Utilización y evaluación del método molecular SDS-PAGE para la comparación y construcción de relaciones fenotípicas entre 4 especies de bacterias de la familia

Enterobacteriaceae.

Diego Andrés Martínez1, Andrés Felipe Zuluaga Zuluaga2, Santiago Ramírez Said3, Julián Santamaría Alvarez3

1Departamento de Ingeniería Biomédica. 201317471, 2Facultad de Medicina, 3Departamento de Ciencias Biológicas, 4Departamento de Química, Universidad de Los Andes, Bogotá, Colombia.

ResumenLos árboles fenéticos son herramientas utilizadas ampliamente en la biología para realizar e inferir relaciones entre organismos basados en sus fenotipos. La comparación de proteínas y de ácidos nucleicos extraídos en un grupo de organismos permite establecer criterios acerca de la relación entre estos. Una técnica recurrente para comparar estas macromoléculas es el SDS-PAGE el cual se fundamenta en la separación de proteínas, otorgando a todas una misma carga neta y separándolas por su peso molecular. En este caso, se utilizó un gel de poliacrilamida para separar proteínas de cuatro especies bacterianas, Escherichia coli (C600, K12y W) Proteus spp. Yersinia entercolitica y Salmonella typhi, todas de la familia Enterobacteriaceae. Luego de separadas, se realizó una matriz de características fenéticas para construir un árbol fenético y poder dar cuenta de las relaciones entre esta familia bacteriana.

AbstractThe phenetic trees are tools widely utilized in biology to construct and hypothesize relationships between organisms based on their phenotypes. The comparison of proteins and nucleic acids extracted from a group of organisms allows the establishment of criteria to build the relationships between them. A recurrent technique to compare these macromolecules is the SDS-PAGE which is based in the separation of proteins, by giving them all the same net charge, and separating them only by their molecular weight. In this case, a polycrilamide gel was used to separate proteins from four different bacterial species, Escherichia coli (C600, K12y W) Proteus spp. Yersinia entercolitica y Salmonella typhi, all of the latter coming from the Enterobacteriaceae family. After being separated, a phenetic characteristic matrix was done in order to build a phenetic tree and for being able to realize the relationships within this bacterial family.

Palabras clave: Bacterias, fenética, Proteoma, SDS-PAGE

I. Introducción

Las bacterias fueron el primer organismo en colonizar nuestro planeta y desde su aparición hace 3 billones de años, han sido de fundamental importancia para la generación de toda la vida que irradia hoy en día el planeta. (Errington, J., 2013) Por lo tanto, es muy fácil entender la fascinación que los humanos hemos

desarrollado por ellas, otorgándoles gran utilidad, desde la industria alimentaría hasta la ambiental.

Como todos los seres vivos, los procesos bioquímicos y biológicos de las bacterias, (que tanto importan a los humanos) son orquestados por proteínas. Por lo tanto el estudio de las proteínas de estos organismos nos permite no solamente

aprender cómo se producen los bioproductos en las bacterias pero también nos informa acerca de su ecología, ciclo de vida y nicho en el ambiente (Ceri, H. & Westra, Y., 1988). Como organismos de tanta utilidad para el hombre y de importancia para la vida en general, es clara la razón por la cual un estudio completo de sus mecanismos proteicos es necesario.

Aunque hoy en día, la variedad de procesos moleculares para el estudio de las proteínas en microorganismos es muy amplia, uno de los métodos más económicos, sencillos y efectivos para realizarlos es la electroforesis en gel, un método que permite la separación de proteínas basada en su carga, propiedades fisicoquímicas, su tamaño y peso molecular (Schagger, H & von Jagow, G., 1987). Si se desea separar las proteínas de la muestra a estudiar en base solamente de su peso molecular, se emplea generalmente la técnica del SDS-PAGE, el cual gracias al SDS, se otorga una misma carga negativa a todas las proteínas y estas pueden correr por el gel solo dependiendo de su peso (Kresge, N. Simoni, R & Hill, R., 2006).

Ahora bien, después de correr las proteínas en el gel, falta todavía la parte más importante, y es realizar las relaciones feneticas entre las bacterias. La utilidad al trabajar con proteínas y ácidos nucleicos es que secuencias similares tendrán propiedades fisicoquímicas parecidas (mismas bandas en el gel) y por lo tanto darán información acerca de los linajes de dos bacterias, que seguramente tuvieron un ancestro común no muy lejano, en comparación con bacterias que tienen menos bandas en común entre sí; lo que significa que la divergencia de los linajes fue más ancestral y por lo tanto

existe una mayor diferencia en su proteoma (Sayed, N. 2012).

