• Home

  • Documents

  • ASMA KALLUS KÜLTÜRLERİNDE UV IŞINI ETKİSİ İLE RESVERATROL ÜRETİMİNİN UYARILMASI VE...
92
ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ ASMA KALLUS KÜLTÜRLERİNDE UV IŞINI ETKİSİ İLE RESVERATROL ÜRETİMİNİN UYARILMASI VE BELİRLENMESİ Nurhan KESKİN BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

ASMA KALLUS KÜLTÜRLERİNDE UV IŞINI ETKİSİ İLE RESVERATROL ÜRETİMİNİN UYARILMASI VE BELİRLENMESİ

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Bu çalışmada, Kalecik karası (Klon 12), Öküzgözü, Erciş ve Cabernet Sauvignon üzümçeşitlerine ait kallus kültürlerinde, resveratrol üretiminin uyarılması üzerine ultraviyole (UV)ışınının etkisi incelenmiştir.En uygun kallus dokuları, serada yetiştirilen çeliklerin yapraklarından elde edilmiştir. Ortamolarak, %2 sakkaroz, % 0.8 agar, 1.0 μM BAP (6-benzilaminopürin) ve 0.1 μM 2, 4-D (2, 4-diklorofenosi-asetik asit) eklenmiş Gamborg B-5 ortamı kullanılmıştır. Kalluslar, 21 gün ara ileiki defa alt kültüre alınmıştır. İkinci alt kültürden sonra, 12 ve 15 gün yaşlı kalluslara, sterilkabin içerisinde petri kutularının kapakları açılarak, 10 cm uzaklıktan 10 ve 15 dakika süreyle254 nm dalga boyuna sahip UV ışını uygulanmıştır. Uygulamanın ardından kalluslar karanlıkkoşullarda inkübe edilmiştir. Resveratrol ölçümleri 24., 48. ve 72. saatlerde yapılmıştır.Resveratrol üretiminin belirlenmesi amacıyla, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi (HPLC)tekniğinden yararlanılmıştır. UV ışınının asma dokularında resveratrol sentezini uyarmada etkiliolduğu ve in vitro koşullarda resveratrolün üretilebildiği belirlenmiştir. Çalışmada yer alan 4üzüm çeşidinde de en yüksek resveratrol üretimi, UV ışını uygulamasından 48 saat sonra eldeedilmiştir. En yüksek resveratrol derişimi, 66.39 μg/g YA ile Erciş üzüm çeşidindebelirlenirken, bu çeşidi sırasıyla, Cabernet Sauvignon (62.66 μg/g YA), Öküzgözü (62.23 μg/gYA) ve Kalecik karası (2.42 μg/g YA) çeşitleri izlemiştir. UV ışınının her iki uygulama zamanıda etkili bulunmuştur. Genel olarak 12 gün yaşlı kallus kültürlerinde elde edilen resveratrolbirikimi daha yüksek bulunmuştur.2007, 81 sayfaAnahtar Kelimeler: Vitis vinifera L., stilben, resveratrol, kallus kültürü, UV ışını

Citation preview

  • ANKARA NVERSTES

    FEN BLMLER ENSTTS

    DOKTORA TEZ

    ASMA KALLUS KLTRLERNDE UV IINI ETKS LE RESVERATROL

    RETMNN UYARILMASI VE BELRLENMES

    Nurhan KESKN

    BAHE BTKLER ANABLM DALI

    ANKARA

    2007

    Her hakk sakldr

  • ZET

    Doktora Tezi

    ASMA KALLUS KLTRLERNDE UV IINI ETKS LE RESVERATROL

    RETMNN UYARILMASI VE BELRLENMES

    Nurhan KESKN

    Ankara niversitesi

    Fen Bilimleri Enstits Bahe Bitkileri Anabilim Dal

    Danman: Prof. Dr. Birhan KUNTER

    Bu almada, Kalecik karas (Klon 12), kzgz, Erci ve Cabernet Sauvignon zm

    eitlerine ait kallus kltrlerinde, resveratrol retiminin uyarlmas zerine ultraviyole (UV)

    nnn etkisi incelenmitir.

    En uygun kallus dokular, serada yetitirilen eliklerin yapraklarndan elde edilmitir. Ortam

    olarak, %2 sakkaroz, % 0.8 agar, 1.0 M BAP (6-benzilaminoprin) ve 0.1 M 2, 4-D (2, 4-

    diklorofenosi-asetik asit) eklenmi Gamborg B-5 ortam kullanlmtr. Kalluslar, 21 gn ara ile

    iki defa alt kltre alnmtr. kinci alt kltrden sonra, 12 ve 15 gn yal kalluslara, steril

    kabin ierisinde petri kutularnn kapaklar alarak, 10 cm uzaklktan 10 ve 15 dakika sreyle

    254 nm dalga boyuna sahip UV n uygulanmtr. Uygulamann ardndan kalluslar karanlk

    koullarda inkbe edilmitir. Resveratrol lmleri 24., 48. ve 72. saatlerde yaplmtr.

    Resveratrol retiminin belirlenmesi amacyla, Yksek Basnl Sv Kromotografisi (HPLC)

    tekniinden yararlanlmtr. UV nnn asma dokularnda resveratrol sentezini uyarmada etkili

    olduu ve in vitro koullarda resveratroln retilebildii belirlenmitir. almada yer alan 4

    zm eidinde de en yksek resveratrol retimi, UV n uygulamasndan 48 saat sonra elde

    edilmitir. En yksek resveratrol deriimi, 66.39 g/g YA ile Erci zm eidinde belirlenirken, bu eidi srasyla, Cabernet Sauvignon (62.66 g/g YA), kzgz (62.23 g/g YA) ve Kalecik karas (2.42 g/g YA) eitleri izlemitir. UV nnn her iki uygulama zaman da etkili bulunmutur. Genel olarak 12 gn yal kallus kltrlerinde elde edilen resveratrol

    birikimi daha yksek bulunmutur.

    2007, 81 sayfa

    Anahtar Kelimeler: Vitis vinifera L., stilben, resveratrol, kallus kltr, UV n

    i

  • ABSTRACT

    Ph. D. Thesis

    PRODUCTION AND DETERMINATION OF RESVERATROL

    IN GRAPEVINE CALLUS CULTURE IN RESPONSE TO UV IRRADIATION

    Nurhan KESKN

    Ankara University

    Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Horticulture

    Supervisor: Prof. Dr. Birhan KUNTER

    The effect of ultraviolet (UV) irradiation on induction of resveratrol production on callus

    cultures of Kalecik karas Clon 12, kzgz, Erci and Cabernet Sauvignon grape

    cultivars was investigated in this study.

    The most suitable callus tissues were obtained from the leaves of the cuttings grown in

    greenhouse. Gamborg B-5 media including 2% saccarose, 0.8% agar, 1.0 M BAP (6-

    benzylaminopurine) and 0.1 M 2, 4-D (2, 4-dichlorophenoxy-acetic acid) was used as culture

    media. Callus tissues were sub cultured two times with 21 days intervals. After the second

    subculture, 12 and 15 days old callus tissues were exposed to 254 nm UV light at 10 cm

    distance from the source for 10 and 15 min by opening covers of the petri dishes in sterile cabin.

    After the treatment, callus tissues were incubated under dark conditions. Resveratrol production

    was determined at 24, 48 and 72 hours of incubation with High Pressure Liquid

    Chromatography (HPLC).

    The results showed that UV irradiation was effective for induction of resveratrol production in

    callus tissues of grape cultivars in vitro. The highest resveratrol production was obtained at the

    48th hours of incubation. The highest resveratrol concentration was determined in Erci with

    66.39 g/g fw and followed by Cabarnet Sauvignon (62.66 g/g fw), kzgz (62.23 g/g fw) and Kalecik karas (2.42 g/g fw). Both 10 min and 15 min UV irradiation periods were found to be effective in induction of resveratrol production. In general, resveratrol accumulation

    in 12 days old callus was higher than that of 15 days old.

    2007, 81 pages

    Key Words: Vitis vinifera L., stilbene, resveratrol, callus culture, UV irradiation

    ii

  • TEEKKR

    Doktora tezimi yapmak zere beni ynlendiren, tezimin tm aamalarnda deerli

    fikirlerinin yansra ilgi ve desteini esirgemeyen deerli danman hocam, Sayn Prof.

    Dr. Birhan KUNTERe sonsuz teekkrlerimi sunarm.

    Tez almamn oluumu ve geliimi boyunca, Tez zleme Komitesinde yer alarak

    bilimsel dncelerini benimle paylaan, ilgilerini esirgemeyen hocalarm Prof. Dr. Y.

    Sabit AAOLU (Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri Blm) ve

    Sayn Prof. Dr. lk MEHMETOLU na (Ankara niversitesi Mhendislik Fakltesi

    Kimya Mhendislii Blm ve Fen Bilimleri Enstits Mdr) teekkr ederim.

    Doktora renimim sresince bilgi birikimlerini benimle paylaan, yakn ilgi ve

    desteklerini esirgemeyen hocalarm Prof. Dr. Hasan ELK ve Prof. Dr. Gkhan

    SYLEMEZOLUna; nerileri ve samimi yaklamlar iin hocam Prof. Dr. ebnem

    ELLALTIOLUna ok teekkr ederim. Yine bu srete, Blm olanaklarndan

    yararlanma imkn salayan Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri

    Blm Bakanlna ve Bahe Bitkileri Blmnn tm deerli retim ye ve

    elemanlar ile idari personeline teekkrlerimi sunarm.

    Tez almamn maddi desteklerini salayan, Yznc Yl niversitesi Rektrl

    Bilimsel Aratrma Projeleri Bakanl (2005-ZF-D19 Nolu proje)na, Ankara

    niversitesi Biyoteknoloji Enstits (2005-163 Nolu proje)ne, Ankara niversitesi

    Bilimsel Aratrma Projeleri Mdrl (2005 K 120/140-6 kod nolu Bilim nsan

    Yetitirme konulu (BYEP) proje) ve Ankara niversitesi Fen Bilimleri Enstitsne

    sonsuz teekkr ederim. zellikle BYEP olanaklarnn salanmasnda yakn ilgi ve

    desteinden dolay Ankara niversitesi Fen Bilimleri Enstits Mdr Yardmcs Prof.

    Dr. Aydn GNEe teekkr ederim.

    Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri Blmnde 35. madde

    kapsamnda Doktora yapabilmem ile ilgili izin ve grevlendirilmem konusundaki

    iii

  • destei iin deerli hocam Yznc Yl niversitesi, Ziraat Fakltesi Dekan Prof. Dr.

    Frat CENGZe teekkr bir bor bilirim.

    Tezimin deiik aamalarnda yardmlarn ve manevi desteklerini grdm Do. Dr.

    Afife GVEN (Ankara niversitesi, Mhendislik Fakltesi, Kimya Mhendislii

    Blm), Uzman Nilfer VURAL (Ankara niversitesi, Biyoteknoloji Enstits

    Enstrmental Analiz Birimi sorumlusu) ve Kimya Mhendisi Ebru ERTEye de ok

    teekkr ederim.

    Her ne kadar bugnleri gremediyse de manevi olarak hep yanmda hissettiim rahmetli

    babam Mustafa KSALye, dnyaya geldiim gnden beri benden hogr, anlay ve

    desteini esirgemeyen, bana hem anne hem de baba olan sevgili annem Mihriban

    KSALye, abim Muzaffer KSALye, ablam Neriman KOa, kardeim Mjgan

    KSALye sonsuz kranlarm sunarm.

    Ve sevgili eim Yrd. Do. Dr. Sddk KESKNe (Yznc Yl niversitesi, Tp

    Fakltesi, Biyoistatistik A.B.) ncelikle iyi ve kt gnde, yanmda olsun ya da olmasn

    desteini esirgemedii iin, ayrca tezimin istatistik analizlerinde gsterdii stn

    baars iin sonsuz teekkrlerimi sunarm. Son olarak, varlyla canma can katan

    biricik kzm Reyyan KESKNe iyi ki varsn der, teekkr ederim.

    Nurhan KESKN

    Ankara, ubat 2007

    iv

  • NDEKLER

    ZET....i

    ABSTRACT....iii

    TEEKKR....v

    SMGELER DZN......ix

    EKLLER DZN........x

    ZELGELER DZN....xii

    1. GR ................................................................................................................... 1

    2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ZETLER ........................................ 5

    2.1 Fitoaleksinler .............................................................................................................5

    2.2 Asmalarda Stilben Fitoaleksinleri ........................................................................... 6

    2.3 Resveratrol Moleklnn zellikleri ve Asmalardaki Fizyolojik Rol .............. 8

    2.4 Asmalarda Resveratrol ve Dier Stilben Fitoaleksinlerinin Uyarlmasna

    Neden Olan Etmenler..11

    2.4.1 Biyotik elisitrler..................................................................................................11

    2.4.2 Abiyotik elisitrler ............................................................................................... 17

    2.4.2.1 Ultraviyole (UV) n ........................................................................................18

    2.4.2.2 Kimyasal maddeler ...........................................................................................19

    2.3.3 Yetitiricilik faktrleri ......................................................................................... 23

    2.4 Asmalarda in vitro Koullarda Resveratrol retme almalar .......................27

    2.5 Resveratroln Biyolojik Etkileri............................................................................29

    3. MATERYAL VE YNTEM....................................................................................32

    3.1 Materyal ...................................................................................................................32

    3.2 Yntem ..................................................................................................................... 34

    3.2.1 Kallus kltr almalar...................................................................................34

    3.2.1.1 Eksplantlarn eldesi...........................................................................................34

    3.2.1.2 Eksplantlarn sterilizasyonu.............................................................................35

    3.2.1.3 Kallus kltrlerinin kurulmas........................................................................35

    3.2.2 Elisitr (Uyarc) uygulanmas ............................................................................37

    3.2.3 Yksek basnl sv kromotografisi (HPLC) almalar.................................39

    3.2.3.1 Kallus dokularndan resveratroln ztlenmesi............................................39

    v

  • 3.2.3.2 Stok solsyonlarn hazrlanmas ve kalibrasyon............................................39

    3.2.3.3 Resveratroln HPLC ile analizi.......................................................................41

    3.2.3.4 Bileik tans ve hesaplama...............................................................................42

    3.2.4 Sonularn istatistik deerlendirmesi.................................................................44

    4. BULGULAR ..............................................................................................................45

    4.1 UV In Uygulama Sresinin Resveratrol Deriimine Etkisi .............................45

    4.1.1 Kalecik karas .......................................................................................................45

    4.1.2 kzgz ..............................................................................................................49

    4.1.3 Erci .......................................................................................................................53

