agregado en el momento en que se cambio la temperatura, no se observo un aumento en los transconjugantes en presencia de SDS en 32 o 42°C (Tabla 2). Esto indica que la transferencia de DNA todavía no había ocurrido durante la pre incubación a 42°C y debe haber ocurrido a 32°C cuando la actividad de traD fue recuperada.

La eficacia de la transferencia de JCFL39 en este experimento (Tabla 2) era cerca de 4. Aunque este valor no se pueda relacionar directamente con la Tabla 1 o FIG. 2ª, indica que un alto porcentaje de los donantes de JCFL39 tienen actividad traD potencialmente recuperada a 32°C puede, de hecho, transferir DNA a una bacteria receptora. Esta formación sugerida de que el acoplamiento estable se aparea durante el periodo de pre incubación a 42°C y la resistencia de estos pares de acoplamiento a la disociación por el SDS (3). Puesto que con el SDS se podía esperar una disminución en el nivel de agregación no especifica de las células donantes y receptoras (3), decidimos mirar en el microscopio electrónico las bacterias en acoplamiento que fueron acumuladas por el procedimiento en la Tabla 2.

a Toda la segunda incubación se efectuó por 2 hrs.b Todos los acoplamientos usados son JC6140 donantes y XK1502 receptoras y fueron realizados según lo descrito en el texto. El número de donantes introducidos fue 1.0 X 107 por mL.c El SDS fue agregada a la mezcla de acoplamiento durante la incubación inicial.

Microscopia electrónica de pares de acoplamiento. Las bacterias donantes JCFL39 se les permitió formar el agregado de acoplamiento con las bacterias receptoras en la temperatura no permisiva. Después del minuto 30 de incubación a 42°C, el SDS y el glutaraldehido fueron agregados, y el cultivo fue examinado en el microscopio electrónico. Las células tratadas de este modo eran consideradas raramente en

contacto en los cultivos individuales de donantes y receptoras, mientras que en la población de acoplamiento mezclada virtualmente todas las bacterias fueron encontradas en una cierta clase de agregado con la superficie celular en contacto (FIG. 3). En este experimento, no era posible identificar las bacterias donantes y receptoras en los agregados de acoplamiento, puesto que son morfológicamente similares. Así la correlación de células agregadas a las bacterias en acoplamiento se basa sobre la distribución estadística observada. Los agregados de acoplamiento observados de este modo eran similares en aspecto a los divulgados por Atchman y otros (3). Aunque la coloración negativa de células enteras demostraba fácilmente la existencia de tales pares, no podía proporcionar el detalle adicional sobre la naturaleza exacta de la región en contacto de pared a pared. Que el análisis requería cuidadosamente preparo esto las secciones de pares de acoplamiento, tales como estos, para ser visto en el microscopio electrónico. Tal análisis está en curso a otra parte.

Análisis de los niveles de proteína traD en donantes JCFL39. La rápida declinación en la actividad detectada en el experimento de la FIG. 2B es constante con la función termo sensible. Sin embargo, El coeficiente de incremento en eficacia de acoplamiento durante la activación de traD39 fue paralelo al crecimiento de la célula (FIG. 2A) y sugiere que el producto funcional de traD39 puede tener que ser sintetizado nuevamente. El nivel de producto traD39 en células de F+ es muy bajo, y la proteína ah sido observada previamente solamente usando un alto número de copias del plásmido o transduciendo el bacteriófago λ llevando el gene conjuntamente con un protocolo de etiquetado especifico (14, 20). Puesto que ahora tenemos disponible antisuero de conejo contra la proteína traD purificada, podíamos determinar directamente el nivel de traDp en el donante JCFL39 en temperaturas permisivas y las no permisivas, usando Immunoblot como análisis altamente sensible. Los resultados con JCFL39 que contiene las células crecidas exponencialmente a 32 y 42°C se demuestran en la FIG. 4, junto con F-, F lac tra+ y las manchas de control de F lac traD8 (Am). Los resultados indicaron que los niveles de traDp en las células de traD y traD39 eran esencialmente idénticos en ambos tipos crecidos a 42°C. Esto indica que el defecto se asocio a los resultados del alelo traD39 de una perdida de función en la temperatura no permisiva, y la síntesis no termo sensible de la proteína.

