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Aus der
Abteilung für Anatomie und Molekulare Embryologie
der Ruhr-Universität Bochum
Leitung: Prof. Dr. Beate Brand-Saberi
Der Einfluss des Transkriptionsfaktors Atoh8 auf die
Embryonalentwicklung des Zebrafisches – Analyse der Skelett- &
Herzmuskelentwicklung
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Kevin Bockholt
aus Dorsten
2014
Dekan: Prof. Dr. Klaus Überla Referent: Prof. Dr. Beate Brand-Saberi Korreferent: Prof. Dr. Ruijin Huang Tag der Mündlichen Prüfung: 11.12.2014
Abstract Kevin Bockholt
Der Einfluss des Transkriptionsfaktors Atoh8 auf die Embryonalentwicklung des Zebrafisches –
Analyse der Skelett- & Herzmuskelentwicklung
Problem:
Einige Studien haben bereits nachgewiesen, dass der bHLH Transkriptionsfaktor atoh8 an der
embryonalen Entwicklung von Retina, Skelett- und Herzmuskulatur sowie an der Neurogenese
wesentlich beteiligt ist. In der vorliegenden Dissertation wurde der Einfluss dieses Transkriptionsfaktors
insbesondere auf die Myogenese und Kardiogenese des Zebrafisches experimentell untersucht. Es
wurden spezifische Knockdown-Experimente an Zebrafischembryonen durchgeführt, um Defekte in
den beobachteten muskulären sowie kardialen Strukturen während der Embryogenese nachzuweisen,
die in Abhängigkeit zum atoh8-Mangel auftreten.
Methode:
Im Rahmen der artgerechten Tierhaltung wurden die zur Beobachtung und Analyse genutzten
Zebrafischembryonen gewonnen. In den atoh8- Knockdown-Versuchsreihen erfolgte eine Aufteilung
der Embryonen in drei Testgruppen unterschiedlicher Bedingungen (Morpholinoinjektion,
Kontrollsubstanz-Injektion, keine Injektion). Die Injektionen erfolgten als Mikroinjektionen in Embryonen
im Ein- bis Zwei-Zell-Stadium. Neben der anschließenden Beobachtung der Entwicklung wurden
Embryonen verschiedener Stadien zur Durchführung von whole mount in-situ-Hybridisierungen
vorbereitet. Die in-situ-Hybridisierungen erfolgten mittels spezifischer Marker zur Darstellung
entsprechender Strukturen. Die Expressionsmuster der drei Testgruppen wurden jeweils verglichen
und ausgewertet. Schnittbildpräparate dienen der detaillierten, vergleichenden Beobachtung und
Analyse der Testgruppen.
Ergebnis:
In dieser Studie konnte der ausgeprägte Einfluss von atoh8 auf die Embryonalentwicklung der
Skelettmuskulatur dargestellt werden. Dabei gelang erstmalig der Nachweis, dass die direkte myod-
Genexpression selbst nicht beeinflusst wird. Aufgrund beobachteter Störungen der Ausprägung
horizontaler Myosepten bei atoh8-Knockdown innerhalb der Somiten scheint die Differenzierung
myogener pioneer cells einem Einfluss von atoh8 zu unterliegen.
Darüber hinaus wurde eine prägnante, bei Knockdown häufig letal endende Beeinflussung der
kardialen Embryogenese gezeigt. Beobachtungen an Morphanten weisen auf eine eingeschränkte
kardiale Kontraktilität hin; assoziiert mit einer erstmals beschriebenen Abhängigkeit einiger
Schlüsselgene der Herzentwicklung von atoh8 mit Auswirkung auf die vmhc-Genexpression. Neben
dem Einfluss auf die Entwicklung kardialer Strukturen, wie der Ausbildung von atrioventrikulären
Grenzen und der Ausbildung tubulärer Vorläuferstrukturen, scheint ebenfalls eine Abhängigkeit der
kardialen Fusion von atoh8 zu bestehen.
Diskussion:
Hinsichtlich der Beeinflussung der embryonalen Entwicklung der Skelettmuskulatur durch atoh8 geben
sowohl mit der Entwicklung der pioneer cells assoziierte Differenzierungsstörungen als auch daraus
resultierende Myopathien langsamer Muskelfasern Anlass zur weiteren Forschung. Zudem stellen die
von atoh8 beeinflusste Regulation der vmhc-Genexpression und mit dessen Defekten assoziierte
Kardiomyopathien, wichtige Themen weiterer Analysen dar. Auch die Beeinflussung der frühen
kardialen Prägung tubulärer Systeme, deren Fusionsprozesse sowie mögliche Auswirkungen auf die
Ausbildung atrioventrikulärer Übergänge repräsentieren weitere Schwerpunkte anschließender
Forschungsprojekte.
Für meine Familie
1
Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 7
1.1 Danio rerio 7
1.1.1 Allgemeines 7
1.1.2 Verwendung in der Forschung 7
1.1.3 Embryogenese 8
1.1.4 Somito- & Myogenese 12
1.1.5 Herzentwicklung 14
1.2 Atonal homolog 8 (atoh8) 16
1.3 Marker zur Analyse der Myo- & Kardiogenese 17
1.3.1 Pax3a 18
1.3.2 Myod 19
1.3.3 Ventricular myosin heavy chain (vmhc) 20
1.3.4 Natrium-Calcium-Austauscher (ncx-1) 21
1.4 Entwicklung der Methodik 22
1.4.1 In-situ-Hybridisierung 22
1.4.2 Morpholinos 23
1.4.3 Mikroinjektion 24
2. Zielsetzung 26
3. Material & Methoden 27
3.0 Materialien 27
3.1 Danio rerio Aquaristik 29
3.1.1 Tierhaltung 29
3.1.2 Fütterung 31
3.1.3 Nach- & Aufzucht 31
3.2 Mikroinjektion 32
3.2.1 Agarose-Gel Platten 32
3.2.2 Injektionsnadeln 33
3.2.3 Morpholino 33
3.2.4 Etablierung der Anlage/ Setting 34
2
3.2.5 Mikroinjektionsvorgang 34
3.2.6 Nachbehandlung 35
3.3 Dechorionation 35
3.4 In-situ-Hybridisierung 36
3.4.1 Primer-Design 36
3.4.2 Sondenherstellung 37
3.4.3 Ablauf der in-situ-Hybridisierung 37
3.5 Herstellung von Schnittpräparaten 42
3.5.1 Semi- & Ultradünnschnittpräparate 42
3.5.2 Kryoschnittpräparate 43
3.6 Mikroskopie 43
3.7 Auswertung 44
4. Ergebnisse 45
4.1 Atoh8-Expression in Herz- & Skelettmuskulatur 45
4.2 Morpholino-Mikroinjektion 46
4.2.1 Morphologisch- anatomische Unterschiede 47
4.3 Atoh8 beeinflusst die Skelettmuskelentwicklung 48
4.3.1 In-situ-Hybridisierung mit pax3a-Marker 48
4.3.2 In-situ-Hybridisierung mit myod-Marker 50
4.3.3 Kein myod-Nachweis im 48 hpf-Stadium 54
4.3.4 Atoh8 beeinflusst die Skelettmuskelentwicklung,
jedoch nicht die myod-Genexpression 55
4.3.5 Atoh8 beeinflusst adaxiale Zellpopulationen 55
4.4 Beeinflussung der kardialen Embryogenese 59
4.4.1 Darstellung der kardialen Strukturen mittels
vmhc-Marker 59
4.4.2 Funktion der Doppel-in-situ-Hybridisierung 62
4.4.3 Atoh8 beeinflusst die Herzentwicklung
- Beobachtungen 64
4.4.4 Atoh8 beeinflusst die Herzentwicklung
- Analyse der vmhc-in-situ-Hybridisierung 65
4.4.5 Atoh8 beeinflusst die vmhc-Genexpression 70
3
4.4.6 Atoh8 beeinflusst die Herzentwicklung
- Analyse der ncx-1-in-situ-Hybridisierung 72
4.4.7 Kein direkter Einfluss auf die ncx-1-Genexpression 78
5. Diskussion 81
5.1 Etablierung der Mikroinjektion 81
5.2 In-situ-Hybridisierung 83
5.3 Atoh8 beeinflusst die Skelettmuskelentwicklung 84
5.3.1 Pax3a-Analysen 85
5.3.2 Myod-Analysen 87
5.4 Atoh8 beeinflusst die kardiale Entwicklung 90
5.4.1 Vmhc-Analysen 91
5.4.2 Ncx-1-Analysen 94
5.4.3 Embryonen in späteren Entwicklungsstadien 98
6. Zusammenfassung 101
7. Literaturverzeichnis 104
8. Anhang 112
4
Abkürzungsverzeichnis atoh8 atonal homolog 8
bHLH Basic helix-loop-helix
Bmp Bone morphogenetic protein
cmlc1 cardiac myosin light chain 1
cmlc2 cardiac myosin light chain 2
Eng Engrailed
GFP grün fluoreszierendes Protein
hpf hours post fertilisation
ISH in-situ-Hybridisierung
KI Konfidenzintervall
mil miles apart-Gen
MO Morpholino
MOmis mismatch Morpholino
MRF myogenic regulatory factor
mRNA messenger RNA
myf5 myogener Faktor 5
myod myogener Faktor 3
myog myogener Faktor 4 (myogenin)
ncx-1 Natrium-Calcium-Austauscher
N.N. non nomine
Nodal Protein der TGF-beta Superfamilie
o.O. ohne Ortsangabe
OR Odds Ratio
pan pandora-Gen
pax3 paired box Transkriptionsfaktor 3
PFA Paraformaldehyd
smhc slow muscle heavy chain
vmhc ventricular muscle heavy chain
5
Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Schema der frühen embryonalen
Entwicklungsstadien 10
Abb. 2 Schema der Embryonalentwicklung nach 24 hpf 11
Abb. 3 Agarose- Gel Platte 33
Abb. 4 Prinzip der in-situ-Hybridisierung 39
Abb. 5 ISH mit atoh8-Sonde 45
Abb. 6 Fluoreszenz der Morpholino- Injektion 47
Abb. 7 Pax3a-in-situ-Hybridisierung 50
Abb. 8 Myod-in-situ-Hybridisierung 52
Abb. 9 Statistische Auswertung der myod-ISH 53
Abb. 10 Myod/vmhc-ISH, 48 hpf 54
Abb. 11 Dünnschnittpräparate 56
Abb. 12 Dünnschnittpräparate nach myod-ISH 57
Abb. 13 Schematischer distaler Schnitt eines Zebrafisches 58
Abb. 14 Vmhc-ISH verschiedener Stadien 60
Abb. 15 Vmhc-ISH späterer Stadien 61
Abb. 16 Vmhc-ISH nach 30 hpf 62
Abb. 17 Vmhc/myod-ISH 24 hpf 66
Abb. 18 Vmhc/myod-ISH 48 hpf 68
Abb. 19 Statistische Auswertung der vmhc-ISH 70
Abb. 20 Erweiterte statistische Auswertung der vmhc-ISH 72
Abb. 21 Ncx-1-ISH 75
Abb. 22 Statistische Auswertung der ncx-1-ISH 77
Abb. 23 Schritte der kardialen Embryogenese 98
Abb. A1 Stand-Alone-Unit 112
Abb. A2 Chemische Strukturformeln von Morpholino und DNA
im Vergleich 112
Abb. A3 Injektionsvorbereitungen 113
Abb. A4 Schematische Darstellung einer Vier-Felder-Tafel 113
6
Tabellenverzeichnis
1. Chemikalien 27
2. Geräte & Hilfsmittel 28
3. sonstige Verbrauchsmaterialien 29
4. Wasserwerte 30
5. E3-Medium 32
6. Injektionsparameter 34
7. 4% PFA in PBS 35
8. PBS (20x) 35
9. Primersequenzen 36
10. PBST (20x) 39
11. DEPC-Wasser 39
12. Proteinase K Verdau 39
13. Hybridisierungslösung nach Patel (1000ml) 39
14. 20X SSC (1000ml) 40
15. CHAPS 40
16. 2X SSC (50ml) 40
17. 0,2X SSC mit CHAPS (1:50) 40
18. Blockinglösung 40
19. Maleinsäure-Puffer 41
20. Anti-DIG-AK-Lösung 41
21. 10X KTBT-Puffer (1000ml) 41
22. Tris-Lösung 1M, pH 7,4 41
23. Tris-Lösung 1M, pH 9,5 41
24. alkalische Phosphatase-Puffer (NTMT) 100ml 41
25. Färbelösung (NBT/BCIP) 42
26. “Durcupan Microscopy Sciences“ACM von Electron 42
27. Methylenblau-Färbelösung 43
7
1. Einleitung
1.1 Danio rerio
1.1.1 Allgemeines
Der Zebrabärbling, Danio rerio (früher Brachydanio rerio) (Hamilton, 1822),
gehört zur Familie der karpfenartigen Fische, Cyprinidae (Nüsslein-Volhard
and Dahm, 2002). Beheimatet ist diese Fischart ursprünglich in den langsam
fließenden Gewässern Asiens und Indiens.
Diese Bärblingart besitzt einen langen, stromlinienförmigen Körper mit weiß-
gelblicher Grundfarbe. Vom Kiemendeckel bis zur Schwanzflosse erstrecken
sich horizontal verlaufende, bläulich- schwarz irisierende Banden, während
die übrigen Brust- sowie Bauchflossen farblos schimmern. Die
Gesamtwirbelzahl der Zebrabärblinge liegt bei 31-32. Während die
Männchen in ihrer Zeichnung kräftiger schimmern, weisen Weibchen einen
fülligeren Körperbau auf und werden etwas größer, wobei die streifige
Zeichnung blasser erscheint (Nüsslein-Volhard and Dahm, 2002; Baensch
and Riehl, 1997).
1.1.2 Verwendung in der Forschung
Der Zebrabärbling dient aufgrund vieler Charakteristika als
Modellorganismus in der Genetik, Biologie und Anatomie (Nüsslein-Volhard
and Dahm, 2002; Kimmel et al., 1995). Durch sein diploides Genom mit 25
Chromosomen und einer, im Vergleich zum Menschen, geringen Größe von
1,7 Gigabasen eignet sich D. rerio insbesondere zur genetischen Analytik.
Mutanten können experimentell etabliert werden oder die Möglichkeit zu
Knockoutexperimenten einzelner Gene besteht. Der enorme Vorteil liegt in
der vollständigen extramaternalen Entwicklung der abgelaichten Eier vom
Ein-Zell-Stadium an. Zudem haben die Eier bereits im frühesten Stadium
eine entsprechende Größe für die Durchführung von Mikroinjektionen und
sind darüber hinaus während der gesamten Embryogenese durchsichtig,
sodass Beobachtungen bis zum Schlüpfen erfolgen und morphologische
Unterschiede erkannt werden können.
8
Ein weiterer Vorteil der experimentellen Nutzung von Zebrafischen liegt in
der Tierhaltung, da D. rerio keine hohen Ansprüche an ihre Umgebung
stellen. Dank ihrer geringen Größe und der vergleichbar einfachen
Wasseransprüche ist die Haltung eine kostengünstige Variante im Vergleich
zur Haltung von Mäusen. Nach etwa drei bis vier Monaten sind die Fische
geschlechtsreif und können wöchentlich bis zu mehreren Hundert Eiern
produzieren. Somit besteht aufgrund der im Vergleich zu Hühnern oder
Mäusen kurzen Regenerationsdauer die Möglichkeit, kurzfristig gezielt
Embryonen zur experimentellen Nutzung zu gewinnen.
1.1.3 Embryogenese
Eine sehr detaillierte Beschreibung und Aufschlüsselung der embryonalen
Entwicklung von D. rerio wurde von Kimmel et. al vorgenommen (Kimmel et
al., 1995). Die Einteilung der Embryogenese erfolgt demnach in
verschiedene charakteristische Stadien, die nachfolgend dargestellt werden.
Nach der Fertilisation liegt etwa 45 Minuten später das Stadium der Zygote
vor, welche die Komplettierung des ersten zygotischen Zellzyklusses
beschreibt. Die Zygote weist einen Durchmesser von etwa 0,7mm auf. Es
schließt sich die Furchungsperiode an, welche die Entstehung der
Blastomeren durch Zellteilung umfasst. Die Zellteilungen erfolgen
durchschnittlich im 10-15 Minuten Rhythmus (s. Abb. 1A). Dieses Stadium
dauert etwa zwei Stunden an, die Embryonen befinden sich anschließend im
64- Zell- Stadium mit dreireihig angeordneten Blastomeren.