    4.1.4 Cabernet Sauvignon.............................................................................................56

    4.2 zm eitlerinin Resveratrol retim Kapasiteleri Bakmndan

    Karlatrlmas ......................................................................................................60

    4.3 Kallus Yalarnn Resveratrol retimine Etkisi ..................................................62

    5. TARTIMA VE SONU..........................................................................................64

    KAYNAKLAR .............................................................................................................. 70

    ZGEM................................................................................................................... 80

    vi

  • SMGELER DZN

    CoA Koenzim A

    CS Cabernet Sauvignon

    ER Erci

    HPLC Yksek Basnl Sv Kromatografisi

    KK Kalecik karas

    LDL Dk younluklu lipoprotein

    G kzgz

    PR Patojen ilikili

    YA Ya arlk

    UV Ultraviyole

    BAP 6-benzilaminoprin

    2,4-D 2, 4-diklorofenosi-asetik asit

    JA Jasmonik asit

    SA Salisilik asit

    MeJa Metil jasmonat

    BHT Benzotiadizol

    ABA Absizik asit

    vii

  • EKLLER DZN

    ekil 2.1 Asmada bulunan baz stilben grubu fitoaleksinlerin kimyasal yaplar ............. 7 ekil 2.2 Stilben fitoaleksinlerinin biyosentez yolu ......................................................... 8 ekil 3.1 zm eitlerine ait olgun salkmlarn grn ........................................... 33 ekil3.2 Kallus kltrleri iin kullanlan eksplantlar...................................................... 36 ekil 3.3 Yaprak eksplantlarndan elde edilen kalluslar ................................................. 36 ekil 3.4 UV lambasnn kurulduu dzenek ................................................................. 37 ekil 3.5 Kalluslara UV nnn uygulanmas ................................................................ 38 ekil 3.6 Resveratrol ztlenmesin aamalar ................................................................ 40 ekil 3.7 Resveratrol standart ile izilen kalibrasyon erisi .......................................... 41 ekil 3.8 HPLC kromatogram rnei ............................................................................ 43 ekil 4.1 Kalecik karas zm eidinde, 12 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika

    UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ............................................................................................................. 46

    ekil 4.2 Kalecik karas zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika

    UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ............................................................................................................. 48

    ekil 4.3 kzgz zm eidinde, 12 gn yal kalluslara,10 ve 15 dakika UV

    n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ... 50 ekil 4.4 kzgz zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV

    n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ... 52 ekil 4.5 Erci zm eidinde, 12 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV n

    uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ........... 54 ekil 4.6 Erci zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV n

    uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri .......... 56 ekil 4.7 Cabernet Sauvignon zm eidinde, 12 gn yal kalluslara, 10 ve 15

    dakika UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri ........................................................................................... 57

    viii

  • ekil 4.8 Cabernet Sauvignon zm eidinde, 15 gn yal kalluslara, 10 ve 15 dakika UV n uygulamalarnn inkbasyon sresince resveratrol deriimine etkileri .......................................................................................... 59

    ekil 4.9 12 gn yal kalluslarda, uygulamalara gre zm eitlerinin resveratrol

    birikimlerinin karlatrlmas ....................................................................... 61 ekil 4.10 15 gn yal kalluslarda, uygulamalara gre zm eitlerinin resveratrol

    birikimlerinin karlatrlmas ..................................................................... 61 ekil 4.11 10 dakika sre ile UV n uygulamas yaplm 12 ve 15 gn yal

    kallus kltrlerinde resveratrol birikimlerinin karlatrlmas ................... 63 ekil 4.12 15 dakika sre ile UV n uygulamas yaplm 12 ve 15 gn yal kallus kltrlerinde resveratrol birikimlerinin karlatrlmas .............................. 63

    ix

  • ZELGELER DZN

    izelge 3.1 zm eitlerine ait baz zellikler.............................................................. 34 izelge 4.1 Kalecik karas zm eidinde, 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA)

    etkileri ........................................................................................................... 46 izelge 4.2 Kalecik karas zm eidinde, 15 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA)

    etkileri ........................................................................................................... 48 izelge 4.3 kzgz zm eidinde, 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri .......... 50 izelge 4.4 kzgz zm eidinde, 15 gn yal kalluslarda, UV n uygulama

    ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri ......... 52 izelge 4.5 Erci zm eidinde 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri ............... 53 izelge 4.6 Erci zm eidinde 15 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA ) etkileri ............. 55 izelge 4.7 C. Sauvignon zm eidinde, 15 gn yal kalluslarda, UV n

    uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA ) etkileri....................................................................................... 57 izelge 4.8 C. Sauvignon zm eidinde,15 gn yal kalluslarda, UV n

    uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA ) etkileri....................................................................................... 59

    x

  • 1. GR

    Bitkilerin yaam dngleri boyunca byme ve gelime olaylarnn sonucu olarak

    meydana getirdikleri birincil rnler, ekosistemin tm varlklarnn yaamnda nem

    tad gibi insanlar iin de beslenmeden barnmaya kadar vazgeilmezdir. Dier

    taraftan bitkiler, birincil rnlerden farkl olarak dorudan byme ve gelime ile ilikili

    olmayan, trlere zg zel molekller sentezleyebilmektedir. Bu zel molekllere

    ikincil rnler (sekonder metabolitler) ad verilmektedir.

    Modern kimya ve zellikle bitki biyokimyasnn gelimesi ve 20. yzyln ortalarnda

    analitik yntemlerin, zellikle kromatografik yntemlerin hzla ilerlemeye balamasyla

    birlikte, ikincil rnlerin molekler yaplar tanmlanmaya balamtr. Bu gelimelere

    molekler biyolojideki gelimelerin de katlmasyla birlikte, ikincil rnlerin, bitkilerin

    bulunduklar evre koullarna adaptasyonunda, ekosistem ile bitki sal arasndaki

    ilikilerin dzenlenmesinde rol oynadklar aa karlmtr. Bu maddeler, dk

    molekl arlkl olmakla birlikte, bitkilerden retildikleri miktarlar da olduka dk

    (kuru arln %1inden daha az) olup, bitkinin fizyolojik durumu ve gelime

    aamasna bal olarak sentezlenmektedir. Karmak ve zel kimyasal yaplara sahip

    olan bu maddelerin retilmeleri, biyotik ve abiyotik stres koullar tarafndan uyarlarak

    artrlabilmektedir.

    kincil rnlerin, dorudan bitki iin nemli olmalarnn yan sra, yzyllardr bitkileri

    kullanan insanlar iin de nemli olduklar giderek daha iyi anlalmaktadr. Bitkilerden

    elde edilen besin maddelerinin, zel tad ve aromalar bu maddelerden kaynaklanmakta

    ve bylece bu maddeler insan yaamna tad ve renk katmaktadr. Bu konuda, kahvedeki

    kafein ve ttndeki nikotin en yaygn bilinen rnekler olarak verilebilir. kincil

    rnlerin bir dier ve ok nemli yararlanma alanlar bitkilerin tedavi amal

    kullanmnn bu maddelere dayanmasdr. nsanolu, bitkileri ve dolaysyla ikincil

    rnleri iyi veya kt amal olarak yzyllardr kullanmtr. Gnmzde de ikincil

    rnler; ila, kozmetik, tarmsal kimyasallar, gda katk maddeleri gibi birok sektr

    iin nemli olan deerli ham maddelerdir. Bitkiler leminde 100.000 kadar ikincil

    rnden sz edilirken, bu saynn ancak yarsnn kimyasal yaplarnn tanmlanabildii

    1

  • ve halen bilinmeyenlerle birlikte, bitkilerin esiz bir kimyasal eitlilik sunarak yukarda

    belirtilen sektrler iin deerli ham madde kaynaklar olduu kabul edilmektedir.

    Gnmzde ila sektrne konu olan kimyasallarn %25inin bitki kkenli ham

    maddelere dayand dikkate alndnda, doal bitkisel kaynaklarn yksek getirili

    ekonomik deerler olduu aka ortaya kmaktadr (Bourgaud et al. 2001, Oksman-

    Caldentey and Inz 2004).

    Doktora tez almasna konu olan resveratrol, tp ve eczaclk literatrnde son yllarda

    giderek nem kazanm olan ikincil bir bitki rndr. Bir ok kaynak, (Frankel et al.

    1993, Kopp 1998, Srdi et al. 2000, Falchetti et al. 2001, Moriarty et al. 2001, Cui et al.

    2002) resveratroln koroner kalp hastalklar riskini azaltan ve kanser hcrelerinin

    oluumunu engelleyen gl bir antioksidan olduunu bildirmektedir. Bu maddeye olan

    ilgi, uzun yllar Japonya ve inde halk ilac olarak bilinen, Polygonum cuspidatum

    bitkisinin kklerinden yaplan kojo-kon adl geleneksel ilatan kaynaklanmaktadr.

    Bu ila; hipertansiyon, damar tkankl, cilt iltihab ve alerji gibi birok hastaln

    tedavisinde kullanlmaktadr (Goldberg et al. 1996). Bugne kadar yaplan almalar

    dikkate alndnda, 72 bitki trnde resveratroln retilebildii belirlenmitir (Dong

    2003). Bu trlerin bir ou tarmsal ama dnda olup, dorudan insan beslenmesine

    konu olan trlerin says olduka snrldr. Bu trlerden; asma, dut, yaban mersini,

    yerfst ve Antepfst en bata gelenlerdir. Asma ise dier trlerle

    karlatrldnda, daha yksek resveratrol retebilme kapasitesi ve taze veya ilenmi

    rnlerinin yaygn kullanm nedeniyle deer kazanmakta ve aratrmalarda ne

    kmaktadr.

    zm ve arabn tbbi deeri, eski Msr kaynaklarnda yer ald gibi Hippocrates

    tarafndan da bildirilmitir. Hindistanda zm ayurvedik beslenmede kullanld gibi

    Orta-dou, in ve Gney Afrikada tbbi anlamda kullanlmaktadr. Aralarnda

    Amerikan ve ngiliz farmokopelerinin de bulunduu baz ila rehberlerinde zme yer

    verilmitir (Bavaresco and Vezzulli 2006).

    2

  • Stilben grubu bir fitoaleksin olan resveratrol; asmalarda ekirdek, tane kabuu,

    yapraklar ve destek doku organlarnda biyotik ve abiyotik stres faktrlerine kar

    sentezlenmektedir. Bu nedenle, taze zm veya ilenmi rnlerinin, besleyici

    zelliklerinin artrlmasnn yan sra, resveratrol ierii bakmndan yksek olduu

    dnemde tketilmesiyle salk ynnden salayaca katknn artrlmas

    hedeflenmektedir. Ancak, resveratroln sentezlenme mekanizmasn etkileyen

    faktrlerin kontrol edilemeyii bu yndeki aratrmalarda en nemli sorunu

    oluturmaktadr. Dier yandan, dorudan resveratrol ztnn tbbi destek olarak

    kullanlabilmesine ynelik ham maddenin elde edilmesi ayr bir aratrma alann

    oluturmaktadr. Bu almalar, merkezde kimya ve eczaclk bilimlerinden arlkl

    olarak yararlanmakla birlikte, ham maddeyi oluturan bitkiyi tanyan, oaltan ve

    yetitiren ziraat ve son rnn etkisini inceleyen tp bilimlerinden de destek alan,

    disiplinleraras bilgi retme alanlardr. Bu anlay ile ziraat mhendislii, geleneksel ve

    biyoteknolojik yntemlerin uygulanmas ile almalara katkda bulunmaktadr.

    Genel olarak, ikincil rnlerin elde edilmesi iin gerekli olan materyal, daha ok doal

    yetime alanlarndan toplanan bitkilerden elde edilmektedir. Baz trlerin ise bu amaca

    ynelik kltrleri yaplmaktadr. Geleneksel yntemler olarak adlandrlan her iki

    koulda da elde edilen saf madde miktar, bitkisel materyalin miktarna ve kalitesine

    bal olarak deimektedir. Her iki durumda da bitkilerin iinde bulunduu ekolojik

    koullarn olumlu veya olumsuz etkilerinden bamsz retim yapmak mmkn deildir.

    Bu nedenle, ikincil rnlerin elde edilmesinde, kontroll koullardan ve birim alan en

    iyi ekilde deerlendirecek sistemlerden yararlanlmas hedeflenmektedir. Genel olarak,

    bitki doku kltrlerinin ikincil rn retimindeki avantajlarn aadaki balklar

    altnda zetlemek mmkndr (Ramachandra and Ravishankar 2002, Lila 2005).

    1. Doku veya hcreler zerinde ayn dzeyde etkiler meydana getirerek bir rnek rn

    elde etmeyi mmkn klmaktadr.

    2. Yln her dneminde retim imkn salamaktadr.

    3. zel dokularda retilen molekller, yalnz bu doku veya hcrelerin kltre alnmas

    ile retilebilir. Bylece tm bitki materyalinin kullanlmas yerine hedef organ veya

    hcrelerden daha kolay madde ztlenmesi salanmaktadr.

    3

  • 4. Kltre alnmas zor trlerde ar hasat nedeniyle olas yok edilme tehlikesinin

    nne geilmesine imkn salamaktadr.

    5. Bir ok ikincil rn, son derece karmak molekl yaplar nedeniyle sentetik veya

    yar sentetik olarak elde edilemediinden veya sentetik trevlerinin maliyeti ok

    yksek olduundan bu yntemler ile bunlarn daha ekonomik retimleri

    salanmaktadr.

    6. Madde retim amac dnda, molekllerin biyosentez mekanizmalarnn aa

    karlmasnda da yararlanlan sistemler olma zellii tamaktadr.

    Belirtilen bir ok yararlarna karn, bitki doku kltrleri aracl ile ticari anlamda

    ikincil rn retiminde ulalan baarlarn ok snrl olduu da dnlmektedir. Bu

    konu zerine, ikincil rnlerin biyosentezi konusundaki bilgi eksikliklerinin yan sra,

    kltre alnacak bitki tr ve dokular ile kltr koullarna ilikin bilgilerin bir araya

    getirilemeyii, ksacas yukarda da deinilen disiplinleraras alma sisteminin

    uygulanamay da etkili olmaktadr. Doktora tez almasnda, tarmsal neminin yan

    sra, salk ve ila sektr iin deerli bir ikincil rn olan resveratrol retebilmesi ile

    de deer kazanan asmalarda, kallus kltr yntemi ile asma dokularnda ultraviyole

    (UV) nn aa karc etkisinden yararlanarak resveratrol retilmesi ve baz

    genotiplerin resveratrol retme kapasitelerinin belirlenmesi amalanmtr. Bu amala,

    lkemizin nde gelen krmz araplk zm eitleri olan Kalecik karas (Klon 12) ve

    kzgz ile Van ili evresine zg Erci ve uluslararas nemde yabanc bir krmz

    araplk eit olan Cabernet Sauvignon eitlerinin kallus kltrlerinde, UV nna kar

    resveratrol retim kapasiteleri belirlenmitir. Bylece kallus dokularnda resveratrol

    retimi zerinde, UV n uygulama sresi, inkbasyon sresi ve kallus yann etkisi

    genotipler dzeyinde incelenmitir.

