Prof. Milton Luiz da Paz Lima

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA

INSTITUTO FEDERAL GOIANO CAMPUS URUTAÍ

DISCIPLINA DE FITOPATOLOGIA II

CLÍNICA

FITOSSANITÁRIA

Clínica Fitopatológica da Esalq - http://www.lfn.esalq.usp.br/

http://www.lfn.esalq.usp.br/clinica/

RECOMENDAÇÕES PARA COLETA,

PREPARO E ENVIO DE AMOSTRAS

AMOSTRAS DE PLANTAS: • Amostras apresentando sintomas típicos da doença. • Amostras em estágio inicial ou intermediário. • As plantas devem apresentar partes sadias e doentes. • Colete um número razoável de plantas (2 a 3 plantas para cada

amostra), considerando, evidentemente, o custo do transporte. • No caso de plantas pequenas, colete a planta inteira, com as raízes. • Quando não for possível enviar plantas inteiras, como no caso de

plantas maiores (ex. árvores, arbustos), cortar porções de todas as partes da planta: ramos (inclusive com flores e/ou frutos), caule e raízes. É fundamental a coleta de fragmentos de raízes e da base do caule, principalmente de plantas murchas, amareladas ou com crescimento reduzido.

RECOMENDAÇÕES PARA COLETA,

PREPARO E ENVIO DE AMOSTRAS

AMOSTRAS DE PLANTAS:

• No caso de culturas hidropônicas, as plantas devem ser retiradas das bancadas de cultivo, tomando o cuidado de deixar escorrer e secar o excesso de solução nutritiva das raízes.

• As plantas devem ser envolvidas em folha de jornal ou sacos de papel, acondicionadas em caixas de papelão de sedex, devidamente identificadas e imediatamente enviadas pelo correio.

• Apenas as plantas que forem encaminhadas pessoalmente à Clínica Fitopatológica e com chegada prevista para o mesmo dia da coleta devem ser acondicionadas em sacos plásticos.

RECOMENDAÇÕES PARA COLETA, PREPARO E ENVIO DE AMOSTRAS

AMOSTRAS DE SOLO:

• Amostras de solo devem ser encaminhadas para análise apenas na ausência da planta doente. A coleta deve ser realizada até 30 cm de profundidade, de preferência no local onde estavam as raízes das plantas, ou nos canteiros ou covas que a nova cultura será plantada.

• Aproximadamente 500 g de solo ou substrato são suficientes para análise de fitopatógenos. Amostras de solo ou substrato devem ser colocadas em saco plástico fechado e devidamente identificadas.

• STOP 01/09

RECOMENDAÇÕES PARA COLETA, PREPARO E ENVIO DE AMOSTRAS

ENVIO DAS AMOSTRAS

• Para o exato diagnóstico de uma doença de planta, a amostra vegetal deve chegar ao laboratório em perfeitas condições, preferencialmente frescas.

• As amostras devem ser enviadas para análise imediatamente após a coleta. O ideal é que sejam enviadas na segunda ou no máximo terça-feira de manhã para evitar que fiquem retidas no correio durante o final de semana e se deteriorem.

RECOMENDAÇÕES PARA COLETA, PREPARO E ENVIO DE AMOSTRAS

ENVIO DAS AMOSTRAS

• Juntamente com a amostra é fundamental que seja enviada a ficha de informações totalmente preenchida.

• Amostras enviadas sem a ficha informativa adequadamente preenchida e/ou em estágio avançado de deterioração não poderão serem analisadas.

• As amostras também podem ser entregues no local.

RECOMENDAÇÕES PARA COLETA, PREPARO E ENVIO DE AMOSTRAS

PAGAMENTO

• Esalq – “O pagamento pode ser realizado através de boleto bancário

(que será enviado ao solicitante pelo correio) ou através de depósito em conta corrente (A forma de pagamento deve ser selecionada na ficha informativa)”.

• O depósito deve ser realizado em nome da FEALQ (Fundação de Estudos Agrários Luiz de Queiroz) - (CNPJ: 48.659.502/0001-55), no BANCO DO BRASIL, agência 3149-6, c/c 4008-8.

• O laudo diagnóstico será enviado via e-mail ou pelo correio (se o solicitante não possuir endereço eletrônico), após comprovação do pagamento.