Die sich mit dem 128-Zell-Stadium anschließende Phase der
Embryonalentwicklung wird von Kimmel und Kollegen als Blastula
beschrieben (Kimmel et al., 1995). Die Blastomeren teilen sich asynchron
und formen die Keimscheibe. Der animale Pol erhält zunächst einen
sphärischen Charakter mit flacher Grenze zum Dottersack (s. Abb. 1B).
Zwischen dem Dottersack und dem animalen Pol beginnt sich eine dünne
Membran (yolk syncytial layer) zu entwickeln. Mit zunehmender Zellmasse
des animalen Pols wird der Begriff des Blastoderm geprägt, welcher aus der
Keimscheibe durch eine frühe Morphogenese hervorgeht. Am Ende des
Blastulastadiums, etwa 4,5 Stunden nach Fertilisation (hpf), liegt das
9
Blastoderm als uniforme Schicht vor. Der Dotter wird zu dem Zeitpunkt bis zu
30% vom Blastoderm umwachsen (30% Epibolie).
Die sich an die Blastulation anschließende Gastrulation (5-10 hpf) ist
zunächst durch das voran schreitende Umschließen des Dottersackes (50%
Epibolie) geprägt. Mit weiterem Umwachsen bildet sich eine Verdickung
(embryonic shield), welche die Dorsalseite des Embryos vermuten lässt. Mit
fortschreitender Entwicklung formen sich erste Strukturen des Kopfes aus
dem früheren animalen Pol, weiterhin entsteht über das 75% Epibolie- das
100% Epiboliestadium. Einerseits ist der Epiblast, aus welchem sich alle drei
Keimblätter entwickeln, erkennbar, andererseits ist der Hypoblast, aus
welchem sowohl der Dottersack als auch die Prächordalplatte hervorgehen,
abgrenzbar. Von der mesodermalen Chorda dorsalis, welche sich als
elastischer Stab zwischen Neuralrohr und späterem Darm befindet und
während der Entwicklung Festigkeit verleiht, lässt sich zunehmend die
Segmentplatte, welche dem paraxialen Mesoderm entspringt und aus noch
undifferenziertem Gewebe besteht, abgrenzen. Die sich später aus der
Segmentplatte formenden Somiten nutzen die Chorda dorsalis zur
Befestigung. Nach ungefähr zehn Stunden ist schließlich ein prominenter
Schwanzbereich sichtbar und die Hirnstrukturen sowie das zentrale
Nervensystem des Neuralrohres treten deutlicher hervor (Mendelson, 1986).
In der darauf folgenden Segmentierungsperiode (10 bis 24 hpf) erstreckt sich
die größte Vielfalt der embryonaler Entwicklungsschritte (s. Abb. 1D). Die
Ausbildung der Somiten, welche später Myotome, Sklerotome und
Dermatome bilden, aus der Segmentplatte von kranial nach kaudal beginnt
mit einer Frequenz von zwei Somitenpaaren pro Stunde, der Embryo
elongiert. Zudem werden die Organanlagen deutlich sichtbar. Die
Hirnstrukturen entwickeln sich etwa im 5-Somiten-Stadium weiter, es entsteht
die Gehöranlage aus dem optischen Vesikel die Anlage des Auges. Auch die
Herzanlage, welche bereits in der Gastrulation ihren Ursprung nahm, wird
ventral des Dottersackes zunehmend deutlich. Im 20-Somiten-Stadium sind
erste Muskelkontraktionen der Somiten oder frühen Myotome im
Schwanzbereich wahrnehmbar (s. Abb. 1D). Die Bildung der kaudalen
Somiten erfolgt mit einer geringeren Frequenz. 24 hpf befindet sich der
10
Embryo im 26-Somiten-Stadium bei einer Länge von etwa 1,6mm (s. Abb.
2A).
Während der nächsten 24 Stunden beginnt neben der weiteren Reifung der
Organe die Pigmentierung der Retina und in den dorsolateralen
Melanophoren der Haut. Dieses Entwicklungsstadium wird von Kimmel et. al
als Pharyngula-Periode, zuerst von W. Ballard beschrieben (Ballard, 1981),
bezeichnet. Die Anlagen der Flossen werden deutlich. Zudem sind am
Rande des Dottersackes erste Blutzellen in den Blutinseln erkennbar. Die
zunächst paarig angelegten Herztuben nähern sich bis zur Vereinigung an.
Mit der Entwicklung des Gefäßsystems entsteht nach ca. 30 hpf eine
schwache Zirkulation bei erkennbarem Herzschlag. Durch die voran
schreitende embryonale Ausbildung einer einstämmigen Aorta, der
Gefäßversorgung der kaudalen Körperregionen und eines suffizienten
Venensystems entsteht ab der 36. hpf ein starker Blutkreislauf mit Teilung in
Atrium und Ventrikel des Herzens. Die Größe des Dottersackes verringert
sich mit zunehmender Extension nach kaudal. Nach 42-48 hpf hat bereits
eine deutliche Differenzierung der Sinnesorgane sowie des Intestinums
stattgefunden, sodass der Embryo bei einer Länge von 2,9mm in die
Schlüpfphase eintreten kann (s. Abb. 2B).
Abbildung 1. Schema der frühen embryonalen Entwickl ungsstadien Entwickelt nach den Vorgaben von Kimmel und Kollegen (Kimmel et al., 1995)
A) 4-Zell-Stadium; die Keimscheibe beginnt sich zu formen.
B) Sphären- Stadium während der Blastulation nach dem 128-Zell-Stadium.
C) 1-Somiten-Stadium zu Beginn der Segmentation nach etwa 10hpf.
D) 19-Somiten-Stadium nach etwa 20hpf. Die v-förmig angeordneten Somiten sind bis
in die Schwanzregion erkennbar, die Extension des Dottersackes nach kaudal
beginnt, die Anlage der Augen ist sichtbar.
11
Abbildung 2. Schema der Embryonalentwicklung nach 2 4 hpf Entwickelt nach den Vorgaben von Kimmel und Kollegen (Kimmel et al., 1995)
A) Embryo 24hpf im 26-Somiten-Stadium.
B) B) Embryo 48hpf, kurz vor dem Schlüpfen.
Die von Kimmel und Kollegen bis zur 72. hpf dauernde „Hatching-Period“ ist
geprägt durch die Komplettierung der Organogenese (Kimmel et al., 1995).
Bezeichnend für diese Phase sind einerseits die reifenden Flossen und die
Aushärtung des Skeletts, andererseits die vollständige Ausbildung aller
Kopfstrukturen aus den Kiemenbögen. Durch den schrumpfenden Dottersack
gewinnt das Herz mehr Prominenz. Nach etwa drei Tagen ist die embryonale
Entwicklung soweit abgeschlossen, dass die Larve schlüpfen kann. Der
Dottersack ist nach seiner Elongation nur noch rudimentär sichtbar. Das
Darmrohr verlagert sich nach ventral und tritt mehr in Erscheinung, die
Pigmentierung der Haut ist mit der lateralen Streifung nahezu
12
abgeschlossen, allerdings gewinnen die Streifen mit zunehmendem
Wachstum des Fisches an Prominenz. Mit dem Schlüpfen nach dem 3. Tag
nach der Befruchtung beginnen die aktive Bewegung sowie die aktive, orale
Nahrungsaufnahme. Die Länge der Tiere in der Phase beträgt etwa 3, 6mm.
In der sich anschließenden Lebensphase ist das wichtigste Element das
Körperwachstum des Fisches.
1.1.4 Somito- & Myogenese
In der embryonalen Periode der Gastrulation werden neben vielen weiteren
embryonalen Prozessen auch die Keimblätter gebildet. Während das
Endoderm beispielsweise zur Bildung der gastrointestinalen Organe beiträgt
und aus dem Ektoderm Nervensystem und Haut entstehen, ist das
Mesoderm für die Bildung des Gefäß- & Blutsystems, der Muskulatur und
des Skelettsystems unerlässlich.
Tritt der Embryo in die Phase der Segmentation ein, entstehen aus dem
paraxialen Mesoderm von kranial nach kaudal sequentiell Somiten (Kimmel
et al., 1995). Die ersten Somitenpaare entstehen dabei aus ungeklärter
Ursache mit einer höheren Frequenz als die kaudalen Somiten. Nach
vollständiger Ausbildung der Somiten erscheinen diese differenziert oval. Die
überwiegende Mehrheit der medial in den Somiten befindlichen Zellen wird in
die Myogenese eintreten und sich zu Myotomen, den späteren
Muskelsegmenten, entwickeln (Kimmel et al., 1995), der lateral gelegene Teil
bildet Sklerotome. Anhand der Transkription von myf5 und myod wurde
nachgewiesen, dass bereits während der Gastrulation die Myogenese einiger
muskulärer Vorläuferzellen beginnt (Weinberg et al., 1996).
Am medialen Rand der Somiten gelegen, lateral der Chorda dorsalis,
befindet sich eine Region, die als adaxiale Region bezeichnet wird (Thisse et
al., 1993). Sowohl in den adaxialen Somiten als auch dorsoventral mittig der
Somiten befinden sich Zellen, als „muscle pioneer cells“ bezeichnet, welche
zu den ersten sich ausprägenden Muskelfasern zählen (Felsenfeld et al.,
1991) und sich im Verlauf zu langsamen Muskelfasern differenzieren (Devoto
et al., 1996). Die adaxialen muskulären Vorläuferzellen bilden eine pseudo-
epitheliare Schicht, welche die Pionierzellen (pioneer cells) in hoher Anzahl
enthält (Devoto et al., 1996). Durch die Migration und Elongation eines Teiles
13
der sich zu langsamen Muskelfasern differenzierenden Pionierzellen an den
äußeren Rand der Somiten erhalten die Myotome ihre chevron-artige (v-
förmige) Form, wobei der Apex nach anterior weist (van Eeden et al., 1996).
Entlang des Verlaufes der Pionierzellen bildet sich im Verlauf das horizontale
Myoseptum aus, welches die Myotome in dorsal des Septums liegende
epaxiale und ventral liegende hypaxiale Muskelmassen unterteilt (Kimmel et
al., 1995). Die lateral gelegenen, nicht adaxialen Vorläuferzellen bilden die
Vorläufer der schnellen Muskelfasern (Devoto et al., 1996).
Somit können bereits während der embryonalen Entwicklung verschiedene
Muskelzellpopulationen aufgrund ihrer unterschiedlichen Lokalisation im
Myotom unterschieden werden (Hirsinger et al., 2004). Während die
Vorläuferzellen der langsamen (roten) Muskelfasern im adulten Fisch in den
superfiziellen Schichten unter der Haut angelegt sind, bilden die schnellen
(weißen) Muskelfasern später die tieferen Skelettmuskelschichten aus (Ochi
and Westerfield, 2007).
Die Pionierzellen exprimieren neben dem für langsame Muskelfasern
typischen Protein smhc auch spezifisch Mitglieder der Engrailed (Eng)
Homeobox Protein Familie (Hatta et al., 1991). Während der
Somitenentwicklung fällt eine sich wolkenförmig lateral an die adaxialen
Pionierzellen anlagernde Zellpopulation auf, die eine geringere Expression
von Eng aufweist, jedoch kein smhc exprimiert. Diese als „mittelschnelle
Muskelfaserzellen“ oder „Eng positive fast muscle cells“ klassifizierte
Zellgruppe ist bislang unklarer Funktion (Hatta et al., 1991).
Am Ende der Periode der Segmentierung liegt zwischen den lateral
befindlichen langsamen Muskelfasern und der Dermis eine als von Devoto
und Kollegen „external cells“ bezeichnete Zellschicht, die im Rahmen einer
Determinierung zwar pax3, pax7, myf5 und myog exprimiert, jedoch kein
Myosin, welches eine abgeschlossene Zellentwicklung erkennen ließe
(Devoto et al., 1996). Es wird angenommen, dass diese Zellschicht
muskuläre Vorläuferzellen beinhaltet, die sich in anderen Körperregionen im
Verlauf zu Muskelzellen differenzieren können (Ochi and Westerfield, 2007).
14
1.1.5 Herzentwicklung
Myokardiale Progenitorzellen zählen zu den sich zuerst differenzierenden
Zellen des Mesoderms während der frühen Gastrulation und sind
ursprünglich lokalisiert im ventrolateralen Randbereich der Blastula im 512-
Zell-Stadium (Yelon, 2001). Bereits im 8-Somiten-Stadium ist die Migration
zur embryonalen Achse in den kranialen Teil des Embryos erfolgt (Warga
and Kimmel, 1990).
Die sich zu Myokardiozyten differenzierenden Progenitorzellen beginnen mit
der Expression von Sarcomer-Protein kodierenden Genen wie cmlc1 und
cmlc2 (Reiter et al., 1999).
Bis zum 15-Somiten-Stadium bilden die myokardialen Progenitorzellen im
flachen Mesoderm zwei tubuläre Primordiale, die sich vom kaudalen Ende
des trigeminalen Ganglions rostral bis zum otischen Vesikel kaudal
erstrecken und dabei dem Dottersack direkt aufzuliegen scheinen, wobei den
Primordialen dorsomedial je eine dünne endodermale Zellschicht aufliegt
(Stainier et al., 1993). Im 21-Somiten-Stadium wird die Migration beider
ausgebildeten Tuben nach medial aufeinander zu deutlich, wobei sich mittig
beider tubulären Konstrukte eine Zellpopulation, erstmals von Swaen
beschrieben (Swaen and Brachet, 1899), befindet, die für die Ausbildung des
Endokards verantwortlich ist (Stainier et al., 1993).
Nach etwa 24 hpf erfolgt die kardiale Fusion beider primitiver tubulärer
Vorläufer zum tubulären Herzen mit kegelförmiger Ausprägung, dessen
Basis dem Dottersack aufliegt und mit dem Perikard in Verbindung steht. Das
venöse System wird später Anschluss an die Basis erhalten, das zukünftige
arterielle Ende bildet die Kegelspitze; die Migration der endokardialen
Vorläuferzellen scheint dabei von der Spitze in Richtung Basis entlang der
anterioren und posterioren Seite zu erfolgen (Stainier et al., 1993). Die
kardiale Fusion ist bislang nur unvollständig verstanden. Eine Reihe von
Genen wie beispielsweise der bHLH Transkriptionsfaktor hand2 (Yelon et al.,
2000) oder das miles apart-Gen (mil), welches für einen Lysosphingolipid G-
Protein-gekoppelten Rezeptor kodiert (Kupperman et al., 2000), scheinen an
der Migration der tubulären Systeme nach medial beteiligt zu sein. Ebenfalls
an der Fusion beteiligt zu sein scheinen die mit den Myokardiozyten in
Kontakt stehenden endodermalen Zellen, welche ebenso zeitlich koordiniert
15
nach medial wandern um die anterioren Anteile des Magen-Darm-
Schlauches zu bilden (Yelon, 2001), denn Genmutationen, die die
endodermale Differenzierung inhibieren, wie zum Beispiel casanova, bonnie
and clyde oder fau, verursachen ebenfalls kongenitale Herzanomalien
(Alexander et al., 1999; Yelon, 2001; Kikuchi et al., 2000).
Durch mhc-Gen Expressionsmuster konnte die Ausprägung der einzelnen
Kammern ab dem 26-Somiten-Stadium nachgewiesen werden (Stainier et
al., 1993). Dabei können atriale von ventrikulären, myokardialen
Subpopulationen anhand des Expressionsmusters von vmhc unterschieden
werden, welches für die Ventrikel-spezifische schwere Myosinkette kodiert
(Yelon et al., 1999).
Bereits im 22-Somiten-Stadium sind erste myokardiale Kontraktionen
erkennbar, nach 24 hpf ist eine koordinierte Herzfrequenz von etwa 90
Schlägen/ Minute messbar. Man erkennt wellenförmige Kontraktionen,
beginnend am Sinus venosus bis zum Ausflusstrakt (Nguyen et al., 2008). In
dieser Phase der Entwicklung ist die beginnende Blutzirkulation nachweisbar
(Stainier et al., 1993).