    4

  • 2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ZETLER 2.1 Fitoaleksinler Bitkiler bulunduklar veya yetitirildikleri ortamlarda biyotik veya abiyotik kkenli stres

    faktrleri ile kar karya kalmaktadr. Bu faktrler tarafndan meydana gelen uyarlar,

    hcre zarnda bulunan alclar tarafndan alglanmakta, sinyal olarak hcre ierisinde

    gerekli yerlere iletilmekte ve sonrasnda bitkide bu faktrlere kar bir tepki meydana

    gelmektedir. Bu kar tepkinin rn olan ikincil rnlerin, bitkilerin bulunduklar

    ekosistem ile uyumlu ve salkl bir yaam srmelerinde rol oynadklar bilinmektedir.

    kincil rnlerin bitki metabolizmasndaki son derece karmak ve eitli olan bu rolleri

    hakknda ulalan bilgiler ok snrl olmakla birlikte bunlarn; antimikrobiyal,

    antifungal ve antiviral etki ile patojenlere kar savunma mekanizmalarnn harekete

    geirilmesi (fitoaleksin etkisi) ve tohum imlenmesini engelleyici veya toksik etkiler

    meydana getirerek dier baz bitkiler ile oluabilecek rekabetin engellenmesi (Verpoorte

    et al. 1999), tozlanma ajanlar ve simbiyotikler iin de ekim mekanizmalarnn

    oluturulmasnda rol oynadklar bilinmektedir.

    eitli snflandrma biimleri bulunmakla birlikte, ikincil rnler biyosentez yollarna

    gre genel olarak byk molekl ailesine ayrlarak incelenmektedir. Bunlar: (1)

    fenolikler, (2) terpenler ve steroidler ile (3) alkaloidlerdir (Bourgaud et al. 2001).

    Fenolik maddeler ailesi iinde yer alan gruplardan birisi olan stilbenler, antioksidan

    aktivitelerinin yan sra fitoaleksin olarak da grev yapan molekllerdir. Phytoalexin,

    Yunanca bir terim olup; phyton: bitki, alexein: koruyucu anlamndadr (rsek and

    Kirly 1986, Bavaresco and Vezzulli 2006).

    Fitoaleksinleri biriktirme yetenei ok sayda bitki trnde incelenmi ve kk

    farkllklar dnda sentezin yapsal olarak benzerlik gsterdii belirtilmitir (Bavaresco

    and Fregoni 2001). Fitoaleksinlerin biyosentezi temel metabolizma yolunu

    iermektedir (rsek and Kirly 1986). Bunlar,

    5

  • a) Asetat-mevalonat yolu

    b) Asetat-melonat yolu

    c) ikimik asit yolu

    Bitkide fitoaleksin sentezi bir etki-tepki mekanizmas sonucu olduundan, bu

    maddelerin sentezini uyaran farkl etkilerin olabilecei dnlmtr. Bitkilerde

    fitoaleksin sentezini tevik edici maddelere ilk olarak uyarc (inducer) ismi

    verilmitir. Daha sonra, bu maddeler aa karc (elisitor) maddeler olarak

    tanmlanmtr (Keen 1975). Elisitrler, biyotik (bakteri, mantar vb. hastalk yapc

    mikroorganizmalar) ya da abiyotik (yaralama, ultraviyole (UV) nlar, alminyum,

    bakr, gm gibi metal iyonlar) kaynakl olabilmektedirler. Smith (1996), biyotik ya

    da abiyotik elisitrlerin, bitkide savunma sistemini uyardn ve bitkilerin elisitr

    uyarmn takiben fitoaleksinleri sentezlediini bildirmitir. Ayn zamanda elisitrler,

    fitoaleksinlerin biyosentezinde rol olan enzimleri harekete geiren bileiklerdir.

    2.2 Asmalarda Stilben Fitoaleksinleri

    Asmalarda stilbenlerin varl ilk olarak Langcake and Pryce (1976) tarafndan baz V.

    vinifera L. genotiplerinde belirlenmitir. Botrytis cinerea ile bulatrlm baz zm

    eitlerine ait yapraklarda, bulama blgesinin hemen snrnda yer alan salkl

    hcreler, 366 nanometre (nm) dalga boyunda UV n altnda incelendiinde, bunlarn

    parlak mavi floresans renk oluturduklar grlm ve rengi veren bileiin trans-

    resveratrol olduu bildirilmitir.

    Asmalarda en yksek miktarda sentezlenen temel ikincil rn bileii trans-resveratrol

    (3,4',5-trihidroksi-stilben) olmakla birlikte, bir ou resveratroln dimer, trimer veya

    tetramer yapsnda olan baka stilben bileikleri de belirlenmitir. Bu bileiklerin en

    nemlileri olarak; trans- ve cis-piceid (resveratrol glikoziti), -viniferin (trans-

    resveratrol dimeri), pterostilben (trans-3,5-dimetoksi-4'-tetrahidroksistilben),

    piceatannol (trans-3,3',4,5'-tetrahidroksi-stilben) ve pallidol (trans-resveratrol dimeri)

    molekllerinden sz edilmektedir (Bavaresco et al. 2002).

    6

  • Stilbenlerin ana iskelet yapsn bir metilen kprs ile birlemi olan iki aromatik halka

    oluturmaktadr (Soleas et al. 1997). ekil 2.1 de baz asma stilbenlerinin molekl

    yaplar verilmitir.

    trans-pterostilben

    trans- resveratrol

    piceid (polydatin)

    trans--viniferin

    ekil 2.1 Asmada bulunan baz stilben grubu fitoaleksinlerin kimyasal yaplar

    Stilbenlerin biyosentezi; ekil 2.2de de grld zere, genel fenilpraponoid

    metabolizmasnda yer alr ve fenilaleninden, sinamik asit ve koenzim A (CoA)

    esterlerine dnm sz konusudur. Biyosentezde, Stilben sentaz (STS) ve Kalkon

    sentaz (CHS) anahtar grevi gren iki nemli enzimdir (Bavaresco and Vezzulli 2006).

    7

  • Fenilalenin

    Fenil alenin amonya-liyaz

    Sinamik asit Ligninler

    4-kumarat:CoA-ligaz

    Sinamat 4-hidroksilaz

    Asetat melonat 3 x Malonil-CoA + 4-Cumaril-CoA

    Stilben Sentaz Kalkon Sentaz

    Resveratrol Kalkonlar

    Resveratol trevleri Flavonoller Tanenler Antosiyaninler

    ekil 2.2 Stilben fitoaleksinlerinin biyosentez yolu, (Bais et al. 2000).

    2.3 Resveratrol Moleklnn zellikleri ve Asmalardaki Fizyolojik Rol

    Asmalarda ilk tanmlanan stilben olan resveratrol, Vitaceae familyas bitkilerinde

    zellikle fungitoksik zellii ile savunma mekanizmasnn bata gelen fitoaleksin

    molekl olmasnn yan sra, insan sal zerindeki olumlu etkilerinin anlalmasnn

    ardndan zerinde en fazla allan ikincil rnlerden biri haline gelmitir.

    ekil 2.1de molekl yaps aklanm olan resveratroln, baz kimyasal zellikleri

    aada verilmitir (Haneke 2002).

    8

  • Ak kimyasal ad : 3,4',5-trihydroxy-trans-stilbene

    Kapal forml : C14H12O3Molekl arl : 228.25 g/mol

    znrlk : Su, metanol ve asetonda kolayca zlr

    Kaynama noktas : 253-255C

    Fiziksel yaps : Kat-toz

    Renk : Hafif grimsi beyaz

    UV absorbans deeri :

    trans- iin[UVmax (EtOH) nm () 308 (30000)]

    cis- iin [UVmax (EtOH) nm () 288 (12600)]

    Resveratroln, trans- ve cis- olmak zere iki izomeri bulunmaktadr. Doal olarak

    asmalarda bulunan formu trans- izomerdir. Cis- izomer, zm tanelerinde nadiren

    grlr. Bu durumu aklayan iki hipotez sz konusudur. Bunlardan ilki; cis-resveratrol

    glikozitinin hidrolize olmas (Vrhovsek et al. 1997), ikincisi ise n izomerizasyonu

    uyarmas ve trans-resveratroln cis- forma dnmesidir (Versari et al. 2001). Dier

    yandan cis- izomerin araplarda nemli miktarlarda bulunduu dikkat ekmektedir.

    (Mattivi et al. 1995, Lamuela-Ravents et al. 1995). Bu durumun arap yapm srasnda

    trans-resveratroln izomerizasyonundan kaynakland ileri srlmektedir (Jeandet et

    al. 1993).

    Resveratrol, asmann yaprak, iek dokular ve tanelerinde fitoaleksin olarak

    sentezlenmektedir. Buna gre sz konusu dokularda resveratroln sentezlenebilmesi

    iin bitkinin bir stres faktr ile karlamasnn gerekli olduu, uyarc etkisinin

    bulunmad durumlarda bu dokularda resveratrol retiminin gereklemedii veya eser

    miktarda gerekletii belirtilmitir (Hoos and Blaich 1988, Fregoni et al. 2000).

    Yapraklarda alt / st yaprak dokusundaki hcreler, tanelerde ise tane kabuk hcreleri,

    resveratroln sentezlendii yerlerdir. Dier taraftan, asmalarn odunsu ksmlarnda;

    gvde, bir yal dallar, kk, ekirdek ve yar odunsu salkm saplarnda resveratroln

    yap maddesi olarak bulunduu ve bu organlar rmelere kar koruduu, uyarc bir

    faktr etkisi altnda da sentezlenmenin olduu belirtilmitir (Ector et al. 1996,

    Bavaresco et al. 1997a, Bavaresco et al. 2000, Bavaresco et al. 2003).

    9

  • Yaplan aratrmalarda, Vitaceae familyasna ait btn trlerde resveratroln

    sentezlenebildii belirlenmitir. Tr ve eitlerin sentez yeteneklerinin ve retim

    miktarlarnn farkl olduu nemle vurgulanmaktadr. Ancak, ba koullarnda

    resveratrol ve dier stilben fitoaleksinlerinin retiminde, genotipin etkisi bir ok faktr

    tarafndan etkilenmekte ve bamsz bir deerlendirme yaplamamaktadr.

    Resveratroln fungal hastalklara zellikle Botrytise dayanm ile ilikilendirildii ilk

    aratrmalarda; hastalklara dayankl tr ve eitlerin stilben fitoaleksin ieriinin,

    dolaysyla resveratrol ieriinin hassas tr ve eitlere gre daha yksek olmas

    beklenmitir. Bu beklentinin karland aratrma sonular bulunmaktadr. Bu

    sonulara gre Vitis cinsinin dier trlerinin veya trler aras melezlerinin, V. vinifera L.

    trnden daima daha yksek resveratrol sentezleyebildii bildirilmitir. (Creasy and

    Coffee 1988, Jeandet et al.1991, Bavaresco et al. 1997b). Bu bulgulara karlk, tr ve

    eitlerde hastalklara kar dayankllk ile resveratrol ierii arasnda ters ilikinin

    olduu belirtilen aratrma sonular da bulunmaktadr. (Soleas et al. 1995a ve b).

    Tane kabuunda veya yapraklarda sentezlenen resveratrol deriimine bal olarak ortaya

    konulan bu sonularn yan sra; tr veya eitlerden elde edilen araplardaki resveratrol

    dzeyi de hastalklara dayanm ile ilikilendirilmitir. Lamikanra et al. (1996), 5 adet V.

    rotundifolia (Muskadin), 8 adet V. vinifera ve 2 adet V. labrusca zmne ait 18 farkl

    Amerikan arabnda trans- ve cis- resveratrol deriimini incelemilerdir. Aratrclar,

    hastalk etmenlerine kar en dayankl tr olan V. rotundifoliadan retilen araplarn

    resveratrol ieriinin (4.9 and 13.4 mg/l), genel olarak hastalk etmenlerine kar hassas

    tr olan V. viniferadan retilen araplarn resveratrol ieriinden (1.1 and 4.5 mg/l)

    daha yksek olduunu belirtmilerdir.

    spanyada yetitirilen 7 beyaz araplk zm eidine ait 13 arapta (V. vinifera)

    resveratrol ve piceid deriimini aratran Romero-Prez et al. (1996), eitlerin bilinen

    hastalklara dayankllk dzeyleri ile stilben fitoaleksin ieriklerinin uyumlu olduunu

    belirlemilerdir. Elde edilen sonulara gre Chardonnay (0-0.225 mg/l) en hassas eit

    10

  • olarak belirlenirken, en dayankl eit Xarello (0.802-1.089 mg/l) olmu ve bunu

    Parellada (0.235-0.523 mg/l) eidi izlemitir.

    Kopp (1998), beyaz araplarda ve fermente olmam zm sularnda, resveratrol

    deriiminin ok az olduuna dikkat ekmekle birlikte, maserasyonun hi uygulanmad

    ya da snrl uyguland bu rnlerde krmz araba gre ok daha dk dzeyde

    resveratrol bulunduunu belirtmektedir. Bu konuda kapsaml bir alma, Okuda and

    Yokotsuka (1996) tarafndan yaplmtr. Aratrclar, Botrytis bulamam ve ayn

    koullardan hasat edilen, 16 beyaz, 17 pembe veya krmz zm eidinde, tane

    kabuunda resveratrol miktarndaki deiimi incelemilerdir. Beyaz ve krmz

    eitlerin tane kabuklarnda saptanan resveratrol miktarlar arasndaki farkn nemli

    olmadn belirlemilerdir. ncelenen eitler toplu olarak deerlendirildiinde,

    resveratrol miktarnn tanede 0.5 g/g (Pizzutello bianco)-14.1 g/g (Mller-Thurgau)

    arasnda deitiini ifade etmileridir. Bu sonuca gre en yksek ve en dk deerler

    iki beyaz eitten elde edilmitir. Ayn aratrmada baz eitlerin ra ve sonrasndaki

    araplar resveratrol ierii bakmndan incelendiinde, genel olarak araplardaki

    resveratrol miktarnn radakinden daha yksek olduu ve krmz araplarn, beyaz

    araplardan ortalama alt kat daha yksek resveratrol ierdii belirlenmitir. Bu

    durumun maserasyon srasnda kabuun kalma sresi ile ilikili olduu da aklanmtr.