DISCUSIONEstos resultados proporcionan evidencia directa para ordenar dos acontecimientos en la conjugación bacteriana mediada por el factor sexual F. Con la adición del SDS y un mutante de F lac traD (Ts) era posible determinar que el paso de sensibilidad al SDS en la conjugación (La función del pili extendido F) precede el paso en el cual la función de traD es coincidente con la sensibilidad al acido naldixic,

proporcionar la evidencia adicional para el papel directo del producto de traD en la transferencia de DNA. Combinando estos resultados con la microscopia electrónica de acoplamiento de pares, concluimos, según lo también propuesto por otros que el papel del pili F en la conjugación sea la generación de pares de acoplamiento estables que estén en contacto mediante la superficie celular, y que una vez que estos se forman no es necesaria mas el filamento extendido del pilus F. La transferencia del DNA ocurre de la bacteria donante a la bacteria receptora mientras que las superficies de las células están en contacto. Aunque sea obvio que el juego del pili F es el papel esencial para establecer el primer contacto entre las células bacterianas en acoplamiento, los acontecimientos subsecuentes de la superficie celular de la transferencia de DNA.

FIG. 3. Histogramas de los estados de agregación de las bacterias donantes JC6140, las bacterias receptoras XK1502, o una mezcla de ambas, después de la incubación a 42°C por 30 minutos. Las células fueron preparadas y observadas al microscopio electrónico según lo descrito en

el texto. Por lo menos 200 células fueron examinadas para obtener cada histograma. Las barras verticales representan el número de células de cada tipo de agregado contra el porcentaje total de células examinadas.

FIG. 4. Análisis Immunoblot de los niveles de proteína traD en células con crecimiento exponencial a 32°C y 42°C. Anti traDp IgG de conejo y peroxidasa de rábano picante conjugado esto como segundo anticuerpo fueron utilizados para visualizar la proteína traDp entera de la célula en un gel de losa de poliacrilamida SDS (véase el texto). Carriles; a y b, JC3273 (F lac tra+) a 32 y 42°C, respectivamente, c y d, JC3272 (F-) a 32 y 42°C, respectivamente; e y f, JC6140 [F lac traD39 (Ts)] a 32 y 42°C, respectivamente; g ay h, JC6190 [F lac traD8 (Am)] a 32 y 42°C, respectivamente. Cada carril obtuvo la proteína en aproximadamente 3 x 108 células.

La comparación de estos resultados con los experimentos anteriores destaca las ventajas inherentes en el acercamiento de Jarvik y Boenstein a los acontecimientos que ordenan la ruta biológica (13). Para obtener un alto porcentaje de los agregados de acoplamiento (el 70% de todas las células), Achtman y otros (3) utilizaron un periodo de incubación de 20 minutos antes de agregar el SDS. Sin embargo, para obtener razonablemente niveles de la formación recombinante, emplearon a un donante de HfrC y probados para los genes lac que se transfirieron en el minuto 7 (23). El uso de un último marcador habría podido proporcionar evidencia más convincente, pero el gradiente de HfrC de la transmisión habría reducido perceptiblemente el número de recombinantes. Incluso entonces, la base de su experimento es cinética, y no había así una discusión concluyente para una etapa discreta en la conjugación donde el pili extendido F no se requiera. Ponemos mayor confianza en el uso del mutante de traD (Ts), donde se acumula un intermedio que se puede aislar y caracterizar y después demostrar para proceder a travez de las etapas subsecuentes de la transferencia conjugativa.

La caracterización anterior de mutantes traD puso la etapa de acción de traD después de la formación de un par de acoplamiento estable, sin embargo, la demostración de que un mutante traD puede formar un par de acoplamiento estable no elimina la posibilidad de que la función traD requerida realmente en un primer tiempo en la

conjugación y que los pares de acoplamiento estables observados representan realmente una etapa abortada o sin salida en la transferencia conjugativa. De hecho, se ah divulgado que el mutante lac F de JCFL60, que lleva una mutación sin sentido de traD, hace 2.5 veces tanto pili F al igual que la cepa tipo lac F (2). También, las células que llevan un mutante lac F traD son resistentes a la infección del bacteriófago F2. Las partículas bacteriófagas fijan por adsorción a los lados del pili F, pero ningún RNA penetra en la célula (4). Estos fenotipos traD adicionales sugieren la validez de preguntar si la sincronización de la función de traD bien puede estar en un primer tiempo en la conjugación, por ejemplo cuando un pili extendido F este presente. Sin embargo, por lo que la conjugación, nuestro experimento elimina explícitamente esta posibilidad.