Etwa 30 hpf ist eine Herzfrequenz von etwa 140 Schlägen/ Minute messbar,
zudem wird die Windung des Herzens auf die rechte Körperhälfte des
Embryos deutlich, welche 36 hpf abgeschlossen ist. Neuste Studien haben
darüber hinaus gezeigt, dass insbesondere die Signale des Proteins Nodal
und dessen inhibierende Wirkung auf Bmp die Migration myokardialer
Vorläuferzellen beeinflussen und wesentlich an der links-rechts Asymmetrie
des Herzens sowie dessen Lateralisation beteiligt sind (Veerkamp et al.,
2013). Das Herz schlägt nun mit 180 Schlägen/ Minute, eine deutliche
Zirkulation bis in den Schwanzbereich ist erkennbar. Die Ausbildung der
einzelnen Herzhöhlen beginnt mit der Induktion von Subtypen myo- &
endokardialer Zellen an der atrioventrikulären Grenze. Durch die
Kommunikation beider Zellpopulationen entsteht ein epithelialer-
mesenchymaler Übergang, welcher zur Bildung atrioventrikulärer Kissen
führt, die sich im Verlauf zu den atrioventrikulären Klappen entwickeln
(Eisenberg and Markwald, 1995). Wesentlich beteiligt an der Ausprägung der
Kissen und der Ausbildung der atrioventrikulären Herzklappen ist nach Walsh
das jekll-Gen (Walsh and Stainier, 2001).
16
Nach etwa 48 hpf differenzieren am atrioventrikulären Übergang gelegene
Kardiomyozyten zu langsam leitenden Zellen, d. h. elektrische Impulse
werden mit Verzögerung auf den Ventrikel übergeleitet, sodass aus der
peristaltischen Kontraktion eine koordinierte Kontraktion entsteht (Chi et al.,
2008; Milan et al., 2006). Mit Zunahme der Myokarddicke entwickelt sich
innerhalb des ventrikulären Myokards ein Trabekelwerk, welches eine
schnelle Reizweiterleitung vom Apex zur Basis ermöglicht (Sedmera et al.,
2003; Nguyen et al., 2008).
Nach abgeschlossener Embryogenese befindet sich das Herzatrium mehr
linksseitig, der Ventrikel liegt mehr rechtsseitig. Dem Vorhof schließt sich
eine kleine Kammer, der Sinus venosus, an, dem Ventrikel der Bulbus
arteriosus als Ausflusstrakt (Stainier et al., 1993). Eine Übersicht über die
Beeinflussung einiger Schritte der kardialen Entwicklung gibt Abbildung 23.
1.2 Atonal homolog 8 ( atoh8)
Basic Helix Loop Helix (bHLH) Transkriptionsfaktoren werden eine große
Bedeutung in der embryonalen Entwicklung diverser Organsysteme, sowie
der Myo- & Neurogenese zugeschrieben (Wang et al., 2009). Anhand
phylogenetischer Beziehungen und biochemischer Eigenschaften lassen sich
bHLH Transkriptionsfaktoren in 6 Klassen (A, B, C, D, E, F) gliedern. Atoh8,
welches math6 der Säugetiere entspricht (Yao et al., 2010), gehört zur
Gruppe der A-bHLH Transkriptionsfaktoren (Simionato et al., 2007) und lässt
sich spezifisch zur NET-Familie innerhalb der atonal Superfamilie zuweisen,
welcher ebenfalls Familien von Atonal, Neurogenin, NeuroD, Oligo, Beta3,
Dellilah und Mist angehören (Ledent et al., 2002). Menschliches atoh8
(math6) besteht aus 321 Aminosäuren, besitzt eine bHLH-Domäne und ist
auf Chromosom 2p11.2 lokalisiert (Yao et al., 2010); es ist ein
Fusionsprodukt aus zwei orthologen Chromosomen nicht menschlicher
Primaten (Chen et al., 2011). Während Proteine der atonal Familie allgemein
durch jeweils ein einzelnes Exon kodiert werden und hauptsächlich an der
Neurogenese beteiligt sind, wird atoh8 durch drei Exons kodiert und
beeinflusst nach seiner spatiotemporalen Expression diverse Organsysteme
während der Embryogenese (Inoue et al., 2001).
17
Unterschiede in der atoh8 Gensequenz und dessen regulatorischen
Einheiten wie beispielsweise die Häufigkeitsverteilungen von TATA-Boxen
und CpG-Inseln verdeutlichen einerseits die Spezies-abhängigen
Unterschiede im Expressionsmuster, andererseits die Feinregulierung in der
Expression und somit Wirkung auf die verschiedenen Organe und Gewebe
(Chen et al., 2011).
Es ist beispielsweise nachgewiesen, dass atoh8 durch die Induzierung der
Neurogenese bei Inhibierung der Gliogenese entscheidenden Einfluss auf
die sich entwickelnde Retina der Maus nimmt (Inoue et al., 2001). Ebenso
scheint in der Embryogenese der Maus eine Beteiligung an der
Differenzierung der Podozyten während der Nierenentwicklung vorzuliegen
(Ross et al., 2006). Auch die Entwicklung des endokrinen Pankreas unterliegt
Einflüssen von atoh8, sodass ein Knockout des atoh8-Gens in Mäusen
aufgrund der dramatischen Fehlentwicklung diverser Organsysteme letal
endet (Lynn et al., 2008). Jüngste Studien an Mäusen haben gezeigt, dass
atoh8 eine entscheidende Rolle bei der Kompartimentierung hypaxialer
Myotome während der Somitogenese spielt und demnach entscheidend an
der Regulierung der Myogenese beteiligt ist (Balakrishnan-Renuka et al.,
2013). Auch im Zebrafisch weist das atoh8- Expressionsmuster in Retina,
Somiten und Herz insbesondere auf eine Beteiligung von Neurogenese,
Myogenese und Herzentwicklung hin (Yao et al., 2010). Eine Beteiligung an
muskulären sowie kardialen, embryonal determinierten Erkrankungen kann
demnach vermutet werden.
Forschungen an neurologischen Patienten konnten darüber hinaus eine
erhöhte atoh8-Expressionsbereitschaft bei an Oligodendrogliomen leidenden
Patienten nachweisen (Ducray et al., 2008), Ähnliches wurde bei
Glioblastoma multiforme Patienten nachgewiesen (Freire et al., 2008).
1.3 Marker zur Analyse der Myo- & Kardiogenese
Um eine Darstellung der Skelettmuskulatur und des Herzens während der
Embryogenese mittels in-situ-Hybridisierung zu erreichen, erfolgte die
Auswahl und der Einsatz verschiedener, jeweils speziell geeigneter,
analytischer Marker.
18
Zu Beginn der Versuchsreihe wurde eine atoh8-Sonde eingesetzt, um das
atoh8-Expressionsmuster insbesondere in den Somiten und der Herzanlage
des Zebrafisches während der Embryogenese darzustellen. Spezifische
myod- & pax3a-Sonden wurden genutzt, um die Skelettmuskulatur in
verschiedenen Stadien der embryonalen Entwicklung nachzuvollziehen.
Pax3a determiniert dabei die ersten Differenzierungsprozesse der frühen
Myogenese, daran anschließend dominieren die muskulären Regulatoren
wie myf5, myod, myog und mrf4 die myogene Differenzierung (Yokoyama
and Asahara, 2011).
Zur Analyse der kardialen Entwicklung wurden in der in-situ-Hybridisierung
spezifische Marker eingesetzt, die einerseits kardiale Strukturen zur
Darstellung bringen, andererseits bei Veränderung in deren
Expressionsmuster Hinweise auf verschiedene kardiale Funktion geben
können. Dabei beleuchtet vmhc die Expression eines Teiles des
Strukturproteins Myosin und ncx-1 die Expression eines kardialen Calcium-
Kanals (Yelon et al., 1999; Langenbacher et al., 2005).
1.3.1 Pax3a
Pax3a zählt als Transkriptionsfaktor zur Familie der paired box Proteine und
dient als wichtiger Marker der frühen muskulären Stammzellen in den
Dermomyotomen der lateralen Somiten (Hammond et al., 2007). Neben
pax3a existiert eine weitere Isoform pax3b, beide Formen entstehen durch
den Vorgang des alternativen Splicings (Tsukamoto et al., 1994). Es ist
neben der Skelettmuskelentwicklung von großer Bedeutung für die
Entwicklung der dorsalen Zellen des Nervensystems und des Neuralrohres
(Epstein et al., 1991; Goulding et al., 1994).
Nahezu alle myogenen Vorläuferzellen des Dermomyotomes exprimieren
pax3a. Mit dem Beginn der Myogenese sinkt die pax3a Expression
kontinuierlich ab, die Expression der bHLH Transkriptionsfaktoren, bekannt
als muskuläre Regulationsfaktoren (MRFs), steigt signifikant an (Yusuf and
Brand-Saberi, 2006), aus den Progenitorzellen entstehen Myoblasten
(Yokoyama and Asahara, 2011). Somit ist pax3a entscheidend an der
Induktion und Regulation der Expression der MRF-Muster, insbesondere von
myf5 und myod, beteiligt. Es konnte einerseits gezeigt werden, dass eine
19
Überexpression von pax3a eine gesteigerte Myogenese zur Folge hat
(Maroto et al., 1997; Hammond et al., 2007), andererseits wurde
nachgewiesen, dass ein myod-Knockout eine Hochregulation der pax3a
Expression in den anterioren Somiten verursacht, ein gleichzeitiger Knockout
von myod und myf5 führte bei kontinuierlicher pax3a Expression zur
Apoptose betroffener Zellen (Hammond et al., 2007).
Veränderungen im pax3a Expressionsmuster können zu kongenitalen
Erkrankungen wie dem Waardenburg Syndrom führen (Moase and Trasler,
1992).
1.3.2 Myod
Myod, erstmals 1986 von Weintraub beschrieben (Lassar et al., 1986), zählt
zu den bHLH Transkriptionsfaktoren und ist Teil der Gruppe der MRFs. Es ist
während der Myogenese wesentlich beteiligt an der Differenzierung von
Fibro- zu Myoblasten (Tapscott, 2005), dabei reicht die Anwesenheit von
myod allein zur Induktion funktionsfähiger Skelettmuskelzellen aus, ein
gleichzeitiger Knockout von myf5 und myod jedoch hat eine fehlende
Muskelbildung zur Folge (Rudnicki et al., 1993; Kassar-Duchossoy et al.,
2004). Myod dient somit als spezifischer Marker der frühen Myogenese durch
Expression in den Satellitenzellen, den Vorläuferzellen der Myoblasten (Kadi
et al., 2005).
Wie zuvor beschrieben existieren Zusammenhänge zwischen der Expression
von pax3a und den MRFs. Mit dem Beginn der Myogenese und Expression
der MRFs findet eine Herunterregulation der pax3a Expression in den
Progenitorzellen statt (Rudnicki et al., 1993), beispielsweise durch eine
Suppression durch myod über FGF8-Signalwege (Hammond et al., 2007).
Während myod deutlich in den hypaxialen Muskelmassen exprimiert wird,
findet sich myf5 zu großen Teilen in den epaxialen Muskelmassen
(Yokoyama and Asahara, 2011), dadurch besitzt myod im Verlauf eine
Schlüsselfunktion an der Entwicklung der Extremitätenmuskulatur und
Kiemenbögen, während myf5 an der Entwicklung der paraspinalen und
interkostalen Muskulatur beteiligt ist (Kablar et al., 1997). Die Expression von
myf5 geht dabei der myod Expression leicht voraus (Mok and Sweetman,
2011). Obwohl die Faktoren, welche die myod Expression induzieren,
20
weitgehend unbekannt sind, existieren Signalwege wie Mef2 und p38-
Kinase, ausgelöst durch myod, welche die myod Expression der sich
differenzierenden Myoblasten aufrecht halten um die dauerhafte
Proteinproduktion dieser Zellen zur Differenzierung zu verändern (Tapscott,
2005).
1.3.3 Ventricular myosin heavy chain (vmhc)
Ventricular myosin heavy chain (vmhc) stellt neben einer Anzahl variabler
leichter Ketten ein zum Motorprotein Myosin gehörendes, spezifisch
kardiales Protein dar. Dabei besitzt es eine katalytische Kopfdomäne mit
ATPase-Funktionalität und ist wesentlich an der Kontraktilität der
Muskelfasern beteiligt (Alberts et al., 2002). Die vmhc Expression kann dabei
als Marker der frühen Kardiogenese genutzt werden. In der frühen
embryonalen Entwicklung des Herzens lassen sich zwei Zellpopulationen
anhand ihrer Expression von vmhc oder cmlc2 (cardiac myosin light chain)
unterscheiden, wobei vmhc spezifisch in den sich zu ventrikulären
Myokardiozyten entwickelnden Zellen exprimiert wird (Yelon et al., 1999).
Während der Embryogenese der kardialen Strukturen findet eine kardiale
Fusion statt. Durch einige Mutationsversuche konnten beispielsweise bei der
Mutation des cas-Gens (casanova) zwei parallel schlagende Herzen,
bezeichnet als cardia bifida, nachgewiesen werden (Alexander et al., 1999;
Chen et al., 1996; Stainier et al., 1996). Diese Fusion ist jedoch für die
Expression bzw. spätere Funktionsfähigkeit des Myosins nicht von
Bedeutung (Yelon et al., 1999).
Bei der Initialisierung der myokardialen Vorläuferzellen scheint das Pandora-
Gen (pan) eine wichtige Rolle zu spielen, wie durch Mutationsversuche
ebenfalls gezeigt werden konnte (Stainier et al., 1996). Yelon wies nach,
dass neben der verzögerten Differenzierung und Fusion der myokardialen
Vorläuferzellen durch induzierte pan-Defekte eine essentielle Abhängigkeit
der frühen vmhc-Expression von der pan-Aktivität besteht (Yelon et al.,
1999). Weiterhin übernehmen Transkriptionsfaktoren wie hand2 (Yelon et al.,
2000), gata5 und fgf8 (Reiter et al., 1999) bei der Induktion der vmhc-
Expression und Differenzierung der Myokardiozyten ebenso wichtige
Funktionen, die bislang nicht vollständig geklärt sind. Promotoranalysen von
21
vmhc zeigten, dass den Transkriptionsfaktoren gata4 und gata6 ebenfalls
Schlüsselfunktionen in der Induktion der vmhc- Genexpression zukommen
(Park et al., 2009). Das Homeobox-Protein nkx2.5, ein Transkriptionsfaktor
und Marker des präkardialen Mesoderms (Chen et al., 1996; Evans, 1999),
gilt als einer der frühesten zur Differenzierung der kardialen Zellen
erforderlichen Proteine, da eine Abwesenheit der nkx2.5-Expression zur
vollständig fehlenden Differenzierung führt (Yelon, 2001). Das vmhc-Gen
selbst wird dabei über diverse, nur unvollständig geklärte Mechanismen
reguliert. Es besitzt beispielsweise eine Bindestelle für gata und zwei
Bindestellen für den Transkriptionsfaktor nkx2.5, wobei nkx2.5 für die
selektive Expression von vmhc in ventrikulären Zellen verantwortlich zu sein
scheint, da Deletionsversuche nachwiesen, dass unter Abwesenheit von
nkx2.5 ektopes vmhc in atrialen Zellen exprimiert wurde (Jin et al., 2009).
1.3.4 Natrium-Calcium-Austauscher 1 ( ncx-1)
Kardiomyozyten des Herzens verfügen über ein fein reguliertes System an
Ionenkanälen für verschiedene Mineralien, um eine koordinierte Kontraktilität
über das gesamte Organ zu erreichen. Dabei spielt die Calcium-
Homöostase eine übergeordnete Rolle (Langenbacher et al., 2005).
Während für die Einleitung der Kontraktion spannungsabhängige L-Typ-
Calciumkanäle, die zu einem Anstieg der intrazellulären
Calciumkonzentration führen, verantwortlich sind, sorgt eine Reihe von
Kanälen für den Ausstrom von Calciumionen und somit zu einer sinkenden
intrazellulären Konzentration. Dazu zählen einerseits die Calcium-ATPase2
(SERCA2) des endoplasmatischen Reticulums, welche Calciumionen zur
Speicherung zurück in das endoplasmatische Reticulum pumpt, andererseits
die Plasmamembran-Calcium-ATPase (PMCA) und der Natrium-Calcium-
Austauscher-1 (ncx-1), welche zu einem Ausstrom aus der Zelle führen
(Langenbacher et al., 2005).