    2.4 Asmalarda Resveratrol ve Dier Stilben Fitoaleksinlerinin Uyarlmasna Neden

    Olan Etmenler

    2.4.1 Biyotik elisitrler

    Fitoaleksinler, bitkilerin hastalk etmenlerine kar savunma mekanizmalarnn doal

    antimikrobiyal rnleridir. Bu rnlerin aa kmasnda, bulamay meydana getiren

    patojenin alglanmasnn yan sra, bu algya kar aa kan ve fitoaleksin birikimini

    uyaran baz sinyal molekller de etkili olmaktadr. Buna gre genel bir kural olarak,

    bitkilerde fitoaleksin bileiklerinin sentezlenmesi, uyarc (elisitr) etkisi ile gerekleen

    metabolik olaylarn sonucudur.

    11

  • Fitoaleksin sentezi ve birikimini balatan faktr, bir patojen etkisine bal olarak

    meydan geliyorsa biyotik elisitr (uyarc) kavram ile tanmlanrken; bitki patojen ile

    bulak olsun veya olmasn sinyal molekl etkisi abiyotik elisitr (uyarc) olarak

    adlandrlmaktadr.

    Asmalar, yalnz stilben fitoaleksinleri sentezlemeleri ve biriktirmeleri ile tanmlanan

    trlerdir. Bu byk aileye ait bitkilerin, salkl ve zarar grmemi dokularnda,

    zellikle yapsal organlarnda stilben bileiklerinin tespit edildiini gsteren aratrma

    sonular bulunmakla beraber (Bavaresco and Fregoni 2001), fizyolojik olarak etkili

    miktarlar, uyarc (elisitr) etkisine bal stres mekanizmalar sonucunda retilmektedir.

    Asmalarda, resveratrol ve dier stilben bileiklerinin sentezini balatan ve artran

    biyotik ve abiyotik uyarclara ilikin aratrmalar, aada gruplandrlarak

    incelenmitir

    Stilben fitoaleksinlerinin sentezlenmesi biyolojik bir etmene bal olarak

    gerekletiinde, sz konusu etmenler biyotik uyarclar (elisitr) olarak

    tanmlanmaktadr. Bu grupta fungal ve bakteriyel hastalk etmenleri yer almaktadr.

    Asmalarda biyotik uyarclar olarak bata Gri kf (Botrytis cinerea) olmak zere;

    Mildiy (Plasmopara viticola), Klleme (Uncinula necator), Tane rkl (Rhizopus

    stolonifer), Kk rkl bakterileri (Bacillus ssp.) ve Aspergillus ssp. incelenmitir.

    Biyotik elisitrler genel olarak genotiplerin hastalklara kar dayanm zelliinin

    belirlenmesi amacyla incelenmitir. Bulamadan sonra fitoaleksinlerin retim hz ve

    miktar ile hastala tolerans arasnda iliki kurulmaya allmtr. Temel yaklam,

    fitoaleksin birikiminin dayankl genotiplerde hzl ve yksek miktarda, hassas

    genotiplerde ise daha yava ve dk miktarlarda gerekletii eklindedir (Bavaresco

    and Fregoni 2001).

    12

  • Gri kf (Botrytis cinerea Pers.)

    Asmalarda fitoaleksin sentezinin gereklemesine ilikin ilk bulgular, Botrytis

    bulamas sonucundadr. Langcake and Pryce (1976), Botrytis cineraea ile bulam

    yapraklarn (V. vinifera L. eitlerinden Cabernet Sauvignon, Gordo, Sultana, Clare,

    Mller-Thurgau, Riesling x Sylvaner) stilben deriimlerini nce Tabaka Kromatografisi

    (TLC) ile belirlemilerdir. Aratrclar, Bortytis bulamam salkl yapraklarda stilben

    bileiklerinin sentezlenmediini, bulak yapraklarda ise deriimin 50-396 g/g YA

    arasnda deitiini belirtmilerdir.

    Botrytisin zarar verdii (Vitis vinifera eitlerinden Clare, Gordo, Mller-Thurgau,

    Cabernet Sauvignon, Sultana ve Riesling x Sylvaner) yapraklardaki stilbenik bileikleri

    inceleyen Langcake and McCarthy (1979), bulamann meydana geldii alann hemen

    dn evreleyen salkl dokularda resveratrol deriimini daha yksek bulmulardr

    (34.5 g/g YA). Bu bulgu, resveratroln bulamaya kar oluturulan savunma

    mekanizmasnn bir rn olduunu gstermitir. Botrytise dayanm konusunda

    bilgilere ulamak amacyla aratrclar, hastalk etmeni ile yaprak dayanklln

    ilikilendirmeye almlardr. Serada yetitirilen V. vinifera L. eitlerinin farkl

    pozisyonlardaki srgnlerinden alnan farkl yalardaki yapraklar, hastalk etmeni ile

    bulatrlp, hastaln yaylmas iin bir sre bekletildikten sonra, bu yapraklardaki

    resveratol retim dzeyi Gaz Kromatorafisi (GC) ve spektrofotometre ile belirlenmitir.

    Elde edilen bulgulara gre yaprak yann artmas ile birlikte, resveratrol retim miktar

    da art gstermi ve B. cinereaya kar dayanm artmtr.

    Langcake (1981), V. vinifera L.ya ait Botrytis bulam ve bulamann 10 mm kadar

    yaylm olduu gen ve yal asma yapraklarnda srasyla, resveratrol deriimini 4.79-

    9.40 g/g YA, -viniferin deriimini 9.59-15.83 g/g YA, -viniferin deriimini ise 26.7-72.4 g/g YA olarak bulmutur. Buna gre olgunlama ile birlikte yapraklarda

    resveratrol deriiminin artt ve bylece Botrytise kar dayanklln olutuu bir kez

    daha aklk kazanmtr.

    13

  • Botrytis hastal karsnda trlerin ve eitlerin resveratrol retim kapasitelerinin farkl

    olduu bulunmutur. Amerikan asmalar ve trler aras melezlerin, V. vinifera trnden

    daha fazla resveratrol retebildikleri belirlenmitir (Blaich et al. 1982, Creasy and

    Coffee 1988, Jeandet et al.1991, Bavaresco et al. 1997b).

    Dier taraftan, Botrytis hastalna bal resveratrol retim kapasitesinin vinifera

    eitleri arasnda da farkl olduu izlenmitir. Pinot noir, Chardonnay ve Cabernet

    Sauvignon eitlerinin in vitro bitkilerinin yapraklarnda resveratrol retim kapasitesini

    inceleyen Jeandet and Sbaghi (1992), Pinot noir, Chardonnay ve Cabernet Sauvignonda

    srasyla; 67 mu g/g , 82 mu g/g ve 151 mu g/g resveratrol belirlemilerdir. Bu verilere

    gre Pinot noir, Chardonnay eitlerini Botrytis hastalna kar hassas, bu eitlere

    kyasla iki kat daha fazla resveratrol retebilen Cabernet Sauvignon eidini orta

    dzeyde dayankl olarak tanmlamlardr.

    Ancak bu genel ilikinin kurulamad aratrmalar da bulunmaktadr. Sbaghi et al.

    (1995), 13 Vitis tr ve eidinde, in vitro koullarda elisitr aracl ile uyarlan

    resveratrol retimi ile Botrytis cinerea etmenine dayanm arasndaki ilikileri

    incelemilerdir. Aratrmada, resveratrol retim kapasitesi ile Botrytise dayanm

    arasnda 11 tr ve eitte dorusal bir iliki bulunmutur. Genotipler ierisinde yalnz V.

    labrusca tr ile Carignan (V. vinifera L.) eidi bu dorusal ilikiyle uyumlu

    bulunmamtr. Dayanakl bir tr olan V. labruscann yapraklarnda, beklenenden daha

    dk dzeyde resveratrol deriimi (246 g/g) belirlenmitir. Dier taraftan hassas

    olarak bilinen Carignan eidinde ise beklenenden daha yksek dzeyde resveratrol

    deriimi (382 g/g) gzlenmitir. Aratrclar bu sonucun artc olmadn, gri kf

    etmenine dayanmn birok gen tarafndan kontrol edildiini ve salkm yaps gibi eit

    zelliklerinin de gri kfe dayanmda nemli rol oynadn bildirmilerdir. Bununla

    birlikte aratrclar, bu iki genotip gz ard edildiinde resveratrol deriiminin gri kfe

    dayankl ve hassas genotiplerin seilmesinde iyi bir markr olarak kullanlabileceine

    de dikkat ekmilerdir.

    14

  • Botrytis hastal karsnda resveratroln tane kabuu, meyve eti ve ekirdekte

    retilebilme dzeylerini inceleyen almalarda btn koullarda en yksek resveratrol

    seviyesi, hastalkl alana en yakn salkl kabuk dokularnda belirlenmitir. Bunu

    ekirdekler izlerken, resveratroln meyve etinde iz miktarda sentezlenebildii tespit

    edilmitir. Pinot noir, Gamay ve Chardonnay zm eitlerine ait grnte salkl

    zm taneleri B. cinerea ile bulatrldnda, resveratrol miktarlar tane kabuunda 4-7

    g/g YA, ekirdekte 1 g/g YA, meyve etinde ise 0.1 g/g YA olarak belirlenmitir

    (Jeandet et al. 1995a).

    Bavaresco et al. (1997b), B. cinereaya dayankl Castor (V. rupestris B-38) ve hassas

    Huxelrebe (V. vinifera L.) eitlerinin tanelerinde bulama sonras, stilben

    fitoaleksinlerinin genel olarak tane geliimi boyunca azaldn, olgunluk aamasnda

    ise miktarlarn en dk dzeye indiini belirlemilerdir. Ancak, dayankl trdeki

    trans-resveratrol ve -viniferin dzeyinin hassas trlerden daha fazla olduu sonucuna ulamlardr. Castor eidinde olgun tanede trans-resveratrol 5 g/g YA, -viniferin 6.6 g/g YA olarak belirlenirken, Huxelrebe eidine ait olgun tanelerde ulalan deerler

    srasyla; 2.1 ve 3.3 g/g YA olmutur.

    Mildiy ( Plasmopara viticola (Berk. & Curt.) Berl.& de Toni)

    Bacln nemli hastalklarndan biri olan Mildiynn (Plasmopara viticola)

    fitoaleksin retiminde uyarc bir faktr olduu Langcake and Pryce (1976) tarafndan

    belirlenmitir. Yapraklarda, fitoaleksin retimi ile hastalk etmenine dayanm arasndaki

    ilikiyi inceleyen Langcake (1981), P. viticola ile bulatktan sonra V. vinifera

    yapraklarnda resveratrol birikiminin en fazla 10 g/g YA dzeyine ulaabildiini, buna

    karlk, V. riparia yapraklarnda stres rnlerinin daha hzl ve daha yksek miktarda

    biriktirilebildiini belirlemitir. Bu trde baskn stilben bileiinin -viniferin (100 g/g YA ) olduu izlenmitir. Bylece, V. ripariann mildiyye dayankl bir tr olmas,

    hzl ve yksek stilben birikimi ile ilikilendirilmitir.

    15

  • Pezet et al. (2003), mildiy bulam Chasselas (V. vinifera) yapraklarnda ilk kez

    resveratroln dehidromeri ve -viniferinin izomeri olan -viniferini tanmlamlardr. Aratrclar -viniferinin (156 g/g YA), resveratrol (50 g/g YA) ve -viniferine (87 g/g YA) gre daha fungitoksik bir stilben bileii olduunu ileri srmlerdir.

    Tane rkl (Rhizopus stolonifer Ehrenb.)

    zm tanelerinde hasattan sonra rmelere neden olan etmenlerden olan Rhizopus

    stolonifer fungusunun stilben fitoaleksinlerini uyarmadaki etkisini, resveratrol ve

    pterostilben deriimleri dzeyinde inceleyen Sarig et al. (1997), zm tanelerinde ar

    olgunluk ve rme ile birlikte fitoaleksin bileiklerinin azalmaya baladn tespit

    ederek, rklk etmenlerinin tek bana hasattan sonra elisitr etkisi gsteremeyeceini

    belirtmilerdir. almada, hasat sonrasnda UV-C uygulamas ile birlikte rme

    etmenlerine kar koyabilecek stilben bileiklerinin retiminin uyarlabilecei

    belirlenmitir. Aratrclar, hasat sonrasnda Rhizopus stolonifer bulatrlan tanelere

    UV-C uygulamas yaplmasnn da ardndan, 18 saat sonra resveratrol, 40 saat sonra

    pterostilben bileiklerinin yksek deriim deerlerinde sentezlendiini belirlemiler;

    hasattan sonraki rmelere kar, stilben sentezini uyarc UV-C veya ozon

    uygulamalarnn etkili koruyucu nlemler olabileceini vurgulamlardr.

    Klleme (Uncinula necator (Schw.) Burr. - Oidium tuckeri Berk.)

    Klleme hastalnn elisitr olma etkisini yaprak (Langcake and Pryce 1976) ve

    tanelerde (Romero-Prez et al. 2001) inceleyen aratrmalarda, resveratrol ve piceid

    bileiklerinde artlar meydana geldii izlenmi olmakla birlikte, stilben bileikleri ile

    kllemeye dayanm arasndaki ilikinin kurulmas ynndeki bulgulara henz

    ulalamamtr.

    16

  • Bacillus ssp.

    Asmalarda bakterilerin biyotik elisitr etkileri de aratrlmtr. Ancak bu grup

    etmenlerde ulalan sonular toprak bakterilerine aittir. In vitro koullarda Bacillus ssp.

    (B-781) ile bulatrlan V. vinifera ve V. rupestrise ait bitkiciklerde stilben retiminin

    artt gzlenmitir (Paul et al. 1998). In vitro bitkiciklerin yapraklarnda resveratrol

    birikimi artm, bitkiler bakterilere ramen yaama gcn devam ettirmitir. In vitro

    bitkilerin yapraklarnda llen resveratrol miktar V. viniferada 78.3 g/g YA, V.

    rupestris de 31.0 g/g YA olmutur.

    Aspergillus spp.

    Tanelerde stilben elisitr olarak Aspergillus funguslarnn roln aratran Bavaresco

    et al. (2003), A. carbonarius, A. ochraeus ve A. japonicusun trans-resveratrol sentezini

    uyarabildiini, ayn zamanda A. ochraeusun, stilben bileikleri ierisinde gl bir

    fungitoksik bileik olan piceattanol sentezini de aa kardn belirlemilerdir.