Importância

• A partir da correta identificação decorrem as indicações aos métodos mais adequados para o controle e manejo da enfermidade.

• Técnicas de Diagnose (maiores informações): Agrios (1997) e Amorim & Salgado (1995).

O que é a diagnose?

• Diagnóstico: Sintomas e Sinais.

• Visualização de estruturas patogênicas: MO.

• Necessidade ao Identificador: Experiência e treinamento contínuo.

• Necessidade de Precisão.

• Brasil existem Laboratórios: laudos sobre o agente causal – Indicações de métodos de controle.

LAUDOS

Organismos Fitopatogênicos importantes

•Fungos: Reino Fungi – Claviceps, Diaporthe, Erysiphe, Glomerella, Ceratocystis, Athelia, Tanatephorus, Puccina, Uromyces, Phakopsora, Tilletia, Ustillago, Sphaceloma, Urocystis, Olpidium, Rhizopus, Mucor, Gibertella; Fungos Mitospóricos: Verticillium, Fusarium, Oidium, Septoria, Rhizoctonia, Alternaria, Cercospora, Colletotrichum; Reino Straminipila – Albugo, Peronospora, Plasmopara, Pythium e Phytophthora, Reino Protozoa – Plasmodiophora, Spongospora, Polymixa.

•Bactérias: Reino Procariotae - Agrobacterium, Clavibacter, Erwinia, Pseudomonas, Ralstonia, Xanthomonas, Streptomyces e Xyllela. Contudo existem novas propostas de reclassificação de vários gêneros e espécies baseados em técnicas de biologia molecular.

Organismos Fitopatogênicos importantes

Vírus: Alfamovirus, Badnavirus, Bromovirus, Bymovirus, Capilovirus, Carlavirus, Carmovirus,

Caulimovirus, Closterovirus, Comovirus, Cucumovirus, Cytohabdovirus, Diathovirus,

Enamovirus, Fabavirus, Fijivirus, Furovirus, Geminivirus, Idaeovirus, Ilavirus, Luteovirus,

Machlovirus, Marafivirus, Necrovirus, Nordeivirus, Oryzavirus, Phytoreovirus, Potexvirus,

Potyvirus, Rymovirus, Sequivirus, Sobemovirus, Tenuivirus, Tobravirus, Tombamovirus,

Tombusvirus, Tospovirus, Trichovirus, Tymovirus.

Nematóides: Reino Animalia - Anguina, Aphelenchoides, Aphelenchus, Atylenchus,

Belonolaimus, Brachydorys, Bursaphelenchus, Cacopaurus, Caloosia, Criconema,Criconemella,

Dolichodorus, Dytylenchus, Globodera, Gracilacus, Helicotylenchus, Hemicriconemoides,

Hemicycliophora,Heterodera, Hirschmanniella, Hoplolaimus, Longidorus, Meloidodera,

Meloidogyne, Nacobbus, Nothanguina, Paralongidorus, Paratrichodorus, Paratylenchus,

Peltamigratus, Pratylenchoides, Pratylenchus, Radopholoides, Radopholus, Rhadinaphelenchus,

Rotylenchoides, Rotylenchulus, Rotylenchus, Scutellonema, Sphaeronema, Subanguina,

Tylenchorhynchus, Tylenchulus, Trichodorus, Xiphinema.

Figura 8.2. Sintomas e sinais de doenças causadas por fungos biotróficos (não

cultivados em meio de cultura). (A) Oídio em folha de pepino; (B) Míldio em folha

de alface.

Passos para diagnose de doenças

• coleta do material em grande quantidade, de partes apresentando sintomas em estágio inicial do aparecimento e em diferentes estágios de desenvolvimento da doença;

• A embalagem deve ser de papel, guardada recipientes de isopor;

• Anotar no campo: dados históricos (plantios anteriores, sistema de rotação de cultura, etc); o local das amostras; nome comum; espécie; variedade / cultivar da planta, dados climáticos e edáficos (pH, textura e tipo de solo); sistema de irrigação, tratos culturais efetuados durante o período; tipos de agrotóxicos utilizados; época de plantio; origem das sementes ou mudas.

