1

1. ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROMETRİSİ (AAS) İLE BAKIR TAYİNİ

1.1 Teori ve temel prensip:

Bir elementin atom halinde buhar fazında kendine özgü belirli dalga boylarında ışıma

(elektromanyetik radyasyon) absorplamasına “Atomik Absorpsiyon” denir. Absorplanan ışımalar

genellikle ultraviyole ve görünür alan ışımalarıdır. Metal katyonları içeren bir çözelti, uygun

sıcaklıktaki ortama püskürtüldüğünde önce çözücü buharlaşır. Ardından alev bölgesindeki metal

tuzundan ilgilenilen elementin atomik buharı oluşur. Sıcak ortamda kararlı konumdaki bu atomlar

üzerine metale özgü karakteristik dalga boylarındaki bir ışıma gönderilirse ışımanın bir kısmı

absorplanır; ölçülen absorbans değeri, ortamdaki atomların miktarı ile orantılıdır. AAS tekniğinde

analizlenen element, uygun bir alevle (FAAS) ya da elektrotermal yoldan (ETAASGFAAS) atom

buharına dönüştürülür ve analizlenen elementi katodda içeren oyuk katod lambası (OKL) gibi

çizgisel bir ışıma kaynağından çıkan belirli dalga boylarındaki ışıma, atom buharı tarafından

absorplanır. Absorpsiyon sonrası bir monokromatörden geçirilen ışıma, intensitesi (şiddeti)

zayıflamış olarak dedektöre ulaşır. Böylece ölçülen absorbansdan madde derişimine geçilir.

1.2 Cihazın tanımı:

1) Tayin edilecek elementin keskin rezonans çizgisini yayınlayan kararlı bir ışıma kaynağı (Oyuk

Katod Lambası)

2) Örnek çözeltisinin sabit hızda emilip içine püskürtüldüğü bir alev sistemi veya örneğin içine

enjekte edildiği grafit fırın atomlaştırıcı. Alev kullanılıyorsa sıcaklığı, tayin edilen elementi atom

buharına dönüştürebilecek büyüklükte olmalıdır.

3) Tayin edilen elemente özgü rezonans çizgisini ayıran ve fotoçoğaltıcı üzerine odaklayan bir

monokromatör

4) Üzerine düşen ışıma şiddetini ölçen bir fotoçoğaltıcı dedektör

Şekil 1. AAS yönteminin çalışma prensibinin şematik gösterimi

2

1.3 Ölçüm teknikleri:

Analizlerin yürütülmesinde, örnek ve standart hazırlamada uygulanan çok sayıda yöntem

geliştirilmiştir. Bu denemede

1) Normal kalibrasyon yöntemi (sadece ilgilenilen elementi içeren basit standart çözeltiler

kullanılarak çizilen çalışma grafiği yardımıyla yapılan tayinler)

2) Standart katkı yöntemi

3) Ekstraktif derişiklendirme yöntemi

uygulamaları görülecektir.

2. Denemenin yapılışı:

Denemede kullanılan çözeltiler: 100 mg/L (ppm) CuSO4.5H2O stok çözeltisi, %1’lik

amonyum pirolidinditiyokarbamat (ADPC) çözeltisi, isobutilmetilketon (IBMK).

2.1 Normal kalibrasyon yöntemi:

Derişimi bilinen standart çözeltilerin absorbansları alevli atomik absorpsiyon spektrometresinde

(FAAS) ölçülerek absorbans ile derişim (mg/L=ppm) arasında çizilen çalışma eğrisinden

yararlanarak bilinmeyen örneğin derişimi belirlenir. 1.0, 2.5, 5.0 ve 10.0 ppm derişiminde dört ayrı

Cu(II) standart çözeltisi hazırlanır. Oluşturulan grafikten bilinmeyen örneğin derişimi saptanır.

2.2 Standart katkı yöntemi:

Tayin edilen elementin birlikte bulunduğu yabancı maddelerden gelen etkilerin niteliği

bilinmediğinde standart katkı yöntemi uygulanır. Standart katkı yönteminde, uygun seyreltiklikteki

analiz çözeltisi A, B, C ....... gibi kısımlara ayrılır; A kısmının kendi başına absorbansı okunur; B, C

ve diğer kısımlarına ise tayin edilen elementin bilinen miktarları katıldıktan sonra absorbansları

okunur. Böylece absorbans değerleri ile katkı derişimleri arasında bir kalibrasyon doğrusu çizilir.

Başlangıçtaki katkısız örneğin absorbansı (A0), katkısız örneğin bilinmeyen derişimi (C0), element

için absorplama (ekstinksiyon) katsayısı (k), katkılı örneğin derişimi (C1) olacak şekilde ilave

yapılmış çözeltinin absorbansı (A1), katkılı örnek derişimi (C2) olacak şekilde ilave yapılmış

çözeltinin absorbansı (A2) okunuyorsa;

A0 = k.C0 buradan k = A0/C0

A1 = k(C0C1) ................. A2 = k(C0C2)....... vb

k değeri A1 ve A2 denklemlerinde yerine konursa

A1 = (A0/C0) (C0C1) ve A2 = (A0/C0) (C0C2) .........’den

C0 = A0C1/(A1A0) = A0C2/(A2A0) ........... hesaplanır.

Grafiksel olarak C0 derişiminin hesaplanması için, ppm cinsinden standart katkı derişimleri absise,

absorbans değerleri ordinata konularak grafik çizilir. Çizilen doğrunun absis eksenini kestiği

noktanın orijine uzaklığı, bilinmeyenin başlangıç derişimini (C0) ppm olarak verir.

Derişimi bilinmeyen Cu(II) örnek çözeltisinden 10’ar mL alınarak 5 ayrı 50 mL’lik balonjojeye

aktarılır. Birinci balonjoje saf su ile 50 mL’ye tamamlanır. Örnek çözeltisinin aktarıldığı 50 mL

hacmindeki diğer dört balonjojeye 100 ppm derişimindeki stok Cu(II) çözeltisinden sırasıyla 2, 4, 6

ve 8 ppm olacak şekilde ilave edilir ve saf su ile çizgiye kadar tamamlanır. Bu şekilde hazırlanan

çözeltilerin absorbansları cihazda ölçülür. Elde edilen değerlerle grafik çizilir.

3

2.3 Ekstraktif derişiklendirme yöntemi:

Analizlenecek metal derişiminin çok küçük olduğu durumlarda uygulanan bu yöntemde, örnek

çözeltisine ekstraksiyon işlemi uygulanarak örnekteki metal iyonunun tayin edilebilecek miktara

derişiklendirilmesi amaçlanır.

0.05, 0.1 ve 0.2 ppm derişiminde 3 ayrı Cu(II) standart çözeltisi hazırlanır. Sırası ile her bir

çözeltinin 100 mL’si ayırma hunisine alınır. 0.5 M HCl ve 0.5 M NaOH çözeltileri ile pH 2.2-2.8

aralığında olacak şekilde gerekli ayarlamalar yapıldıktan sonra, 5 mL %1’lik ADPC çözeltisi ve 10

mL IBMK çözücüsünden ilave edilerek 2 dakika süre ile çalkalama işlemi yapılır. Sulu faz atılır.

Ağır metal iyonunun derişiklendiği (10 kez) organik ekstrakt fazı bir deney tüpüne alınır. Her üç

farklı derişim için de aynı işlemler tekrarlanır. Deriştirilecek (derişimi bilinmeyen) örneğe de aynı

işlemler uygulanır. Deriştirilme işlemleri yapılan standart çözeltilerle çizilen çalışma eğrisinden

yararlanılarak derişiklendirme işlemi yapılmış örnekteki analit derişimi belirlenir.

Şekil 2. Standart katkı yöntemiyle bilinmeyen örnekte bakır derişiminin grafik yöntemiyle

belirlenmesi

4

2. METİL KIRMIZISININ DİSOSİYASYON SABİTİ TAYİNİ

Bir pH indikatörü ve zayıf bir asit olan metil kırmızısının disosiyasyon sabitini spektrofotometrik

olarak tayin edebiliriz. Asit, baz denge sabitlerinin spektrofotometrik tayini, dengede bulunan

türlerin oldukça farklı dalga boylarında absorpsiyon yapmaları prensibine dayanır. Bu prensip genel

olarak bütün kimyasal dengelere uygulanabilir. Organik asit ve bazlar ortamın pH’ına bağlı olarak

absorpsiyon spektrumları verirler. Bunun nedeni bunların zayıf asit veya baz olmalarıdır. HA bir

organik asit olduğuna göre çözeltisinde;

HA H+ + A- dengesi kurulur, bu dengeden çözeltinin iyonik kuvveti de dikkate alınarak,

+ -+ -

+ -

H AH Aa

HA HA

f H f Aa aK

a f HA

(1)

eşitliği yazılır ve Ka (maddenin asitlik sabiti) bulunur.

Çözeltinin molar derişimi yüksekse; (I>10–1) molar derişim yerine aktiviteler kullanılır.

( HA HAa HA f ; A A

a A f

; 2

i i

Ilog f 0.5 Z

1 I

; 2

i i

1I C Z

2 )

a: Aktivite, f: Aktivite Katsayısı, I: İyonik Kuvvet

Denklemde iki tarafın eksi logaritmaları alınarak;

-

HA

a -

A

f HApK pH log

f A

(2) denklemi ele geçer.

HA’nın molar derişimi çok düşük olduğunda, aktiviteler molar derişimlere eşit kabul edilip

HA Aa HA , a A

(2) nolu denklemin iyonik kuvvet içeren kısmı ihmal edilebilir.

pKa ve dolayısıyla Ka bu eşitlikteki pH, [HA], ve [A-] ayrı ayrı tayin edilmeden de bulunabilir.

Bunun için iki yöntem vardır: Birincisi pH ile çözelti absorpsiyonunun değişiminden yararlanan

grafik yöntemidir. İkincisi ise denge denklemlerinden, izobestik noktadaki ε , zayıf asidin

tamamının HA halinde olduğu HAε ve zayıf asidin tamamının A- haline dönüştüğü Aε

pH’lardaki molar absorplama (ekstinksiyon) katsayılarından yararlanılan hesap yöntemi.

1. Grafik Yöntemi

Yukarıdaki eşitlikte [HA] = [A-] yani -HA Aa a olursa, pKa = pH olur. pH - absorbans grafiği

bir sigmoiddir (S şeklindedir). Bu sigmoidin orta noktasında [HA] = [A-]’dır. Bu noktadaki pH’a

yarı titrasyon pH’ı denir. Çünkü bu noktada HA’nın yarısı titre edilmiştir. Sigmoidin orta noktasını

bulabilmek için pH ile absorpsiyonun artık değişmediği en düşük ve en yüksek absorbanslar

belirlenir. En düşük ve en yüksek değerlerin orta noktasından pH eksenine bir paralel çizilir. Bu

doğrunun sigmoid eğrisini kestiği noktadan pH eksenine bir dikme indirilir. Dikmenin pH ekseni

üzerinde gösterdiği değer pKa’ya eşit olur.

--------------------

A520

--------------------------------

--------------------------------------

pKa pH

5

2. Hesap Yöntemi Metil kırmızısı, HA şeklinde bir zayıf asit olduğu için sulu çözeltide yukarıdaki

HA H+ + A-

denge denklemine uyar. Çözünmüş maddenin (indikatörün) toplam derişimi (x), disosiyasyon

sonucu oluşan iyonların derişimleri (y) ise, her üç türün dengedeki derişimleri ;

[HA] = (x-y), [A-] = y ve [H+] = y olacaktır.

Her iki [HA] ve [A-] bileşenleri de Beer kanununa uyuyor ise ve H+ iyonunun absorpsiyonu ihmal

edilirse; herhangi bir dalga boyunda A: absorbansı, HAε ve -Aε : HA ve A- bileşenlerine ait molar

absorplama katsayılarını ve l: çözelti tabakasının cm olarak kalınlığını (ışımanın çözelti içinde

aldığı yolu) göstermek üzere,

-HA AA ε HA l ε A l

bağıntısı yazılabilir. İzobestik noktada (λ = 460 nm’de) absorbans sabit olduğundan toplam

derişimin (x) de sabit olduğu bilindiğinden A ε x l yazılabilir.