    2.3.2 Abiyotik elisitrler

    Stilben fitoaleksinlerinin, hastalk etmenleri dnda, abiyotik stres faktrleri tarafndan

    da uyarlmas, bitkilerde metabolizma sonucu doal olarak var olan molekller etkisi ile

    sentezlenebilecei gibi dardan yapay uygulamalarla da ayn uyarc etkilerin elde

    edilmesi mmkn olmaktadr. Larronde et al. (2003), abiyotik elisitrleri, bitkilerde

    kaltsal olan hastalklara dayanm mekanizmalarn altran, klasik pestisit

    uygulamalarna alternatif veya tamamlayc etkenler olarak yorumlamlardr.

    Asmalarda stilben fitoaleksinlerinin sentezi ve birikimine neden olduu belirlenen

    abiyotik elisitrler zerindeki almalar aada verilmitir.

    17

  • 2.3.2.1 Ultraviyole (UV) n

    Bitkilerde DNA protein ve ATPase hasarlar ve henz tam aklanamam bir ok

    sistemde hasar meydana getiren UV (B,C) nlarnn, patojen ataklarna benzer biimde

    enzim, flavanoid ve fitoaleksin biyosentezlerini harekete geirdii, savunma

    mekanizmas ile ilgili gen ekspresyonlarn balatt ve PR (pathogenesisrelated)

    proteinlerin sentezini uyard bilinmektedir (Chappel and Hahlbrok 1984, Green and

    Fluhr 1995, Nawrath et al. 2002, Cantos et al. 2000, Melzoch et al. 2001, Bonomelli et

    al. 2004).

    UV nnn asmalarda stilben fitoaleksinlerinin retimine olan etkileri konusunda ok

    sayda aratrma bulunmaktadr. UV nnn baarl bir elisitr olarak asma

    yapraklarnda (Langcake and Pryce 1977, Pryce and Langcake 1977, Pool et al. 1981,

    Barlass et al. 1987, Sbaghi et al. 1995, Douillet-Breuil et al. 1999, Pezet et al. 2003) ve

    tanelerinde (Creasy and Coffee 1988, Jeandet et al. 1991, Threlfall et al. 1999, Adrian

    et al. 2000, Moriartry et al. 2001, Versari et al. 2001., Cantos et al. 2000, 2003,

    Takayanagi et al. 2004) fitoaleksin birikimini balatt ve artrd belirlenmitir.

    254 nmlik UV-C n, asmalarda resveratrol uyarm iin uygulanabilir en etkili doz

    olarak ifade edilmitir (Barlass et al. 1987). Yapraklara yaplan uygulamalarda, alt

    (abaksial) ve st (adaksiyal) yzey uygulamalarnn etkisinin farkl olduu, ancak alt

    yzeylerin nlanmasnn stilben fitoaleksinlerinin retimini uyard gr,

    (Langcake and Pryce 1976, 1977, Pool et al. 1981), Adrian et al. (1996) ve Srdi et al.

    (2000)un asma yapraklarnn her iki yzeyinde de resveratrol sentezlendiini

    belirlemeleri ile geerliini yitirmitir.

    Douillet-Breuil et al. (1999), V. rupestris, V. cinerea, V. labrusca ve V. vinifera

    yapraklarnn alt yzeylerine 15 dakika 254 nm UV n uygulamasndan sonra

    fitoaleksin sentezini incelemilerdir. Uygulamay takiben zellikle resveratrol ve -viniferin sentezinin uyarld ve Amerikan trlerindeki birikimin daha yksek dzeyde

    gerekletii bulunmutur. rnein, nlamadan sonra, 48 saat ierisinde resveratrol

    18

  • seviyesi V. rupestris de 750 g/g YAa ularken, V. viniferada en yksek deer 200

    g/g YA olarak tespit edilmitir.

    zm eitlerinin tanenin olgunlama dneminde gri kfe dayanm bakmndan farkl

    zellikler gstermesi, UV n etkisinden yararlanma olaslnn aratrlmasna neden

    olmutur. Creasy and Coffee (1988), ba ve sera koullarnda yetitirilen zmlere UV

    n uygulam ve sonu olarak tane etinde fitoaleksin retimi belirlenemezken, tane

    kabuklarnda az miktarda ve dzensiz stilben retimi izlenmitir.

    UV nnn hasat sonrasnda zm tanelerine uygulanmas sonucunda da stilben

    sentezinin artt belirlenmitir (Threlfall et al. 1999, Cantos et al. 2000, 2003,

    Moriartry et al. 2001). Bu bulgu, sofralk zmlerde hasat sonras uygulamalarda yeni

    yaklamlar ve teknikler asndan deerlendirilebilir.

    Srdi et al. (2000), trler aras melezler ile V. vinifera eitlerinde resveratrol birikimini

    en yksek dzeyde arttran abiyotik elisitrn UV n olduunu vurgulamlardr.

    2.3.2.2 Kimyasal maddeler

    Asmalarda stilben fitoaleksinlerinin sentezinde etkili olduu belirlenen kimyasal

    maddelerin, yaprak veya tane kabuu hcrelerinde patojenler ile ilikili savunma

    genlerinin uyarlmasnda sinyal molekl olarak grev yapmalar beklenmektedir. Bu

    amala, fungal hastalk etmenlerine kar sistemik ilalarn gelitirilmesinde veya

    zmlerin depolanmas srasnda kullanlan kimyasallar ile fizyolojik almalarda PR

    genlerle ilikili olduu belirlenen isel organik maddelerin, dsal uygulamalardaki

    elisitr etkileri aratrlmtr.

    Fungal hastalk etmenlerine kar gelitirilen sistemik ilalarn ieriinde metal tuzlar,

    zellikle civa, bakr ve alminyum etken madde olarak yer almaktadr. Asmalarda

    alminyum klorrn (AlCl3) doal savunma mekanizmasn harekete geirme zelliini

    aratran Adrian et al. (1996), Rupestris du Lot Klon T110 ve V. vinifera eitlerinden

    19

  • Pinot noir eliklerinin AlCl3 ile muamele edilmesinden sonra, elde edilen srgnde

    resveratrol birikim dzeyini incelemilerdir. Trler arasnda mildiyye dayanm

    bakmndan bilinen farklla paralel sonular elde edilmitir. Rupestris du Lot

    eidinde, incelenen tm AlCl3 deriimlerinde (7-90 mM arasnda), resveratrol

    retiminin meydana geldii belirlenirken, Pinot noir eidinin daha yksek deriimlerde

    (22-70 mM) resveratrol retimine balad saptanmtr. Elde edilen bu sonuca gre

    aratrclar alminyumun, fitoaleksin birikimi yoluyla balarda mildiy mcadelesinde

    kullanlabilecek ilalarda yer almasnn nemini vurgulamlardr.

    Alminyumun bir dier kimyasal bileii olan, organik fosetil-Al (alminyum etil

    fosfit), zellikle Oomycetes funguslarna kar sistemik fungusitlerin etkili maddesidir.

    Fungusun metabolizmasna dahil olarak konuku-patojen etkileiminin fizyolojisini

    deitirdii bilinen bu madde, Vitis trlerinde de Plasmopara viticolaya kar

    kullanlabilecek bir bileik olarak tanmlanmtr (Baveresco and Fregoni 2001).

    Balarda en yaygn olarak kullanlan tarmsal sava ilalar bakr ierikli olanlardr.

    Ar metallerden olan bakrn elisitr etkisinin incelendii aratrma sonularndan ilki

    Coulomb et al. (1999) tarafndan elde edilmitir. Mildiy ve gri kf hastalklarna kar

    bordo bulamac ve bakr hidroksit uygulamas yaplan zm eitlerinde hasattan 21

    gn sonra yaplan incelemelerde uygulama yaplmam olanlara gre daha yksek

    stilben sentezi belirlenmitir .

    Tinttunen and Lehtonen (2001), Fransada mildiyye kar yalnz bakr uygulamasna

    izin verilen organik ba alanlarndan elde edilen 16 organik krmz arap ile geleneksel

    yetitiricilikten elde edilen 16 krmz arab resveratrol ierii bakmndan

    karlatrmlardr. Organik araplarda resveratrol deriimi ortalamas 5.6 mg/l olarak

    llrken, normal araplarda 2.9 mg/l olarak llmtr. En yksek resveratrol

    deriimi ise 14.5 mg/l ile Loire blgesinden salanan organik krmz araplardan elde

    edilmitir.

    20

  • Bitki fizyolojisi kavramlar ierisinde ozon, bitkiler iin hava kirlilik etmenlerinden biri,

    dolaysyla bir stres faktr olarak tanmlanmaktadr. Ancak son yllarda ozonun, bitki

    patojenlerine kar gelitirilen savunma mekanizmalarnda; etilen, salisilik asit gibi

    nemli sinyal molekllerini uyard, oksidatif dayanm mekanizmalar ile ilgili

    biyosentez yollarnn balamasnda uyarc olduu ve PR genleri zerinde etkili olduu

    bildirilmektedir (Kangasjrvi et al. 1994, Sandermann et al. 1998).

    Ozonun yukarda belirtilen etkilerini ayrntl olarak bildiren ve asmalarda stilben

    fitoaleksinleri zerinde etkisi olmas gerektiini vurgulayan Sarig et al. (1996), ozon

    etkisinden yararlanmak iin pratik adan en uygun dnem olarak hasat sonras

    depolama aamasnda uygulama yaplmasn tercih etmilerdir. Aratrclar, Perlette,

    Thompson Seedless, Zeiny ve Barlinka olmak zere drt sofralk zm eidinde

    depolama srasnda zel koullarda ozon uygulamlardr. Tm eitlerde nemli

    rklk etmenlerinden biri olan Rhizopus stoloniferin bulama durumu ile stilben

    bileiklerinden resveratrol ve pterostilben retimini incelemilerdir. Sonuta, ozonun

    rklk etmeninin geliimine kar baaryla kullanlabileceini ve buna paralel olarak

    eitlerde her iki stilben bileii ynnden baarl bir retimin elde edildiini

    gstermilerdir.

    Napolyon zm eidinin 8 ppm dozunda ozon uygulamas ile depoland koullar,

    kontroll atmosfer ve sekiz farkl depolama koulu ile karlatrlm, kalite kriterleri

    kapsamnda, resveratrol ve piceid ieriindeki deiimler de incelenmitir. zmler

    hasat edilip depoya alnrken llen piceid ve resveratrol deriimlerinin, depolama

    sresi ve market koullarn simle eden sreler sonundaki deiimleri belirlenmitir.

    Ozon uygulamasnda, piceid deiiminin ok az buna karlk, resveratroln balang

    miktarndan 3-4 kat daha yksek olduu saptanmtr. Ayrca ozon uygulamas ile

    kontroll atmosfer koullarnda yaplan muhafaza karlatrldnda; ozon

    uygulamasnn resveratrol deriiminde 2 kat art meydana getirmesi ile yine ne kan

    depolama koulu olduu ifade edilmitir (Arts-Hernandez et al. 2003).

    21

  • Bitkilerde patojenlere kar yerel veya sistemik doal savunma mekanizmalarnn

    harekete geirilmesinde, baz isel organik maddeler sinyal molekl olarak grev

    yapmaktadr. Bu maddelerin banda salisilik asit (SA), etilen ve jasmonik asit (JA)

    gelmektedir. Jasmonik asitin, kereviz yapraklarna gaz halinde uygulanmas sonucunda

    furanokumarin fitoaleksininin biyosentezini artrmas sonucundan yola kan Larronde

    et al. (2003), metil jasmonat (MeJa) uygulamasnn stilben birikimi zerindeki etkisini

    belirlemek amacyla, Cabernet Sauvignon eidinin saks asmalarna, kontroll sera

    koullarnda gaz formunda MeJa uygulamlardr. Yapraklarda piceid formunda stilben

    birikimi meydana gelirken, tanelerde uygulama zamanna bal olmak koulu ile

    resveratrol birikimi uyarlmtr. Aratrclar elde ettikleri bulgulara gre MeJan

    asmalarn savunma mekanizmasnn kurulmasnda gaz formunda mesaj molekl olarak

    altn vurgulamlardr.

    sel bitki hormonlarna fonksiyonel olarak benzerlik gsteren ve doal savunma

    mekanizmas ile ilgili bir dier bileik Benzotiadizol (BTH)dr. Dardan BTH,

    uygulamalarnda stilben sentezi ynnde ilgin sonular elde edilmitir. Iriti et al.

    (2004), Merlot zm eidine ait tanelere, 0.3 mM BHT uygulamas yaptklar

    almada, resveratrol deriimini kontrolde 0.390 mg/kg olarak belirlerken, uygulama

    yaplm tanelerde 0.546 mg/kg olarak belirlemilerdir. Aratrclar sonu olarak

    BHTnin resveratrol sentezini kontrole gre %40 orannda artrdn vurgulamlardr.

    Buna karn Bavaresco and Vezzulli (2006)ya gre ise BHT, asma yapraklarnda

    stilben sentezini uyarmamaktadr.

    Bitkilerde stres metabolizmasnn nemli rnlerinden bir dieri de Absizik asit

    (ABA)dir. Bu zellii nedeniyle dardan ABA uygulamalarnn etkisinin aratrlmas

    da ilgi ekici olmutur. Kyoho zm eidinin tanelerinde ABA uygulamasnn kontrol

    grubuna gre resveratrol deriimini 1.2 kat artrd belirlenmitir (Ban et al. 2000).

    22

  • 2.3.3 Yetitiricilik faktrleri

    Baclk kltr kavram kapsamndaki eitli yetitiricilik uygulamalar genellikle birer

    stres faktr olarak asmalar etkilemektedir. Bu nedenle, yetitiricilik uygulamalarnn

    fitoaleksin retimine katkda bulunma dzeyi ve etki mekanizmasnn belirlenmesi,

    rnn nitelii ve kalitesi zerindeki etkileri nedeniyle nem tamaktadr. Yetitiricilik

    faktrlerinin bamsz etkilerinin belirlenebilmesine uygun aratrmalarn planlanmas

    olduka deer tamakla birlikte, ba koullarnda bamsz sonulara ulamak mmkn

    olmamaktadr. Ancak, yetitiricilik koullarnn etkilerinin nemi dikkate alnarak nc

    nitelikte almalar gerekletirilmektedir.

