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Métodos de estudo da célula
Dimensões das estruturas celulares e
subcelulares
• Célula vegetal: ± 50µm
• Célula animal: ± 10-20µm
• Bactérias: ± 1-2µm
• Vírus: ± 0,05µm• Vírus: ± 0,05µm
• Núcleo: ± 3-6µm
• Mitocôndrias: ± 0,5µm
• Ribossomos: ± 25nm
• Membrana: ± 10nm
Como visualizar células e diferentes estruturas celulares?diferentes estruturas celulares?
Métodos de investigação da estruturacelular
Microscopia óptica (ou microscopia de luz)Descobrimento da célula e formulação da teoria celular
Técnicas citoquímicasTécnicas citoquímicasIdentificação e localização de diversas moléculasconstituintes das células
Microscopia eletrônicaGrande poder de resolução; detalhes da estrutura celular
Separação de organelas celulares
Estudo celular em Microscopia Óptica
MonoMono--ocularocular BinocularBinocular Múltiplos observadoresMúltiplos observadores
Constituído de: parte mecânica + parte óptica (Lembra da prática?)
Parte Óptica � 3 sistemas de lentesCondensador � projeta a luz sobre as células
Objetiva � recebe o cone de luz, projeta uma imagem aumentada
Ocular � recebe imagem da objetiva e amplia
Limites de Resolução
Estudo celular em Microscopia Óptica
• Exames de tecido à fresco
• Exame de tecidos mortos ou preservados
• Problemas• Problemas
– Células transparentes
– Células pequenas e complexas
• Visualização: coloração
Estudo celular em Microscopia ÓpticaExames de tecido à fresco
• Corte fino ou transparente para ser posto nalâmina
Estudo celular em MicroscopiaExames de tecido à fresco
• Espalhamento - células de mucosa bucal
azul de metileno
Estudo celular em MicroscopiaExames de tecido à fresco
• Esfregaço – células sanguíneas
Estudo celular em MicroscopiaExames de tecido à fresco
• Esmagamento – cromossomos e núcleo eminterfase
Estudo celular em MicroscopiaCORTES HISTOLÓGICOS
• Cortes extremamente finos para permitir a fixaçãona lâmina
Estudo celular em MicroscopiaFIXAÇÃO E PREPARAÇÃO DE CORTES
�� FIXAÇÃOFIXAÇÃO DEDE TECIDOSTECIDOS
�� Formol,Formol, GlutaraldeídoGlutaraldeído,, MisturasMisturas fixadorasfixadoras......
�� PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS�� PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS�� CortesCortes dede tecidotecido�� DesidrataçãoDesidratação�� DiafanizaçãoDiafanização�� InfiltraçãoInfiltração // ImpregnaçãoImpregnação�� CortesCortes emem µµmm�� ColoraçãoColoração�� MontagemMontagem
�� VisualizaçãoVisualização
DesidrataçãoDesidratação DiafanizaçãoDiafanização InfiltraçãoInfiltraçãoFixaçãoFixação
MicrotomiaMicrotomiaColoraçãoColoraçãoMontagemMontagem
Fixação - promove a preservação das característicasmorfológicas e macromoléculas dos tecidos oucélulas.
• Função → impedir a autólise ou degradaçãobacteriana do material biológico a ser analisado
• Facilitar os processamentos posteriores de coloração → muitos corantes apresentam maiorafinidade pelo substrato fixado → promover o enrijecimento dos orgãos e tecidos.
• Aumentar o contraste na microscopia eletrônica
Fixadores → agentes químicos das mais diversasfunções orgânicas;
– Reagem quimicamente com os componentescelulares, promovendo a sua estabilização.
– Principais componentes celulares que podem ser preservados → proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e lipídios → os fixadores atuamsobre estas macromoléculas tornando-as insolúveis.
• Desidratação → retirada lenta de água
• Bateria de álcool com concentrações crescentes: 70%, 80%, 90% e 100% → o tempo vai depender do material e do material de inclusão.
• A água deve ser toda retirada por não ser missível em• A água deve ser toda retirada por não ser missível emXILOL ou em ÓLEO DE CEDRO → diafanização → clareamento do material
• Inclusão em parafina → dar maior consistência aomaterial.
• Microtomia → corte do material em micrótomo.
Coloração para Microscopia Óptica
• Corantes básicos ou catiônicos (+) - Liga-se a moléculas com carga (-)
BASOFILIA → a estrutura corada é BASÓFILA
Ex: Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Hematoxilina, Orceína, lugol, Verde-janus B, violeta de genciana
Núcleo → DNA e RNANúcleo → DNA e RNA
Citoplasma → proteínas e carboidratos
• Corantes ácidos ou aniônicos (-) - Liga-se a moléculas com carga (+)
ACIDOFILIA → a estrutura corada é ACIDÓFILA
Ex: Eosina, Ácido Periódico Schiff (PAS), ácido ósmico
Citoplasma e núcleo → proteínas com carga (+)
NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelamacidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.
Quanto ao papel fisiológico:
VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Ex: Verde-janus B, azul de metileno, vermelho neutro, Sudan III.
NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol,
Coloração para Microscopia Óptica
NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol, vermelho escarlate, violeta de genciana.
Quanto às propriedades tintoriais:
ORTOCROMÁTICOS - Conferem a célula a mesma cor que apresentam in
vitro. Exemplos: Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.
METACROMÁTICOS - Dão a célula coloração diferente da que apresentam in vitro. Exemplos: Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.