ε karışım çözeltilerinin izobestik noktadaki molar absorplama katsayısıdır. Bu noktada her iki tür

(HA ve A-) de bulunduğundan ve A toplamsal olduğundan,

-HA AA ε x l ε HA l ε A l şeklinde yazabiliriz.

x HA + A olduğuna göre

-HA Aε HA + A l ε HA l ε A l

l =1 cm olduğundan denklem basitleştirilebilir.

Denklemi düzenleyecek olursak,

-HA Aε HA ε A ε HA ε A

- HAAA ε ε HA ε ε

A

HA

ε εHA

ε εA

denklemi elde edilir. Bu HA

A

oranı (2) denkleminde yerine konursa;

-A

HA

ε εpK pH log

ε ε

(3) denklemi ele geçer.

Böylece (3) denkleminden eğer HAε ve A

ε bilinirse ve izobestik noktadaki ε tayin edilirse, pKa

ve dolayısıyla Ka bulunabilir.

3. İzobestik Nokta: Çözelti içinde iki veya daha fazla madde dengede ise ve bu iki maddenin

absorpsiyon spektrumları bir girişim gösteriyorlarsa, dengedeki türlerin derişimleri oranına bağlı

olmaksızın çözeltinin absorbansının sabit kaldığı bir dalga boyu olacaktır. Buna izobestik nokta

denir (Metil kırmızısı indikatörü için bu dalga boyu 460 nm’dir).

6

4. Deneyin Yapılışı a.) 10 mL 0.1 M sodyum asetat çözeltisi, 100 mL’lik bir balon jojeye konur ve 2.5 mL % 0.04’lük

indikatör (metil kırmızısı) çözeltisi katılır. Balon joje distile su ile çizgiye tamamlanıp karıştırılır.

b.) 10 mL 0.1 M sodyum asetat çözeltisi alınıp indikatör ilavesi yapılmadan distile su ile 100

mL’ye tamamlanır. Bu çözelti, referans (kör) çözelti olarak kullanılır.

c.) Her iki çözelti de ayrı ayrı büyük beherlere aktarılır. Her iki çözeltinin pH’ları ölçülür. İndikatör

çözeltisinin absorbansı referans çözeltisine karşı λ = 520’nm de ve izobestik noktada (λ = 460

nm’de) okunur. Ölçümden sonra çözeltiler ait oldukları beherlere boşaltılır.

(0.25 M HAc – 0.1 M KCl) içeren asit çözeltisinden indikatör ve referans çözeltilerine ayrı ayrı 2

kez 1’er mL ve 3 kez 2’şer mL asit çözeltisi katılarak iyice karıştırılır. İndikatör çözeltisinin pH’ı

ve referansa karşı indikatörün absorbansı ölçülerek tabloya kaydedilir. Kullanılan çözeltiler tekrar

beherlere aktarılır.

Son olarak 1 mL 3 M HCl çözeltisi ilavesiyle absorbans ve pH ölçümü yapılır; HCl katılmış

çözeltide indikatör asidik formdadır. İndikatörün bazik formunda sarı olan rengi, asetik asit

ilavesiyle gitgide koyulaşarak turuncuya ve asidik formunda kırmızıya döner.

4.1 Yapılacak Hesaplar

1.) Dışarıdan katılan çözelti (HAc veya HCl) hacmi V ile gösterilirse100 V

V

formulünden

seyreltme faktörü tayin edilir.

2.) Tüm absorbans okumalarında seyreltme etkisini ortadan kaldırmak için ölçülen her absorbans

(A) değeri seyreltme faktörü ile çarpılarak düzeltilmiş absorbans (Aı) değerleri hesaplanır.

3.) % 0.04 (ağırlık/hacim) derişimindeki metil kırmızısı çözeltisinden 2.5 mL alındığı ve mol

tartısının 270 g mol-1 olduğu dikkate alınarak, başlangıç çözeltisindeki indikatörün molar derişimi

hesaplanır.

4.) Tablodaki değerlerden, pH ile düzeltilmiş A520 arasında grafik çizilerek pKa grafikten

hesaplanır.

5.) Tablodaki değerlerden, düzeltilmiş A460 kullanılarak izobestik noktadaki ε (molar absorblama

katsayısı) ve sodyum asetatlı ilk örneğe ait düzeltilmiş A520 kullanılarak da anyonik (bazik tür) icin

Aε ve yine düzeltilmiş A520 kullanılarak 3 M HCl’li son çözelti (asidik tür) icin ε hesaplanarak (3)

nolu formülden hesap yoluyla pKa bulunur.

7

3. Fe(II)-Fe(III) KARIŞIMINDAN TÜRLERİN VE TOPLAM DEMİRİN

SPEKTROFOTOMETRİK TAYİNİ

1. Giriş

Demir, jeolojik örneklerin bileşiminde 2+ ve 3+ değerliklerinde bulunur. Ayrıca

proteinlerin, oksidaz, redüktaz ve dehidraz gibi enzimlerin aktif merkezi olarak oksijen ve elektron

taşınmasında rol oynar. Oksijenin hemoglobin ve miyoglobin vasıtasıyla taşınması ve depolanması

için Fe2+ iyonu gerekir. Demirin 3+ değerlikli olduğu methemoglobin ve metmiyoglobin

(hemoglobin ve miyoglobinin oksitlenmiş şekilleri) ise oksijen bağlamaz. Demirin çevresel ve

biyolojik materyallerdeki varlığı ve bu elementin iki ayrı değerliğinin etkisi ile ilgili bilgilerin

yetersizliği demir tayinini ve türlemesini (farklı değerlikteki miktarlarının saptanmasını) önemli

kılar. Demirin çok sayıda ligandla spektrofotometrik tayini yapılabilmektedir. Bu ligandlardan biri

de pek çok metal katyonu ile renkli ve kararlı kompleks oluşturduğu bilinen 5-Br-PADAP (2-(5-

bromo-2-piridilazo)-5-(dietilamino) fenol)’dır. Bu denemede 5-Br-PADAP ligandı ile toplam demir

tayini kolorimetri, demir türlendirilmesi ise türev spektrofotometrisi yöntemi kullanılarak

gerçekleştirilecektir.

1.1 Kolorimetrik Analiz

Analiz edilmek istenen elementin uygun bir ligand ile renkli kompleksinin oluşturulması ve

en yüksek absorbsiyon gösterdiği dalga boyundaki absorbans değerlerinin kullanılmasına dayanan

yöntemdir. Bilinen derişimlerde bir seri çözeltinin absorbansı ölçüldükten sonra derişim ile

absorbans değerleri arasında çalışma grafiği oluşturulur. Aynı şekilde hazırlanan örneğin absorbansı

ölçüldükten sonra ya grafik üzerinde kestirme yöntemi ile ya da grafikten belirlenen doğru

denklemi kullanılarak örnek derişimi belirlenir.

1.2 Türev Spektrofotometrisi

Türev spektroskopisinin temeli normal absorpsiyon spektrumlarının yerine türev

spektrumlarının kullanılmasıdır. Bazı durumlarda bir çözeltide bileşenlerin UV-görünür bölge

spektroskopisi ile nicel tayini, spektral benzerlikler yüzünden ve bir bileşenin zayıf absorpsiyon

bandının diğer bileşenlerin güçlü absorpsiyon bandları ile örtülmesi sebebiyle zorlaşır. Bu durumda

türev spektrumlarından faydalanılır (Şekil 1)

Türev spektrumlarının oluşturulması için gerekli olan matematiksel işlemlerin uzun ve güç

olması nedeniyle analitik kimyadaki önemi ve uygulamaları ancak analitik cihazların bilgisayarlar

ile donatılmasından sonra büyük gelişme göstermiştir.

8

Şekil 1. (a) Çakışan iki pik, (b) çakışan iki pikin normal spektrumu ve 1-4. türev spektrumları ile

ayrılması

1.3 Türev Spektrumları

Birinci türev absorpsiyon spektrumu dalga boyuna karşı çizilen absorbans türevi eğrisidir

(dA/dλ). Buna benzer şekilde 2., 3., ......n. türev spektrumları, sırasıyla d2A/dλ2, d3A/dλ3,......dnA/dλn

değerleri ile dalga boyu arasındadır. Şekil 2.’de basit bir pikin 1-4. türev spektrumları verilmiştir.

Bir pikin 1. türevi alındığında yükselen bölgeler pozitif, inen bolgeler negatif pikler oluşturmakta,

dönüm noktalarının bulunduğu dalga boylarında ekstremumlar oluşmakta,orijinal spektrumdaki

ekstremumların karşılığı olan dalga boylarında ise türev eğrisi sıfırdan geçmektedir. Orijinal

spektrumdaki bir pike karşılık n. türev spektrumunda n+1 adet pik oluşmakta, türevin derecesi

arttıkça pikler keskinleşmekte ve daralmaktadır. Orijinal spektrumda absorpsiyon maksimumunun

bulunduğu dalga boyunda 2. türev spektrumunda bir minimum, 4. türev spektrumunda bir

maksimum ortaya çıkmakta, 1. ve 3. türev spektrumları ise bu dalga boyunda sıfırdan geçmektedir.

Türev derecesi arttıkça piklerin keskinleşmesi ve daralmasıyla rezolüsyon (ayırım)

artmaktadır. Bundan spektrumların ince yapısının aydınlatılmasında yararlanılır ki bu durum saflık

testleri ve maddelerin belirlenmesinde önemlidir. En çok yararlanılan türev dereceleri genellikle 4’e

kadardır.

9

Şekil 2. Bir pikin normal ve 1-4. türev spektrumlarında karakteristik görünümler

1.4 Nicel Analizler İçin Türev Spektrumlarının Değerlendirilmesi

1.4.1 Pik-sıfır Yöntemi: Peak-zero ya da zero-crossing yöntemi olarak adlandırılan bu yöntem pik

tepesinin absise olan uzaklığının ordinata paralel olarak ölçülmesidir (z). Absise göre simetrik

sinyaller içeren yüksek türevlerin değerlendirilmesinde ve birbiri üzerine binen eğrilerden birinin

sıfırdan geçtiği durumda uygundur.

1.4.2 Tanjant Yöntemi: Birbirini izleyen iki maksimum ya da iki minimuma ortak teğet çizilir. Bu

teğetin aradaki ekstremuma olan uzaklığı ordinata paralel olarak ölçülür (t). Bu yöntem doğrusal bir

zemin olduğu zaman daha iyi sonuçlar verir ve zeminin spesifik olmayan etkilerinin ortadan

kaldırılmasında, en azından azaltılmasında yararlanılır.

1.4.3 Pik-Pik Yöntemi: Birbirini izleyen iki ekstremum arasındaki uzaklık, ordinata paralel olarak

ölçülür (P1 ya da P2). Bu yöntem çok bileşenli karışımların nicel analizinde kullanılmaktadır. Zemin

absorbansının giderilmesinde de kullanılır.

1.4.4 Pik-Pik Oranı Yöntemi: Birbirine komşu iki pikin oranı alınır ( P1 : P2 ). Bu teknik ikili

karışımların kantitatif analizinde kullanılır. Çalışma eğrisi yapay karışımların bağıl derişimleri ile

pik-pik oranları arasında hazırlanır.