Durch die Fehlfunktion insbesondere der SERCA2 und des ncx-1 wurden
kardiale Erkrankungen, die mit Fibrillationen und Arrhythmien bis zum
plötzlichen Herztod durch eine unzureichende Regulation des
Calciumhaushaltes einhergehen, assoziiert (Pogwizd et al., 1999; Hasenfuss
et al., 1999). Durch Knockout-Versuche an Mäusen konnte dies bestätigt
22
werden, da durch die Abwesenheit von ncx-1 schwere kardiale,
arrhythmische Defekte mit sehr schwacher Kontraktilität erzeugt wurden
(Wakimoto et al., 2003). Zudem haben genetische Studien nachgewiesen,
dass die ncx-1 Aktivität eine essentielle Rolle in der embryonalen kardialen
Entwicklung spielt (Rottbauer et al., 2001).
Langenbacher wies durch Knockdown-Versuche am Zebrafisch nach, dass
die Genexpression des herzspezifischen ncx-1-Gens ebenfalls für die
kardiale Rhythmizität des Zebrabärblings von essentieller Bedeutung ist
(Langenbacher et al., 2005).
Somit dient ncx-1 als hilfreicher Marker, da durch das ncx-1
Genexpressionsmuster im Zebrafisch die Embryogenese des Herzens
verfolgt werden kann, wobei Veränderungen in der Expression hinweisend
für die Entstehung von Arrhythmien sein können.
1.4 Entwicklung der Methodik
Zur Detektion und Analyse embryonaler Prozesse stehen diverse Methoden
zur Verfügung. Dabei eignet sich die whole mount in-situ- Hybridisierung sehr
gut zur Darstellung einzelner Genexpressionsmuster auf der Ebene der
mRNA Expression. Gefärbte Schnittbilder erlauben ebenfalls die Detektion
und Differenzierung anatomischer Strukturen. Immunhistochemische
Antikörperfärbungen weisen translatierte Proteine spezifisch nach.
Zur Untersuchung der Funktion einzelner Gene, wie in dieser Arbeit atoh8,
auf den Organismus werden zusätzlich Knockdown-Experimente eingesetzt.
Eine gute Möglichkeit bietet die Mikroinjektion von Morpholinosubstanzen in
den Embryo.
1.4.1 In-situ-Hybridisierung
Gene, die für Proteine kodieren, besitzen in den meisten Fällen spezifische
Expressionsmuster, da die entstehenden Proteine Funktionen in spezifischen
Geweben nachgehen und nicht von jeder Zelle produziert werden. Im Laufe
der embryonalen Entwicklung kann es einerseits zu Veränderungen im
Expressionsmuster eines Gens kommen, andererseits werden einige Gene
beispielsweise nur in der frühen embryonalen Phase exprimiert, sodass in
späteren Stadien keine Expression mehr nachweisbar ist. Auch genetische
23
Defekte oder Knockdown-Experimente erzeugen veränderte
Expressionsmuster im Organismus.
Durch die Methode der whole mount in-situ-Hybridisierung, zuerst von Gall
und Pardue im Jahre 1969 beschrieben (Gall and Pardue, 1969), können
Expressionsmuster einzelner Gene durch die Erzeugung von DNA-/RNA-
oder RNA-/RNA-Hybriden mittels spezifischer, markierter Sonden
nachgewiesen werden. Meist kommt zur Markierung Digoxigenin an den
Uracilbasen oder ein Fluoreszenzmittel zum Einsatz, an den spezifische,
meist mit alkalischer Phosphatase beladene Antikörper binden. Durch
Zugabe einer Lösung, beispielsweise NBT/BCIP, mit welcher die alkalische
Phosphatase reagiert, entsteht eine Färbung im Embryo ausschließlich an
den Stellen, an denen Hybride entstanden sind. Nach erfolgreicher
Anfärbung können die Embryonen fixiert werden und es besteht die
Möglichkeit, Schnitte zur gezielten Analyse verschiedener anatomischer
Strukturen anzufertigen. Durch die Schnittbilder können feine
Expressionsmuster differenziert werden und insbesondere in Körpermitte
gelegene Strukturen sind voneinander abgrenzbar analysierbar. Im
besonderen Fall des Umgangs mit Zebrafischeiern ist die Dechorionation der
Embryonen unerlässlich um ein Eindringen der Substanzen zu
gewährleisten. Zudem muss während der gesamten Versuchsanordnung
streng RNase-frei gearbeitet werden, um Abbauprozessen und somit
Ergebnisverfälschungen vorzubeugen.
1.4.2 Morpholinos
In Knockdown-Experimenten werden spezifische Gene durch verschiedene
Mechanismen der Blockierung der Transkription oder Translation
herunterreguliert. Um beispielsweise die Funktion eines Gens wie atoh8 auf
die Embryonalentwicklung oder Auswirkungen eines atoh8-Mangels auf den
Organismus zu erforschen, können derartige Experimente genutzt werden.
Eine Variante stellt die Mikroinjektion von Morpholinos in den Embryo dar.
Molekularbiologisch sind Morpholinos, entwickelt von Summerton im Jahre
1997 (Summerton and Weller, 1997), synthetisierte Nukleinsäure-Analoga,
meist bestehend aus 25 Basen mit Strukturveränderungen im Grundgerüst.
Anstelle des Ribose-Zuckers der RNA verbindet die Basen ein
24
heterozyklischer Morpholinring (s. Anhang A1). Die strukturellen
Veränderungen schaffen im Vergleich zur RNA eine erhöhte Stabilität, da
kein RNase-Verdau stattfindet (Corey and Abrams, 2001). Spezifische
Morpholinos binden komplementäre mRNA in antisense-Richtung und
verhindern dadurch entweder die Translation oder das Splicing der prä-
mRNA, wobei das Startcodon des Genabschnittes in der Morpholino-
Sequenz enthalten sein muss, um einen spezifischen Knockdown zu
gewährleisten, da keine Bindung des ribosomalen Translationskomplexes an
die Hybride im Bereich des Startcodons erfolgen kann (Corey and Abrams,
2001). Für den Zebrabärbling existieren zwei verschiedene, spezifische
atoh8-Morpholinos, wobei atoh8-MO1 die Translation blockiert und atoh8-
MO2 das Splicing blockiert (Yao et al., 2010). In dieser Versuchsreihe wurde
mit den Translations-blockierenden Morpholinos gearbeitet.
Meist werden Morpholinos mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie GFP markiert,
um nach Mikroinjektion die erfolgreiche Diffusion in die Zielzelle
mikroskopisch nachweisen zu können (Yuan and Sun, 2009).
Der Unterschied zu Knockout-Experimenten besteht darin, dass der Effekt
von der injizierten Morpholino-Konzentration abhängig ist und sich diese mit
der Größenzunahme des Embryos proportional verringert. Somit wird in den
Endstadien der Embryonalentwicklung durchaus in einer Vielzahl der Zellen
atoh8 translatiert.
Um auszuschließen, dass mögliche beobachtbare, morphologische
Veränderungen während der Embryonalentwicklung allein auf die
Manipulation am Embryo während des Vorgangs der Injektion
zurückzuführen sind, wurde in allen Versuchsreihen neben der nicht
injizierten Kontrollgruppe auch eine Kontrollgruppe gebildet, welche mit einer
funktionslosen Morpholino-Kontrollsubstanz injiziert wurde.
1.4.3 Mikroinjektion
Die Technik der Mikroinjektion wird genutzt, um eine Substanz, wie in dieser
Versuchsreihe atoh8-MO1 und atoh8-MO1mis, in einen lebenden
Organismus zu injizieren, ohne für die embryonale Entwicklung bedeutsame
Verletzungen und anatomische Fehlbildungen hervorzurufen. Nachdem eine
feine Kapillare mit der jeweils zur Testgruppe zugehörigen Substanz befüllt
25
wurde, erfolgt unter mikroskopischer Sicht die manuelle Injektion des
Zebrabärblingembyros. Dabei wird zunächst die Eihülle, das Chorion,
durchstochen, anschließend wird die Kapillarspitze in den Dottersack
eingebracht und möglichst nah an den Zellpol herangeführt; dort erfolgt die
Injektion der Substanz, welche im Verlauf der weiteren Entwicklung in die
sich teilenden, embryonalen Zellen diffundiert (Yuan and Sun, 2009). Der
Embryo befindet sich zum Zeitpunkt der Injektion im Ein- bis Zwei-Zell-
Stadium, um eine Diffusion in nahezu alle embryonalen Zellen zu gewähren
und einen früh beginnenden Effekt über einen möglichst langen Zeitraum der
Embryonalentwicklung in Stadien der Determinierung zu erzielen. Würde die
Injektion zu späteren Zeitpunkten erfolgen, bestünde die Gefahr der
weitgehenden Ausdifferenzierung einiger embryonaler Zellen, auf die ein
Knockdown des untersuchten Transkriptionsfaktors dann möglicherweise
keinen Einfluss mehr haben würde.
26
2. Zielsetzung
Viele Studien haben bereits gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor atoh8
während der Embryonalentwicklung in diversen Organsystemen, darunter
auch in der Skelettmuskulatur und im Herzen, nachgewiesen werden kann
und die Entwicklung durch atoh8 beeinflusst wird, jedoch sind bislang nur
Teile der genauen Interaktionen verstanden.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Effekt dieses Transkriptionsfaktors auf
die Differenzierung der Skelettmuskulatur, mit den Teilstrukturen der
Skelettmuskulatur, die durch einen atoh8-Knockdown vermutlich betroffen
sind, und mit den Interaktionen der betroffenen Faktoren untereinander, die
zu den beobachtbaren muskulären Defekten nach Knockdown-Experimenten
führen können.
Darüber hinaus wird die Entwicklung des Herzens unter dem Einfluss eines
atoh8-Knockdowns beleuchtet. Neben der Analyse der erkennbaren Defekte
kardialer Strukturen während der Embryogenese werden zwei
unterschiedliche kardiale Funktionsbereiche (Kontraktilität und Rhythmik)
durch die Betrachtung jeweils spezifischer, analytischer Marker bezüglich
einer jeweils individuellen Beeinflussung untersucht. Dabei werden deren
Veränderungen gegenübergestellt und gewertet, Bezüge zu bereits
bekannten Auswirkungen hergestellt und Korrelationen zu klinisch relevanten
Erkrankungen erhoben.
27
3. Material & Methoden
3.0 Materialien
Alle genutzten Chemikalien sind von analytischem Reinheitsgrad.
Tabelle 1. Chemikalien
Aceton J.T. Baker, Griesheim
Agarose Sigma Aldrich, Hannover
Anti-DIG AK/ Lamb Serum Invitrogen, Darmstadt
Anti-DIG AP, Fab-Fragments Roche, Mannheim
Atoh8-MO1 Gene-Tools LLC
Atoh8-MO1mis Gene-Tools LLC
Basisches Fuchsin Merck, Darmstadt
BCIP Roche, Mannheim
Blocking Reagent Roche, Mannheim
CaCl2 Riedel de Haen, Seelze
CHAPS Applichem, Darmstadt
Diethylpyrocarbonat Sigma Aldrich, Hannover
Durcupan ACM I & II Fluka, Hannover
EDTA Sigma Aldrich, Hannover
Ethanol Sigma Aldrich, Hannover
Formamide VWR Prolabo, Darmstadt
Glutaraldehyd Fluka, Hannover
Glycin Sigma Aldrich, Hannover
HCl Merck, Darmstadt
Heparin Roth, Karlsruhe
KCl Merck, Darmstadt
KH2PO4 Sigma Aldrich, Hannover
Maleinsäure Sigma Aldrich, Hannover
Methanol Sigma Aldrich, Hannover
Methylenblau Merck, Darmstadt
MgCl2 Merck, Darmstadt
MgSO4 Merck, Darmstadt
Na-Citrat Sigma Aldrich, Hannover
28
Na2HPO4 Merck, Darmstadt
NaCl J.T.Baker, Griesheim
NaOH Riedel de Haen, Seelze
NBT Roche, Mannheim
Osmium Riedel de Haen, Seelze
Paraformaldehyd VWR Prolabo, Darmstadt
Phosphorwolframsäure Riedel de Haen, Seelze
Propylenoxid Fluka, Hannover
Proteinase K Roche, Mannheim
RNA (DIG labeling Mix) Roche, Mannheim
spezifische Sonden siehe 3.4.2
Sucrose J.T. Baker, Griesheim
Tissue Tek O. C. T. Compound Weckert, Kitzingen
Tris Base Roth, Karlsruhe
Tris HCl Roth, Karlsruhe
Triton-x-100 Sigma Aldrich, Hannover
TWEEN 20 Sigma Aldrich, Hannover
Uranylacetat Merck, Darmstadt
Aufgelistet sind Hilfsmittel, die von den in Laboratorien genutzten
Standardausrüstungen abweichen.
Tabelle 2. Geräte & Hilfsmittel
Ablaichgitter Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
Cryotom Leica CM3050S
Eppendorf-Aufsätze GELoader Tips
Fischanlage Stand-Alone Unit V30
& PP-Modul inkl. 500L
Tanksystem Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
Fischboxen Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
Fluoreszenmikroskop Leica M165FC
Glaskapillaren TW 100F-4, WPI
Lichtmikroskop Olympus SZX7 mit ACH 1X Obj,
29
Lichtquelle Olympus KL1500 compact
Mikroinjektionspumpe PV820 Pneumatic Picopump, WPI
Mikroskop-Kamera Leica D420
Needle-Puller
Bachofer Laboratoriumsdiagnostik
Reutlingen
Objektträger (Cryo) Superfrost Plus Menzel-Gläser
Pasteurpipetten 3ml graduiert VWR International
Petrischalen 15mm Durchm. Becton Dickinson Labward
Ultracut mit Diamantmesser Reichert-Jung
Tabelle 3. Sonstige Verbrauchsmaterialien
Agar-Platten siehe 3.2.1
AquaCon Plus u.a. Regulatoren
der Wassergüte Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
Silver Star Artemia Brine Shrimp
Eggs Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
pyramidenförmiges Gefäß Eigenkonstrukt
Red Sea Coral Pro Salt Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
TetraMin Baby Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
TetraMin Pro Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
Wassergüte-Testset Aquarien-Bau Schwarz, Göttingen
3.1 Danio rerio Aquaristik
3.1.1 Tierhaltung
Der durchschnittliche Tierbestand lag bei etwa 20-25 Tieren/ 5 Liter Box und
einer Boxenanzahl von 15-20 Boxen. Die in dieser Arbeit eingesetzten
Zebrabärblinge (Danio rerio) entstammen einer Münsteraner Anzucht
(Wildtyp L87 AB, L89 AB, L52 AB2).
Die Boxen waren Teil einer Großanlage (s. Anhang A2), welche sowohl eine
kontinuierliche Wasserzirkulation als auch die Filterfunktion des Wassers
gewährleistet und darüber hinaus einen automatischen Austausch von bis zu
1/3 des Wasservolumens über 24h bei konstanten Wasserwerten ermöglicht,
30
um das Zirkulationsvermögen aufrecht halten zu können (Aquarien-Bau
Schwarz aus Göttingen, Stand-Alone Unit V30 & PP-Modul mit 500 Liter
Tanksystem).
Um eine bestmögliche Imitation des natürlichen Lebensraumes des
Zebrafisches zu erreichen, wurde eine konstante Raumtemperatur von
28,5°C ermöglicht. Auch ein Tag-/Nachtrhythmus wurde durch eine
Zeitschaltuhr am Licht der Großanlage (Tagesbeginn 09:00 Uhr) künstlich
erzeugt, sodass ein 14 Stunden-Tag-/ 10 Stunden-Nacht-Zyklus vorlag
(Nüsslein-Volhard and Dahm, 2002; Westerfield, 1995).
Zudem erfolgte eine tägliche Kontrolle der optimalen Wasserwerte, ggf.
wurde durch Zusätze eine optimale Wasserqualität gewährleistet.