• Guardar o material em câmara frigorífica ou adicionar gelo no recipiente de isopor para conservação (no campo);

Envio das amostras

• O envio desses materiais deve ser realizado preferencialmente, no início da semana para os laboratórios de diagnose. Este procedimento visa garantir que a amostra chegue em perfeito estado e em tempo hábil para acomodação, processamento e aplicação dos testes.

Plantas demonstrando murcha, amerelecimento ou enfraquecimento geral.

1. Arrancar as plantas cuidadosamente (não puxá-las). 2. Enviar a planta inteira, incluindo as raízes, com

torrão de terra em volta. 3. Enviar plantas que apresentem os primeiros

sintomas da doença. 4. Enviar amostras do solo e pedaços de raízes em saco

plástico, bem fechado para evitar perda de umidade. 5. Árvores grandes, coletar as raízes, grandes e

pequenas, junto com torrão de solo, na área da projeção da copa, cobrindo-as com plástico.

Cancros em ramos e troncos

• 1. Selecionar espécimes com infecções recentes.

• 2. Enviar uma parte inteira com o sintoma e, se possível, também uma parte localizada abaixo e acima da parte infectada.

• 3. Ramos e galhos mortos, há vários meses, não servem para identificações.

Manchas foliares

• Coletar amostras de folhas que mostram sintomas iniciais e adiantados de infecção.

Órgãos frágeis

1. Putrefações em frutas frágeis e vegetais necessitam atenção especial. Não enviar aquelas com avançado estado de decomposição.

2. Selecionar espécimes frescos que demonstrem os primeiros sintomas, colocá-los em saco plástico, não adicionar água. Vegetais frágeis e frutas devem ser acondicionadas separadamente.

Guardar em lugar fresco, até o momento do despacho.

Obs.: É recomendado o uso de saco plástico devido a melhor conservação do material e para evitar derrames de secreções, etc.

Acondicionamento e despacho

1. Embrulhar cada espécie em papel resistente. Colocar o endereço perfeitamente visível.

2. Folhas ou pequenas plantas podem ser envolvidas em folha de jornal ou mata borrão.

3. Não colocar o endereço e a ficha de identificação em contato com o material a ser analisado.

4. Enviar logo após a coleta. Se não for possível, guardar em geladeira até o momento da remessa.

5. Endereçar para laboratório fitopatológico. 6. Programar a chegada das amostras no laboratório, em

dias úteis (segundas as sextas-feiras).

Informações que devem acompanhar o espécime

• 1. Preencher o mais detalhado possível a ficha para o envio do material para análise.

• 2. Colocar a ficha em lugar seguro junto ao pacote.

RECOMENDAÇÕES PARA COLETA DE MATERIAL PARA ANÁLISE DE NEMATÓIDES

• 1. Caules e folhas – envoltos em algodão ou papel umedecido - sacos de polietileno.

• 2. Raízes – cuidado arranquio - com blocos de terra - saco de polietileno. Não – arrancar com a mão – perda radicelas e nematóides. Retirar amostras de plantas com sintomas e áreas sem sintomas. Quanto maior o número de amostras melhor.

• 3. Amostras de solo com trado oco, de poucos centímetros de diâmetro, sempre próximos à zona das raízes. Em se tratando de plantas anuais, as amostras são colhidas até 0,30 m de profundidade.

• Amostras em solo úmido, embaladas em sacos de polietileno, podem conservar os nematóides em bom estado para exame, por cerca de 2 a 4 meses, quando mantidos em ambiente de 4 a 6 ºC.

• 4. Numa área, coleta-se um grande número de pequenas amostras de vários locais do campo, acumulando-se de 10 a 20 quilos de terra, mistura-se 2 a 3 quilos para exame.

• 5. Amostras de solo seco, antes de serem examinadas, devem ser umedecidas e deixadas em repouso por vários dias afim de que os nematóides reiniciem seus ciclos de vida.

• 6. As amostras de qualquer natureza devem ser mantidas de tal forma que os nematóides nelas presentes não sofram excesso de aquecimento ou desidratação até a chegada ao laboratório.

Principais técnicas Diagnósticas

Primeiro: identificação e reconhecimento dos sintomas e sinais,

Isolamento do organismo em meio de cultura.

incubação em câmara úmida para exteriorização das estruturas do patógeno.

exame de fluxo bacteriano.