10

Şekil 3. Kantitatif analizler için türev spektrumlarını değerlendirme yöntemleri (t: tanjant yöntemi,

P: pik-pik yöntemi, Z: pik sıfır (peak-zero) yöntemi)

2. Deneysel Kısım

2.1 Kullanılan Çözeltiler:

i. 1.0x10-3 M Fe(II) stok çözeltisi, (NH4)2Fe(SO4)2.6H2O (392.14 g mol-1)’tan 0.0392g tartılıp 100

mL distile suda çözülerek hazırlanır ve bu stoktan 1,0x10-4M’a seyreltilir.

ii. 1.0x10-3 M Fe(III) stok çözeltisi, NH4Fe(SO4)2.12H2O (482.2 g mol-1)’tan 0.0482g tartılıp 1 mL

1M HCl de çözülerek distile suyla 100 ml ye tamamlanır, bu stoktan 1,0x10-4M’a seyreltilir.

iii. 2.0x10-4 M 5-Br-PADAP (349.23 gmol-1)’dan 0.0175g tartılıp 250 mL metanolde çözülerek

hazırlanır.

iv. pH 7 tamponu ( 0.1 M Tris (hidroksimetil) - aminometan)-0.1 M HCl )

v. %2’lik (ağırlıkça) Hidroksilamin hidroklorür (NH2OH.HCl) çözeltisi

2.2 Denemenin Yapılışı

Fe(II) ve Fe(III) iyonlarının 5-Br-PADAP (2-(5-bromo-2-piridilazo)-5-(dietilamino) fenol)

ile verdiği renkli komplekslerden yararlanılarak hem toplam Fe tayini hem de Fe’in her iki

değerliğinin yan yana analizi gerçekleştirilir. Normal spektrumda her iki değerlikli Fe’in verdiği

spektrum büyük ölçüde çakışmaktadır. 2. Türev spektrumunda ise komplekslerin piklerinin

çakışmadığı iki ayrı dalga boyu (λ) bulmak mümkündür. Toplam Fe tayini ayrı ayrı bulunan Fe(II)

ve Fe(III) miktarlarının toplamından bulunabileceği gibi türev spektrofotometrisine gerek olmadan

çözeltideki demiri tek bir değerlikte, (hidroksilamin hidroklorür (NH2OH.HCl) veya Askorbik asit

gibi bir indirgen varlığında Fe(II) halinde veya sodyum persülfat (NaS2O8) gibi bir yükseltgen

varlığında Fe(III) halinde) tutarak 555 nm dalga boyunda okunan normal absorbans değerinden

saptanabilir.

x mL Fe(II) veya Fe(III) + (1-x) mL distile su + 5 mL ligand + 1mL tampon VT=7 mL

x= 0.25, 0.5, 0.75, 1 mL olacak şekilde karışımlar hazırlanır ve bunların 400-900 nm dalga boyları

arasındaki absorpsiyon spektrumları çizilir. Fe(II) standartları ile 555 nm’de okunan absorbans

değerleri ile çizilen çalışma eğrisinden ve/veya elde edilen doğru denkleminden örnekteki toplam

Fe miktarını belirlemek için yararlanılır. Her bir karışım için 1. ve 2. derece türev spektrumları

alınarak kantitatif analiz için kullanılacak olan türev derecesi (çakışmanın olmadığı ya da en az

olduğu), ∆λ aralığı (yeterince büyük türev absorbans değeri veren, spektrumda yol açtığı bozunma

fazla olmayan) ve türev absorbans değerlerinin ölçüleceği çalışma dalga boyları (ikili karışım

olduğu için iki ayrı dalga boyu) belirlenir. Türev absorbans değerleri ile derişim arasında Fe’in her

iki değerliği için çalışma eğrileri çizilir, doğru denklemleri belirlenir. Bu çalışma eğrilerinden de

Fe’in türlemesi için yararlanılır.

11

2.3 Örnek Analizi Fe(II) ve Fe(III) içerikleri bilinmeyen örnekten 1 mL alınır, 1 mL %2 (ağırlıkça) ) hidroksilamin

hidroklorür (NH2OH.HCl) çözeltisi yukarıda belirtilen miktarda ligand ve tampon çözelti eklenerek

hazırlanan çözeltinin 555 nm’de okunan absorbans değeri ve Fe(II) için çizilen çalışma eğrisinden

ve/veya elde edilen doğru denkleminden örnekteki toplam demir miktarı hesaplanır. Örnek

çözeltiden alınan ikinci 1mL’lik kısma ligand ve tampon eklenerek hazırlanan çözeltinin

belirlenmiş türev derecesinde ve ∆λ aralığında türev spektrumu alınarak, yine daha önce belirlenmiş

olan dalga boylarındaki türev absorbans değerleri ölçülür ve bunlar doğru denklemlerinde yerine

konularak başlangıç çözeltisindeki Fe(II) ve Fe(III) iyonu konsantrasyonları (mol L-1) hesaplanır.

12

4. KROM(VI) ve MANGAN(VII)’IN YANYANA SPEKTROFOTOMETRİK TAYİNİ

1. Giriş

Çözünen iki madde arasında kimyasal bir tepkime yoksa ve absorpsiyon spektrumları,

belirgin bir biçimde birbiriyle çakışmıyorsa bu iki maddenin belirli bir dalga boyundaki

absorbansları toplamsaldır.

1 1 1 2 2 2λ λ 1 λ 2 λ λ 1 λ 2A A A .......... 1 ve A A A .......... 2

Burada 1λ A ve

2λ A , 1λ ve

2λ dalga boylarında ölçülen absorbanslar olup, 1 ve 2 indisleri farklı

maddeleri göstermektedir. 1λ ve 2λ farklı dalga boylarıdır.

Bu dalga boyları, çözünen iki maddenin absorpsiyon maksimumları ile çakışacak şekilde seçilir;

öyle ki, (1) maddesi 1λ ’de zayıf, 2λ ’de kuvvetli absorpsiyon yaparken (2) maddesi de 1λ ’de

kuvvetli, 2λ ’de zayıf absorpsiyon yapmalıdır. Her iki bileşenin de bu iki dalga boyunda Beer

kanununa uyması gerekmektedir.

A ε c l (Beer Kanunu)

ε : Belirli bir dalga boyundaki molar absorplama katsayısı

c: Molar derisim

l: Çözelti tabakasının cm olarak kalınlığı (Işımanın çözelti içinde aldığı yol). ‘l’ genellikle 1 cm’dir.

1 1 1λ λ 1 1 λ 2 2A ε c ε c .......... 3

2 2 2λ λ 1 1 λ 2 2A ε c ε c ......... 4

Bu iki bilinmeyenli iki denklemin yan yana çözümünden c1 ve c2 bilinmeyen konsantrasyonları

bulunur.

Bunun için molar absorplama katsayılarının ( 1ε ve 2ε ), saf (1) ve (2) maddelerinin sudaki

çözeltilerinin absorbanslarından belirlenmesi gerekir. Karışımın 1λ ve 2λ dalga boylarındaki

absorbansları ölçülerek , iki bileşenin karışım içindeki derişimleri hesaplanır.

Bu yöntem, çelik ve diğer demir alaşımlarında Mn ve Cr’un yanyana tayinine olanak verir.

1.1 Bozucu Etkiler

Bikromat anyonuna ait 350 nm’deki pik, Fe(III) iyonlarının 425 nm’nin altında kuvvetli

absorbans göstermesi nedeniyle elverişli değildir; 440 nm’de daha zayıf olan band maksimumuna

Fe(III) etkisi ise genellikle ihmal edilecek boyutlardadır.

MnO4- için absorpsiyon maksimumu 545 nm’de olup, bikromattan gelen absorbans için ufak

bir düzeltme yapmak gerekir. Bu iki iyon için gerek bireysel olarak, gerekse karışım halinde

absorbanslar, H2SO4 derişimi en az 0.5 M olmak koşuluyla Beer kanununa uymaktadır. Fe(III),

Ni, Co, ve V, 425 ve 545 nm’de absorpsiyon yaptıklarından bu iyonların varlığında gereken

düzeltmeler yapılmalıdır.

13

2. Deneyin Yapılışı

Saf permanganat ve saf bikromat çözeltileri 1M H2SO4 çözeltisinde hazırlanır örneklerin ayrı ayrı

spektrumları çizilir. C (permanganat)= 2.5x10-4 M ve c (bikromat)= 1x10-3 M’dır. Bu maddelerden

birinin zayıf, diğerinin ise kuvvetli absorpsiyon yaptığı iki adet dalga boyu (1=440 ve 2=545)

analitik dalga boyları olarak seçilir. Bu dalga boylarında 1λ 1ε ,

2λ 1ε , 1λ 2ε ,

2λ 2ε hesaplanır.

Bileşimi aydınlatacak analiz örneği için, önceden saptanan iki analitik dalga boyunda yapılan

absorbans okumaları ile 1λ A ve

2λ A bulunur. (3) ve (4) nolu denklemlerden örnekteki permanganat

ve bikromat konsantrasyonları hesaplanır.

2.1 Yapılacak Hesaplar

λ , -4(MnO )

A ve 2-2 7(Cr O )

A değerleri tablo halinde verilir. Spektrum üzerinde seçilen analitik dalga

boyları işaretlenir. Bu dalga boylarında saf permanganat ve saf bikromatın molar absorplama

katsayıları hesaplanır. Daha sonra analiz örneğinde bu iki bileşenin konsantrasyonları hesaplanır.

14

5. DEMİR(III) SÜLFOSALİSİLAT KOMPLEKSİNİN FORMÜLÜNÜN VE

KARARLILIK SABİTİNİN TAYİNİ

1. Kompleks Stokiyometrisinin (Birleşim Oranının) Spektrofotometrik Olarak Belirlenmesi

Kompleks stokiyometrisini bulmak için başlıca iki yöntem uygulanır. Bunlar:

i. Job veya sürekli değişmeler yöntemi

ii. Mol oranı yöntemi

1.1 Job veya Sürekli Değişmeler Yöntemi

Metal (M) ve Ligand (L)’dan meydana gelen kompleks için uygun bir çözücü ve

absorpsiyon maksimumu bulunarak böyle bir maddenin bir molünün içerdiği M ve L’nin mol

sayıları bulunabilir. Yöntem Job tarafından geliştirildiğinden çoğu kez Job Yöntemi adını alır.

Bunun için M ve L’den meydana gelen maddenin spektrumu alınır ve bu spektrumun en şiddetli

absorpsiyonunun dalga boyu (max) tespit edilir. M ve L’nin aynı derişimde birer çözeltisi

hazırlanır ve aşağıdaki karışım çözeltilerin absorbansları ölçülür.

M L

10.0 mL

+

0.0 mL

9.0 mL + 1.0 mL

8.0 mL + 2.0 mL

7.0 mL + 3.0 mL

6.0 mL + 4.0 mL

5.0 mL + 5.0 mL

4.0 mL + 6.0 mL

3.0 mL + 7.0 mL

2.0 mL + 8.0 mL

1.0 mL + 9.0 mL

0.0 mL + 10.0 mL

Ölçülen absorbans değerleri alınan mL’lere örneğin M’nin mL sayılarına karşılık grafiğe geçirilirse

Şekil-1’deki gibi bir eğri elde edilir. (Apsiste M veya L’nin mol kesri de kullanılabilir.) Eğrinin tepe

noktasının yuvarlaklığı kompleksin dissosiye olmasını sivri olmasıysa kompleksin kararlılığını

gösterir. İdeal halde eğri bir üçgendir.

Şekil 1. Sürekli değişmeler grafiği

ML2

15

1.2 Mol Oranı Yöntemi

Bu metodda yine kompleksin maksimum absorpsiyon yaptığı dalgaboyunda hazırlanan bir

dizi karışım çözeltinin absorbansı okunur. Çözeltilerde kompleksi oluşturan bileşenlerden birinin

(M) derişimi sabit tutulurken diğeri (L) değiştirilir. Böylece artan mol oranlarında bir dizi çözelti

elde edilir. Her çözeltinin absorbansı, mol oranına (CL/CM) karşı grafiğe geçirilir. Eğer kompleksin

oluşum sabiti (kararlılık sabiti) yeteri kadar büyükse, eğimleri farklı iki doğru elde edilir. İki

doğrunun kesiştiği noktaya karşı gelen mol oranları, metal ve ligandın kompleksteki oranlarını

verir. Tipik bir mol oranı grafiği şekil 2’de verilmiştir.

Şekil-2. Mol oranı grafiği

Mol oranı metodu basamaklı olarak oluşan iki veya daha fazla kompleksin yapı tayinin de de

kullanılabilir. Ancak kompleksler farklı absorptivitelere sahip olmalı ve oluşum sabitleri çok yakın

olmamalıdır.

1.3 Kompleksin Kararlılık (Oluşum) Sabitinin Tayini

Gerek sürekli değişmeler yönteminde, gerekse mol oranı yönteminde, doğruların kesişme noktasına

karşı gelen absorbans değerleri, deneysel olarak bulunan absorbans değerlerinden daha büyüktür.

Bunun sebebi kompleksin ayrışmasıdır. Teorik değer %100 kompleks oluşumuna karşı gelen

absorbanstır. İki değer arasındaki fark, ayrışmanın veya başka bir deyişle kompleks kararsızlığının

bir ölçüsüdür. Bu farktan yararlanılarak kompleksin kararlılık sabiti bulunabilir. Örneğin 1:1’lik

ML formülündeki bir kompleksin kararlılık ve oluşum sabiti,

MLM L ML, K

M L

Gerçek absorbans (deneysel olarak ölçülen) dengedeki ML’nin derişimiyle orantılıdır.