El producto de traD es una proteína interna de la membrana de peso molecular cercano a 78 000 (14, 20; observaciones inéditas). Puesto que es una proteína de la membrana, la respuesta de la proteína traD39 (Ts) a la temperatura es potencialmente interesante. El immunoblot demostró que la proteína no está conforme a síntesis termo sensible. En el experimento de cambio de temperatura la proteína mutante de traD39 demostró una rápida inactivación en la temperatura no permisiva, pero la recuperación extremadamente lenta de la actividad cuando fue cambiada a la temperatura permisiva. El tiempo de recuperación de la proteína traD39 (mas de 4 hrs para recuperar su actividad máxima) es especialmente notable en comparación con el intervalo de 30 minutos durante el cual toda una población de receptoras nuevamente acopladas hace competente como bacterias donantes (observación inédita). Una posibilidad de esta discrepancia es que la proteína traD39 sintetizada en 42°C se inactivo irreversiblemente y que la regulación aprieta el nivel de resultados de la expresión de la proteína tra en una bacteria donante existente puesta a 32°C. Una segunda posibilidad es que la proteína traD39 inactiva está incorporada en una estructura celular (por ejemplo, el cuerpo basal del pili F), y toma varias generaciones de crecimiento a 32°C para diluir hacia el exterior las moléculas de traD inactivas presentes en estos sitios. Una tercera posibilidad es que incluso en la temperatura permisiva la mayor parte del producto de traD39 sintetizado es inactivo; puede entonces tomar muchas generaciones para acumular un nivel suficiente de la forma activa de la proteína para que ocurra la transferencia conjugativa. Esta última sugerencia es constante con que la eficacia de la transferencia de los donantes de JCFL39 en la temperatura permisiva.

Los experimentos en curso actualmente en este laboratorio sugieren actualmente que la función de la proteína traD en la conjugación puede ser, servir como un ancla en la membrana para la DNA helicasa 1, el producto del gen F lac (1). De esta manera, la energía de la hidrólisis del ATP es usada para desenrollar el círculo del plásmido F y para desplazar la enzima, el desenrollar con respecto a la DNA que es enrollada seria convertida directamente en la

fuerza motiva para el transporte de un soporte del DNA de los plásmidos en la bacteria receptora. El hecho de que hayamos demostrado que la función de traD es requerida cuando las bacterias de acoplamiento están en contacto con su superficie celular es constante con los requisitos de este modelo.

Aunque estos experimentos ayuden a aclarar ciertos aspectos de las etapas implicadas en la conjugación bacteriana, todavía sigue siendo un número de pasos (FIG. 1) para los cuales hay menos que evidencia definitiva. Primero, no hay ninguna evidencia convincentemente de que la función del pili F sea la contracción para traer las células de acoplamiento y ponerlas en contacto superficial. En segundo lugar, poco se sabe sobre la naturaleza de conversión de un par de acoplamiento inestable en un par de acoplamiento estable. Y tercero, según lo observado acentuando en una revisión reciente, mucho queda aprender sobre la bioquímica de los productos de tra implicados en el metabolismo conjugativo del DNA (27).

Finalmente, los experimentos hacen posible una comparación interesante de la conjugación mediada por F a la transferencia conjugativa de plásmidos que ocurre en bacterias Gram (+), tales como Streptococcus faecalis, donde no se ah encontrado pili sexual. En el S. faecalis, hay evidencia de que una feromona sexual induce que la célula se agrupe y transfiera el DNA del plásmido, mientras que las bacterias están en contacto superficial (11). Puesto que no creemos que el pili F no desempeñe un papel directo en la transferencia del DNA, una comparación se puede hacer entre la función del pili sexual encontrado en las bacterias Gram (-) y la de las células agrupadas inducidas por la feromona sexual en bacterias Gram (+). Es posible que los acontecimientos subsecuentes de la transferencia del DNA que ocurren se puedan relacionar más directamente el uno con el otro.