Tabelle 4. Wasserwerte
Die komplette Reinigung der Anlage erfolgte ein Mal wöchentlich. Die
Reinigung der Boxen erfolgte zwei bis drei Mal wöchentlich.
Futterüberstände wurden abgesaugt und die Filterfunktion der Großanlage
wurde kontrolliert. Geringe Verschmutzungen wie z.B. Futterablagerungen im
Strömungsgitter, wurden täglich nach der Fütterung mit einer Pipette
bereinigt.
Der Tierbestand wurde regelmäßig kontrolliert und die Tiere wurden täglich
auf äußerlich sichtbare Erkrankungen untersucht. Die Tierhaltung erfolgte
nach den Maßgaben der tierschutzgesetzlichen Richtlinien.
Gesamthärte 4-6°d
pH-Wert 6,8- 7,5
Karbonhärte 3°d
Phosphat <0,4mg/L
Ammoniak <0,2mg/L
Nitrit <0,2mg/L
Nitrat <50mg/L
Leitfähigkeit 180-350µS
31
3.1.2 Fütterung
Die Fütterung der Fische erfolgte täglich morgens nach Anschalten des
Lichtes. Gefüttert wurde ein Trocken-Fischfutter (Tetra Pro).
Zwei bis drei Mal pro Woche haben die Fische als Zusatzfutter Artemien
(Silver Star Artemia Brine Shrimp Eggs) erhalten. Die Artemienanzucht
erfolgte in einer dazu angefertigten Vorrichtung. Ein kontinuierlich belüftetes,
pyramidenförmiges Gefäß wurde mit Wasser unter Zugabe von 30g/L Salz
(Red Sea Coral Pro Salt) befüllt. Hinzu gegeben wurden etwa 5 Löffel
Artemien-Eier. Der Vorteil des Gefäßes ist die Isolation der lebenden
Artemien, da nach etwa zwei Tagen ungeschlüpfte Eier zu Boden sinken und
über einen Hahn abgelassen werden können, die lebenden Artemien sich in
der Gefäßmitte aufhalten und die Eihüllen an der Oberfläche schwimmen. So
besteht die Möglichkeit der Fütterung von ausschließlich lebenden
Organismen, sodass keine salzigen Überstände in das Süßwassersystem
gelangen. Zu hohe Salzkonzentrationen wirken für D. rerio letal. Daher
wurden auch die zugefütterten Artemien vor der Fütterung mehrfach gespült.
Die Jungtiere erhielten spezielles Fischfutter (Tetra Min Baby).
3.1.3 Nach- & Aufzucht
Zur Erweiterung des Tierbestandes und um permanent Tiere im
fortpflanzungsfähigen bzw. brutfähigen Alter (im Alter von 7-18 Monaten) im
Bestand zu halten, erfolgte ebenfalls eigens die Nachzucht von Jungtieren
(Nüsslein-Volhard et al., 1995).
Tiere einer Box wurden vor Beginn des Tagesrhythmus am Morgen zur
Paarung in eine Ablaichbox gesetzt, in welcher sich ein engmaschiges Gitter
ca. 3 cm über dem Boden befand. Die Ablaichbox wurde zurück in die
Großanlage gestellt, sodass Anschluss an die Filterversorgung gewährleistet
war. Die etwa ein bis zwei Stunden nach Paarung abgelaichten Eier glitten
durch das Gitter auf den Boden, sodass diese von den Tieren nicht
gefressen werden konnten. Im Anschluss wurden die Tiere zurückgesetzt
und die Eier zur weiteren Nutzung abgeschöpft. Zur Nachzucht wurden
abgelaichte Fischeier zunächst für 5 Tage in eine mit E3-Medium (non
nominatur 2011) befüllte Schale gegeben. Täglich wurden abgestorbene
Embryonen ausgelesen (erkennbar an der Eintrübung). Anschließend
32
wurden geschlüpfte Fische in eine Jungtierbox, außerhalb der Großanlage,
gesetzt. Durch die Zirkulationsströmung innerhalb der Anlage würden die
Embryonen andernfalls in das System gespült.
Nach etwa drei Wochen haben die Jungtiere die Größe erreicht um in eine
Box der Großanlage umgesetzt werden zu können. Nach dem 5. dpf (days
post fertilisation) wurde mit der Fütterung zwei Mal täglich begonnen. Ab dem
16. dpf wurden Artemien gefüttert und nach etwa einem Monat erhielten die
Jungtiere Trocken-Fischfutter. Die Tierhaltung und Tieraufzucht erfolgte nach
den Protokollen von Westerfield und Nüsslein-Volhard (Nüsslein-Volhard and
Dahm, 2002; Westerfield, 1995).
Die zur Mikroinjektion genutzten Fischeier wurden nach dem Abschöpfen
ebenfalls in E3-Medium gegeben.
Tabelle 5. E3-Medium
NaCl 5mM
KCl 0,17mM
CaCl2 0,33mM
MgSO4 0,33mM
Methylenblau 20µl von 0,03M/L
3.2 Mikroinjektion
3.2.1 Agarose-Gel Platten
Zur gezielten Mikroinjektion wurden Zebrafischeier auf einer konstruierten
Agarose-Gel Platte linear angeordnet (1,5% Agar gelöst in Aqua dest.).
Agarose-Gel wurde in eine flache Petri-Schale (100x15 mm) gegeben. Auf
das flüssige Gel wurde eine Plastikform mit feinen Lamellen gelegt, sodass
das Negativ der Lammelen in dem trocknenden Agarose-Gel abgebildet
wurde. In den so entstandenen Einkerbungen im Agarose-Gel konnten die
Zebrafisch-Eier fixiert angeordnet werden (siehe Abbildung 3).
33
Abbildung 3. Agarose-Gel Platte.
Embryonen werden zur Vorbereitung der Mikroinjektion auf der Agarose-Gel Platte
ausgerichtet.
3.2.2 Injektionsnadeln
Die Injektionsnadeln (WPI TW100F-4 Glaskapillaren aus Sodaglas, 100mm
Länge, äußerer Durchmesser 1,0mm) wurden mit einem Needle-Puller
(Bachofer Laboratoriumsdiagnostik Reutlingen) gezogen, sodass der
Durchmesser an der Nadelspitze bei etwa 0,15mm lag und entstehende
Injektionstropfen bei gegebenem Druck einen Durchmesser von etwa 0,14 -
0,16mm aufwiesen (Yuan and Sun, 2009).
3.2.3 Morpholino
Die zur Mikroinjektion an den Zebrafischen genutzten Translations-
blockierenden antisense Morpholino Oligonukleotide (Atoh8-MO1, 5`-
TGTTTAGATGTGGGTTCTTCATTTG-3`) und nicht blockierenden mismatch
Morpholino Oligonukleotide (Atoh8-MO1mis, 5`-
TGATTACATGTGGCTTCTTGATATC-3`) wurden von Gene-Tools LLC
designed und synthetisiert. Die mismatch Morpholino Oligonukleotide wurden
zur Kontrollinjektion genutzt. Sie sind unspezifisch, binden keine mRNA und
sind daher im Versuch funktionslos. Sowohl Morpholino als auch mismatch
Morpholino sind mit 3`Carboxyfluoreszin markiert. Die Injektion erfolgte in
unverdünnter Lösung mit 8,33ng/nl. Die Lagerung der Morpholinos erfolgte
abgedunkelt bei Raumtemperatur.
34
3.2.4 Etablierung der Anlage/ Setting
Die Injektionsnadel wurde mit einer Eppendorf Pipette mit etwa 1 µl
Injektionslösung befüllt. Unter mikroskopischer Sicht wurden bis zu 1,5mm
der Nadelspitze mit einem Skalpell abgetrennt um die Durchlässigkeit der
Nadel zu gewährleisten. Die Kapillare wurde an einen dünnen
Gummischlauch angeschlossen, sodass die zuvor eingefüllte Lösung durch
Luftzufuhr bis an die Nadelspitze gebracht werden konnte. Anschließend
erfolgte die Befestigung der Nadel an dem Teflon Tubing Aufsatz des
Injektorschlauches der Injektionspumpe. Durch das Setting konnten
Injektionstropfen von annähernd 2nl erzeugt werden, sodass etwa 16ng
Substanz injiziert wurden.
Tabelle 6. Injektionsparameter
Injektionspumpe PV 820 Pneumatic Picopump WPI
Zeitintervall/Injektion 120ms
Haltedruck „Vent“, ohne Vakuumbetrieb
Injektionsdruck „Vent“, Justierung 8psi
Injektionsvolumen 1/5 eines Zellvolumens (~2nL)
3.2.5 Mikroinjektionsvorgang
Es erfolgte die Ausrichtung der vorbereiteten Agarose-Gel Platten. Mit einer
Pasteur-Pipette wurden Zebrafischeier im Ein- bis Zwei-Zell-Stadium (Alter
<30 Minuten) aus dem E3-Medium aufgenommen und auf die Agarose-Gel
Platte aufgetragen, sodass eine Anordnung der Eier entlang der
Einkerbungen vorlag (s. Abb. 3). Unter mikroskopischer Sicht (Olympus
SZX7 Mikroskop mit KL1500compact Lichtquelle) erfolgte die manuelle
Injektion der Eier etwa im 45° Winkel durch das Chorion in den Dottersack
(Mullins, 2010). Dabei sollte die Injektionslösung möglichst nah an den
animalen Zellpol gebracht werden, um eine erleichterte Diffusion in die Zellen
zu gewährleisten (s. Anhang A3). Durch eine Ausrichtung des Zellpols nach
unten ist dabei der Vorstoß der Injektionsnadel bei kontralateralem Einstich
durch den Dottersack am besten kontrollierbar.
35
3.2.6 Nachbehandlung
Nach erfolgter Injektion wurden die injizierten Eier mit E3-Medium von der
Agarose-Gel Platte in jeweils beschriftete Petrischalen gespült und unter der
gegebenen Raumtemperatur von 28,5°C inkubiert. Etwa 5 Stunden nach
Injektion fand eine erste Selektion der abgestorbenen Embryonen statt um
eine bakterielle Kontamination und lebensbedrohliche Nitritgehalte durch
Zersetzungsprozesse möglichst zu vermeiden. Je nach gefordertem
Entwicklungsstand wurden die zur in-situ-Hybridisierung bestimmten
Zebrafischembryonen anschließend zur Fixation in 4% PFA in PBS gegeben.
Zur Schnittbildanfertigung wurden Embryonen direkt in 2,5% Glutaraldehyd
fixiert.
Tabelle 7. 4% PFA in PBS
Paraformaldehyd Pulver 40g
PBS 1000ml
1N NaOH Titration zur klaren Lösung
Gelöstes HCl pH-Wert Feineinstellung auf ~7,1
Tabelle 8. PBS (20x)
H2O, Diethylpyrocarbonat beh. 1000ml
NaCl 160g
KCl 4g
Na2HPO4 28,8g
KH2PO4 4,8g
pH 7,4 mit 1n NaOH & 1n HCl titriert
3.3 Dechorionation
Nach den Protokollen von Chen und Westerfield (Westerfield, 1995; J. Chen,
2011) dient die Dechorionation der Embryonen als wichtige Vorbereitung für
nachfolgende Behandlungen wie die in-situ-Hybridisierung. Frühestens 24
Stunden nach Fixation erfolgte die Entnahme der Embryonen aus der 4%
PFA in PBS-Lösung. Unter mikroskopischer Sicht wurde das Chorion der
Embryonen mit zwei anatomischen Pinzetten vorsichtig abgetragen.
36
Anschließend wurden die dechorionisierten Embryonen zur Lagerung in eine
aufsteigende Methanolreihe überführt und schließlich in 100% Methanol bei
-20°C bis zur weiteren Nutzung gelagert.
3.4 In-situ-Hybridisierung
3.4.1 Primer-Design
Zur Analyse anatomisch-morphologischer Einflüsse der Morpholinoinjektion
auf die Entwicklung von Skelett- & Herzmuskel wurde das
Expressionsmuster verschiedener für bestimmte Proteine kodierende mRNA
Sequenzen untersucht. Für diese Untersuchung mittels in-situ-Hybridisierung
wurden spezifische mRNA Markersonden benötigt, die mit Hilfe
entsprechender Primer synthetisiert wurden.
Atoh8 (Yao et al., 2010) Sonden wurden hybridisiert, um durch die in-situ-
Hybridisierung den Nachweis zu erbringen, dass atoh8 in den untersuchten
Geweben exprimiert wird und die Expression durch den MO1- Morpholino
inhibiert wurde.
Zur Analyse der Skelettmuskulatur wurden für myod (Weinberg et al., 1996),
und für pax3a, zuerst beschrieben von Seo et al. 1998, Primer erzeugt.
Zur Analyse der Herzmuskulatur wurden für vmhc (Yelon et al., 1999) und
ncx-1 (Langenbacher et al., 2005) Primer zur Sondenherstellung erzeugt.
Das Design der genannten Primer, außer myod, erfolgte mittels Primer Blast
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) durch Dr. V. Chankiewitz.
Die Synthese der kreierten Primer erfolgte durch die Firma Eurofins
MWG/Operon (http://www.eurofinsdna.com/de/home.html).
Die lineare myoD-DNA stammt aus dem Bestand von Dr. M.
Hammerschmidt, MPI für Immunbiologie, Freiburg nach den Vorgaben von
Weinberg et al. 1996.
Tabelle 9. Primersequenzen
FW 5´- GAAACGGAAAGCACGAGAGC-3´ atoh8
RW 5´- GACAGTCTTTTCGGAGACGGA-3´
FW 5´- GCTCGAGCAA(A/G)GTIAA(T/C)GA(G/A)GCITT(T/C)GA-3´ myod*
RW 5´-TGGAAGCTTTCIAT(A/G)TAICG(T/G/A)ATIGC(G/A)TT-3́
37
FW 5´-AGCGACGGTTTGACTTCTGA-3´ pax3a
RW 5´-ACGTCAGGAGTTGTGCTCTG3´
FW 5´- CTGCCTCCGCACTTGGTGCA-3´ vmhc
RW 5´- ACCTTCACGACTGACGATTGAAGC-3 ́
FW 5´- AGCTCACGCCAGTCATTGCAGG-3´ ncx-1
RW 5´- CCGCAGGTGCTTGACCTTCCG-3´
*die myod-Sequenz stammt von Weinberg et al. 1996, erhalten von Dr. M. Hammerschmidt
3.4.2 Sondenherstellung
Die Herstellung der zur in-situ-Hybridisierung genutzten Sonden erfolgte
durch Dr. V. Chankiewitz mittels der oben genannten Primersequenzen. Es
wurden die Primersequenzen in der Polymerase-Kettenreaktion zur
Amplifizierung entsprechender DNA-Fragmente eingesetzt, welche nach
Aufreinigung über pDrive Vektoren in E. coli Zellen eingebracht und kloniert
wurden. Mittels Sequenzierung wurden die klonierten Produkte überprüft. Die
durch die anschließende Isolierung, Aufreinigung und Lineralisation mittels
der Restriktionsendonukleasen BamH1 oder Sal1 entstandenen DNA-
Abschnitte konnten zur in-vitro-Transkription der mRNA Sonden genutzt
werden. Die entstandenen mRNA Sonden sind zur späteren Detektion in der
in-situ-Hybridisierung an den Uracilbasen Digoxigenin-markiert.
3.4.3 Ablauf der in-situ-Hybridisierung
Die einzelnen Testgruppen bestanden jeweils aus Morpholinoinjektion,
Kontrollinjektion und nicht injizierten Embryonen, welche in separaten
Kammern hybridisiert wurden. Eine in-situ-Platte beinhaltet 24
Einzelkammern. Die Experimente wurden mit atoh8, myod, pax3a, vmhc und
ncx-1 Sonden separat durchgeführt. Zusätzlich wurden Experimente mit
Einsatz von zwei Sonden simultan (myod und vmhc) durchgeführt. Der
Ablauf des Experiments richtet sich nach einer Modifizierung des Protokolls
von Westerfield (Westerfield, 1995) und wurde mit freundlicher Unterstützung
von S. Wulf durchgeführt.