Ekstrapolasyonla bulunan absorbans ise teorik olarak olması gereken ML derişimiyle orantılıdır. Bu

teorik değer, metalin veya ligandın derişimine eşittir. Ölçüm sırasında hangisi az ise sınırlayıcı

reaktif odur ve aynı miktarda kompleks oluşur.

Yani,

ölçülenA ε l ML

teorikA ε l c

Burada c, ölçümün yapıldığı sırada metal veya liganddan az olan türün derişimidir.

ML2

16

Absorbans değerleri oranlanırsa;

ölçülen

teorik

A ε l ML ML

A ε l c c

ölçülen

teorik

AML c

A olur.

Diğer taraftan, kütle denkliğinden,

ölçülen

M M

teorik

AM c ML c c

A

ölçülen

L L

teorik

AL c ML c c

A

Burada cM ve cL sırasıyla metal ve ligandın başlangıç derişimleridir. Denge değerleri, oluşum sabiti

ifadesinde yerine konulursa;

ölçülen teorik

M ölçülen teorik L ölçülen teorik

A / A cK

c A / A c c A / A c

denkleminden denge sabiti hesaplanır.

2. Deneysel Kısım

2.1 Cihaz ve Malzemeler

Görünür bölge spektrometresi (Kolorimetre), genel laboratuvar malzemeleri

2.2 Reaktifler

0.002 M’lık Demir(III) sülfat çözeltisi, 0.10 M HClO4 ile hazırlanır.

0.02 M’lık Sülfosalisilik asit çözeltisi, 0.10 M HClO4 ile hazırlanır.

2.3 Deneyin yapılışı

1. Sürekli değişmeler yöntemi ile tayin için aşağıdaki çözeltiler hazırlanır. Çözeltiler pipetle veya

büretle alınmalıdır.

Çözelti No Demir(III)

çözeltisi, mL

Sülfosalisilik asit

çözeltisi, mL

HClO4 çözeltisi, mL Toplam hacim, mL

1 0.0 5.0 5.0 10.0

2 0.5 4.5 5.0 10.0

3 1.0 4.0 5.0 10.0

4 1.5 3.5 5.0 10.0

5 2.0 3.0 5.0 10.0

6 2.5 2.5 5.0 10.0

7 3.0 2.0 5.0 10.0

8 3.5 1.5 5.0 10.0

9 4.0 1.0 5.0 10.0

10 4.5 0.5 5.0 10.0

11 5.0 0.0 5.0 10.0

Çözeltiler hazırlandıktan sonra yaklaşık 30 dk bekletilir. Sonra her çözeltinin absorbansı Fe(III)–

sülfosalisilik asit kompleksi için önceden belirlenmiş olan 500 nm dalgaboyunda ölçülür. Referans

çözeltisi ile cihaz, “0” absorbansa ayarlanmalıdır. Metalin veya ligandın mol kesirlerine karşı

absorbans değerleri grafiğe geçirilerek kompleks formülü ve kararlılık sabiti bulunur.(Referans

çözeltisi: Analit dışında tüm ayıraçları içeren çözelti).

17

2. Mol oranı yöntem ve tayini için aşağıdaki çözeltiler hazırlanır Çözeltiler pipetle veya büretle

alınmalıdır. Hazırlanan çözeltiler yaklaşık 30 dk bekletilir. Ref. Çözeltisi ile 500 nm’de cihaz

sıfırlanır ve aynı dalgaboyunda her bir çözeltinin absorbansı ölçülür. Mol oranlarına karşı absorbans

değerleri grafiğe geçirilerek kompleksin formülü ve kararlılık sabiti bulunur.

Çözelti

No

Demir(III)

çözeltisi, mL

Sülfosalisilik asit

çözeltisi, mL

HClO4 çözeltisi, mL Toplam hacim, mL

1 2.0 0.0 8.0 10.0

2 2.0 0.5 7.5 10.0

3 2.0 1.0 7.0 10.0

4 2.0 1.5 6.5 10.0

5 2.0 2.0 6.0 10.0

6 2.0 2.5 5.5 10.0

7 2.0 3.0 5.0 10.0

8 2.0 3.5 4.5 10.0

9 2.0 4.0 4.0 10.0

10 2.0 4.5 3.5 10.0

11 2.0 5.0 3.0 10.0

18

6. KROMATOGRAFİK YÖNTEMLER

1. Giriş

1.1. Tanım:

Kromatografi, kimyasal maddelerin biri hareketli diğeri sabit iki faz arasında çeşitli

mekanizmalara göre farklı oranlarda dağılmalarına dayanan bir ayırma yöntemidir. Maddelerin iki

faz arasında dağılmaları sonucunda bir denge haline ulaşılır. Dengede ayrılması amaçlanan

maddenin iki fazdaki derişim oranları sabittir. Hareketli fazda daha fazla dağılan madde daha hızlı

hareket ederken, sabit fazda daha fazla dağılan madde daha yavaş hareket eder. Bu hızların farklı

olmaları sonucu maddeler birbirlerinden ayrılırlar. Hareketli faz ile bileşenlerin kolondan

sürüklenmesi işlemi elüsyon; kolondan çıkan çözelti ise elüat olarak adlandırılır.

İzokratik elüsyon: Elüsyon işlemi süresince hareketli faz bileşiminin sabit kaldığı

yöntemdir.

Gradient elüsyon: Hareketli fazın bileşiminin elüsyon işlemi süresince sürekli veya

kademeli olarak değiştiği yöntemdir.

1.2. Kromatografik yötemlerin sınıflandırılması:

Kromatografi farklı şekillerde sınıflandırılabilir. Genel olarak kromatografi, kromatografik

yatağın (sabit fazın) şekline göre düzlemsel kromatografi ve kolon kromatografisi olarak ikiye

ayrılır.

i. Düzlemsel kromatografi: Sabit fazın bir düzlem olduğu ya da düzlemde bulunduğu ayırma

yöntemidir (kağıt kromatografisi, ince tabaka kromatografisi gibi).

Gerek kağıt kromatografisinde gerek ince tabaka kromatografisinde ayırılmak istenen

maddeler özel bir kağıt veya ince bir tabaka üzerinde sorplanmış sabit faz ile bununla temas halinde

bulunan hareketli sıvı faz arasında dağılıma uğrarlar.

Şekil 1. Kağıt kromatografisi uygulaması

Bu yöntemde kromatografik kağıdın bir ucundan yaklaşık 5 cm uzaklık kalem ile yavaşça

işaretlenir, ayrılmak istenen örnek bir mikro pipet yardımıyla işaretlenen çizginin ortasına uygulanır

(Şekil 1a). Kağıt genellikle organik bir çözücü olan hareketli fazı içeren kapalı bir cam kaba

yerleştirilir (Şekil 1b). Hareketli faz yaklaşık kağıdın diğer ucuna ulaştığında cam kabın kapağı

açılır ve hareketli fazın sınırı B işaretlenir (Şekil 1c). Kağıt kurumaya bırakılır. Örnek bileşenleri

hareketli ve sabit faza ilgilerine göre kağıt üzerinde farklı noktalarda lekeler halinde belirir (Şekil

1d). Ayrılmış olan maddeler aşağıdaki ilişki ile tanımlanan Rf değerleri ile karakterize edilir:

Leke merkezinin uygulama noktasına uzaklığı (cm)

Rf =

Çözücü sınırının uygulama noktasına uzaklığı (cm)

Rf değerleri belirli koşullar altında maddeye özgüdür ve türlerin nitel tayini için kullanılabilir.

Ayrıca lekenin yoğunluğu da nicel büyüklük açısından fikir verici olabilir.

19

İnce tabaka kromatografisinde ise adsorban cam bir tabaka üzerine kaplanır. İnce tabaka

kromatografisinde çeşitli kaplama materyalleri mevcuttur. En yayın olanlar silika gel ve toz

selülozdur. İnce tabaka kromatografisi kağıt kromatografisiyle kıyaslandığında daha güvenilir, daha

hızlı bir yöntemdir. Ayırım daha keskin ve hassastır. Uygulama kağıt kromatografisine benzer

şekilde gerçekleştirilir (Şekil 2).

Şekil 2. İnce tabaka kromatografisi uygulaması

ii. Kolon kromatografisi: Kolon kromatografisinde sabit faz kolon adı verilen cam yada çelikten

dar bir tüp içine doldurulmuş partiküllerden oluşmuştur. Hareketli faz ise sabit fazın tanecikleri

arasından geçerek ayrılmak istenen maddeleri kolon boyunca sürükler.

İkinci bir sıflandırma yönteminde ise hareketli fazların cinsi göz önüne alınır. Buna göre

hareketli faz gaz ise yöntem gaz kromatografisi (GC), sıvı ise sıvı kromatografisi (LC) olarak

adlandır. Günümüzde sıvı kromatografisi genellikle çok küçük tanecikli sabit faz ve oldukça yüksek

giriş basıncı ile uygulandığı için High-Performance (veya High-Pressure) LC (HPLC) (yüksek

performanslı) olarak ifade edilir. Hareketli fazın kritik bir sıcaklığın üzerindeki bir noktaya kadar

ısıtılmış ve basınç ile sıvılaştırılmış süper kritik bir akışkan olduğu yöntem ise süper kritik akışkan

kromatografisidir (SCF).

Bir diğer sınıflandırmada da ayırma mekanizmaları göz önüne alınır. Ayırma

mekanizmalarına göre sınıflandırıldığında kromatografik yöntemler beş gruba ayrılır.

i. Adsorpsiyon kromatografisi

ii. Dağılım (partisyon) kromatografisi

iii. İyon-değiştirme kromatografisi

iv. Eleme (ekskülizyon, exclusion) kromatografisi

v. Afinite(affinity,benzeşme) kromatografisi

Günümüzde yaygın olarak geniş bir kullanım alanı bulan kromatografik uygulanmalar olan

GC, HPLC ve SFC yöntemlerinin her üçü de kolonda gerçekleştirilir.

Çözünen maddelerin derişimine cevap veren bir dedektör kolon çıkışına yerleştirilirse ve

dedektör sinyali zamanın (veya nadiren kullanılan hareketli faz hacminin) fonksiyonu olarak

kaydedilirse her maddenin derişim profili olan pikler elde edilir ve bu piklerin oluşturduğu grafiğe

kromatogram adı verilir. Şekil 3 de iki bileşenli bir karışıma ait tipik bir kromatogram örnek olarak

verilimiştir.

20

Şekil 3. İki bileşenli bir karışımın kromatogramı

a : Kolonda tutulmamış çözünen piki

b : Temel çizgi (baseline)

HA: A maddesinin pik yüksekliği

HB: B maddesinin pik yüksekliği

(tR)A: A maddesinin alıkonma zamanı (Retensiyon zamanı)

(tR)A: B maddesinin alıkonma zamanı

tM : Ölü zaman(kolonda tutulmayan türün çıkma zamanı)

WA: A maddesinin pik genişliği

WB : B madesinin pik genişliği

Numune enjeksiyonundan sonra, analitin dedektöre ulaşması için gereken süreye alıkonma zamanı

adı verilir. Soldaki küçük pik, kolonda tutulmayan dolayısıyla dedektöre elüsyonun başlamasıyla

hemen ulaşan bileşene aittir. . Bu nedenle bunun alıkonma zamanı hareketli faz molekülünün

kolondan çıkması için gereken zamana (tM) eşit kabul edilebilir. tR karışımdaki bileşenlerin

alıkonma zamanları, W ise pik genişlikleridir. Kromatografide A ile gösterilen bir analit için

dağılım dengesini sıklıkla, aşağıdaki basit denklemle tanımlayabiliriz:

Ahareketli Asabit

Bu dengeye ait sabit, K, dağılım katsayısı olarak adlandırılır: K = Cs / CM

Bu denklemde CS ve CM analitin, sırasıyla sabit ve hareketli (mobil) fazdaki molar

konsantrasyonlarıdır. İdeal olarak dağılım katsayısı, geniş bir konsantrasyon aralığında sabittir, yani

CS, CM ile doğru orantılıdır. Bu eşitliğin uygulandığı kromatografi, doğrusal kromatografi olarak

adlandırılır. Tablo 1'de özetlenen kromatografik büyüklükler ve bunların temeli olan teorik

tartışmalar doğrusal kromatografiyle sınırlıdır.