Enxertia.

Inoculação em plantas indicadoras e em plantas ou partes de plantas susceptíveis.

Transmissão por vetores.

Sorologia.

Técnicas moleculares (multiplicação e hibridação de ácido nucléico), etc.

Tipos de diagnose

baseada somente nos sintomas (Indireta) – consulta de literatura adequada (muito aplicada para doenças conhecidas.

baseada nos sintomas e sinais (Direta) - consulta de literatura adequada (muito aplicada para doenças conhecidas.

baseada nos postulados de Koch (Completa) – utilizada quando não se tem informação sobre a doença em literatura (Hospedeiro-patógeno-ambiente).

baseada em técnicas específicas - sorológicas (Imuno difusão dupla em ágar gel), biológicas (Infecção de hospedeiras indicadoras), bioquímicas (baseado na produção de determinados açúcares e alcoóis) ou moleculares (PCR - Reação em cadeia da polimerase).

Obstáculos encontrados para a identificação

– Se for doença causada por fungo: Tem-se procedimentos padrões e rápidos. Uso de literatura especial, diagnose completa, incompleta ou caso o mesmo não ocorra realizar o teste de patogenicidade

– Se for doença causada por bactéria: consiste na observação dos sintomas, observação do fluxo bacteriano, isolamento da bactéria em cultura pura, teste de patogenicidade (postulados de Koch), testes bioquímicos e outros.

Se for doença causada por vírus: Isolamento biológico (macerado da planta infectada, inoculada em plantas indicadoras ou na própria hospedeira - indexação), isolamento fito-químico (série de tratamentos de purificação para separação das partículas virais do tecido da hospedeira), análise do tecido (preparação purificada) através da análise em microscópio eletrônico de transmissão.

Se for doença causada por nematóide: pode-se utilizar o exame direto (dissecação da amostra em microscópio estereoscópico), ou faz-se coletas de raízes infectadas (ou amostragens de solo), para extração dos nematóides (que é a separação dos nematóides do substrato), bem como preparo de lâminas temporárias e permanentes para identificação. Ao analisar as lâminas se identificará o agente causador da enfermidade, e neste caso, os postulados de Koch são feitos inoculando os nematóides extraídos da planta em estudo para observação dos mesmos sintomas.

Obstáculos encontrados para a identificação

Teste de Patogenicidade ou postulados de Koch

• o organismo deve estar associado a todas as plantas e ao mesmo sintoma;

• o organismo deve ser isolado e cultivado axenicamente (cultura pura livre de contaminantes) em meio de cultura, e seus dados morfológicos anotados;

• o organismo vindo de cultura pura deve ser inoculado em plantas hospedeiras susceptíveis iguais às que originalmente ele fora isolado, e induzir os mesmos sintomas anteriormente encontrados;

• o organismo deve ser isolado novamente em cultura pura e apresentar as mesmas características observadas anteriormente.

Uso de Meios de culturas

• Somente para fungos e bactérias

• Não utiliza-se meio de cultura para: – Vírus e nematóides.

– biotróficos como oídios (Blumeria, Erysiphe, Microsphaera e Sphaerotheca), míldios (Peronospora, Bremia e Plasmopara), ferrugens (Puccinia, Uromyces e Transchelia) e carvões (Tilletia, Ustillago, Sphaceloma e Urocystis).

Nutrientes nos meios de Cultura

Elementos essenciais: Os principais são: C , H, O, N (função: principais constituintes da estrutura celular), S (função: constituinte da cisteína, metionina, fosfato de tiamina, coenzima A, biotina e ácido alfa-lipóico), P (função: constituinte do ácido nucléico, fosfolipídeos e nucleotídeos), K (função: principal cátion inorgânico da célula; é o cofator de algumas enzimas), Mg (função: cofator de diversas enzimas; está presente na parede celular, membranas e éster fosfato), Ca [função: cofator de enzimas; presente em exoenzimas (amilases e proteases); dipicolinato de cálcio (presente também na parede celular e) é o componente mais importante dos endósporos] e Fe (presente nos citocromos, ferrodoxinas e outras proteínas ferro-sulfurosas; cofator de algumas enzimas [algumas desidratases]). Além destes fazem-se presentes outros bio-elementos utilizados em menor quantidade pelos organismos tais como Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W e Ni.