Wie zuvor beschrieben liegen die dechorionierten Embryonen in dehydrierter
Form bei -20°C vor. Somit stellt die Rehydrierung zu je 10 Minuten in 50%
38
und 30% Methanol in PBST sowie in reinem PBST einen wichtigen Schritt
vor Start des Experimentes dar.
Daran anschließend wurden die Embryonen für 20 Minuten erneut in
4%PFA/PBS nachfixiert und für drei mal 15 Minuten in PBST gewaschen. Es
folgte die Inkubation mit Proteinase K Verdau (10µg/ml in PBST) für 5-12
Minuten bei Raumtemperatur. Gestoppt wurde die Reaktion in 0,2% Glycin in
PBS für 1 Minute bei Raumtemperatur. Für weitere 20 Minuten erfolgte die
Nachfixation in 4%PFA/PBS und erneutes Waschen für 15 Minuten in PBST.
Der nachfolgende Schritt beinhaltet die Prähybridisierung mittels
Hybridisierungslösung nach Patel für 1-2 Stunden bei 60°C. Danach wurde
die Lösung gewechselt und die Embryonen über Nacht bei 60°C inkubiert.
Am Folgetag wurden die jeweils entsprechenden mRNA Sonden in die
Lösung zu den Embryonen gegeben und erneut bei 60°C für 24 Stunden
belassen, sodass eine Bindung der komplementären, im Embryo
exprimierten mRNA erfolgen kann.
Am 3. Tag wurden die Embryonen zunächst mit 50% Formamide in 2X SSC
und 0,1% Tween 20 für zwei Mal 20 Minuten bei 60°C gewaschen. Im
Folgenden wurden die Waschvorgänge ohne Formamide in ähnlicher Lösung
bei absteigender SSC-Konzentration (2X SSC, dann 0,2 X SSC) je zwei Mal
20 Minuten unter gleichen Bedingungen wiederholt. Mittels Blockinglösung
(Rezept Intavis) wurden weitere Reaktionen verhindert. Zur Blockinglösung
wurde eine Anti-Digoxigenin-Antikörperlösung 1:5000 gegeben und bei 4°C
über Nacht inkubiert.
Am folgenden Tag wurden die Antikörper beladenen Embryonen für vier Mal
25 Minuten in KTBT Puffer gegeben und anschließend im alkalische
Phophatase Puffer (NTMT) drei Mal 15 Minuten gewaschen, um nicht
gebundene Antikörper auszuwaschen.
Die Anfärbung der mit alkalischer Phosphatase beladenen Antikörper,
welche die mRNA Hybride spezifisch am Digoxigenin gebunden haben,
erfolgte mittels NBT/BCIP-Lösung. Die Fixierung der Embryonen in den
Platten erfolgte durch Waschen in KTBT-Puffer für zwei Mal 10 Minuten, ein
Mal für 10 Minuten Waschen in PBS und anschließender Überführung in
4%PFA/PBS.
39
Abbildung 4 . Prinzip der in-situ-Hybridisierung.
Anti-DIG-AK lagern sich an die mit Digoxigenin beladenen Uracil-Basen der mRNA-Sonden
an. Da die AKs mit alkalischer Phosphatase beladen sind, wird durch Zugabe von
NBT/BCIP-Lösung eine Farbreaktion an den Stellen ausgelöst, an den die Sonden
gebunden haben. Überschüssige mRNA wurde bereits ausgewaschen.
Tabelle 10. PBST (20X)
20X PBS 1000ml
0,1% Triton-x-100 10ml
Tabelle 11. DEPC-Wasser
0,1% DEPC 1ml/1000ml dest. Wasser
Sterilisierung durch Autoklavieren
Tabelle 12. Proteinase K Verdau
DEPC-Wasser 25ml
Proteinase K 12,5µl
Tabelle 13. Hybridisierungslösung nach Patel (1000ml)
Blocking Reagent 20g
Formamide 500ml
20X SSC 250ml
40
CHAPS 5g
10 % Triton-x-100 10ml
EDTA (0,5M, pH 8,0) 10ml
DEPC-Wasser Auffüllen auf 1000ml
2h Inkubation mit Rührfisch Wasserbad bei 65°C
Heparin 600µl
RNA (1mg/ml) 1g
Tabelle 14. 20X SSC (1000ml)
NaCl 175,3g
Na-Citrat 88,2g
H2O 800ml
10N NaOH oder HCl Titration auf pH 7,0
H2O Auffüllen auf 1000ml
DEPC 1:1000
Tabelle 15. CHAPS
10g CHAPS Zu 10% in H2O lösen
Tabelle 16. 2X SSC (50ml)
20X SSC Lösung 5ml
DEPC-Wasser 45ml
Tabelle 17. 0,2X SSC mit CHAPS (1:50)
20X SSC Lösung 1ml
DEPC-Wasser 97ml
CHAPS Lösung (10%) 2ml
Tabelle 18. Blockinglösung
Blocking Reagent in Maleinsäure-
Puffer
Endkonzentration 10%
41
Tabelle 19. Maleinsäure-Puffer
Maleinsäure 100mM
NaCl 150mM
NaOH pH 7,5 titriert
Tabelle 20. Anti-DIG-AK-Lösung
Anti-DIG Antikörper 25µl
KTBT 45ml
Tabelle 21. 10X KTBT-Puffer (1000ml)
Dest. Wasser 740ml
NaCl 88g
KCl 1,5g
TWEEN 20 10ml
Tris (pH 7,4) 250ml
Tabelle 22. Tris-Lösung 1M, pH 7,4
Tris Base 121,1g
Konz. HCl 70ml
DEPC-Wasser 800ml
Tabelle 23. Tris-Lösung 1M, pH 9,5
Tris Base 237,5g
Tris HCl 12,5g
DEPC-Wasser 250ml
Tabelle 24. alkalische Phosphatase Puffer (NTMT) 100ml
NaCl (5M) 2ml
MgCl2 (1M) 5ml
Tris (1M), pH 9,5 10ml
10% Triton-x-100 1ml
Aqua dest. Auffüllen auf 100ml
42
Tabelle 25. Färbelösung (NBT/BCIP)
NBT 180µl
BCIP 140µl
NTMT-AP-Puffer 40ml
3.5 Herstellung von Schnittpräparaten
3.5.1 Semi- & Ultradünnschnittpräparate
Die für die Herstellung von Schnittpräparaten genutzten Embryonen wurden
nach der vorgesehenen Inkubationszeit in 2,5% Glutaraldehydlösung fixiert.
Mit Unterstützung von Frau U. Ritenberg wurden zur Herstellung
schnittfähiger Blöcke die fixierten Embryonen nach etwa 24 Stunden
zunächst etwa 2Stunden in PBS gewaschen, anschließend für weitere 1,5h
in 1% Osmiumlösung in PBS gegeben und erneut 2 Stunden in PBS
gewaschen. Zur Entwässerung wurden die Embryonen in eine aufsteigende
Acetonreihe (30%, 50%, 70%, je 30 Minuten) überführt. Bei 4°C wurden die
Embryonen zur Stückkontrastierung in mit 1% Uranylacetat und 1%
Phosphorwolframsäure versetzte 70% Acetonlösung inkubiert. Daran
anschließend erfolgte die Überführung in die aufsteigende Acetonreihe (je 2
x 20 Minuten in 80%, 90%, 95% und abs. Aceton). Bei 4°C wurden die
Embryonen für 1h in Propylenoxid gegeben und im Anschluss für je 1h bei
4°C in Propylenoxid-Durcupan in den Verhältnissen 3:1, 1:1 und zuletzt 1:3
(über Nacht) überführt. Am Folgetag erfolgte die Inkubation mit Durcupan
ACM I für 24 Stunden bei 40°C, anschließend die Überführung in Durcupan
ACM II für 1 Stunde bei 40°C und zuletzt die Einbettung bei 70°C für 3-4
Tage.
Tabelle 26. Durcupan Microscopy Sciences“ACM von „Electron
DURCUPAN ACM I DURCUPAN ACM II
10ml Epoxy resin 10ml Epoxy resin
10ml 964 Aushärter 10ml 964 Aushärter
0,2ml Dibutylphthalat 0,4ml 964 Beschleuniger
/ 0,2ml Dibutylphthalat
43
Die erzeugten Blöcke wurden mittels eines Ultra-Diamantmessers des
Ultracut (Reichert-Jung) geschnitten. Dazu wurden etwa 14µm dicke Schnitte
erzeugt, welche über ein Wasserbad auf einen Objektträger aufgetragen
wurden.
Die auf diese Weise hergestellten Dünnschnittpräparate wurden in einer
Methylenblau-Färbelösung für einige Minuten inkubiert.
Tabelle 27. Methylenblau-Färbelösung
Methylenblau 0,13% wässrg. Lsg. 12ml
Basisches Fuchsin 0,13% wässrg. Lsg. 12ml
Ethanol 95% 15ml
PBS 21ml
3.5.2 Kryoschnittpräparate
Zur Anfertigung von Kryoschnittpräparaten aus PFA-fixierten Embryonen
nach in-situ-Hybridisierung eignet sich insbesondere die Methode des
Sucrose geschützten Einfrierens von Gewebe. Diese Methode wurde zu
weiterführenden und bestätigenden Untersuchungen von Maximilian Breuer
durchgeführt (s. Abb. 12).
Dazu wurden die zuvor mindestens 12 Stunden in 4%PFA befindlichen
Embryonen für 10 Minuten in 15% Sucrose in PBS, anschließend in 30%
Sucrose in PBS überführt, bis sie im Medium sanken. Anschließend wurden
die Embryonen in Cryo-Medium (Tissue-Tek) eingebettet, dazu dienten
geformte Würfel aus Aluminiumfolie, und mittels Stickstoff gefroren. Bei etwa
-23°C wurden die gefrorenen Würfel mit einem Cryotom (Leica CM3050S) in
etwa 10µm dünne Slides geschnitten. Die Dünnschnittpräparate wurden mit
speziell beschichteten Objektträgern (Superfrost Plus Menzel-Gläser)
aufgenommen.
3.6 Mikroskopie
Die Präparate der in-situ-Hybridisierung wurden mit einem
Fluoreszenzmikroskop (Leica M165FC) untersucht, analysiert und nach den
Vorgaben von Devoto et al. und Kimmel et al. ausgewertet. Dazu wurden die
Embryonen auf Agarose-Gel Platten ausgerichtet. Für sagittale Aufnahmen
44
wurden in die Gel-Platten Kerben geschnitten, sodass die Embryonen in den
Einkerbungen ausgerichtet werden konnten. Bilder wurden mit einer Leica
D420 Kamera und der zugehörigen Leica Software aufgenommen. Zur
Anfertigung von Fluoreszenzaufnahmen wurde ein einschiebbarer GFP-Filter
genutzt. Von Schnittpräparaten wurden lichtmikroskopische Aufnahmen mit
entsprechender Software erzeugt.
3.7 Auswertung
Nach Auszählung aller Embryonen der drei verschiedenen Testgruppen
bezüglich der jeweils untersuchten Merkmalsausprägungen erfolgte eine
prozentuale Angabe in Diagrammendarstellung. Zur statistischen
Auswertung wurden jeweils spezifische Vierfeldertafeln angelegt (s. Anhang
A4) und zunächst zur Klärung von signifikanten Abhängigkeiten der
beobachteten Ergebnisse Chi-Quadrat-Testungen durchgeführt. Um eine
Darstellung von Chancenverteilungen bei nachgewiesen signifikanten
Ergebnissen zu erhalten, wurden Odds Ratio-Berechnungen mit
entsprechenden 95%-Konfidenzintervallen (KI) für errechnete Chancen
durchgeführt.
45
4. Ergebnisse
4.1 Atoh8-Expression in Herz- & Skelettmuskulatur
Diverse Untersuchungen haben sich bereits mit dem Expressionsmuster des
atoh8-Gens beschäftigt und gezeigt, dass neben einer Vielzahl innerer
Organe eine Expression in den Somitenanlagen stattfindet. Auch in der
Herzanlage wurde eine atoh8-Expression beobachtet. Zu Beginn dieser
Versuchsreihe wurde jedoch zunächst eine bestätigende atoh8-in-situ-
Hybridisierung an 24 hpf Zebrabärblingembryonen durchgeführt, um den
erneuten Nachweis einer Genexpression sowohl in den Somiten, der Anlage
der sich differenzierenden Skelettmuskulatur, als auch in der
Herzmuskelanlage zu erbringen (Abb. 5).
Abbildung 5. In-situ-Hybridisierung mit atoh8-Sonde
In-situ-Hybridisierung mit atoh8-Marker an 24 hpf, 4% PFA fixiertem Zebrafisch-Embryo.
Deutliche Anfärbung der durch vertikale Septierung klar voneinander abgrenzbaren Somiten
mit Unterscheidung einzelner Muskelmassenanteile (schwarzer Pfeil). Anfärbung der
Herzanlage als länglich-ovale Struktur im oberen Rumpfbereich (roter Pfeil).
Deutlich erkennbar ist die Anfärbung der atoh8-mRNA-Hybride in klar
kompartimentierten Somiten bis in die Schwanzspitze, epaxiale und
hypaxiale Muskelmassen bilden dabei eine v-förmige Ausprägung. Einzelne
Somitenpaare sind eindeutig voneinander abgrenzbar.
46
Eine dunkel gefärbte, länglich bis ovale Struktur im oberen Rumpfbereich,
dem Dottersack aufliegend, weist die atoh8-Expression in der kardialen
Anlage nach.
Darüber hinaus ist ein schwaches Muster sowohl in neuralen Strukturen,
dorsal der Augenanlage entlang des proximalen Rumpfes in den
Rhombomeren und dem Diencephalon, als auch in der embryonalen
Augenanlage nachweisbar.
Ein Nachweis der Genexpression in den verschiedensten Geweben lässt
vermuten, dass atoh8 eine wichtige Aufgabe in der Entwicklung zuteil wird.
4.2 Morpholino-Mikroinjektion
Zur Analyse der Funktionalität und Einflüsse des atoh8-Gens wurden
Knockdown-Experimente durch Morpholino-Mikroinjektionen in
Zebrafischembryonen durchgeführt. Da die Morpholinos mit dem
Fluoreszenzfarbstoff (grün fluoreszierendes Protein) GFP markiert sind, kann
zunächst eine erfolgreich platzierte Mikroinjektion überprüft werden. Darüber
hinaus wird die Diffusion und Verteilung der Substanz innerhalb des Embryos
verfolgt. Abbildung 6 veranschaulicht den Unterschied von nicht injizierten
Embryonen im Vergleich zu injizierten Embryonen. Neben der starken
Fluoreszenz des Dottersacks, in welchen die Substanz zu Beginn
eingebracht wird, ist eine deutliche Fluoreszenzzunahme im Gegensatz zum
nicht injizierten Embryo im gesamten Körper bis in die kaudalen
Körperregionen erkennbar (vgl. Abb. 6B). Etwa 48 hpf, folglich etwa 48
Stunden nach Injektion, verblasst die Fluoreszenz im Körper im Rahmen der
Verdünnungsprozesse durch die Größenzunahme des Körpers (vgl. Abb.
6C), wobei für alle Versuche ein fest definiertes Injektionsvolumen von ~2nl
genutzt wurde. Durch die Verdünnungsprozesse wird der nachlassende
Knockout-Effekt nach einer gewissen Zeit erklärt.
47
Abbildung 6. Fluoreszenz der Morpholino-Injektion
A) Zebrafischembryo, 20 hpf, Morpholinoinjektion. Die Substanz wurde in den
Dottersack injiziert und ist in den Zellpol diffundiert. Durch Zellteilungen und
Größenzunahme im Rahmen der Entwicklung hat sich die Substanz im gesamten
Organismus verteilt, sichtbar durch die deutliche Fluoreszenz.
B) Zebrafischembryo, 48 hpf, Kontrollsubstanzinjektion. Eine umschriebene
Fluoreszenzzunahme ist wolkenförmig im Dottersack erkennbar. Die Fluoreszenz
des Körpers verringert sich, ist jedoch noch sichtbar.
C) Zebrafischembryo, 48 hpf, nicht injiziert. Der Dottersack weist keine umschriebene
Fluoreszenzzunahme auf, sondern eine leichte Eigenfluoreszenz. Im Körper des
Fisches sind keine Fluoreszenzanreicherungen erkennbar.