Por último es de gran importancia reconocer que este método molecular sólo nos permitirá construir las relaciones basadas en el tamaño de las proteínas y no por su secuencia y función en sí. Por lo tanto, no se lleva a cabo un análisis funcional de las proteínas y por lo tanto el árbol fenético construido, se basaría más que todo en características como proteínas de tamaño parecido más que porque tengan funciones parecidas, elemento que sería mucho más informativo para entender las relaciones entre ellas).

En este orden de ideas, el objetivo de este estudio es estudiar las relaciones fenéticas en base a las proteínas de 4 especies de bacterias, Escherichia coli (C600, K12y W) Proteus spp. Yersinia entercolitica y Salmonella typhi, para construir un árbol fenetico y compararlo con las relaciones ya conocidas en la literatura.

II. Materiales y Métodos

II.I Extracción de proteínas bacterianas

En la realización de la extracción de proteínas en bacterianas, se deja crecer las bacterias “over night” en un caldo LB con determinada agitación. Después, se añade una porción del medio de cultivo al eppendorf correspondiente de cada bacteria. El siguiente paso es la centrifugación de los eppendorfs y añadir al sobrenadante en hipoclorito diluído, se realiza un vórtex para el resuspendido de la muestra. El Buffer que se realiza para la muestra está compuesto por un detergente (SDS) el cual ataca a los enlaces apolares de las proteínas, ayudando a la lisis celular y a la carga (-) que necesitamos en nuestra muestra de

proteínas, glicerol el cual compite con el glicerol de la membrana de la bacteria ayudando a la lisis celular, y un colorante de Azul de bromofenol el cual ayuda al tinte de las proteínas para visualizar el frente de corrido en el gel. Seguido a esto se colocan las muestras (con perforaciones en las tapas de los tubos eppendorf) en una plancha de calentamiento a 100°C para ayudar a romper los enlaces disulfuro de nuestras proteínas en remplazo de un reductor, en el paso final en la preparación de la muestra es centrifugar nuestras muestras, quitar el (moco) y el sobrenadante son las proteínas.

II.II Electroforesis en geles de poliacrilamida

Para la electroforesis en geles de poliacrilamida. Se realiza el gel de separación y para esto se prepara una solución de persulfato de amonio (agua con persulfato de amonio al 10%). Después, se marca un aforo para el gel y se realiza una mezcla de solución de poliacrilamida, pH 8.8 y agua. A ésta se le adiciona persulfato de amonio al 10% y TEMED. Se agita suavemente y se inserta inmediatamente hasta el punto de aforo, se cubre con agua desionizada. Una vez estuvo polimerizado el gel se remueve el agua volteando el montaje.

Para la realización del gel de stacking primero se mezcla poliacrilamida con solución pH 6.8 y agua. A esto se le adiciona persulfato de amonio al 10% y TEMED. Se agita bien y se usa inmediatamente. Se espera hasta que el gel se polimerice.

Seguido se hace el corrido de extractos de proteína celular bacteriana ya extraída, al gel hecho se utiliza de técnica llamada electroforesis denaturante SDS-PAGE. Primero se realiza el montaje de la

cámara de electroforesis. Se empieza por llenar la cámara interna con buffer de electroforesis 1X hasta que se cubren todos los pozos y la cámara externa (debía estar aislada de la cámara interna). Se siembra determinada porción de cada una de las muestras teniendo en cuenta el orden aleatorio de sembrado. Se cierra la cámara de electroforesis, y se inicia el corrido con determinado voltaje según lo que se necesite, en este caso fue de 150V durante 90 minutos.

II.III Tinción con Azul de Coomassie

Al terminar la electroforesis, se hace el fijado. Se prepara la solución de fijado. Esta solución se compuso de: 50% de etanol, 10% de ácido acético y 40% de agua desionizada. Luego se vierte la solución de fijado en las cubetas de tinción. Se retira el montaje de los vidrios. Se separa y se descarta el gel de stacking. Posteriormente, se hace un corte en la esquina superior del gel de separación en donde se encontraba el primer carril de sembrado. Este gel se depositó en la cubeta con la solución de fijado y se mantuvo una media hora en ésta.