21

Tablo 1. Kolon kromatografisinde önemli deneysel büyüklükler ve bağıntıları

Deneysel büyüklüğün ismi Sembolü Elde edilişi

Tutulmayan türün kolondan çıkma

(göçme) zamanı

tM Kromatogramdan (Şekil 3)

A ve B bileşenlerinin alıkonma

zamanları (bileşen piklerinin

maksimumlarına karşı gelen süre)

tR(A) , tR(B) Kromatogramdan (Şekil 3)

A bileşeni için düzeltilmiş

alıkonma zamanı

t'R(A) t'R(A) tR(A) - tM

A ve B bileşenlerinin pik

genişlikleri

WA , WB Kromatogramdan (Şekil 3)

Kolon dolgusu (sabit faz)

uzunluğu

L Doğrudan ölçülerek

Akış hızı (hacımsal akış hızı)

F Doğrudan ölçülerek

Sabit faz hacmı

VS Kolonun hazırlanma verilerinden

Analitin hareketli ve sabit

fazlardaki konsantrasyonu

CM , CS Analiz ve hazırlama verilerinden

Bir çözünenin kromatografik davranışını belirlemek için en sık kullanılan terimler; alıkonma

zamanı, tR (veya alıkonulma hacmi, VR) alıkonma faktörü, k dır.

Alıkonma Faktörü (k): Analitlerin kolonda göçetme hızlarını tanımlamak amacıyla yaygın olarak

kullanılan önemli bir büyüklüktür : kA = (tR — tM) / tM

formülü ile hesaplanabilir. Alıkonma faktörü(k)’nün 1-5 arasında bir değer göstermesi idealdir.

Uygun bir kolonun seçilmiş olması halinde k değeri mobil fazın bileşimi değiştirilerek ayarlanabilir.

1.3. Sıvı Kromatografisi (HPLC)

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ya da High Performance Liquid Chromatography

= HPLC) 2-5 mm çaplı, çok ince taneciklerin (5-15 m) doldurulmasıyla hazırlanmış kolonların

kullanıldığı, 100-200 atm gibi yüksek basınç altında gerçekleştirilen likit kromatografisi yöntemidir.

Bu yöntemde, çözücü yani hareketli faz kolondan bir pompa ile geçirilir. Örnek, pompa ile kolon

girişi arasında bir enjektör yardımıyla devreye sokulur. HPLC yönteminde kolon çapının

küçültülmesi, kolona giren madde miktarının aynı tutulması durumunda yöntemin duyarlılığını

arttırmakta ve ayrıca harcanan çözücü miktarını azaltmaktadır.

Sıvı kromatografisinin 4 temel türü: (1) adsorpsiyon veya likit-katı kromatografisi; (2)

dağılım kromatografisi; (3) iyon kromatografisi; ve (4) boyut eleme veya jel kromatografisidir.

Dağılım kromatografisi, sıvı kromatografisinin en yaygın kullanılan türüdür. Dağılım

kromatografisi, sıvı-sıvı ve bağlı-faz kromatografisi olmak üzere iki alt sınıfa ayrılabilir. Bu

teknikler arasındaki fark, dolgu maddesine sabit fazın tutunmasına dayanır. Sıvı-sıvı

kromatografisinde sabit faz dolgu maddesine fiziksel adsorpsiyonla tutunmuştur. Bağlı-faz

yönteminde ise kimyasal bir bağlanma söz konusudur. Bağlı-faz yöntemi, sıvı-sıvı yöntemine göre

üstünlüklerinden dolayı günümüzde yaygın olarak kullanılır.

Dağılım kromatografisinde kullanılan bağlı-faz dolgu maddelerinin bir çoğu için kullanılan

destek maddeleri silis veya silis esaslı bileşimlerden hazırlanmaktadır. Bu katılar, tek düze,

22

gözenekli, genellikle 3, 5 veya 10 μm çapında mekanik olarak dayanıklı yapılardır. Tamamen

hidroliz edilmiş silisin yüzeyi, kimyasal olarak reaktif silanol gruplarından meydana gelmiştir :

Si SiSi Si

OOO

OH OHOH OH

Tipik silis yüzeyleri yaklaşık 8 μmol/m2 OH grubu içermektedir. En kullanışlı bağlı-faz kaplaması,

hidrolizlenmiş yüzeyin organosilan ile reaksiyonundan meydana gelen siloksandır. Örneğin :

Cl Si

CH3 CH3

CH3CH3

RSi OH + Si O Si R

Burada; R, bir alkil grubu veya sübstitüe olmuş alkil grubudur.

Dağılım kromatografisi, hareketli ve durgun fazların bağıl polarlığına bağlı olarak iki kısıma

ayrılabilir. Polar sabit faz ve apolar hareketli faz ile yapılan uygulamalar normal-faz

kromatografisi olarak adlandırılırken, sabit fazın apolar, hareketli fazın polar olduğu yöntem ters-

faz kromatografisi olarak bilinir. Normal-faz kromatografisinde, en düşük polariteli bileşenler

hareketli fazda nispeten çok çözündükleri için en önce elüe edilirler; hareketli fazın polaritesindeki

artış, elüsyon zamanının azalması ile sonuçlanır. Bunun aksine, ters-faz yönteminde, en polar

bileşenler en önde yürür ve hareketli fazın polaritesindeki artış, elüsyon zamanını arttırır.

Bağlı-faz dolguları, bağlanan katman apolar karakterde olduğu zaman ters-faz olarak, bu

katman polar fonksiyonlu gruplar içerdiği zaman ise normal-faz olarak sınıflandırılır. Ters-faz

dolgu maddeleri ile doldurulmuş kolonların çoğunda, R grubu bir C8 zinciri (n-oktil) veya bir C18

zinciridir (n-oktadesil). Alkil gruplarının zincir uzunluğu performans üzerinde etkilidir. Daha uzun

zincirler daha fazla alıkoyma özelliğindeki dolguları meydana getirirler. Ters-faz kromatografisi

uygulamalarında en sık kullanılan polar hareketli fazlar metanol, asetonitril veya tetrahidrofuran

gibi çözücüler içeren oldukça polar sulu çözeltilerdir.

Piyasada bulunan normal-faz bağlı dolgu maddelerinde, R, siyano (C-C2H4CN), diol (-

C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (-C3H6NH2) ve dimetilamino (-C3H6N(CH3)2) gibi polar bir

fonksiyonlu gruptur. Bu dolgu maddelerinin polariteleri, siyano en düşük ve amino tipleri en büyük

polaritede olacak şekilde, geniş bir aralıkta değişir. Normal faz dolgularıyla elüsyon, nispeten

apolar etil eter, kloroform ve n-hekzan gibi çözücüler kullanılarak yapılır.

1.4 HPLC Cihazının Kısımları

1.4.1 Pompalar Pompa gereksinimleri; akış hızı, basınç, kararlılık, basınç değişimi, uyumluluk ve servis

kolaylığı olarak özetlenebilir. Pompa, standart analitik kolonlar için 0.1-10 mL/dakika akış hızını

sağlayabilecek kapasitede olmalıdır. Mikrobor kolonlar için 0.01-0.2 mL/dakika akış hızı istenir.

Preparatif çalışmalar için kullanılan kolonlarda 50 mL/dakika akış hızı gerekli olabilmektedir. 5000

psi’a kadar basınç altında, istenen akış hızını sağlayacak kapasiteye sahip olmalıdır. Tuz, tampon ve

düşük kaynama noktalı çözücüler içeren hareketli faz bileşenlerine uyumlu olmalıdır.

1.4.2 Enjeksiyon Üniteleri

1.4.2.1 Manuel enjeksiyon valfleri

Enjeksiyon valfleri, yüksek basınçlı bir ortama örnek çözeltisini aktarmak amacıyla

kullanılan sistemlerdir. Enjeksiyon valfinin örnek yükleme ve enjeksiyon olmak üzere iki konumu

23

vardır. Yükleme konumunda loop, basınçlı ortamdan izole edilir ve bir şırınga yardımı ile istenilen

örnek miktarı loop’a doldurulur.Enjeksiyon konumunda loop tekrar yüksek basınçlı ortama dönerek

örnek çözeltisini sisteme aktarır.

1.4.2.2 Basit otomatik enjektör

Bu enjektörlerde, manuel enjeksiyon valfine benzer bir valf kullanılır. Bu sistemde örnek

şişesine azot basıncı uygulayarak loop doldurulur ve valfin dönmesi ile örnek enjekte edilir.

1.4.2.3 Programlanabilen otomatik örnekleyiciler

Programlanabilen otomatik örnekleyiciler, örnek loop’unu doldurmak için hassas motor ile

hareket ettirilen şırınga kullanırlar. Enjektörle çekilen hacim kontrol edilerek, istenilen miktarda

örnek, loop’a doldurulur.

1.4.3 Kolonlar Ayırabildikleri maksimum madde miktarına göre kolonlar, mikrobor analitik kolonlar,

standart analitik kolonlar ve preparatif kolonlar olmak üzere üç farklı tipte sınıflandırılır.

Dolgu maddelerinin en önemli karakteristikleri; partikül boyutu, partikül şekli, gözenek

yapısı ve yüzey kimyasıdır. HPLC’de kullanılan dolgu maddelerinin çapları, 3-20 µm arasında

değişmektedir. Partikül çapı ne kadar küçükse kolonun etkinliği ve hareketli fazın kolon boyunca

hareketini sağlamak için gerekli olan basınç o kadar büyüktür. Analitik çalışmalarda, 3-10 µm çaplı

partiküller kullanılır. Preparatif çalışmalarda ise 10 µm’den daha büyük çaplı partiküller

kullanılmaktadır. Kolon dolgu maddeleri, küresel veya düzensiz şekillerde olabilir. Kolon

materyalleri genellikle paslanmaz çelik kolonlara doldurulur. Başarılı bir sıvı kromatografik ayırım,

uygun kolon seçimine bağlıdır.

1.4.4 Dedektörler

Kolondan çıkan maddenin derişimi, kolon çıkışına yerleştirilen uygun bir dedektör ile

ölçülür. Dedektörün görevi örnek derişimi ile orantılı elektriksel bir cevap üretmektir. Dedektör

seçimi, örneğin kimyasal yapısına ve yöntemin gereksinimlerine bağlıdır. En çok kullanılan likit

kromatografisi dedektörü, UV-görünür bölgede absorbans ölçümüne dayanan türdür. Bu dedektör,

ya tek dalga boyunda (Hg lambası, 254 nm) çalışır, ya da bir monokromatör yardımıyla bir

döteryum ışık kaynağından çeşitli dalga boylarını seçerek ölçüm yapar. Daha hızlı bir

spektrofotometrik dedektör türü olarak fotodiyot dizisi kullanılır. Fotodiyot dizisi ile birçok dalga

boyunda, aynı zamanda, çok hızlı bir biçimde ölçüm yapmak mümkündür. Fotodiyot dizisinin

uygulandığı spektrofotometrik dedektörlerde monokromatör, ışık kaynağı ile örnek arasına değil,

örnek ile dedektör arasına yerleştirilir. Bu tür bir optik yerleştirmede ışık kaynağından gelen

ışımaların tümü birden örneğe gönderilerek duyarlılık arttırılmış olur. Spektrofotometrik

dedektörler ancak ışığı absorplayabilen bileşenleri ölçebilir ve dalgaboyunun her bir bileşene göre

ayarlanabilmesi nedeniyle seçimli bir dedektör türüdür. Bu dedektörlerle elde edilen gözlenebilme

sınırı 10-10 gmL-1 ’dir ve bu dedektörün kullanılabilmesi için çözücünün absorbansının olmaması

gerekir. HPLC de kullanılan diğer dedektörler arasında IR absorbans dedektörleri, floresans

dedektörleri, kırılma indisi dedektörleri, buharlaştırmalı ışık saçma dedektörleri, elektrokimyasal

dedektörler ile kütle spektrometrik dedektörler sayılabilir.

2. Deneysel Kısım:

2.1. Kullanılan maddeler

2.2. İşlemin yapılışı: Karışımı oluşturan bileşenler için ayrı ayrı en az dört farklı bilinen derişimde

çözelti hazırlanır. Her bir derişimdedeki çözelti kolona enjekte edilir. Kromatogramdan elde edilen

alıkonma süreleri her bir madde için spesifiktir. Pik alanları ise madde miktarı ile orantılıdır. İşlem

sonucunda hesaplanan pik alanları ordinata, analit derişimleri apsise yerleştirilerek her bir bileşen

24

için standart kalibrasyon doğrusu çizilir. Karışım çözeltisi enjekte edilir. İşlem sonucunda

kromatogram üzerinde görülen alıkonma süreleri maddelerin nitel analizinde kullanılır. Alıkonma

sürelerinden yararlanılarak kromatogramdaki hangi pikin hangi maddeye ait olduğu belirlenir. Söz

konusu pike ait pik alanı standart kalibrasyon eğrisinde yerine konularak pik alanından absise bir

dik indirilerek bilinmeyen örneğin derişimi saptanır.