    Ana etkisi

    Bu blm, Resveratrol Moleklnn zellikleri ve Asmalardaki Fizyolojik Rol

    bal altnda incelenmi olduu gibi tr ve eitler anlamnda asma genotiplerinin

    fitoaleksin retim kapasitesi farkllk gstermektedir. Baclk anlamnda ise al bir

    bitkide, analarn fitoaleksin retimi zerinde nemli etkilerinin olduu, resveratrol ve

    dier stilbenik bileiklerin retiminin, su ve mineral madde almyla etkilenebilecei

    bildirilmise de (Bavaresco and Vezzuli 2006), henz ana etkisi konusunda bamsz

    aratrma verilerinin sunulduu kaynaklara ulamak mmkn olmamtr.

    klim

    klim farkl bileenleri ile bitkiler iin en nemli stres faktrlerinden biridir. Bu nedenle,

    stilben sentezi zerinde de nemli etkilerinin olmas beklenmektedir.

    klimin bir esi olarak, ba alanlarnn corafik konumu ile eitlerin resveratrol

    retimini ilikilendirmi olan aratrma sonular bulunmaktadr. Lamuella-Ravents

    and Waterhouse (1993), Kaliforniyann kuzeyinde ve gneyinde yetitirilen

    zmlerden elde edilen araplarn resveratrol ieriklerini incelemiler ve serin

    23

  • ekolojilerde (kuzey) yetitirilen zmlerden elde edilen araplarn, iyi gnelenen gney

    ekolojilerde yetitirilen zmlerden elde edilen araplara gre daha yksek resveratrol

    deriimine sahip olduunu belirtmilerdir.

    Avrupada bacln en kuzey snrlarndan biri olarak gsterilen Bohemya ve Moravya

    blgelerinde yetitirilen zmlerin; yaprak, tane kabuu ve araplarnda resveratrol

    ieriinin olduka yksek olduu bildirilmitir. Resveratrol dzeyindeki artn,

    blgedeki dk scakla bal olarak fungal hastalk etmenleri riskinin yksek olmas

    ve bu alanlarda hava kirlilik etmenlerinin youn olmas sonucu meydana gelen stres

    etkisinden kaynakland ileri srlmtr (Melzoch et al. 2001).

    Anl et al. (2006), arap reticilerinin eit ve eidin elde edildii blgeyi belirttikleri

    13 zm eidine ait 39 kalite krmz arapta resveratrol ve dier fenolik bileiklerin

    deriimini incelemilerdir. Elde edilen bulgulara gre en yksek resveratrol deriimi,

    Gneydou Anadolu blgesi eitleri olan kzgz-Boazkere paalnda

    belirlenmitir (2.258 mg/l). En dk resverarol deriimi ise 0.421 mg/l ile Ada karas

    zm eidinin arabndan elde edilmitir.

    Resveratrol retimi zerinde kuraklk etkisi hl zerinde allan bir konudur.

    Avrupada pek ok kurak alan baclk ile deerlendirilmeye allmakta, ayrca ba

    alanlarnda sulama nerilmemektedir. Martinez-Ortega et al. (2000), spanyann

    gneyinde 1986 ile 1993 yllar arasnda retilmi, 14 krmz, 11 beyaz ve 28 sherry

    tipi ticari arapta yaptklar almada; kurak geen ylda krmz araplardaki toplam

    resveratrol miktarn 0.038 mg/l, normal iklim koullarnda ise 1.164 mg/l olarak

    gzlemilerdir. Bavaresco and Vezzulli (2006) yksek scaklklarn, dk scaklklara

    gre resveratrol deriiminde azalmaya neden olduunu vurgulamlardr.

    Yllk ya ve hasattan nceki nem miktar da stilben sentezi zerine etkili bir faktr

    olarak deerlendirilmitir. Ya ile balardaki fungal hastalklar yakn ilikilidir

    (Jeandet et al. 1995b). Tanelerdeki resveratrol sentezini balatmak iin plak gzle

    24

  • belirlenemeyecek kadar dk fungus etkisi yeterlidir. Bu durumun oluabilmesi iin de

    dk ya da orta dzeyde nem gereklidir.

    Toprak

    Resveratrol retimi zerine; bitkinin besin maddesi ihtiyac gz nne alndnda

    topran etkili olmas beklense de, bu etkileri aklamaya ynelik almalar da olduka

    snrldr.

    Gbreleme

    Balarn gbrelenmesinde azot, ana besin maddelerinden ve bitki fizyolojisini

    dzenleyen minerallerden birisidir. Graham (1983)a gre azotun snrl olduu

    koullarda, ikimate sentez yolu deierek stilben sentezini de ieren polifenol ve

    alkoloid sentezi artmaktadr.

    Bavaresco et al. (2001), 420 A anac zerine al Cabernet Sauvignon Klon R5 zm

    eidine ait bitkilerde dk ve yksek azot uygulamalarnn tanede resveratrol

    retimine etkisini aratrmlardr. Elde edilen bulgulara gre hi azot uygulanmayan

    bitkilerin tanelerinde llen resveratrol deriimi; 0.4 mg/kg iken, 4 g azot

    uygulananlarda bu deriim 0.2 mg/ga gerilemitir. 8 g ve 16 g azot uygulanan bitkilerin

    tanelerinde ise resveratrol belirlenememitir.

    Topraktaki kirecin stilben dzeyini etkilediini vurgulayan Bavaresco et al. (2005),

    kirece hassas bir ana olan 3309 C zerine al Merlot zm eidine ait klonlar kireli

    ve kiresiz topraklarda yetitirmilerdir. Elde edilen bulgulara gre zm eitlerinde

    tanede stilben birikiminin uyarldn belirtmilerdir. Kiresiz topraklarda yetitirilen

    zmlerin tanelerinde resveratrol deriimi 0.039 g/g YA olarak belirlenirken, kireli

    topraklarda bu deer yaklak % 635lik bir artla 0.25 g/g YA olarak belirlenmitir.

    25

  • Resveratrol deriimi zerine tropik bitkilerin z suyundan elde edilen ticari bir sv

    gbre olan Trimin de etkisi incelenmitir. Enzimler, mineral maddeler ve vitaminler

    bakmndan zengin bir bileik olan Trim, Barbera eidinin yapraklarnda trans-

    resveratrol birikimini uyarmtr (Bavaresco and Vezzulli 2006).

    Budama ve terbiye ekli

    Budama iddeti ve asmalarn resveratrol dzeyi incelendiinde, asmalarda k

    budamasnn resveratrol deriimini etkilemedii sonucuna ulalmtr (Bavavesco and

    Vezzulli 2006).

    Terbiye sistemleri, yapraklarn ve salkmlarn mikroklimasn deitirmektedir. Bu

    nedenle resveratrol dzeyini etkileme olasl daha yksektir. Threlfall and Morris

    (1996) ile Bertamini and Mattivi (1999)nin bulgular bu genel yaklam destekler

    nitelikte olup, telli terbiye sistemlerinin, Cynthiana (V. aestivalis) ve Cabernet

    Sauvignon araplarnda resveratrol seviyesini olumlu etkiledii belirlenmitir.

    Glgeleme

    Salkm glgeleme Kyoho eidinde resveratrol deriimini etkilememitir (Ban et al.

    2000). Salkmlarn ksa sreli gne na maruz braklmas, scak yllarda resveratrol

    sentezi iin tercih edilirken, bu uygulamann serin yllarda ters tepki verdii

    belirlenmitir (Bertamini and Mattivi 1999).

    Yaralama

    Olgun tanelerin yaralanmas ile tanelerde stilben retiminin artt belirlenmitir. Buna

    gre mekanik hasat srasnda tanelerin yaralanmasnn bir abiyotik elisitr davran

    gsterebilecei dnlmektedir (Bavaresco et al. 1997b). Srdi et al. (2000), gen ve

    26

  • olgun asma yapraklarnda yaralamann, yaralama yaplmam kontrol yapraklarna gre

    resveratrol dzeyinde nemli bir arta neden olmadn belirtmilerdir.

    2.4 Asmalarda in vitro Koullarda Resveratrol retme almalar

    Aseptik koullarda, yapay bir besin ortamnda, btn bir bitki, hcre, doku veya organ

    gibi bitki ksmlarndan yeni bir bitkinin retilmesi olarak tanmlanan bitki doku

    kltrleri (Babaolu vd. 2001), ikincil rnlerin elde edilmesinde de baaryla

    kullanlmaktadr (Knorr et al. 1993). Bu amala en yaygn kullanlan doku kltr

    yntemleri, kallus kltrleri ve bunlardan elde edilen hcre sspansiyon kltrleridir.

    Geleneksel yntemlerle ayn kalitede ve srekli retilemeyen ikincil rnler, in vitro

    yntemler kullanlarak; ayn kalitede ve yksek saflkta srekli olarak elde

    edilebilmektedir (Ramachandra and Ravishankar 2002). Ayrca ikincil rnlerin

    biyosentez mekanizmalarnn belirlenmesinde in vitro yntemler iyi bir model sistem

    oluturmaktadr.

    Asmada in vitro koullarda resveratrol retimine ynelik almalar (Keller et al. 2000,

    Commun et al. 2003, Tassoni et al. 2005, Bru et al. 2006, Zamboni et al. 2006) snrl

    sayda olup, bu almalarda, en yksek resveratrol deriimini salayacak etkili elisitr

    belirlemenin yan sra, stilben biyosentezi ve metabolizmasn dzenleyen ve artmasn

    salayan faktrler de belirlenmeye allmtr.

    Keller et al. (2000), Cabernet Sauvignon zm eidine ait kallus kltrlerinde, elisitr

    olarak UV n uygulamasnn resveratrol deriimine etkisini incelemilerdir. Elde

    edilen sonulara gre UV n uygulanmam kalluslarda, resveratrol iz miktarda

    belirlenirken, UV n uygulamasndan 24 saat sonra kalluslarda resveratrol retimi

    hzla artmaya balam (2.5 g/g YA) ve bu art 40. saate kadar devam etmitir (20 g/g YA). 72. saat sonunda ise resveratrol retimi belirgin bir ekilde azalma

    gstermitir (12 g/g YA).

    27

  • Commun et al. (2003), V. vinifera eitlerinden Chardonnay, Pinot noir ve Seyval ile

    trler aras bir melez olan 41 B anacna ait protoplast kltrlerinde resveratrol retimi

    zerine almlardr. Aratrclar, bu amala genotiplere ait bitkileri in vitro

    koullarda yetitirmiler ve elde edilen bitkilerin yapraklarn eksplant olarak

    kullanmlardr. almada yer alan genotiplere ait protoplast kltrlerinde, resveratrol

    ilk 24 saat ierisinde atmaya balam ve en yksek resveratrol deriimi 2-7. gnde

    llmtr (12 g 1x106 protoplast). Kltrn birinci haftasndan itibaren, resveratrol birikimi azalmaya balam ve 15. gnde en yksek resveratrol deriiminin %50si

    kadar bir azalma ile sonulanmtr ( 6 g 1x106 protoplast) .

    Tassoni et al. (2005), Barbera zm eidine ait hcre sspansiyon kltrlerinde,

    resveratrol retimini salamak ve artrmak amacyla, JA (10 M), MeJa (10 M) ile Na-ortovanedat (0.1-1 mM) elisitrlerinin etkilerini incelemilerdir. Elde edilen

    sonulara gre Na-ortovanedatn her iki deriimi de trans-resveratrol retimini

    etkilemezken, MeJan olduka etkili bir elisitr olduu belirlenmitir. JAin ise

    MeJatan daha az uyarc etkisinin olduu gzlenmitir.

    Bru et al. (2006), Gamay rouge, Monastrell albine ve Monastrell gren eitlerine ait

    hcre sspansiyon kltrlerinde deiik siklodekstrin (CD) uygulamalarnn (slfo-

    CD, sikloheptamiloz (CD), 2-hidroksipropil-CD (HYPROB), Dimetil--siklodekstrin (DIMEB), maltosi-CD (G2-CD)) resveratrol retimi zerine etkilerini incelemilerdir. Uygulama yaplmam kontrol grubunda resveratrol retimi

    belirlenememitir. En etkili elisitr DIMEB olarak belirlenirken, slfo-CDnin ise resveratrol retimini uyarmad gzlenmitir. En yksek resveratrol deriimi

    Monastrell albine eidinde 14.8 mM olarak belirlenmitir.

    Zamboni et al. (2006), V. vinifera eitlerinden Pinot noir ve Merzling ile V. amurensis

    ve V. riparia x V. berlandieri melezine ait hcre sspansiyon kltrlerinde, resveratrol

    retimine DIMEBin etkisini incelemilerdir. Resveratrol retimi kallus dokusu faznda

    ve sznt faznda ayr ayr belirlenmitir. Uygulama yaplmayan kontrol gruplarnda

    Pinot noir kltrleri hari, bir miktar resveratrol retimi gzlenmitir. En yksek

    28

  • resveratrol deriimi, DIMEB uygulamasndan 48 saat sonra; V. riparia x V. berlandieri

    melezine ait sspansiyon kltrlerinin sznt (911.25 g/g) ve doku faznda (622.90

    g/g) elde edilmitir. En dk resveratrol retimi ise Merzling eidine ait kallus

    dokularnda gzlenmitir (3.91 g/g).

    2.5 Resveratroln Biyolojik Etkileri Resveratrol, ilk olarak 1930lu yllarn balarnda tbbi bir bitki olan Veratrum

    grandifolium Loes. fil.de tanmlanm ve salk zerine etkileri, zellikle in ve Japon

    bilim adamlar bata olmak zere, birok bilim adam tarafndan uzun yllar

    aratrlmtr (Creasy and Creasy 1998). Polygonum cuspidatum bitkisinin kklerinden

    ztlenen resveratrol, Japonya ve inde halk tarafndan kojo-kon adyla bilinen

    geleneksel bir ila olarak; hipertansiyon, damar tkankl, cilt iltihab, alerji gibi birok

    hastaln tedavisinde kullanlmaktadr. Arichi et al. (1982) ve Kimura et al. (1983)

    fareler zerinde yaptklar almalarda, bu ilacn karacierde ya birikimini nlediini

    ve kan-serum kimyasn dzenlediini belirlemilerdir.

    Siemann and Creasy (1992)nin araplarda resveratrol tanmlamalaryla birlikte,

    resveratroln salk zerine etkisi ile ilgili almalar da hz kazanmtr. Bu almann

    ardndan, Renaud and de Lorgeril (1992)in koroner kalp hastalklar ve Fransz

    Paradoksu zerine yaptklar alma dikkat ekicidir. Yksek oranda doymu ya

    tketimi ile koroner kalp hastalklarndan lm oran arasnda pozitif bir iliki

    olmasndan yola kan aratrclar, Fransada koroner kalp hastalklarndan lm

    orannn dk olmasn lml arap tketimine (Fransz Paradoksu) dayandrmlardr.