Elementos dos Meios de Cultura

– Elementos estimulantes: Alguns sais com: MgSO4.7H2O, CaCO3, etc.

– Elementos tamponantes: responsáveis pela estabilização do pH, tais como: K2HPO4, Na2HPO4 e CaCO3.

– Elementos solidificantes: ágar e menos freqüentemente, gelatina.

– Elementos inibidores: antibióticos e ácidos orgânicos, etc.

– Elementos indicadores: substâncias que conferem uma característica especial à colônia a qual se pretende isolar.

Quanto a composição os meios podem ser:

• Semi-sintéticos: com constituintes de composição química indefinida (caldo de batata, caldo de verduras, extrato de malte, extrato de carne, extrato de levedura, peptona, caseína hidrolizada, ágar, suco de tomate, e outros) e outros constituintes de composição química do meio é definida (Sais minerais e carboidratos);

• Sintéticos: com todos os constituintes de composição química definida (Sais minerais, carboidratos, vitaminas e aminoácidos).

• Quanto à consistência: (a) Líquido: sem constituinte solidificante; (b) Sólido: possui como constituinte solidificante a gelatina ou ágar.

• Quanto à finalidade: (a) Não seletivo: onde vários tipos de organismos podem crescer; (b) Semi-seletivo: onde poucos tipos de organismos são capazes de desenvolver; (c) Seletivo: onde uma espécie ou gênero de organismo se desenvolve.

Classificação dos Meios de Cultura:

Receita - Meio BDA

– Composição: 200g de batata descascada e fatiada; 20g dextrose; 15g ágar; 1l água destilada;

– Preparo: descascar, fatiar e pesar 200g de batata; cozinhar as batatas por trinta minutos em 1,2l de água; filtrar e manter o caldo; pesar e colocar em um frasco com capacidade superior a 1,2l a dextrose (glucose) e o ágar; adicionar o caldo ao frasco, completando o volume para 1l; tampar o frasco com rolha termo-resistente ou algodão; misturar e dissolver o conteúdo em banho-maria por 15 minutos; autoclavar o frasco por 15 minutos (121oC, 1 atm); resfriar a 50oC ou a temperatura onde seja suportável segurar o frasco e vertê-lo.

Receitas de Meios de Cultura para FUNGOS

• Meio Ágar-água: 15-20 g de ágar e 1000 mL de água destilada. • Meio Suco de tomate - ST (10%): 12-18 g de ágar, 3 g de CaCO3, 100 mL de

suco de tomate temperado (“SuperBom” temperado ou normal) e 900 mL de água destilada.

• Meio V8 (10%): 12-18 g de ágar, 3 g de CaCO3, 100 mL de suco de tomate V8 e 900 mL e água.

• Malte-ágar: 25g de extrato de malte, 15-20g de ágar e 1000 mL de água destilada.

• Solução de Czapek em ágar: 30 g de sacarose, 2 g de NaNO3, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 0,5 g de KCl, 0,01 g de FeSO4.7H2O, 0,01 g de ágar e 1 L de água.

• Meio ágar Leonian modificado: 6,25 g de maltose, 6,25 g de extrato de malte, 1,25 g de KH2PO4, 1 g de extrato de levedura, 0,25 g de MgSO4.7H2O, 0,625 g de peptona, 20 g de ágar e 1000 mL de água destilada.

• Meio ágar Rosa de Bengala de Martin: 10g de glicose, 5g de peptona, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 0,03 g de estreptomicina, 15 g de ágar e 1000 mL de água destilada.

Receitas de Meios de Cultura para FUNGOS

Meio ágar de farinha de milho: 60 g de farinha de milho amarelo, 15 g ágar e 1000 mL de água destilada.

Meio ágar de farinha de aveia: 100 g de farinha de aveia, 15 g de ágar e 1000 mL de água destilada.

Meio de Nash Snyder: 15 g de peptona, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 1 g de PCNB a 75 % PM, 0,12 g de neomicina em 100 mL de água, 1 g de streptomicina em 100 mL de água, 15 g de ágar e 700 mL de água destilada.