4.2.1 Morphologisch-anatomische Unterschiede
In der Embryogenese des Zebrabärblings findet neben einer Vielzahl von
Entwicklungen auch die Elongation des Rumpfes und Ausprägung des
Schwanzbereiches statt. Während sich der sich verlängernde Rumpfbereich
des Fisches in den ersten 24 Stunden leicht wölbt, findet in folgenden
Stadien mit der Entwicklung des muskulären Systems eine Begradigung der
kaudalen Körperabschnitte statt (vgl. Abb. 6B). Darüber hinaus verjüngt sich
der Schwanzbereich nach distal, der Rumpfbereich erscheint schlank und
ausdifferenziert mit erkennbarer Mittellinie.
Analog zur physiologischen Embryogenese weisen Morphanten in hohem
Maße Anomalien in der muskulären Entwicklung auf. Der Schwanz scheint
sich mit zunehmender Elongation deutlich abzuknicken (vgl. Abb. 6A) und
erhält eine Asymmetrie, da die schlanke Stromlinienform fehlt. Proximale
48
Rumpfanteile, die zunächst dem noch großen Dottersack anliegen, weisen
eine dauerhaft gekrümmte Form auf (vgl. Abb. 8). Bei Betrachtung der
embryonalen Körperbewegungen noch in der Eihülle fällt sowohl eine
Verlangsamung als auch eine Verminderung der Bewegung auf, während
sich die nicht injizierten Embryonen deutlich in der Eihülle winden.
Zur Analyse der verschiedenen Marker wurden Embryonen in den
nachfolgenden Experimenten in verschiedenen Stadien analysiert. Da bei
Morphanten ab etwa 40 hpf Sterberaten von mehr als 70% (bei Injektion der
Kontrollsubstanz lag die Sterberate bei ca. 20%) nachweisbar waren, wurden
in den Fällen keine statistischen Auswertungen vorgenommen, da durch die
Selektion überlebender, „gesunder“ Embryonen, bei denen beispielsweise
die Injektion nicht erfolgreich war, eine Ergebnisverzerrung zustande käme.
Die hohe Sterberate der Morphanten verdeutlicht jedoch den großen Einfluss
des atoh8-Gens auf die embryonale Entwicklung, da ein Knockdown in einer
Vielzahl der Fälle zu mit dem Leben nur schwer vereinbaren Anomalien führt.
4.3 Atoh8 beeinflusst die Skelettmuskelentwicklung
Nachdem der Nachweis einer atoh8-Genexpression in den Somiten während
der Embryogenese erbracht wurde, erfolgten zuvor beschriebene
Morpholino-Knockout-Experimente. Dabei zeigten sich, wie beschrieben,
deutliche muskuläre Anomalien, sodass eine eingehende Untersuchung und
Analyse einzelner beteiligter Strukturen angezeigt war. Mittels in-situ-
Hybridisierung wurde anschließend anhand spezifischer Marker die
Myogenese der Skelettmuskulatur verfolgt, analysiert und mit nicht injizierten
Embryonen sowie mit Kontrollsubstanz injizierten Embryonen vergleichen.
4.3.1 In-situ-Hybridisierung mit pax3a-Marker
Der Transkriptionsfaktor pax3a zählt zu den wichtigsten Markerproteinen der
frühen Myogenese, da nahezu alle myogenen Vorläuferzellen vor Eintritt in
die myogene Differenzierung pax3a exprimieren. Darüber hinaus ist pax3a
wesentlich an der Induktion der Myogenese beteiligt (s. Kapitel 1.3.1).
Zur Analyse des Expressionsmusters wurden 12 hpf Zebrafischembryonen
mittels in-situ-Hybridisierung untersucht. Es zeigte sich eine deutliche, jedoch
unspezifische, wolkenförmige Anfärbung im Bereich des
49
Zentralnervensystems und der sich zuerst abgrenzenden Somiten im
proximalen Rumpf (s. Abb. 7a). Der Mangel an pax3a- Nachweisbarkeit
ergibt sich aus der in diesem embryonalen Stadium erst folgenden Anlage
von Somiten. Nach Somitenreifung, etwa 26 hpf, wiesen die Embryonen
neben einer ausgeprägten Genexpression der Hirnanlagen lediglich eine
minimale pax3a-Expression im Bereich der Myotome auf (s. Abb. 7B). Eine
kontinuierliche Verminderung der pax3a-Genexpression während der
Myogenese, wie von Yusuf und Kollegen beschrieben, ist daher in dieser
Versuchsreihe bestätigend anzunehmen (Yusuf and Brand-Saberi, 2006).
Die Untersuchung erfolgte in jeder Gruppe mit mehr als 60 Embryonen.
Analysen von Morphanten, sowie von Kontrollsubstanzinjektionen ergaben
dabei jedoch keine eindeutigen Unterschiede, die eine Abgrenzung zu den
nicht injizierten Embryonen zuließen, da sich in den sehr frühen Stadien (12
hpf) die beschriebene wolkenförmige Anfärbung in den meisten untersuchten
Embryonen gleichermaßen zeigte. Aufgrund der in späteren Stadien nach
Eintritt in die Myogenese nahezu fehlenden pax3a- Expression ist eine
Aussage über 26 hpf-Stadien bezogen auf das pax3a-Expressionsmuster
nicht möglich. Morphologische Unterschiede zwischen den Morphanten und
beiden Kontrollgruppen sind im 12 hpf-Stadium aufgrund der noch
unzureichenden Abgrenzung der einzelnen Körperstrukturen nur schwer
erkennbar, im 26 hpf-Stadium jedoch zeigen sich die typischen, bereits
beschriebenen Veränderungen der Körperform bei den Morphanten, auf die
in den folgenden Versuchen näher eingegangen wird.
50
Abbildung 7. Pax3a-in-situ-Hybridisierung.
A) Nicht injizierter Zebrafischembryo, 12 hpf. Eine wolkenförmige Anfärbung wird im
distalen Kopfbereich (der blaue Pfeil markiert die Kopfanlage) deutlich und erstreckt
sich bis in den proximalen Rumpf (roter Pfeil), einzelne Strukturen sind noch nicht
voneinander abgrenzbar.
B) Nicht injizierter Zebrafischembryo, 26 hpf. Einzelne Strukturen sind abgrenzbar.
Deutliche Anfärbung der encephalen Anlagen (roter Pfeil), die Somiten sind nur sehr
schwach angefärbt (blauer Pfeil), da die pax3a-Expression im Rahmen der
Myogenese deutlich abnimmt.
4.3.2 In-situ-Hybridisierung mit myod-Marker
Der bHLH Transkriptionsfaktor myod zählt als einer der muskulären
Regulationsfaktoren zu einem wichtigen Marker der Myogenese, da er unter
anderem wesentlich an der Differenzierung von Fibro- zu Myoblasten
beteiligt ist (Tapscott, 2005). Wie bereits beschrieben folgt das Maximum der
Expression der muskulären Regulationsfaktoren dem der pax3a
Genexpression zeitlich versetzt, sodass myod Marker genutzt werden
können, wenn eine pax3a Expression bereits nicht mehr nachweisbar ist.
Myod wird in dieser Versuchsreihe als Markergen genutzt, um die
Myogenese der Zebrafischembryonen insbesondere in 24 hpf Stadien zu
51
untersuchen. Darüber hinaus wird deutlich, dass eine myod Genexpression
spätestens 48 hpf nicht mehr nachweisbar ist.
An den drei Testgruppen (nicht injiziert, Morpholinoinjektion &
Kontrollinjektion, jeweils in 24 hpf-Stadien) wurden die myod-in-situ-
Hybridisierungen durchgeführt.
Es zeigten sich deutliche Anfärbungen der Somiten/ Myotome entlang des
Rumpfes. Morphologisch ließen sich dabei die nicht injizierten Embryonen
von den mit Kontrollsubstanz injizierten Embryonen nicht unterscheiden. In
beiden Gruppen weist der Körper einen gestreckten Rumpf bis in den
Schwanzbereich ohne starke Krümmung auf, die Somiten sind bis in die
distalen Schwanzbereiche klar differenziert und deutlich durch Septierungen
voneinander abgrenzbar. Auffällig ist die bereits beschriebene chevron-artige
Ausprägung der Somiten mit Aufteilung in einzelne Muskelmassen (s. Abb.
8A/B). Eindeutig davon abgrenzbar ist die Morphologie der Morphanten. In
der Übersicht fällt die deutliche Anomalie des Schwanzes auf, da eine
extreme Bildung von Krümmungen stattfindet. Es besteht ebenfalls eine
deutliche Anfärbung myogener Zellen, die Anfärbung ist jedoch ungeordnet.
Einzelne Strukturen lassen sich nicht voneinander abgrenzen, Septierungen
innerhalb der Somiten in Form eines horizontalen Myoseptums zeigen sich
nicht, sodass eine Abgrenzung epaxialer und hypaxialer Muskelmassen nicht
möglich erscheint. Ein Nachweis der typischen v-Form der Somiten (Devoto
et al., 1996; van Eeden et al., 1996) ist demnach nicht möglich, sodass sich
ein undifferenziertes, wolkenartiges Zellmuster ergibt. Zudem ist (im
Vergleich zu Abb. 8A/B) eine undifferenzierte Anfärbung von Zellen
bandförmig im Verlauf des physiologisch nachweisbaren Septums
nachweisbar (s. Abb. 8C/D).
52
Abbildung 8. Myod-in-situ-Hybridisierung.
A) Nicht injizierter Zebrafischembryo, 24 hpf. Elongierter Körperbau, chevron-
artige Anordnung kompartimentierter Somiten. Klare Struktur durch Septierungen
zwischen einzelnen Somiten und horizontale Septierung (gelber Pfeil)
B) Kontrollsubstanz injizierter Embryo, 24 hpf. Keine morphologischen
Unterschiede im Vergleich zu nicht injizierten Embryonen feststellbar.
C&D) Morphant, 24 hpf. Wolkenförmige, undifferenzierte Anordnung myogener
Zellen, keine voneinander abgrenzbaren Somiten trotz bilateraler Anlage.
Keine Septierung. Bandförmige Färbung des „Somiten“-randes (Pfeil).
Ausgeprägte Veränderung der distalen Rumpfform mit Knickbildung.
53
Die statistische Auswertung belegt die beschriebenen signifikanten
Veränderungen, ausgelöst durch den atoh8-Knockdown. Andere Faktoren,
wie die Erzeugung von Anomalien durch embryonale Verletzungen infolge
der Mikroinjektion gelten daher als Einflussfaktoren geringerer Ordnung.
Während lediglich 1,7% der nicht injizierten Embryonen und 11,2% der
Kontrollsubstanz injizierten Embryonen anatomisch veränderte
Somitenstrukturen aufwiesen, zeigte sich bei den Morphanten mit 64,8% der
Fälle eine hoch signifikante Häufigkeit deutlicher anatomischer Anomalien
(vgl. Abb. 9). Aus den signifikanten Unterschieden zwischen den nicht
injizierten bzw. Kontrollsubstanz injizierten Embryonen und den Morphanten
(jeweils p<0,001) ergibt sich eine hoch signifikante Abhängigkeit zwischen
der Morpholinoinjektion und dem Auftreten anatomischer Anomalien des
Skelettmuskelsystems (Chi-Quadrat-Test, p<0,001).
Abbildung 9. Statistische Auswertung der myod-in-situ-Hybridisierung.
Das Diagramm veranschaulicht die Auswertung der myod-in-situ-Hybridisierung mit
prozentualen Angaben auf der y-Achse und je einem Triplet, bestehend aus der Menge nicht
injizierter, Kontrollsubstanz injizierter und Morphanten, für anatomisch „normal“ geformte
und anatomisch veränderte Somiten auf der x-Achse. Die Auswertung erfolgte nach den
Maßgaben von Kimmel et al. Absolut ausgewertete Embryonenzahlen finden sich
rechtsständig im Kästchen. Nach Chi-Quadrat-Berechnungen zeigten sich signifikante
Unterschiede zwischen der Morpholinoinjektion und beiden Kontrollgruppen mit p<0,001.
54
Dabei liegt die Chance anatomische Veränderungen aufzuweisen, bei der
Morpholinoinjektion mehr als 104fach höher als bei den nicht injizierten
Embryonen (OR=104,7 mit 95%-KI [37,0; 295,9]) und mehr als 14fach höher
als bei den Kontrollsubstanz injizierten Embryonen (OR=14,6 mit 95%-KI
[8,7; 24,3]). Der geringe Einfluss der Manipulation am Embryo durch den
Injektionsvorgang selbst zeigt sich an der leichten Anhebung der Zahlen in
der Testgruppe der Kontrollsubstanz injizierten Embryonen (11,25%).
4.3.3 Kein myod-Nachweis im 48 hpf-Stadium
Embryonen im 26+ Somiten-Stadium (24 hpf) wiesen in allen drei
Testgruppen eine deutliche myod-Genexpression auf (s. Kap. 4.3.2). In
diesem Abschnitt der Embryonalentwicklung zählt die Myogenese zu den
wesentlichen Entwicklungsschritten. 48 hpf jedoch ist die embryonale
Differenzierung der Skelettmuskulatur weitgehend vervollständigt, sodass nur
Spuren exprimierter Gene, die während der Myogenese ihre größte
Funktionalität besitzen, nachweisbar sind.
Abbildung 10. Myod/vmhc-in-situ-Hybridisierung, 48 hpf. Nicht injizierter Zebrafischembryo, 48 hpf. Physiologische Skelettstruktur (vgl. Kap. 4.3.2),
jedoch keine Markerfärbung der Somiten (schwarzer Pfeil). Zusätzlich Anfärbung der
Herzstruktur, dem Dottersack aufliegend, durch vmhc Marker.
55
Dies erklärt die fehlende Färbung einzelner Skelettmuskelanteile in der
myod-in-situ-Hybridisierung (s. Abb. 10), da zu dem Zeitpunkt zwar der
bislang produzierte Transkriptionsfaktor myod anwesend sein wird, jedoch
keine weitere myod-mRNA Expression stattfindet und somit keine
anfärbbaren Hybride gebildet werden können.
4.3.4 Atoh8 beeinflusst die Skelettmuskelentwicklung, jedoch n icht die
myod-Genexpression
Analog zu Kapitel 4.3.2 konnte statistisch belegt werden, dass die
Expression des atoh8-Gens die Entwicklung und Strukturierung der
Somitenstrukturen und damit die Myogenese beeinflusst. Im Gegensatz zu
bisherigen Studien konnte jedoch erstmalig gezeigt werden, dass dabei die
Expression von myod selbst nicht beeinflusst wird (vgl. Abb. 8). Durch die
ausgeprägten Anomalien der Skelettmuskelreifung und –differenzierung lässt
sich zwar ein prägnanter Strukturdefekt nachweisen, jedoch findet eine
deutliche Anfärbung exprimierter myod-mRNA in der in-situ-Hybridisierung
statt, welche eine spezifische Genexpression belegt. Mit Verweis auf Kapitel
1.3.2 wurde bereits bewiesen, dass die Präsenz von myod zur Induktion
funktionsfähiger Skelettmuskelzellen genügt (Rudnicki et al., 1993). Da eine
myod-Expression vorhanden ist, müssen zumindest funktionsfähige
muskuläre Progenitorzellen angelegt sein, die eine myogene Differenzierung
zulassen. Folglich kann durch einen atoh8-Knockdown nicht direkt auf eine
mangelhafte Determinierung von Myozyten geschlossen werden. Vielmehr
muss eine Abhängigkeit der Anlage und Wanderung bestimmter
Zellpopulationen innerhalb der Somitenanlage während der Myogenese von
der atoh8-Expressivität bestehen, sodass bei Knockdown eine Ausprägung
derartiger patterning Defekte stattfinden kann.