En la realización de la tinción con Azul de Coomassie el cual tiñe las proteínas con especificidad. Se prepara la solución de tinción añadiendo cada uno de los siguientes reactivos en su orden respectivo: 50% de metanol, 10% de ácido acético, 40% de agua desionizada y 0.05% de Coomassie. Ésta solución se deja aproximadamente una hora en agitación continua. Después de realizar la tinción, se hace la destinción. En esta se prepara la solución de destinción añadiendo cada uno de los siguientes reactivos en su orden respectivo: 50% de metanol, 10% de ácido acético y 40% de agua desionizada. Se descarta la solución

de tinción en un recipiente de vidrio con tapa (siempre intentando no botar el gel) después se procede a un enjuague con agua desionizada. Posteriormente, se agregó una porción de la solución de destinción y se deja el gel en agitación constante. Se hace una revisión periódica del gel hasta que se obtiene la intensidad de bandas necesaria para hacer las observaciones. Al encontrar una elevada coloración azul de fondo que compite con las bandas se reemplaza la solución de destinción por una nueva. Cuando finalmente se obtiene la intensidad de bandas esperada, se hace el secado del gel en papel celofán en frío.

Para el análisis de las bandas que se obtienen luego de la tinción se realizó una matriz de 1 y 0. Posteriormente, a partir de esta matriz se generaron 2 fenogramas con el uso del programa PAUP*. Esto nos permitirá analizar la cercanía con la realidad de las relaciones fenotípicas entre las especies de bacterias.

Finalmente, se elaboró otra matriz que relaciona las muestras pero en base a información de los rasgos principales que caracterizan a cada una de las especies para realizar una comparación y desarrollar un posterior análisis de efectividad de la metodología propuesta.

III. Resultados

Luego de realizar una plastificación al gel de poliacrilamida posterior al proceso de tinción, se obtuvieron los resultados de la figura 1.

Figura 1. Gel de poliacrilamida luego de la electroforesis y su respectiva tinción. Se muestran las especies que corresponden a cada uno de los pozos y las bandas seleccionadas para la realización del fenograma.

Ya obtenidas las bandas, se selecciona el mayor número de bandas para analizar, y se realiza la matriz de 1 y 0 de la Tabla 1, donde se muestra la presencia o ausencia de cada banda en las seis bacterias. Así, a partir de ésta se pudieron obtener los fenogramas que relacionan los fenotipos de los especímenes estudiados, en base a dos métodos: Neighbor Joining (figura 2) y UPGMA (figura 3).

Bacte\num

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

E.coli W 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1

E.coli K12 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1

E.coli C600

1 1 0 1 1 1 0 0 1 1

Proteus 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1Salmonell

a1 0 1 1 0 1 1 1 0 1

Yersinia 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0Tabla1. Matriz de muestras analizadas en el gel

Figura 2. Fenograma de especímenes analizados en la electroforesis con el método Neighbor Joining

Figura 3. Fenograma de especímenes analizados en la electroforesis con el método UPGMA

El método UPGMA es un algoritmo para generar arboles filogenéticos enraizados y asume que la distancia evolutiva entre las especies es la misma, este sistema se reproduce hasta que todas las especies quedan agrupadas unidas por nodos internos. Por otro lado, Neighbor-joining usa como principio el mayor acortamiento posible de las distancias evolutivas entre especies lo que genera un árbol más preciso y permite ver el cambio evolutivo a partir de la longitud de las ramas.

Adicionalmente, Los mismos metodos tambien fueron aplicados para obtener los fenogramas de la matriz con caracteristicas especificas de cada especimen, los cuales se muestran en las figuras 4 y 5.

Carácter (1) (2)

(3) (4) (5)

(6) (7)

(8) (9)

(10)

Especie

E. coli W 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1

E. coli K12 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1

E. coli C600 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1

Proteus mirabilis

1 1 1 1 1 0 1 1 1 0

Salmonella thypi

1 1 0 1 1 0 1 0 0 0

Yersinia enterocolitic

a

1 0 1 1 1 0 1 1 0 1

Tabla 2. Matriz comparativa entre las especies Escherichia coli (cepas W, K12 y C600), Proteus mirabilis, Salmonella typhi y Yersinia

enterocolitica. Caracteristicas: (1) Gram negativa (-). (2) Sideróforos.(capacidad de la bacteria para quelar Fe) (3) Catalasa (+). (4) Oxidasa negativa (-). (5) Actividad ureasa. (6) Modificada genéticamente. (7) Producción vitamina B12. (8) Producción Fenialanina desaminasa. (9) Indol. (Habilidad de romper el indol del aminoácido triptófano) (10)β-galactosidasa en pared celular.

Figura 4. Fenograma de especímenes analizados por bibliografia con el método Neighbor Joining

Figura 5. Fenograma de especímenes analizados por bibliografía con el método UPGMA

IV. Discusión

Como se puede ver que los fenogramas de las muestras no presentaron los resultados esperados, que describen los fenogramas de caraceriticas reales. Esto puede ser consecuencia de errores en el manejo, así como también en el sesgo que presenta la escogencia de las bandas en el gel de poliacrilamida teñido. Además, las muestras de bacterias que se utilizaron en la experimentación fueron modificadas genéticamente, entonces no presentan las membranas de péptidoglicano u oxidasa negativa. Esto último se puede inferir de la tabla 1 y de la tabla 2. En la primera no hay ninguna característica que tenga presencia en las 6 especies, mientras que en la segunda las características 1 y 4 si posee presencia en todos los especímenes.