Meio de Reis: 50 mg de benomyl em 100 mL de água, 500 mg de sulfato de streptomicina em 100 mL de água, 30 mg de sulfato de neomicina em 100 mL de água destilada, 3 mL de captam (solução estoque = 133,3 mg [75% ppm] em 100 mL de água), 5 mL de Botram (= dicloram; solução estoque = 200 mg [50% ppm] em 100 mL de água), 10 g de ágar, 15 g de batata com casca em fatias e 2,5 g de sacarose, 700 mL de água.

Meio de Oxygall: 10 g de dextrose, 10 g de peptona, 15 g de oxygall, 0,4 g de estreptomicina, 20 g ágar e 1000 mL de água destilada.

Meio ágar para extrato de plantas (variável a composição): 50 g do vegetal, 12 g ágar e 1000 mL de caldo de planta.

Receitas e Meio de Cultura para Bactérias

Meio ágar nutritivo (NA): 3 g de extrato de carne, 5-10 g de peptona, 2,5 g de glicose,

15-20 g de ágar, 1l de água destilada. Após a autoclavagem, acrescentar 50 mL de

solução autoclavada de glicose (10%) e 1 mL de MgSO4.7H2O 1M, ajustar para pH 7,2.

Meio 523 (Kado e Heskett): 10 g de sacarose, 8 g decaseína hidrolizada, 4 g de extrato

de levedura, 2 g de K2HPO4, 300 mg de MgSO4.7H2O, 20 g de ágar e 1000 mL de água.

Meio ágar caldo nutritivo de extrato de levedura: 8 g de caldo nutritivo, 2 g de extrato

de levedura, 2 g de K2HPO4, 2 g de KH2PO4, 15 g de ágar e 1000 mL de água destilada.

Meio líquido padrão para a bacteriologia com pH = 6,6-7,0.

Caldo de extrato de carne: 3 g de extrato de carne, 5 g de peptona e 1000 mL de água.

Meio de extrato de levedura-dextrose-CACO3 (YDC): 10g de extrato de levedura, 20 g

de glicose, 2 g de CaCO3, 15 g de ágar e 1000 mL de água destilada. A glicose deve ser

autoclavada separadamente. O meio deve ser resfriado a 50 oC em ‘banho maria’, e o

CaCO3 acrescentado por agitação antes de ser vertido nas placas.

Meio King B (KB): 20 g de protease peptona no 3, 2,5g de K2HPO4.3H2O, 6g MgSO4.7H2O,

15 mL de glicerol, 15g de ágar e 1000 mL de água destilada.

Receitas e Meio de Cultura para Bactérias

• Meio NDLA (Nutriente-dextrose-levedura-ágar): 5 g de extrato de carne, 10 g de peptona, 4 g de extrato de levedura, 5 g de dextrose, 0,5 g de K2HPO4, 20 g de ágar, 1000 mL de água.

• Meio PSA (potato-sucrose-ágar): 300 g de batata picada e fervida em 1250 mL de água, 2 g Na2HPO4, 0,5 g de Ca(NO3)2, 15 g de sacarose, 5 g de peptona, 20 g de ágar.

• Meio glucose peptona ágar (GP): 5g peptona bacteriológica, 20 g de glucose, 0,5 g K2HPO4 (anidro), 0,25 g MgSO4.7H2O, 15 g de ágar, 3, 1 L de água, pH 7,2-7,4.

• Meio sacarose nutriente ágar (SNA) ou meio Levan (Lev): 28 g nutriente ágar (Oxoid, CM3), 50 g sacarose, 1000 mL de água destilada (pH 7,2 ).

• Meio nutriente dextrose ágar (NDA): 28 g nutriente ágar (Oxoid, CM3), 10 g D-glucose, 1000 mL de água destilada (pH 7,2).

Sites para consulta:

Técnicas para diagnose: http://www.cca.ufsc.br/labfitop/AULA%201%20-%20coleta%20e%20prepara%20de%20amostras.pdf

Diagnose Virtual: http://www6.ufrgs.br/agronomia/fitossan/fitopatologia/index.php

Diagnose molecular de fitopatógenos: http://www.ufv.br/dfp/virologia/FIP704_teor_files/Semanas_7_e_8_Diagnose_molecular_de_fitopatogenos.pdf