Coloração para Microscopia de Fluorescência
Envolve a aplicação de técnicas citoquímicas
Reação com anticorpos ou corantes fluorescentescorantes fluorescentes
Radiação ultravioleta como equivalente a fonte de luz em microscopia óptica
Microscópio Eletrônico
Potencial de aumento muito maior que o óptico
Inventado em 1932 e vem sendo aperfeiçoado desde entãoentão
Intervalo de aumento �1.000x a 200.000x.
Poder de resolução = 1nm (200x maior que o MO)
Microscópio Eletrônico
• Feixes de elétrons ao invés de luz (óptica)
No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes chamadas de lentes eletromagnéticas;
• As lentes eletromagnéticas ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe de elétrons no material e projetam-na sobre uma tela, onde é formada a imagem
Obtenção dos cortes para M.E.
+ solução de sais de urânio e chumbo
• Não é possível observar material vivo neste tipo de microscópio;
• O material a ser estudado passa por um complexo processo:
– Desidratação
– Fixação– Fixação
– Inclusão em resinas especiais (muito duras)
– Cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro-ultramicrótomo;
A imagem do objeto é formada simultaneamente à passagem do feixe de luz através dele.
Bastante difundido no estudo de materiais biológicos, permite definição de imagens intracelulares, permitindo estudos de morfologia celular, aspectos gerais das organelas e também da interação de parasitas com células.
•Tipos de microscópios eletrônicos:
–Transmissão – MET - usado para a observação de cortes ultrafinos;
–Varredura – MEV - capaz de produzir imagens de alta ampliação usado para a observação de superfícies;
Fagocitose
Célula animal
Célula vegetal
Cloroplasto
Mitocôndrias
Cloroplasto
Complexo de Golgi
Um feixe de elétrons bombardeia a superfície do
material “varrendo-a”; então, elétrons secundários ou refletidos são utilizados
para obter imagens tridimensionais.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
tridimensionais.
Capaz de produzir imagens de alta ampliação e
resolução aumentos 10x a 400.000x com grande profundidade de focoPoder de resolução de
10nm.
As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual;
O que é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao
contrário da radiação de luz
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
contrário da radiação de luz
A topografia de objetos sólidos pode ser examinada com grande facilidade, as micrografias têm aspecto
tridimensional;
Ataque de leveduras à Salmonella
Diferentes formas de grãos de pólen
MEV MET
�� CENTRIFUGAÇÃOCENTRIFUGAÇÃO
�� PermitePermite isolarisolar organelasorganelas dede homogeneizadoshomogeneizados celulares,celulares, paraparaanálisesanálises químicas,químicas, físicasfísicas ee biológicasbiológicas;;
SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARESSEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES
�� OO isolamentoisolamento dede umauma organelaorganela dependedepende dede::-- seuseu coeficientecoeficiente dede sedimentaçãosedimentação;;-- densidadedensidade ee viscosidadeviscosidade dada soluçãosolução..
�� CentrifugaçãoCentrifugação FracionadaFracionada;;
�� CentrifugaçãoCentrifugação ContraContra GradienteGradiente..
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).
células
Homogeneização
Material na
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são
possíveis para transformar
células, órgãos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.
tecidos
Homogeneização
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material de partida
Centrifugação FracionadaCentrifugação Fracionada
Centrifugação Contra GradienteCentrifugação Contra Gradiente
Cromatografia
• Separação de macromoléculas, como proteínas e ácidos nucléicos
• “Filtragem” de um macerado celular em uma matriz porosa, por meio da interação das macromoléculas com a matrizmacromoléculas com a matriz– Interação de Troca iônica: dependente de cargas
– Interação hidrofóbica
– Filtração em gel: dependente do tamanho e forma
– Interação por afinidade: enzima-substrato ou antigeno-anticorpo.
Cromatografia
Matriz
Tubos coletores
�� CromatografiaCromatografia dede TrocaTroca IônicaIônica
-A matriz da coluna cromatográfica écarregada + OU –
- Proteínas ligam ao suporte porinteração de carga.
�� CromatografiaCromatografia dede InteraçãoInteração HidrofóbicaHidrofóbica
- A matriz da colunacromatográfica é composta porpartículas com superfíciehidrofóbica;
- Proteínas hidrofóbicasinteragem com o suporte eretardam sua passagem.
Cromatografia Cromatografia de Filtração em Gelde Filtração em Gel
- A matriz da colunacromatográfica é composta porpartículas porosas, atuandocomo uma peneira para acomo uma peneira para apassagem de proteínas;
CromatografiaCromatografia dede AfinidadeAfinidade
- A matriz da colunacromatográfica é composta porantígenos (ou substratos paraenzimas) ligados;
- Proteínas ligam ao suportepor bioafinidade eespecificidade.
Eletroforese
DeterminaDetermina oo tamanhotamanho dasdasproteínasproteínas;;
IdentificaIdentifica fragmentosfragmentos dedediferentesdiferentes tamanhostamanhos dedeDNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..
SeparaçãoSeparação dasdasmacromoléculasmacromoléculas porpor cargacarga(+(+ ouou --)) ee tamanhotamanho (do(domaiormaior parapara oo menor)menor)
Proteínas de diferentes tamanhos e cargas
Fragmentos de DNA de diferentes tamanhos
-- HibridizaçãoHibridização exex situsitu
Resumindo... Existem diversas formas de se explorar a célula:
Ponto de vista morfológico: Microscopia
óptica fluorescência
eletrônica (transmissão e varredura)
Ponto de vista das organelas e seus constituintes:Ponto de vista das organelas e seus constituintes:
Centrifugação: isolamento de organelas
fracionada e com gradiente
Cromatografia: isolamento de macromoléculas
Troca iônica Interação hidrofóbica
Filtração em gel Afinidade
Eletroforese: análise das macromoléculas