Şekil 4. Pik alanı ile konsantrasyon arasındaki kalibrasyon grafiği

Denemede antioksidan maddeler karışımının analizi gerçekleştirilecektir.

Konsantrasyon

Pik alanı

25

7. FLORESANS SPEKTROFOTOMETRİSİ İLE ASETİLSALİSİLİK ASİT (ASPİRİN) VE

SALİSİLİK ASİT TAYİNİ

Lüminesans; bir maddenin absorpladığı ışımayı daha uzun dalga boyunda geri vermesi

olayıdır. Bu geri verme olayı, singlet uyarılmış seviyeden olursa floresans, triplet uyarılmış

seviyeden olursa fosforesans denir. Floresans süresi çok kısa (10-8 s) iken fosforesans, daha uzun

(10-4 s) ömürlüdür.

So ile gösterilen temel singlet haldeki bir elektron, enerji alarak (S1) uyarılmış singlet

seviyenin herhangi bir titreşim enerji düzeyine çıkabilir. Bu elektronlar, 10-13 s gibi kısa bir süre

içinde titreşim enerjilerini kaybederek S1’in en düşük enerjili titreşim seviyesine gelebilirler.

Elektronlar S1’den S0 temel seviyenin herhangi bir titreşim düzeyine, ışıma yayarak (floresans) veya

ışıma yaymadan enerjisini çarpıştığı çözücü molekülleri vb. aktararak (bu durumda ortam sıcaklığı

artar) geçebilir.

Diğer bir durumda elektron, S1’nin en düşük enerjili titreşim seviyesinden sistemlerarası

geçişle triplet seviyenin (T1) üst titreşim enerji düzeylerine geçebilir. Titreşim hareketi sonucu

enerjisi azalan foton T1’in en düşük titreşim enerjili seviyesine gelir. Bu seviyeden S0 temel

seviyenin herhangi bir titreşim düzeyine, ışıma yayarak (fosforesans) veya ışıma yaymadan geçer

(Şekil 1). Doymuş ya da tek bir çift bağı olan moleküller zayıf floresans verirler. En az bir aromatik

halka içeren, ya da çok sayıda konjuge çift bağ içeren moleküller görünür ve yakın UV bölgede

floresans özellik gösterirler.

Şekil 1. Tipik bir organik molekülün enerji düzeyleri diyagramı (Singlet ve triplet seviyler ile

geçişler)

I: Absorpsiyonla uyarılma

II: Titreşimle sönme

III: Floresans ışıması

IV: Uyarılmış siglet seviyenin

ışımasız sönmesi

V: Sistemler arası geçiş ile

triplet seviyeye geçiş

VI: Triplet seviyede titreşimle

sönme

VII: Uyarılmış triplet seviyenin

ışımasız sönmesi

VIII: Fosforesans ışıması

IX: Sistemler arası geçiş ile

singlet seviyeye geçiş

X: İç dönüşümle ışımasız

sönme

26

–OH, OCH3, -NH2 gibi elektron salıcı gruplar floresansı artırırlar. Fosforesans ise genellikle

soğutma ile katılaştırılmış maddeler de dahil katı maddelerden elde edilir.

1. Floresans Şiddeti ile Derişim İlişkisi

Florimetrede, floresans ışımasının gücü(şiddeti) ölçülerek derişim hesabına geçilebilir. Bu

ilişki aşağıdaki bağıntı ile verilir.

εbc

0 f 0 fF P 1 10 Q k P 2.3 εbc Q k

0 fF 2.3 ε b P Q k c

F α c

Burada;

F: Floresans ışımasının gücü(şiddeti); ε : molar absorptivite; b: çözelti kalınlığı(ışıma yolu); P0:

gelen ışımanın gücü (şiddeti); Qf: Kuantum verimi = Yayılan foton/absorplanan foton; k: ölçülen

foton/yayılan foton’dur.

Bağıntıda parantez içinde kalan kısım sabit (α) kabul edersek, floresans şiddeti, derişimle doğru

orantılı olarak bulunur. α sabiti ise F-c grafiğinden elde edilen doğrunun eğiminden bulunur.

Şekil 2. Kalibrasyon grafiği (c< 10-2 M ise doğrusal bir değişim vardır.)

2. Florimetre Cihazı

Floresans ölçmek amacıyla kullanılan cihazlara florimetre denir. Florimetre cihazı, ışıma

kaynağı, monokromatör veya filtre, örnek kabı, ikinci monokromatör veya filtre, dedektör ve

kaydediciden oluşmuştur.

27

Şekil 3. Florimetrenin başlıca kısımları

A: Işıma kaynağı; B-D: Monokromatör (Optik ağ veya filtre); E: Dedektör; F: Kaydedici

A kaynağından alınan ışıma, floresansa yolaçacak uyartıcı ışıma dalga boyunu seçmek için

bir monokromatörden (B) geçirilir. C örnek kabına düşürülen ışımanın meydana getirdiği floresans,

gelen ışımaya dik açıda olacak şekilde ikinci monokromatöre (D) ulaştırılır. Burada floresans ışıma

diğer kaçak ışınlardan temizlenir ve dedektöre (E) ulaştırılır. Burada ışıma enerjisi, elektrik

sinyaline çevrilir ve F kaydedicisinde floresans şiddeti kaydedilir.

3. Deney

3.1 Cihaz ve Malzemeler

i.) Spektroflorimetre

ii.) Balonjojeler, 8x2.5 mL ve 4x100 mL

iii.) Pipetler, 1x5 mL, 4x10 mL, 1x15 mL ve 1x20 mL

iv.) Süzgeç kağıdı, Whatman No:1

3.2 Reaktifler

Asetilsalislik asit(ASA), salisilik asit(SA), aspirin (Tablet), kloroform (spektroskopik saflıkta),

asetik asit (%1, v/v, kloroform içinde), benzoik asit.

2.22x10-3 M ASA stok çözeltisi, %1’lik asetik asit içinde (0.40 mg/L)

2.22x10-5 M ASA standart çözeltisi, %1’lik asetik asit içinde (4.0 μg/L)

5.43x10-3 M SA stok çözeltisi, %1’lik asetik asit içinde (0.75 mg/L)

5.43x10-5 M SA standart çözeltisi, %1’lik asetik asit içinde (7.5 μg/L)

Salisilik asit Asetilsalisilik asit

28

3.3 Asetilsalisilik asit (ASA), salisilik asit (SA) ve ASA-SA karışımlarının spektrumları

Şekil 4a. 1 10-4 M Asetilsalisilik asidin % 1’lik asetik asit-kloroform karışımı içindeki uyarma-

emisyon spektrumu

Şekil 4b. 2.23x10-5 M Salisilik asidin %1’lik asetik asit-klorofom karışımı içindeki uyarma-

emisyon spektrumu

29

Şekil 4c. Aspirin (asetilsalisilik asit) + salisilik asit karışımının %1’lik asetik asit-klorofom karışımı

içindeki emisyon spektrumu-uyarma 280 nm’de yapıldı.

3.4 Kalibrasyon Grafikleri (F-c)

3.4.1 ASA Kalibrasyonu

2.22x10-5 M’lık ASA standart çözeltisinden (4.0 μg/L) pipetle 5, 10, 15, ve 20 mL’lik

kısımlar alınarak 25 mL’lik balojojelere konur. İşaret çizgisine kadar %1’lik asetikasit-kloroform

karışımı ile doldurulur. 254 nm’deki ışımayla uyarılan saf %1’lik asetik asit-kloroform karışımının

ve her bir çözeltinin (F) floresansı okunur. Elde edilen değerlerle F-c grafiği çizilir.

3.4.2 SA Kalibrasyonu

5.43x10-5 M’lık SA standart çözeltisinden (7.5 μg/L) pipetle 5, 10, 15, ve 20 mL’lik kısımlar

alınarak 25 mL’lik balojojelere konur. İşaret çizgisine kadar %1’lik asetikasit-kloroform karışımı ile

doldurulur. 313 nm’deki ışımayla uyarılan saf %1’lik asetik asit-kloroform karışımının ve her bir

çözeltinin (F) floresansı okunur. Elde edilen değerlerle F-c grafiği çizilir.

3.5 İşlem

3-5 adet aspirin tableti havanda toz haline getirilir. 400 mg’lık bir kısım tartılarak alınır ve

100 mL’lik balon jojeye aktarılır. %1’lik asetikasit-kloroform karışımında çözülür ve işaret

çizgisine kadar bu karışımla doldurulur. Hızlı bir şekilde süzgeç kağıdından süzülür. Bu süzüntüden

alınan örnekte salisilik asidin % floresansı belirlenir (SA kalibrasyonundaki şartlarda).

Süzüntüden alınan 1 mL üzerine 1000 mL %1’lik asetikasit-kloroform karışımı ilave edilir. Bu

karışımdan 10 mL alınıp 100 mL’ye seyreltilerek, ASA’nın % floresansı belirlenir (ASA

kalibrasyonundaki şartlarda). ASA okumaları 1 saat içinde yapılmış olmalıdır. Okunan floresans

değerlerinden kalibrasyon grafikleri kullanılarak konsantrasyonlar bulunur. Sonuçlar ppm olarak

verilir.

30

8. GAZ KROMATOGRAFİSİ

Bir karışımdaki gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden

ayrılması amacı ile kullanılan kromatografi yöntemlerinin genel adı gaz kromatografisidir. Bu

yöntemde hareketli faz, helyum, hidrojen, azot veya argon gibi bir gaz olup buna taşıyıcı gaz adı

verilir. Sabit faz ise katı veya bir katı yüzeyine kaplanmış (katıya emdirilmiş) bir sıvı olabilir. Buna

göre gaz kromatografisi ikiye ayrılır;

1) Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi (GSC)

2) Sabit fazı sıvı olan gaz-sıvı kromatografisi (GLC)

Sabit fazı katı olan gaz-katı kromatografisi zayıf (fiziksel) adsorpsiyon olaylarına dayanır. Bu

metotla elde edilen pikler genelde kuyrukludur. Kuyruklu piklerin birbirinden ayrılmaları çok

güçtür. Bundan dolayı gaz-katı kromatografisi oldukça az kullanılır. Kullanılması da, daha çok

küçük moleküllü maddelerin ayrılmaları konusunda olur. Gaz-katı kromatografisinde sabit faz

olarak silikajel, alümina (Al2O3), aktif kömür gibi maddeler kullanılır. Bu kromatografi dalında

ayrılacak maddeler üzerinde sadece katı faz etkili olur.

Gaz-sıvı kromatografisinde yüzeyi geniş gözenekli katı maddeye özel bir sıvı emdirilir. Bu sıvı, katı

maddenin gözenekleri dahil bütün yüzeyine dağılır ve sabit bir faz gibi davranır. Hareketli olan gaz

fazı bu fazın içinden kolaylıkla geçer. Bu kromatografi çeşidinde etkin olan olay dağılmadır.

Analizi yapılacak örnek içindeki maddeler, bu iki faz arasında özelliklerine göre dağılarak taşınır.

Günümüzde bu GC tütünde sabit faz, katıya emdirilmiş sıvı yerine destek materyaline kimyasal

olarak bağlı fonksiyonel maddeler (gruplar)dir.

Gaz Kromatografisi Cihazı:

Şekil 1:Gaz kromatografisi cihazının şeması.

Taşıyıcı Gaz Sistemi

Taşıyıcı gaz olarak, helyum, argon, azot, karbondioksit gibi kimyaca inert gazlar kullanılır. Bu

gazlardan hangisinin kullanılacağı, genelde cihazdaki dedektöre bağlıdır. İçinde taşıyıcı gaz

bulunan silindirden regülatörler yardımıyla basınç düşürülerek, sabit akış hızında taşıyıcı gaz kolon

sistemine gönderilir.

ÖRNEK ENJEKSİYON SİSTEMİ

Gaz kromatografisi cihazına örnek enjekte edilmesi çok önemli ve dikkat isteyen bir işlemdir.