Sin embargo también se presentaron similitudes. La Yesenia entercolitica en los fenogramas de ambos objetos de análisis (muestras y características reales) se separaba de todas las demás especies, como se evidencia en la figuras 3 y 5, además del corrido en el pozo 6 en el gel de poliacrilamida, donde no se observan gran cantidad de bandas.

Adicionalmente, en los fenogramas de las figuras 2, 3 y 5, las muestras de E. coli se encuentran muy relacionadas como se esperaba. Asimismo, la mayoría de las bandas en el gel para estos mismos especímenes fueron congruentes entre sí. Es decir que estaban presentes en los tres pozos de corrido.

Según nuestro análisis estándar (características reales) las muestras de Yersinia entercolitica deberían estar relacionadas con las de Proteus spp. y Salmonella typhi, sin embargo en los fenogramas de las muestras analizadas se encontraban separadas, para el caso del método UPGMA en la figura 3. Esto se evidencia en que el corrido de la Yersinia entercolitica había poca presencia de bandas, mientras que en la Proteus spp. había una sobrevisualización de las bandas que no permitía distinguirlas correctamente. Dichos errores pueden ser delegados a errores en la tinción y destinción del gel, ya que el background pudo no haberse retirado completamente del gel.

Adicionalmente, en todos los fenogramas, a excepción de la figura 1, existe una congruencia entre las muestras y la literatura con la agrupación entre las muestras de E. coli y entre la Proteus spp. y la Salmonella typhi.

Finalmente, se puede apreciar que también hay presencia de bandas en la

mayoría de los especímenes. Esto puede relacionarse a características específicas para esta familia de bacterias o de las bacterias en general (Eubacteria).

V. Conclusiones

El gel al final dio el bandeado esperado lo cual quiere decir que los procesos fueron realizados de manera correcta y de la manera más exacta posible. El árbol fénetico obtenido no se parece mucho al filogenético en la literatura para esta familia de bacterias tan importante para el ser humano (Paradis, S., et al., 2005). Sin embargo si se presentaron algunas similitudes, ya sea por características específicas de la familia a la que pertenecen las especies o por relaciones o agrupaciones de los especímenes en cada uno de los resultados analizados.

Sin embargo, la información brindada por las proteínas denaturadas, aunque si brinda cierta información acerca de las relaciones fenotípicas de las bacterias, se queda corta en muchos aspectos, ya que elementos tan importantes como la función de la proteína se pierde y no se pueden utilizar para la construcción del árbol. Para experimentos futuros, se recomienda utilizar otros métodos de análisis molecular para generar arboles más acordes y que tengan en cuenta factores de más peso en la historia evolutiva. Un estudio de ADN por ejemplo, realizado con una PCR mediante la realización de primers específicos para genes, puede resultar más esclarecente aunque consumiría más tiempo y recursos.

Bibliografía:

Ceri, H., & Westra, Y. (1988). Host binding proteins and bacterial adhesion: Ecology and binding mode. Retrieved February 27, 2015, from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/304832

Errington, J. (2013). L-form bacteria, cell walls and the origins of life. Retrieved February 27, 2015, from http://rsob.royalsocietypublishing.org/content/3/1/120143

Kresge, N., Simoni, R., & Hill, R. (2006). SDS-PAGE to Determine the Molecular Weight of Proteins: The Work of Klaus Weber and Mary Osborn. Retrieved February 27, 2015, from http://www.jbc.org/content/281/24/e19

Kumar, S., Tamura, K., & Nei, M. (2004). MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Retrieved February 27, 2015, from http://bib.oxfordjournals.org/content/5/2/150.short

Paradis, S., Boissinot, M., Paquette, N., Bélanger, S., Martel, E., Boudreau, D., ... Roy, P. (2005). Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding elongation factor Tu and F-ATPase β-subunit. Retrieved February 27, 2015, from http://ijs.sgmjournals.org/content/55/5/2013.full

Sayed, N. (2012). Phylogenetic relationship among five geckos from Egypt based on RAPD-PCR and protein electrophoresis (SDS–PAGE). Retrieved February 27,

2015, from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090989612000082

Schagger, H., & Von Jagow, G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Retrieved February 27, 2015, from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0003269787905872