    Jang et al. (1997)a gre gnlk 375 ml krmz arap tketimi, araidonik asit

    metabolizmasn dzenlemektedir. Dier yandan, Moriarty et al. (2001), Siyah Korint

    zm eidine ait 50 adet tane tketiminin, resveratrol ieren bir kadeh arap ile ayn

    dzeyde etkili olacan vurgulamlardr.

    29

  • Resveratrol sya dayankl olmas nedeniyle, bir ok yiyecek eidinde aktif formunu

    (trans-resveratrol) koruyabilmekte, az yoluyla alndktan hemen sonra sindirilmekte

    ve hzla kana karmaktadr (Kuhnle et al. 2000, Bavaresco and Vezzulli 2006).

    Resveratroln; antioksidan, antitmr ve antimutagen zellikleri nedeniyle insan sal

    iin doal bir kimyasal koruyucu olduu belirtilmitir (Jang et al. 1997, Srdi et al.

    2000, Moriarty et al. 2001). Resveratroln salk zerine olumlu etkileri aada

    maddeler halinde verilmitir.

    1. Koroner kalp hastalklar riskini azaltmaktadr (Frankel et al. 1993, Kopp 1998,

    Cui et al. 2002).

    2. Kanser balangcn geciktirmekte, geliimini yavalatmakta veya

    engellemektedir (Falchetti et al. 2001).

    3. Serbest radikal oluumunu engellemektedir (Kanner et al. 1994).

    4. Trombosit toplanmasn engellemektedir (Kimura et al. 1985, Melzoch et al.

    2001).

    5. Dk younluklu lipoproteinlerin (LDL) oksidasyonunu nlemektedir (Frankel

    et al. 1993, Belguendouz et al. 1998).

    6. Triailgliserol dzeyini drmekte ve karacieri lipit peroksidasyonundan

    korumaktadr (Blond et al. 1995, Kuhnle et al. 2000).

    7. C vitaminine gre 20-50 kat daha fazla etkili bir antioksidan olduu iin immun

    sistemi glendirmektedir (Celotti et al. 1996).

    8. ltihaplanmay engelemeye yardmc olmaktadr (Jang et al. 1997).

    9. Anti alerjiktir (Cheong et al. 1999).

    10. Siklooksigenaz ve hidroperoksidaz fonksiyonlarn engellemektedir (Jang and

    Pezzuto 1997).

    Bunlarn yan sra; son yllarda resveratrolun Alzheimer hastal zerine etkisini

    belirlemeye ynelik aratrmalar da yaplmaktadr (Falchetti et al.2001).

    30

  • Gnmzde, resveratrol kapsl haline getirilerek ticari nem kazantr. Kanadada

    Pharmascience irketi tarafndan retilen Resverin ile Amerika Birleik

    Devletlerinde InterHealth adl irket tarafndan piyasaya srlm olan Protykin

    trans-resveratrol, ieren rnler arasnda nem kazanmtr (Haneke 2002).

    31

  • 3. MATERYAL VE YNTEM

    Bu alma, Ankara niversitesi Ziraat Fakltesi Bahe Bitkileri Blmnde 2003-

    2007 yllar arasnda yrtlmtr. Tez almasnn Kalecik karasna ait kk bir

    blm, Ankara niversitesi Biyoteknoloji Enstits tarafndan desteklenen Asmada

    in vivo ve in vitro Koullarda Resveratrol retim Veriminin Abiyotik Uyarclar ile

    Artrlmas konulu projenin bir alt blmn oluturmaktadr.

    almalar temel olarak; Ankara niversitesi, Ziraat Fakltesi, Bahe Bitkileri Blm,

    Biyoteknoloji I Laboratuvar ve seras, Biyoteknoloji Enstits Laboratuvarlar ile Bilim

    nsan Yetitirme Projesinden (BYEP) salanan destek ile Cattolica Del Sacro Coure

    niversitesi (Universita Cattolica Del Sacro Coure Piacenza-talya) olanaklarndan

    yararlanlarak gerekletirilmitir.

    Tez almasnda kullanlan materyaller ve izlenilen yntemlere ilikin bilgiler aada

    verilmitir.

    3.1 Materyal

    almada, krmz tane rengine sahip Kalecik karas (Klon 12), kzgz, Erci ve

    Cabernet Sauvignon zm eitleri zerinde allmtr. Kalecik karas ve kzgz,

    lkemizin nde gelen krmz araplk zm eitlerindendir (elik 2006). Erci, Van ili

    ve evresine zg krmz bir eit olup; salkm ve tane morfolojisi dikkate alndnda

    araplk-ralk deerlendirilmeye daha uygun olmakla birlikte, yrede sofralk veya

    geleneksel amalar iin de kullanlmaktadr (Uyak 2002). Yabanc krmz araplk bir

    zm eidi olan Cabernet Sauvignon ise tm dnyada yksek kaliteli araplk eitlerin

    banda gelmesi ile tannmaktadr (elik 2006).

    32

  • ekil 3.1de, zerinde allan zm eitlerinin olgun salkmlarnn grn, izelge

    3.1de ise baz zellikleri sunulmutur.

    Kalecik karas kzgz

    Cabernet Sauvignon Erci

    ekil 3.1 zm eitlerine ait olgun salkmlarn grn Kaynak: Kalecik karas, kzgz ve Cabernet Sauvignon zm eitlerine ait fotoraflar, Prof. Dr. Hasan elikten alnmtr.

    33

  • izelge 3.1 zm eitlerine ait baz zellikler*

    eitler zellikler

    Kalecik karas kzgz Erci C. Sauvignon

    iek tipi Erdii Erdii Erdii Erdii

    Tane rengi Mavi puslu siyah Gri puslu siyah Mavimsi siyah Mavi-gri puslu siyah

    Tane irilii Orta, 2-2.5 g ri, 6 g Kk-orta, 2 g Kk, 1.5 g

    Salkm ekli Kanatl konik Kanatl konik Dall konik Konik-silindirik

    Salkm irilii Kk-orta, 200 g ok iri, 450-550 g Orta, 250 g Orta, 230 g

    Olgunlama Orta mevsim Ge Orta mevsim Ge

    Kalite

    zellii

    Meneke-yakut renkli,

    eide zg aromal,

    dolgun ve dengeli

    arab ile lkemizin en

    tannm krmz

    araplk eitlerinden

    birisidir.

    lkemizin en

    kaliteli krmz

    araplk

    eitlerinden

    birisidir.

    araplk-ralk

    bir eit olmakla

    birlikte, eide

    zg aromas

    nedeniyle sofralk

    olarak da

    tketilmektedir.

    Koyu renkli, yksek

    tanenli, meneke

    bukeli,

    yalandrmaya

    uygun yksek

    kaliteli araplk bir

    eittir.

    * Uyak (2002) ve elik (2006)den yararlanlarak hazrlanmtr

    3.2 Yntem

    3.2.1 Kallus kltr almalar

    3.2.1.1 Eksplantlarn eldesi

    Kallus kltr almalarnda, yapraklar ve boum aralar eksplant olarak kullanlmtr. Eksplantlarn elde edilmesi iin zm eitlerinden, k dinlenme dneminde alnan ve +4 Cdeki souk hava deposunda, polietilen torbalar ierisinde muhafaza edilen kalemlik eliklerden hazrlanan iki gzl elikler kullanlmtr. Hazrlanan elikler serada 1:1:1 orannda kum, perlit ve torf ieren polietilen torbalara dikilmitir. Eksplant olarak kullanlacak yapraklar ve boum aralar srgnlerin orta blmnden alnmtr.

    34

  • 3.2.1.2 Eksplantlarn sterilizasyonu

    Yaprak ve boum aralar nce eme suyunda, daha sonra saf suda ykanm, %0.01lik Tween 20 eklenmi, % 20lik sodyum hipoklorit zeltisinde 15 dakika bekletildikten sonra, steril saf su ile 5er dakika 3 kez alkalanarak durulanm ve dikime hazr hale getirilmitir.

    3.2.1.3 Kallus kltrlerinin kurulmas

    Kallus kltrlerinde besin ortam olarak, Gamborg B-5 kat temel besin ortam (Sigma

    G5893) kullanlmtr (Gamborg et al. 1968). Saf su ierisine litreye 3.2 g hazr besin

    ortam katlmasyla hazrlanan besin ortamnn pH deeri 5.7ye ayarlanmtr.

    Bymeyi dzenleyici madde olarak, kallus geliimini artrc 1.0 M BAP (6-

    benzilaminoprin) ve 0.1 M 2,4-D (2,4-diklorofenoksi-asetik asit) eklenmitir (Keller

    et al. 2000). Daha sonra sakkaroz (%2) ve agar (% 0.8 ) ilave edilmi besin ortam,

    otoklavda 121 Cde 20 dakika sreyle sterilizasyon ilemine tabi tutulmutur (Hatipolu 1997).

    Yaprak ve boum aralarna ait paralar, ierisinde 30 ml ortam bulunan 100x200

    mmlik petri kaplarna dikilmitir. Her eit iin 15 petri ve her petri ierisinde 11

    yaprak veya boum arasna ait eksplant bulunacak ekilde dikim yaplmtr (ekil 3.2).

    Daha fazla yara alan oluturmak amacyla, boum aralar ortadan ikiye kesilerek

    dikilmilerdir. ki farkl eksplant kaynan, kallus kalitesi bakmndan test etmek iin

    yaplan bu n alma sonucunda, yaprak eksplantlarndan daha nitelikli kalluslarn

    (beyaz renkli ve gevrek yapl) elde edildii belirlenmitir (ekil 3.3). Bu nedenle,

    almann devamnda eksplant kayna olarak yapraklarn kullanlmasna karar

    verilmitir. Karanlkta ve 25 Cde inkbe edilen kalluslar , 21 gn ara ile iki defa alt kltre alnmtr. kinci alt kltrden sonra kalluslar, taze ortamlara aktarlmtr. Bu

    ortamlarda 12 ve 15 gn olmak zere iki farkl aamaya gelinceye kadar gelitirilmitir.

    Bu aamalar almada kallus ya olarak nitelendirilmitir.

    35

  • B A

    ekil 3.2 Kallus kltrleri iin kullanlan eksplantlar (A: yaprak, B: boum aras)

    ekil 3.3 Yaprak eksplantlarndan elde edilen kalluslar

    36

  • 3.2.2 Elisitr (Uyarc) uygulanmas

    almada, elisitr olarak ksa dalga boylu UV nn etkisi incelenmitir. UV n

    kayna olarak, Vilber-Lourmat T-15C UV-C lamba kullanlm ve Ortadou Teknik

    niversitesi, Fen Edebiyat Fakltesi, Fizik Blmnde test ettirilerek, dalga boyunun

    254 nm olduu belirlenmitir. Lambann almada kullanlabilmesi iin uygun bir

    dzenek kurulmutur (ekil 3.4).

    almada UV 10 (Bais et al. 2000, Keller et al. 2000, Moriarty et al. 2001,

    Commun et al. 2003) ve 15 dakika (Langcake and Pryce 1977, Jeandet et al. 1991,

    Jeandet et al. 1995a, Douillet-Breuil et al.1999, Adrian et al. 2000) olmak zere iki

    farkl sre ile uygulanmtr. Bu amala, 12 ve 15 gn yal kltrlere, steril kabin

    ierisinde petri kutularnn kapaklarnn almas ile uygulama gerekletirilmitir (ekil

    3.5).

    ekil 3.4 UV lambasnn kurulduu dzenek

    37

  • ekil 3.5 Kalluslara UV nnn uygulanmas

    UV kaynana en uygun mesafenin 10 cm olduu bildirildiinden (Bais et al. 2000 ve

    Keller et al. 2000 ) bu uzaklk deeri esas alnmtr.

    Uygulama yaplan kallus kltrleri, 25 Cde, karanlk koullarda 24, 48 ve 72 saat olmak zere farkl srede inkbe edilmitir. nkbasyon sresi olarak farkl

    zamann incelenmesi Douillet-Breuil et al. (1999)a dayanlarak planlanmtr.

    nkbasyon sonunda kalluslar 1g olacak ekilde tartlm, alminyum folyolara sarlm

    ve analize kadar korumak amacyla 80 oCde saklanmaya alnmtr.

    Herhangi bir uygulama yaplmayan Kontol kalluslar, ikinci alt kltrden sonra taze

    ortama aktarlan 12 ve 15 gn yal kalluslardan 1 g rnek ierecek ekilde alnm ve

    alminyum folyo ierisinde 80 oCde analiz zamanna kadar korunmutur.

    38

  • 3.2.3 Yksek basnl sv kromotografisi (HPLC) almalar

    3.2.3.1 Kallus dokularndan resveratroln ztlenmesi

    Resveratrol ztlenmesi, Keller et al. (2000) tarafndan belirtilen ynteme gre

    gerekletirilmitir. Resveratrol ztlenmesi aamalar, ak emas halinde ekil 3.6da

    verilmitir.

    ztler, analiz edilinceye kadar kahverengi rnek ielerinde -20 Cde muhafaza edilmitir. ztlerin scakl oda scaklna ulatktan sonra, gzenek ap 0.45m

    olan mikrofiltrelerden (millipore) renkli ielere szlm ve HPLC kolonuna 5 l

    enjekte edilmitir.

    3.2.3.2 Stok solsyonlarn hazrlanmas ve kalibrasyon

    HPLCde resveratrol okumalarnn yaplabilmesi iin ncelikle standart maddeden stok

    solsyonlar elde edilmitir. Bunun iin saf madde halindeki trans-resveratrol (Sigma -

    R5010 ) standardndan 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10, 20, 30, 40 ppmlik seri zeltiler metanol

    ile hazrlanmtr. Seri zeltilerde yaplan resveratrol okumalar ile standart kalibrasyon

    erisi izilmitir (ekil 3.7). Resveratrol okumalarnn yapld HPLC aleti ve

    kullanlan programa ilikin ayrntl bilgiler Blm 3.2.3.3de verilmitir.