Ayrılacak bileşikler, kolon girişine bir seferde verilir. Gazlar, gaz kaçırmayan şırınga veya özel gaz

muslukları kullanılarak, sıvılar şırınga kullanılarak, katılar önce inert bir çözücüde çözüp sonra

şırınga kullanılarak sisteme verilir. Sistemin örnek verme yerinde küçük bir lastik tıpa bulunur,

buna ‘‘septum’’ denir. Şırınga septuma batırılarak sisteme girilir ve örnek verilir. Bu septum

zamanla eskir ve buradan gaz kaçakları olur. Bu durumda yenisiyle değiştirilir. Kullanılacak septum

enjektör kısmının sıcaklığına dayanacak cinsten olmalıdır.

31

Optimum kolon verimliliği için, örnek çok büyük hacim, miktarda olmamalı ve kolona çok çabuk

verilebilmelidir. Gaz kromatografisinde aşağıda gösterilen split (bölünmeli)/splitless (bölünmesiz)

enjeksiyon bölmesi yaygın olarak kullanılır. Enjektör bölünmeli ve bölünmesiz olmak üzere iki

farklı şekilde çalışır.

Şekil 2:Bölünmeli/bölünmesiz enjeksiyon bölmesinin kesiti.

Split/splitless enjektörü haricinde iki çeşit enjektör daha bulunmaktadır. Bunlar PTV (Programmed

tempature vaporising injector) ve On-Column enjektördür.

Şekil 3: PTV enjektör şeması. Şekil 4: On-Column enjektör şeması.

KOLONLAR VE SABİT FAZLAR Gaz kromatografisinde genel olarak kapiler ve dolgulu olmak üzere iki farklı kolon çeşidi kullanılır.

Dolgulu kolonlar, sabit faz ile dolu olup uzunluğu 0,5-10 m ve iç çapı 2-4 mm’dir.

Kapiler (kılcal) kolonlarda ise sabit faz, kolonun iç yüzeyine veya destek materyaline ince bir film

halinde kaplanır. Kolonlar bakır, alüminyum, paslanmaz çelik, cam veya plastik olabilir. Kolon

uzunluğu 2-50 m ve iç yarıçapı 0,1-0.25 mm’dir.

Dolgulu Kapiler

Şekil 5: Dolgulu ve Kapiler kolonlar.

32

KOLON FIRINI

Duyarlı ve tekrarlanabilir çalışmalar için kolon sıcaklığı hassas bir şekilde kontrol edilmelidir.

Düşük sıcaklıklar iyi çözünürlük vermekle birlikte elüsyon süresini arttırır. Eğer örnek yüksek

kaynama noktası aralığına sahip ise, sıcaklık programı uygulanabilir. Burada kolon fırını sıcaklığı

sürekli veya kademeli olarak arttırılarak ayrışma sağlanır.

Şekil 6: Kolon fırını.

DEDEKTÖRLER

Gaz kromatografisi sistemlerinde birçok dedektör kullanılabilir. Farklı dedektörler farklı seçicilik

sağlarlar. Seçici olmayan dedektör, taşıyıcı gaz dışında tüm bileşiklere cevap verir. Seçici dedektör

ise belli yapılardaki (kimyasal ve fiziksel özelliklerdeki) bileşiklere cevap verirken, spesifik

dedektörler tek bir kimyasal gruba cevap verir.

Gaz kromatografisi sistemlerinde kullanılan dedektörler; Termal İletkenlik Dedektörü (TCD), Alev

İyonizasyon Dedektörü (FID), Alev Fotometrik Dedektör (FPD), Elektron Yakalama Dedektörü

(ECD), Azot-Fosfor Dedektörü (FTD-NPD), β-Işını Dedektörü ve Kütle Spektrometresidir.

GAZ KROMATOGRAFİSİ VE KÜTLE SPEKTROMETRİSİ (GC-MS)

GC/MS adı verilen teknikte, gaz kromatografisi ile kütle spektrometrisi teknikleri birlikte kullanılır.

Gaz kromatografisi (GC) cihazı karışımdaki bileşenleri birbirinden ayırır ve ona bağlı bulunan kütle

spektrometresi (MS) ise, bu bileşenlerin her birinin yapısal özelliklerine ilişkin bilgiler elde

etmemize yarar. Eğer derişimi bilinen standartlar kullanılırsa, GC-MS yöntemiyle örneğimizle ilgili

nicel veriler de elde edebiliriz.

GC/MS yönteminde karışımın çok küçük bir miktarını analiz etmek mümkündür. Bu yöntemde

uygulama, genellikle örneğin seyreltik bir çözeltisinin 0,001ml (1,0 µL)’lik ya da daha az

miktarının, bir şırıngayla gaz kromatografisinin enjeksiyon sistemine verilmesiyle başlar.

Karışımdaki moleküller, bir gaz tarafından kolon boyunca sürüklenirken, kaynama noktalarına ve

sabit faza olan ilgilerine bağlı olarak kolon içinde değişik hızlarla hareket ederler.

Karışımdaki her bir bileşen GC kolonundan çıktıktan sonra kütle spektometresine girer. Burada

elektron bombardımanına uğrayan örnek moleküllerinden moleküler iyon ve parçalar oluşur ve

kütle spektrumu elde edilir. Böylece, orijinal karışımdaki her bir bileşenin ayrılarak kütle

spektrumlarının kaydedilmesi önemli bir üstünlüktür. GC-MS yönteminin karışımları ayırma ve her

bileşenin yapısı hakkında bilgi sağlama yeteneği onu analitik, adli tıp ve organik sentez

laboratuarlarının vazgeçilmez aracı haline getirmiştir.

33

Şekil 7: GC-MS şeması

Gaz kromatografisi kolonu ile kütle spektrometresi arasında yer alan ve organik bileşikten taşıyıcı

gazı ayıran aygıtlar bulunmaktadır. Bu aygıtlara moleküler arayüzey denir.

Becker-Ryhage (Jet) Arayüzeyi (İnterface)

Becker-Ryhage arayüzeyinde kolondan gelen taşıyıcı gaz ve organik bileşik molekülleri daralan bir

ağızdan geçirildiklerinde hızları arttığından belirli bir momentum kazanırlar, taşıyıcı gazın

molekülleri küçük olduğundan momentumları da azdır. Bu nedenle daralan ağızdan vakuma salınan

moleküllerden taşıyıcı gazınkiler etrafa daha kolay difüzlenir. Büyük moleküller ise daralan ağzın

karşısına yerleştirilmiş ve kütle spektrometresine bağlı toplayıcı deliğe yönlenirler ve gaz jeti

buraya ulaştığında, taşıyıcı gazın büyük bir kısmıyla organik bileşiğin az bir kısmı uzaklaşıp

gitmiştir. Böylece organik bileşikçe zenginleşen gaz karışımı toplayıcı delikten girerek iyonlaşma

bölgesine gider.

Şekil 8: Becker-Ryhage (Jet) Ayırıcı

KÜTLE SPEKTROMETRİSİ

Kütle spektrometrisinde, gaz fazında atom ve moleküllerden hızlı hareket eden iyonlar

oluşturularak, bileşiğin molekül ağırlığı ve kimyasal yapısı hakkında bilgi sağlamak için bu iyonlar

analiz edilir. Kütle spektrometrisi, bu iyonları kütle/yük (m/z) temelinde sınıflandırarak kaydeder.

Kütle spektrometrisi, sonuçları her biri belirli bir m/z oranına karşılık gelen değişik şiddetteki

piklerden oluşan bir grafik şeklinde gösterir. Bu gösterim şekline kütle spektrumu denir. Kütle

spektrumu pratik olarak parçacıkların kütlelerine karşın, bağıl bolluklarının çizimiyle elde edilir.

Bir molekülün ya da iyonun parçacıklara nasıl parçalandığı bileşiğin karbon iskeletine ve bulunan

işlevsel gruplara bağlıdır. Bu nedenle parçacıkların yapı ve kütleleri ana molekülün yapısı hakkında

ipucu verir. Bunun yanında bileşiğin molekül ağırlığının belirlenmesi de olasıdır.

Spektrumun her piki molekülün bir parçacığına aittir. Artan m/z değerlerine göre pikler,

spektrumun solundan sağına doğru sıralanacak şekilde moleküler parçacıklar taranır. Piklerin

şiddetleri parçacıkların bağıl bollukları ile orantılıdır. Bu bolluklar ise bağıl kararlılıklarına bağlıdır.

34

Spektrumun en yüksek pikine temel pik denir ve bu pikin şiddeti %100 olarak kabul edilir. Daha

düşük pikler temel pike göre hangi orana sahiplerse o oranda gösterilir. Temel pik bazen moleküler

iyon piki olmakla beraber çoğunlukla daha küçük parçacıklardan birinin pikidir. Molekül piki

molekül kütlesine eşit olan piktir.

Şekil 9: Kütle spektrometresi şeması.

İYON KAYNAĞI

İyonlaşma bölgesine gelen gaz fazındaki örneğin basıncı yaklaşık 10-6-10-5 Torr dolayında tutulur

ve çoğunlukla;

M + e- → M∙+ + 2e- Reaksiyonuna göre pozitif iyonlar elde edilir.

Pozitif iyon elde edebilmek için elektron iyonlaştırma ve kimyasal iyonlaştırma yöntemleri yaygın

olarak kullanılır.

Elektron İyonlaştırma Yöntemi (EI)

Kütle spektrometresinde, gaz halindeki moleküller, düşük basınç altında, yüksek enerjili elektron

demetiyle bombardıman edilirler. Genellikle, elektron demetinin enerjisi, 70 eV (elektron volt)tur

ve bu bombardıman, moleküldeki elektronlardan birini uzaklaştırarak moleküler iyon adı verilen

pozitif yüklü iyonları oluşturabilir.

Şekil 10: EI şeması.

Kimyasal İyonlaştırma Yöntemi (CI)

Gaz halindeki moleküller, başka iyonlarla çarpışarak da iyonlaştırılabilir. Kimyasal iyonlaştırmada,

[M+H]+ gibi moleküler iyonların oluşumu için örnek molekülünü iyonlaştıran bir radikal oluşumu,

metan gibi uygun bir gazın iyonlaştırılmasıyla sağlanır. Kimyasal iyonlaştırma, bir molekülü

iyonlaştırmanın daha az enerji gerektiren yoludur. Bu nedenle CI’da EI‘dan daha az parçalanma

meydana gelir. Dolayısıyla CI ürünleri molekülün yapısı hakkında detaylı bilgi vermez.

KÜTLE AYIRICILARI

GC-MS sisteminde kullanılan başlıca kütle ayırıcıları; dört kutuplu ve iyon kapanlı kütle

ayırıcılarıdır.

Dört Kutuplu Kütle Ayıracı (Quadrapole)

Elektrod olarak hazırlanmış dört silindirik metal çubuktan oluşmuştur. Karşıt çubuk çiftleri bir

doğru akım (direct current, dc) kaynağının zıt uçlarına bağlanır. Bu çiftler aynı zamanda, radyo

35

frekans bölgesinde bir alternatif akım (alternative current, ac) kaynağına çiftlerin potansiyelleri

arasında 180º faz farkı olacak şekilde bağlanır.

Kaynaktan gelen iyonlar, 5-15 V’luk bir potansiyelle hızlandırılır ve bu çubuklar arasındaki boşluğa

enjekte edilir. Dört kutuplu ayırıcı, belli dc/ac değerinde sadece m/z oranının küçük bir aralığındaki

iyonları geçirir. Bunun dışındaki tüm iyonlar çubuklara çarpar ve yüksüzleştirilir. dc/ac potansiyel

oranını değiştirerek, geçirdiği m/z değerleri aralığını değiştirmek ve böylece spektral tarama

yapmak mümkündür.

Şekil 11: Dört Kutuplu Kütle Ayırıcı (Quadrupole) şeması.

İyon Kapanlı Kütle Ayırıcı (Ion Trap) Bir iyon kapanlı ayırıcı, merkezde halka biçimindeki bir elektrod ve her iki yanda bulunan kapak

elektrodlardan oluşur. Halka şeklindeki elektroda değişken bir radyo frekans gerilimi uygulanır.

Uygun m/z değerli iyonlar halkayla çevrilmiş, boşluksuz, kararlı bir yörüngede dolaşırlar.

İyon kapanlı cihazlar, yaygın olarak kullanılırlar ve ucuzdurlar. Bunların dört kutuplu cihazlara göre

üstünlükleri daha duyarlı olmalarıdır. Ayrıca daha önemli üstünlüğü yüksek rezolüsyondur (ayırım).

Bu da doğru kütle ölçümü sağlar.

Şekil 12: İyon Kapanlı Kütle Ayırıcı (Ion Trap).

(İYON) DEDEKTÖRÜ

İyon dedektörü olarak genellikle elektron çoğaltıcı dedektörler kullanılır.

Elektron Çoğaltıcı

Dedektöre çarpan pozitif yüklü iyonlar yüzeyden birkaç elektron fırlatır ve bu elektronlar anotta

tutularak elektrik akımına dönüştürülür. Kesitli-dinot elektron çoğaltıcı ve sürekli-dinot elektron

çoğaltıcı olmak üzere iki çeşit elektron çoğaltıcısı vardır.

36

Şekil 13: İyon Dedektörü şeması.

DENEYSEL KISIM

GC-MS Yöntemi ile Triaseton triperoksit (TATP) Tayini

Yöntemin Uygulanışı: GC-MS cihazında elektron iyonizasyonu modunda ve dört kutuplu kütle

analizörü kullanılarak eser miktardaki TATP’nin asetonitrilde hazırlanmış örnekleri ile çalışılır.

Çalışma şartları;

Kolon : Polar olmayan % 5 fenil-metilpolisiloksan 5 MS 30m×320μm×0,25μm

Enjeksiyon : Bölünmesiz (splitless) enjeksiyon ile 1µL hacimde

Bekleme zamanı : 3 dakika

Enjeksiyon sıcaklığı : 110 °C

Sıcaklık programı : Fırın başlangıç sıcaklığı 50 °C, 3 dakika bekleme zamanı sonrası 8 °C dk−1

arttırılarak 100 °C son sıcaklığa getirilir ve 6 dakika bu sıcaklıkta bekletilir.

Ara yüzey sıcaklığı : 150 °C

MS kaynak sıcaklığı : 200 °C

Tarama aralığı : 30-300 m/z

Taşıyıcı gaz : Helyum

Akış hızı : 1,2 mL dk-1

1, 3, 5, 7, 10 ppm örneklere yöntem uygulanarak çalışma doğrusu elde edilir.

GC-MS YÖNTEMİ İLE TATP TAYİNİ SONUÇLARI:

5 mg L-1 derişimindeki asetonitrilli TATP çözeltisi 1’er µL hacimde GC-MS’e enjeksiyonuyla 30-

300 m/z arası taramada 10.45 dakika alıkonma zamanında Şekil 14’de görülen kütle spektrumu elde

edilmiştir. Kütle spektrumunda TATP için elde edilen karakteristik iyonlar m/z 43, 58 ve 75’dir.

37

Şekil 14. TATP (5 mg L-1) için 30-300 m/z aralığında elde edilen kütle spektrumu.

Seçilmiş İyon İzleme (Selected Ion Monitoring, SIM) modunda m/z 43’de yapılan çalışmalarda 1,

3, 5, 7, 10 ppm derişimlerdeki TATP örneklerinden elde edilen pik alanları ile derişimler arasında

standart kalibrasyon doğrusu çizilir. Derişimi bilinmeyen bir TATP örneği GC-MS sistemine

enjekte edilir ve elde edilen pik alanı kalibrasyon doğrusunda yerine konularak örneğin derişimi

belirlenir. Şekil 15’de m/z 43’de 5 ppm derişimde TATP için elde edilen GC-MS kromatogramı

görülmektedir.

Şekil 15 : TATP’nin (5 mg L-1) için SIM modunda m/z 43’de GC-MS kromatogramı.

38

9. ENERJETİK MADDELERİN (PATLAYICILARIN) ELEKTROANALİTİK

YÖNTEMLE ANALİZİ

Elektroanalitik yöntemler

Elektroanalitik Kimyanın temeli, elektronların bir türden diğerine aktarıldığı bir kimyasal

tepkime olan redoks (indirgenme-yükseltgenme) tepkimesidir.

Yükseltgen1 + İndirgen2 İndirgen1 + Yükseltgen2

Yükseltgen1, İndirgen2’den elektron alarak indirgenirken, İndirgen2, elektron kaybettiği için

yükseltgenir. Bir maddenin indirgenme veya yükseltgenme eğilimi, indirgenme potansiyellerine

bağlıdır. İndirgenme potansiyelinin daha pozitif olması, maddenin yükseltgen şeklinin daha

kuvvetli yükseltgen, indirgen şeklinin ise daha zayıf indirgen olması anlamına gelir. Aynı şekilde

daha negatif indirgenme potansiyeli, maddenin yükseltgen şeklinin daha zayıf yükseltgen, indirgen

şeklinin ise daha kuvvetli bir indirgen olması demektir.

Redoks tepkimelerini incelemenin ve bu tepkimelerdeki elektriksel büyüklükleri ölçebilmenin

temeli elektrokimyasal pil oluşumudur. Bir elektrolit ve bir çift elektrottan oluşan elektrokimyasal

pillerin voltaik (galvanik) ve elektrolitik olmak üzere iki türü vardır. Her iki pil türünde de

yükseltgenmenin oluştuğu elektrot anot, indirgenmenin oluştuğu elektrot ise katottur. Voltaik piller,

elektroanalitik yöntemlerden potansiyometrik, elektrolitik piller ise voltametrik yöntemlerde

kullanılırlar.

Bir elektrokimyasal pil oluşturulabilmesi ve çok sayıda kullanışlı analitik yöntemler olarak

çalıştırılabilmesi için birçok yol vardır. Tablo 1’de elektronalitik yöntemlerin bazıları

görülmektedir.

Tablo 1. Bazı elektroanalitik yöntemler

Ölçülen Büyüklük Kontrollü Değişken Yöntem Adı

E (Potansiyel) i = 0 Potansiyometri

Titrant hacmine karşılık E i = 0 Potansiyometrik titrasyon

E’ekarşılık i (akım) Derişim Voltametri

Titrant hacmine karşılık i E Amperometrik titrasyon

Akım miktarı (i x t) E Kulometri

Ayrılan fazın ağırlığı E Elekrogravimetri

Voltametrik Yöntemler

Voltametri, bir indikatör veya çalışma elektrodunun polarize olduğu şartlar altında,

uygulanan potansiyelin bir fonksiyonu olarak akımın ölçülmesinden faydalanılarak analit hakkında

bilgi edinilen elektroanalitik yöntemdir. Voltametride deneyler üçlü elektrot sisteminde

39

gerçekleştirilmektedir. Üç elektrottan birisi zamanla potansiyeli değiştirilen indikatör elektrot

(çalışma elektrodu)dur. Voltametride çalışma elektrodu olarak, civa, platin, altın, karbon elektrot

(grafit, karbon pasta, camsı karbon) gibi elektrotlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Elektrot

sistemindeki ikinci elektrot, potansiyeli deney süresince sabit kalan referans elektrottur. Referans

elektrot genellikle Ag/AgCl veya doymuş kalomel elektrottur. Elektrot sistemindeki üçüncü elektrot

ise karşıt veya yardımcı elektrottur. Karşıt elektrot olarak ise genellikle Pt tel kullanılır.

Voltametride akım, çalışma elektrodu üzerinde maddelerin indirgenmesi veya yükseltgenmesi

sonucunda oluşur. İndirgenmeden dolayı oluşan akıma katodik akım, yükseltgenmeden dolayı

oluşan akıma ise anodik akım denir.

Voltametrik ölçümlerde elektrolitik bir pil kullanılır (Şekil 1). Potansiyel kontrolü bir

potansiyostat ile sağlanır. Voltametrik sistemde akım, elektroaktif türün mikroelektroda difüzyon

hızı ile sınırlanır.

Şekil 1.Voltametrik ölçümler için pil

Voltametrik analizlerde kullanılan yöntemler, potansiyelin uygulanış tarzına bağlı olarak,

doğrusal taramalı doğru akım voltametrisi, polarografi, normal puls voltametrisi ve polarografisi,

diferansiyel puls voltametrisi ve polarografisi, kare dalga voltametrisi, hızlı taramalı voltametri,

döngüsel (cyclic, siklik) voltametri (CV), sıyırma voltametrisi şeklinde sınıflandırılabilir

Voltametride kullanılan çözücüler ve destek elektrolitler:

Elektrokimyasal deneyler bir destek elektrolit-çözücü sisteminde yapılır. Seçilecek olan

çözücünün; kimyasal iletkenlik, elektriksel iletkenlik, çözme gücü, asit-baz özelliği, vizkozite,

dielektrik sabiti ve polaritesinin bilinmesi gereklidir. Çözücünün kolay bulunabilirliği ve ucuzluğu,

kolay saflaştırılabilmesi, istenilen şekilde düşük donma noktası ve yüksek kaynama noktasına sahip

olması da istenilen özelliklerdir. Elektrokimyasal çalışmalarda en çok kullanılan organik çözücülere

40

örnek olarak dimetilformamid (DMF), dimetilsülfoksit (DMSO) ve asetonitril verilebilir. DMF’nin

toksik olma ve istenmeyen reaksiyonlara girme gibi dezavantajları vardır. Bu nedenle DMSO ve

asetonitril, DMF’den daha uygun çözücülerdir. Anorganik maddeler için su ve alkoller daha

uygundur. Destek elektrolitler elektrik yükünüm taşınımına katkıda bulunurlar. Ayrıca çözeltinin

elektriksel direncini azaltırlar. Destek elektrolit olarak KCl, KNO3, NaClO4 gibi anorganik bir tuz

seçilebileceği gibi bir mineral asidi ya da bir baz da olabilir. Organik çözücüler kullanıldığı zaman

destek elektrolit olarak tetrabutilamonyumtetrafloroborat (TBATFB), tetrabutilamonyumbromür

(TBAB) ve tetrabutilamonyumtetrafloroperklorat (TBATFP) kullanılmaktadır.

Enerjetik maddelerin (patlayıcıların) döngüsel voltametri ile analizi

Elektrokimyasal analiz yöntemlerinden voltametri, enerjetik (patlayıcı) maddelerin

analizinde kullanılan bir yöntemdir. Cihazların basit, taşınabilir olması ve eser miktarda tayin

yapılabilmesi gibi avantajları vardır. Bu maddelerin yapısında kolayca indirgenen nitro gruplarının

olması elektrokimyasal (voltametrik) yöntemin kullanılabilmesi açısından önemlidir. Genelde

trinitro bileşikleri (TNT veya pikrik asit gibi), dinitro ve trinitro bileşiklerinden daha kolay

indirgenmektedir. Voltametrik yöntemin verimliliği kullanılan elektroda bağlıdır. Civa, karbon veya

altın/amalgam tipi elektrotların yanı sıra modifiye edilmiş karbon nanotüpler de kullanılmaktadır.

Deneyde camsı karbon elektrot kullanılarak döngüsel voltametri yöntemiyle trinitrotoluen

(TNT) tayini yapılacaktır.

Deneyin Yapılışı:

Çalışma doğrusunun oluşturulması için 40-120 ppm derişim aralığında, asetonitrilde

hazırlanmış TNT örneklerinin her birine şu yöntem uygulanır: Analizi yapılacak TNT

örneğinden örnek hücresine 5 mL alınır, üzerine destek elektrolit olarak tetrabütilamonyumbromür

eklenir ve ultrasonik banyoda çözünme sağlanır. Elektrotlar örnek hücresine yerleştirilip

potansiyostat ile elektrot bağlantıları kurulur. Örnek hücresi ortamından 5 dk boyunca azot

geçirilir. Örneklerin ölçümü 0,2 V ile -1,6 V potansiyel aralığında döngüsel voltametri yöntemiyle

yapılır ve analizi yapılan enerjetik madde için karakteristik pik potansiyelleri belirlenerek bu

potansiyeldeki akım değerleri ölçülür. Çalışılan her bir derişim ile bu derişimlerde TNT

örneklerinden elde edilen akım değerleri arasında çalışma doğrusu hazırlanır.

Örnek Analizi:

Derişimi bilinmeyen TNT örneği yukarıda belirtilen yöntemle analiz edilerek akım değeri

elde edilir ve çalışma doğrusu kullanılarak örneğin derişimi tespit edilir.

41

Şekil 2: 100 ppm TNT örneğinin döngüsel voltamogramı.