    39

  • Kallusun homojenize edilmesi 1 g donmu kallus dokusu/10 ml souk aseton

    alkalaycda bekletme 30 dakika

    Santrifj 10 dakika, 3000 devir/dakika

    keltinin alnmas

    ekil 3.6 Resveratrol ztlenmesinin aamalar

    Azot gaz ile buharlatrma 40 Cde su banyosu iinde

    Son hacmin tamamlanmas 2 mlye metanol ile

    Santrifj 10 dakika, 3000 devir/dakika

    keltinin zdrlmesi 5 ml aseton

    5 ml metanol

    40

  • y = 15980x - 3465R2 = 0,9994

    0

    100000

    200000

    300000

    400000

    500000

    600000

    700000

    0 10 20 30 40 50

    Resveratrol (ppm)

    Ala

    n

    ekil 3.7 Resveratrol standart ile izilen kalibrasyon erisi

    3.2.3.3 Resveratroln HPLC ile analizi

    Resveratroln HPLC ile analizinde SSI LabAlliance Esence HPLC Workstation marka

    HPLC cihaz, Jeandet et al. (1997)a uyumlu olacak ekilde Phenomenex/Luna guard

    kolon (5 m, 12.5 x 4.6 mm, ID), Phenomenex/Luna C18 kolon (5 m, 250 x 4.6 mm,

    ID) ve UV-VIS dedektr sistemi ile birlikte kullanlmtr. Trans-resveratrol lmleri

    iin 330, 374 ve 380 nm olmak zere dalga boyunda tarama yaplm ve 330 nm

    dalga boyunda deerler elde edilmitir.

    Hareketli (mobil) faz olarak asetonitril (HPLC saflnda, Merk) ve su kullanlmtr.

    lmlerde izlenen HPLC program aada verilmitir.

    41

  • HPLC program:

    zcler Zaman

    (dakika) % A

    Asetonitril

    % B

    Su

    Basn

    (bar)

    0.00 10.00 90.00 200

    18.00 85.00 15.00 200

    23.00 85.00 15.00 200

    30.00 10.00 90.00 200

    35.00 10.00 90.00 200

    zcler HPLC cihazna yerletirilmeden nce, 0.45 mlik gzenek apl membran

    filtreden szlm ve havas alnmtr. Hareketli faz ak hz 1.0 ml/dakika olacak

    ekilde ayarlanmtr.

    3.2.3.4 Bileik tans ve hesaplama

    Kromatogram zerindeki pikler, tutunma sresine (retention time) gre belirlenmitir.

    Uygulanan analiz koullarnda, trans-resveratrol iin tutunma sresi 12.5 dakika

    olmutur. Kallus rneklerinde trans-resveratrol tayini ile ilgili bir HPLC kromatogram

    rnei ekil 3.8 de verilmitir. Kalibrasyon denkleminde deerler yerine konularak

    gerek trans-resveratrol deriim deeri belirlenmitir.

    42

  • ekil 3.8 HPLC kromatogram rnei

    43

  • 3.2.4 Sonularn istatistik deerlendirmesi Uygulamalar ve deneyler tekrarl olarak yaplmtr. eitlerde ve iki kallus yanda;

    (12 ve 15 gn yal) UV n uygulama sresi ile inkbasyon sresi faktrlerinin

    resveratrol deriimi zerine etkisi incelenmitir. Elde edilen lm deerleri,

    Faktriyel Dzende Tekrarlanan lml Varyans Analizi Yntemi ile

    deerlendirilmitir (Winer et al. 1991). Farkllklarn belirlenmesi amacyla, oklu

    karlatrma yntemlerinden Asgari nemli Fark (AF) Yntemi kullanlmtr.

    Farkllklar %1 nemlilik (anlamllk) dzeyinde (p

  • 4. BULGULAR 4.1 UV In Uygulama Sresi ve nkbasyon Sresinin Resveratrol Deriimine

    Etkisi

    almada, zerinde allan zm eitlerinde, 10 ve 15 dakika sre ile UV n

    uygulamalar ve farkl inkbasyon sresi sonunda elde edilen resveratrol uyarm, 12

    ve 15 gn yal kalluslarda ayr ayr olmak zere incelenmitir. Varyans analizi

    sonularna gre zm eitlerinin tmnde UV n uygulama sresi x inkbasyon

    sresi etkileimi istatistik olarak nemli bulunmutur (p

  • izelge 4.1 Kalecik karas zm eidinde, 12 gn yal kalluslarda, UV n uygulama ve inkbasyon srelerinin resveratrol deriimine (g/g YA) etkileri

    nkbasyon Sresi (saat) Uygulama Sresi

    (dakika) 24 48 72 Ortalama

    10 A 1.82

    * 0.02 b A 2.42* 0.04 a A 1.59* 0.02 c 1.94 0.15

    15 A 1.95

    * 0.06 b B 2.16* 0


Kallus - SorhocamErythrina ağacı. Yapraktan kallus oluşumu Vaskular dokudan kallus oluşumu Kökten kallus oluşumu ... •Bağımsız vasküler sistemi olan ve kök ile sürgün

Kallus - SorhocamErythrina ağacı. Yapraktan kallus oluşumu Vaskular dokudan kallus oluşumu Kökten kallus oluşumu ... •Bağımsız vasküler sistemi olan ve kök ile sürgün

Documents
Building a Solid Understanding of Mechanical Ventilation By Chris Kallus, RRT, MEd Nursing2009, June 2009 2.5 ANCC contact hours Online:

Building a Solid Understanding of Mechanical Ventilation By Chris Kallus, RRT, MEd Nursing2009, June 2009 2.5 ANCC contact hours Online:

Documents
Antonin Artaud - Tanrı Yargısının İşini Bitirmek İçin[CS]

Antonin Artaud - Tanrı Yargısının İşini Bitirmek İçin[CS]

Documents
31 Mart azərbaycanlıların soyqırımı günüdür! · biologiya, histologiya, əczaçılıq, genetika, tibbi statistika üzrə işini davam etdirən II Beynəlxalq Tİbb Konqresi

31 Mart azərbaycanlıların soyqırımı günüdür! · biologiya, histologiya, əczaçılıq, genetika, tibbi statistika üzrə işini davam etdirən II Beynəlxalq Tİbb Konqresi

Documents
Türkiye’de ilk defa KANSER DÜŞMANI “HURMACIZADE” …aroniamucizesi.com/tr.pdf · hücre kültürlerinde oldukça yararlı etkileri sap-tandı. Akdeniz Üniversitesi Tıp

Türkiye’de ilk defa KANSER DÜŞMANI “HURMACIZADE” …aroniamucizesi.com/tr.pdf · hücre kültürlerinde oldukça yararlı etkileri sap-tandı. Akdeniz Üniversitesi Tıp

Documents
Balanced Policy Evaluation and Learning · Balanced Policy Evaluation and Learning Nathan Kallus Cornell University and Cornell Tech kallus@cornell.edu Abstract We present a new approach

Balanced Policy Evaluation and Learning · Balanced Policy Evaluation and Learning Nathan Kallus Cornell University and Cornell Tech [email protected] Abstract We present a new approach

Documents
Malle Kallus, Anne Metsmaa, Heli Hinrikson ja Maie Jesjutina: Läti kogemus projektis "Sharing experiences on hospitality management courses and curriculum"

Malle Kallus, Anne Metsmaa, Heli Hinrikson ja Maie Jesjutina: Läti kogemus projektis "Sharing experiences on hospitality management courses and curriculum"

Education
Clinical Decision Unit (CDU) - Kallus

Clinical Decision Unit (CDU) - Kallus

Documents
Asmada (Vitis vinifera L.) in vitro I. Tip Kallus Eldesi Üzerine Çeşit

Asmada (Vitis vinifera L.) in vitro I. Tip Kallus Eldesi Üzerine Çeşit

Documents
SAİD NURSİ, FETHULLAH GÜLEN VE “LAİK” SEMPATİZANLARIahmetsaltik.net/arsiv/2017/02/SAID_NURSI_FETHULLAH_GULEN_VE_LAIK... · dininin, din sömürücülerinin işini zorlaştıran

SAİD NURSİ, FETHULLAH GÜLEN VE “LAİK” SEMPATİZANLARIahmetsaltik.net/arsiv/2017/02/SAID_NURSI_FETHULLAH_GULEN_VE_LAIK... · dininin, din sömürücülerinin işini zorlaştıran

Documents
kararlarbilgibankasi.anayasa.gov.tr · Web viewin işçisi olarak çalışırken 23.10.2002 tarihinde inşaatın 1. kat döşemesi üzerinde kırıcı ile beton traşlama işini yaparken

kararlarbilgibankasi.anayasa.gov.tr · Web viewin işçisi olarak çalışırken 23.10.2002 tarihinde inşaatın 1. kat döşemesi üzerinde kırıcı ile beton traşlama işini yaparken

Documents
A Psychophysiological Investigation of the State of Monotony amongst Air Traffic Controllers ICRAT 2004, Zilina Sonja Straussberger, Wolfgang Kallus &

A Psychophysiological Investigation of the State of Monotony amongst Air Traffic Controllers ICRAT 2004, Zilina Sonja Straussberger, Wolfgang Kallus &

Documents
Kendi işini kurma rehberi

Kendi işini kurma rehberi

Documents
Atomik X- IşInI Spektrometri

Atomik X- IşInI Spektrometri

Documents
T.C. TÜRKİYE İŞ KURUMU GENEL MÜDÜRLÜĞÜdosya.corpus.com.tr/mevzuat/11006079/94c221fc201343618b6... · 2015-11-04 · sunabilirler. Kendi işini kurma yönünde projeleri sadece

T.C. TÜRKİYE İŞ KURUMU GENEL MÜDÜRLÜĞÜdosya.corpus.com.tr/mevzuat/11006079/94c221fc201343618b6... · 2015-11-04 · sunabilirler. Kendi işini kurma yönünde projeleri sadece

Documents
Kallus sketchbook style

Kallus sketchbook style

Documents
ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ X-IŞINI SPEKTROSKOPİSİweb.hitit.edu.tr/dersnotlari/gokcemerey_13.10.2015_0Z7K.pdf · 2015. 10. 13. · X-IŞINI SPEKTROSKOPİSİ X-ışınıspektroskopisi,

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ X-IŞINI SPEKTROSKOPİSİweb.hitit.edu.tr/dersnotlari/gokcemerey_13.10.2015_0Z7K.pdf · 2015. 10. 13. · X-IŞINI SPEKTROSKOPİSİ X-ışınıspektroskopisi,

Documents
X IŞINI FLORESAN SPEKTROSKOPİSİ

X IŞINI FLORESAN SPEKTROSKOPİSİ

Documents
EMS Guide - Kallus

EMS Guide - Kallus

Documents
ProbeTec ET Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae 8 · 2017. 5. 15. · hücre kültürlerinde görülebilen karakteristik hücreiçi yapılar oluştururlar.4Chlamydia trachomatiskadınlarda

ProbeTec ET Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrhoeae 8 · 2017. 5. 15. · hücre kültürlerinde görülebilen karakteristik hücreiçi yapılar oluştururlar.4Chlamydia trachomatiskadınlarda

Documents
alasharaalashara.ru/books/137.pdfSayı: Mussa Ekzekov’un Çalışanlarla Buluşması – 3 s. Abhazya’da “Abaza” Şöleni Geçti – 4 s. Tatlustan Tabulov’un İşini Devam

alasharaalashara.ru/books/137.pdfSayı: Mussa Ekzekov’un Çalışanlarla Buluşması – 3 s. Abhazya’da “Abaza” Şöleni Geçti – 4 s. Tatlustan Tabulov’un İşini Devam

Documents
KENDİ İŞİNİ - gir.ticaret.edu.trgir.ticaret.edu.tr/kendi_isini_kurma rehberi.pdf · Üniversitemiz kısa sürede uluslararası bir üniversite olma yoluna girmi ve bu yolda hızla

KENDİ İŞİNİ - gir.ticaret.edu.trgir.ticaret.edu.tr/kendi_isini_kurma rehberi.pdf · Üniversitemiz kısa sürede uluslararası bir üniversite olma yoluna girmi ve bu yolda hızla

Documents
Kolodny & Kallus-2008-Haifa's History & Planning

Kolodny & Kallus-2008-Haifa's History & Planning

Documents
OLGU SUNUMLARI - tmc-online.orgtmc-online.org/images/37_kongre/nedret_koc.pdf · Hasta takibi ve sonuç Sonraki kan ve balgam kültürlerinde üreme olmadı. IgG düüklüğü olan

OLGU SUNUMLARI - tmc-online.orgtmc-online.org/images/37_kongre/nedret_koc.pdf · Hasta takibi ve sonuç Sonraki kan ve balgam kültürlerinde üreme olmadı. IgG düüklüğü olan

Documents
RIFATILGAZ Asım Bezirci - media.turuz.com · gemicilik yapmış, hem de okur yazar oldu için gemi katipli işini yürütmüştür. İstanbul'da, yüklenecek malların hesabını

RIFATILGAZ Asım Bezirci - media.turuz.com · gemicilik yapmış, hem de okur yazar oldu için gemi katipli işini yürütmüştür. İstanbul'da, yüklenecek malların hesabını

Documents
Çukurova Konar-Göçer Türkmenlerinin Halk Kültürlerinde Eski ...turkoloji.cu.edu.tr/HALKBILIM/artun_konar_gocer.pdfEski Türk İnançlarının İzleri” Prof. Dr. Erman ARTUN

Çukurova Konar-Göçer Türkmenlerinin Halk Kültürlerinde Eski ...turkoloji.cu.edu.tr/HALKBILIM/artun_konar_gocer.pdfEski Türk İnançlarının İzleri” Prof. Dr. Erman ARTUN

Documents
ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ …library.cu.edu.tr/tezler/8011.pdf · spİrulİna kÜltÜrlerİnde besİn elementlerİnİn farkli oranlarda kullaniminin

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ …library.cu.edu.tr/tezler/8011.pdf · spİrulİna kÜltÜrlerİnde besİn elementlerİnİn farkli oranlarda kullaniminin

Documents
Sorunlar ve Öneriler - Serdargunes' Blog...arttırmış, bu girişimler gazete yayıncılığı işini İstanbul’a taşıyarak büyüyen ve Hürriyet’le çetin bir rekabete girişen

Sorunlar ve Öneriler - Serdargunes' Blog...arttırmış, bu girişimler gazete yayıncılığı işini İstanbul’a taşıyarak büyüyen ve Hürriyet’le çetin bir rekabete girişen

Documents
Congestive Heart Failure - Kallus

Congestive Heart Failure - Kallus

Documents
İŞKUR TARAFINDAN DÜZENLENEN MESLEKİ EĞİTİM KURSLARI ...media.iskur.gov.tr/15667/esranur-irdem.pdf · Pasif politikalar, işini kaybedenlere ve işsizlere iş aradıkları dönemde

İŞKUR TARAFINDAN DÜZENLENEN MESLEKİ EĞİTİM KURSLARI ...media.iskur.gov.tr/15667/esranur-irdem.pdf · Pasif politikalar, işini kaybedenlere ve işsizlere iş aradıkları dönemde

Documents