4.3.5 Atoh8 beeinflusst adaxiale Zellpopulationen
Durch myod-in-situ-Hybridisierungen konnten die Strukturveränderungen und
Differenzierungsstörungen während der Skelettmuskelentwicklung
nachgewiesen werden. Bei genauer Analyse kann in einer Vielzahl der
Morphanten jedoch eine längst angeordnete, bandförmige Zellverdichtung im
Bereich der Somiten anstelle der Somiten unterteilenden Myosepten bei
56
beiden Kontrollgruppen nachgewiesen werden (vgl. Abb. 8C). So entsteht
der Verdacht, dass atoh8 Zellpopulationen beeinflusst, die an der
strukturellen Septenbildung beteiligt sein müssen. Zur genaueren Analyse
der Strukturen wurden daher zunächst Dünnschnittpräparate von Embryonen
ohne vorherige in-situ-Hybridisierung angefertigt (s. Abb. 11). Im Vergleich zu
den mit Kontrollsubstanz injizierten Embryonen weisen Morphanten eine sehr
undifferenzierte Anordnung von myogenen Zellen auf (vgl. Abb. 11A/B).
Veränderungen der Chorda dorsalis und des Verlaufes des Neuralrohres
sind beobachtbar, adaxial liegende Zellen der Somiten lassen sich nicht klar
abgrenzen und Aufteilungen einzelner Myotome sind wegen mangelhafter
horizontaler Septenbildung nicht möglich, sodass das Bild plump wirkender,
unkoordiniert angeordneter Zellhaufen der whole mount Analysen bestätigt
wird.
Abbildung 11. Dünnschnittpräparate.
A) Horizontaler Semidünnschnitt des Rumpfes am Übergang in den Schwanzbereich,
Kontrollsubstanz injizierter Embryo, 24 hpf, 20x Vergrößerung. Verschiedene
Myotome sind durch Septen arrangiert (schwarze Pfeile), adaxial gelegene Zellen
(grüne Pfeile) entlang der Chorda dorsalis (blauer Pfeil) sind differenzierbar. Der
Dottersack wurde zur Orientierung angeschnitten (gelber Pfeil).
B) Horizontaler Semidünnschnitt des Rumpfes am Übergang in den Schwanzbereich,
Morphant, 24 hpf, 20x Vergrößerung. Ungeordnetes Bild muskulärer Zellen (rote
Pfeile), die Chorda dorsalis sowie adaxiale Zellpopulationen sind nicht abgrenzbar
(blauer Pfeil), eine Septenbildung fehlt, sodass keine Myotomeinteilung beobachtbar
ist.
57
Aufgrund der Beobachtungen in den adaxialen Bereichen der Morphanten
kann eine Beeinflussung der während der Embryogenese exakt dort
lokalisierten Zellpopulationen angenommen werden. Betrachtet man analog
zu Kapitel 1.1.4 die Funktionalität der in den adaxialen Bereichen
lokalisierten Pionierzellen, erhärtet sich der Verdacht, dass atoh8 Einfluss auf
die Differenzierung dieser Zellgruppe hat, da einige mit den Pionierzellen
verknüpften embryonalen Entwicklungen durch einen Knockdown von atoh8
nicht zu erfolgen scheinen. Es entsteht weder eine typisch differenzierbare
Somitenform, noch sind horizontale Myosepten nachweislich beobachtbar.
Beide Veränderungen deuten auf eine fehlende Zellmigration und
Differenzierung der Pionierzellen während der Embryogenese hin. Die
ausbleibende Differenzierung und defekte Migration dieser Zellen könnte die
in Abbildung 8C/D nachweisbare bandförmige Dichtezunahme der myod
exprimierenden Zellen anstelle eines sich differenzierenden Myoseptums
erklären. Vergleichende Analysen von Schnittbildpräparaten nach myod-in-
situ-Hybridisierung verdeutlichen die Ergebnisse (s. Abb. 12).
Abbildung 12. Dünnschnittpräparate nach myod-in-situ-Hybridisierung.
A) horizontales Semidünnschnittpräparat nach myod-in-situ-Hybridisierung, nicht
injizierter Embryo, 24 hpf, aufgenommen von M. Breuer. Myod erscheint rötlich
58
angefärbt. Gut abgrenzbares Neuralrohr (schwarzer Pfeil) und Chorda dorsalis
(grüner Pfeil). Definiertes horizontales Myoseptum (rote Pfeile), verschiedene
Muskelmassen (blauer Pfeil) erscheinen voneinander getrennt als epaxiale und
hypaxiale Massen. Zarte Zellreihe adaxial liegend (roter, in Richtung Chorda
weisender Pfeil & Stern).
B) horizontales Semidünnschnittpräparat nach myod-in-situ-Hybridisierung, Morphant,
24 hpf, aufgenommen von M. Breuer. Myod erscheint rötlich angefärbt. Anomalien
der zentralen Strukturen (schwarzer & grüner Pfeil). Muskelmassen (blauer Pfeil)
lassen sich wegen fehlender Myosepten (roter Pfeil) nicht voneinander abgrenzen.
Ein horizontales Myoseptum ist nicht definiert, anstelle feiner adaxialer Zellreihen
finden sich bereits adaxial liegend undifferenzierte Zellanhäufungen myogenen
Ursprungs (Stern).
Insbesondere die fehlende Ausprägung des horizontalen Myoseptums ist hier
deutlich zu beobachten. Während bei den nicht injizierten Embryonen ein
schmaler Saum von Zellen, die die Chorda dorsalis umgeben, zu vermuten
ist, von denen das horizontale Myoseptum zu entspringen scheint, ist eine
Differenzierung bei den Morphanten nicht möglich, da die zentralen
Strukturen hier direkt von muskulären Zellansammlungen, die nicht eindeutig
in Septen gegliedert werden, umgeben sind (vgl. Abb. 12B).
Abbildung 13. Schematischer distaler Schnitt eines Zebrafisches. Entworfen anhand der Vorgaben von Du et al. 1997.
Analog zu Kapitel 1.1.4 besteht eine Einteilung der verschiedenen Zellpopulationen, adaxial
gelegene Pionierzellen bilden das horizontale Myoseptum, die tief liegenden Muskelmassen
59
sind zu großen Anteilen schnelle Muskelfasern, eine dünne Schicht langsamer Muskelfasern
liegt den tiefen Schichten nach lateral auf, dabei bilden vermutlich myogene Vorläuferzellen
eine Schicht von „external cells“, die sich im Verlauf in anderen Geweben zu Muskelzellen
differenzieren können.
Anhand der Skizze eines physiologisch entwickelten Rumpfabschnittes des
Zebrabärblings können die Ergebnisse der Abbildungen vergleichen
werden (s. Abb. 13). Nicht injizierte Embryonen (vgl. Abb. 12A) weisen eine
der Skizze sehr ähnliche Struktur auf, wohingegen die Struktur des in
Abbildung 12B gezeigten Schnittes eines Morphanten deutlich von dieser
Veranschaulichung abweicht.
4.4 Beeinflussung der kardialen Embryogenese
Durch atoh8-in-situ-Hybridisierungen wurde neben der Aktivität in der
Entwicklung der Skelettmuskeln ebenfalls nachgewiesen, dass während der
Embryonalentwicklung des Zebrafisches eine Genexpression von atoh8 in
der Herzanlage stattfindet. Daher sollte neben dem Einfluss des Gens auf die
Skelettmuskulatur auch die Entwicklung des Herzmuskels nach atoh8-
Knockdown-Experimenten analysiert werden. Zur spezifischen Analyse
wurden die in Kapitel 1.3.3 und 1.3.4 beschriebenen Marker vmhc und ncx-1
in in-situ-Hybridisierungen genutzt.
4.4.1 Darstellung der kardialen Strukturen mittels vmhc-Marker
Zuvor jedoch wurden Experimente zur Bestimmung des Zeitpunktes der
Herzanlage und des Zeitpunktes des Fusionsvorganges beider tubulären
Systeme (vgl. Kapitel 1.1.5) durchgeführt, die zudem auch die Funktionalität
der in den in-situ-Hybridisierungen eingesetzten vmhc-Sonde nachwiesen.
Nicht injizierte Embryonen in verschiedenen Entwicklungsstadien (8 hpf, 10
hpf, 12 hpf, 14 hpf, 16 hpf, 24 hpf, 30 hpf, 48 hpf) wurden fixiert und einer
vmhc-in-situ-Hybridisierung zugeführt. Nach Stainier et al. wurde bereits
nachgewiesen, dass die Fusion im 26+ Somiten-Stadium (24 hpf)
abgeschlossen ist (Stainier et al., 1993). Durch diese Versuchsreihe soll
deshalb eine spezifische Anfärbung von Herzmuskelzellen ab einem
bestimmten Zeitpunkt während der Embryonalentwicklung zur Darstellung
60
kommen, um in späteren Knockdown-Versuchen eine Nutzung von
Vergleichswerten im Falle von verzögerten Entwicklungsprozessen oder
nicht gefärbten Herzanlagen zu ermöglichen.
In keinem der untersuchten Embryonen <12 hpf wurde in den in-situ-
Hybridisierungen eine spezifische Färbung nachgewiesen (s. Abb. 14A).
Abbildung 14. Vmhc-in-situ-Hybridisierung verschiedener Stadien. A) Nicht injizierter Embryo, etwa 10 hpf, vmhc-in-situ-Hybridisierung. Es ist keine
spezifische Färbung einer Herzanlage sichtbar.
B) Nicht injizierter Embryo, etwa 14 hpf, vmhc-in-situ-Hybridisierung. Eine schwache
Anfärbung beider tubulärer, kardialer Systeme ist im oberen Rumpfbereich, dem
Dottersack aufliegend, nachweisbar (schwarze Pfeile).
C) Nicht injizierter Embryo, etwa 16 hpf, vmhc-in-situ-Hybridisierung. Die beiden
nachweisbaren tubulären Systeme weisen eine deutlichere Anfärbung auf und
nähern sich im Rahmen der kardialen Fusion an (schwarze Pfeile).
61
D) Nicht injizierter Embryo, etwa 18 hpf, vmhc-in-situ-Hybridisierung. Deutliche
Annäherung beider tubulären Strukturen nach medial. Die kaudalen Enden scheinen
zuerst zu fusionieren (schwarze Pfeile).
Die Anlage der kardialen Vorläuferzellen ist dabei bereits vorhanden, jedoch
liegen zu dem Zeitpunkt noch keine funktionsfähigen Myokardiozyten, in
denen eine Genexpression von vmhc induziert wird, vor. Erste Kontraktionen
im Rahmen vollständig funktionsfähiger Myokardiozyten liegen erst in
späteren Stadien vor (Nguyen et al., 2008). Erst ab etwa 14 hpf war eine
schwache Anfärbung beider Anlagen der tubulären Systeme (s. Abb. 14B),
die sich während der weiteren Entwicklung im Rahmen der kardialen Fusion
aufeinander zu bewegen (s. Abb. 14C), beobachtbar, bis sich schließlich
nach abgeschlossener Fusion ein länglich bis ovales, gekammertes Herz
nach etwa 24 hpf darstellt (vgl. Abb. 15).
Abbildung 15. Vmhc-in-situ-Hybridisierung späterer Stadien. A) Nicht injizierter Embryo, 24 hpf, vmhc-in-situ-Hybridisierung. Eine tubuläre
Anfärbung des Ventrikelsystems ist beobachtbar (schwarzer Pfeil), das Atrium an
der kaudalen Grenze ist nicht gefärbt, ein Septum lässt sich nicht abgrenzen.
B) Nicht injizierter Embryo, 48 hpf, vmhc-in-situ-Hybridisierung. Deutlicher Fortschritt in
der Gesamtentwicklung mit beginnender Hautpigmentierung. Das Herz hat die
tubuläre Form verlassen und wirkt bulbär aufliegend, jedoch sind einzelne
Herzstrukturen nicht eindeutig voneinander abgrenzbar.
62
Die fusionierte Herzanlage wirkt länglich mit kraniokaudaler Ausrichtung. Im
Verlauf entsteht durch atrioventrikuläre Kissenbildung ein aus Kammer und
Vorhof bestehendes Herz (Eisenberg and Markwald, 1995), jedoch ist das
trennende Septum in dieser Versuchsreihe nur schwer erkennbar, da keine
spezifischen Marker zur Färbung dieser Strukturen genutzt wurden. Nach
abgeschlossener Reifung des Organs, 48 hpf, ist eine leichte Rotation
erfolgt, welche bereits 30 hpf nachweisbar ist (s. Abb. 16), sodass der
Ventrikel mit Ausflusstrakt rechtsseitig kranial, das Atrium leicht linksseitig
kaudal orientiert ist (Stainier et al., 1993). Die tubuläre Ausbildung verändert
sich dabei zunehmend und es entstehen bulbäre, Hohlorganen ähnelnde
Strukturen, um eine effiziente Pumpfunktion bestimmter Blutvolumina im
kardiovaskulären System gewährleisten zu können.
Abbildung 16. Vmhc-in-situ-Hybridisierung nach 30 hpf.
Nicht injizierter Embryo, 30 hpf, vmhc-in-situ-Hybridisierung in leicht sagittaler Ausrichtung.
Rotation der fusionierten Herzanlage, tubuläre Form wandelt sich zunehmend in bulbäre
Form eines voluminösen Organs.
4.4.2 Funktion der Doppel -in-situ-Hybridisierung
Da die zur Beobachtung und Analyse der Herzentwicklung genutzten Marker
vmhc und ncx-1 herzspezifische Gene darstellen, würden in der in-situ-
Hybridisierung ausschließlich die kleinen Herzstrukturen gefärbt (vgl. Abb.
14). Daher wurden während eines Hybridisierungsvorganges zwei Marker
simultan genutzt, um neben der spezifischen Herzfärbung auch eine
Anfärbung der sich entwickelnden Skelettmuskulatur zu erhalten (vgl. Abb.
17). Durch diese Doppelfärbung können beispielsweise eine gelungene
Mikroinjektion nachgewiesen und Fehlerquellen ausgeschlossen werden:
63
Eine einfach analysierbare Situation würde sich demnach einstellen, wenn
nach Mikroinjektion die Färbung im Herzen nachweisbar wäre und sich
ausschließlich beobachtbare Anomalien einstellen würden. Es wäre
allerdings nicht sicher möglich, von einer gelungenen Mikroinjektion und
einem alleinigen Effekt des atoh8-Knockdowns auszugehen, wenn die
erwartete Herzfärbung ausbliebe und kein Marker wie myod zur Färbung
anderer Strukturen wie in diesem Fall der Skelettmuskulatur eingesetzt
würde. Folglich entstünden verschiedene Interpretationsmöglichkeiten der
Ergebnisse und ein Rückschluss der Knockdown-Experimente auf
Entwicklungsstörungen wäre nur schwer möglich. Es bestünde Unklarheit,
ob eine fehlende Färbung auf eine nicht geglückte Mikroinjektion
zurückzuführen sei, Funktionseinschränkungen der genutzten Sonde
bestünden oder eine fehlende Genexpression eine Hybridisierung tatsächlich
ausschließe. Im Gegensatz zu Anomalien der Skelettmuskulatur, die bereits
mit morphologisch sichtbaren Körperveränderungen einher gehen, können
embryonale Schäden in der Herzmuskelentwicklung, die meist nicht mit
Veränderungen der Körpergestalt einhergehen, nur anhand von Markern
sichtbar gemacht werden. Ohne spezifische Marker ist die Beurteilung des
Herzens in-situ aufgrund der Lage des Organs nicht möglich. Somit würde
die alleinige Nutzung einer herzspezifischen Sonde auch nur bei deren
Nachweisbarkeit eine Analyse der Struktur zulassen, wohingegegen die
grobe Beurteilung der Skelettmuskulatur und Veränderungen der Muskulatur
aufgrund der bereits makroskopisch sichtbaren Anomalien auch ohne
spezifische Marker möglich wäre. Durch den simultanen Einsatz von
Skelettmuskelsonden wie myod, von denen nach oben beschriebenen
Ergebnissen eine Expression und daher Nachweisbarkeit in bestimmten
Stadien bekannt ist, können die genannten Interpretationsmöglichkeiten nach
in-situ-Hybridisierung demnach deutlich eingeschränkt werden.
Weiterhin können durch die simultane Anfärbung Rückschlüsse auf
Zusammenhänge gezogen werden, denn nach den zuvor beschriebenen
Ergebnissen ist es bei der Beobachtung krankhaft geformter Herzstrukturen
nach Morpholinoinjektion unwahrscheinlich, eine physiologische
Skelettmuskulatur nachweisen zu können. Bei diesen seltenen Fällen, in
denen Anomalien kardialer Strukturen nachweisbar sind, sich jedoch keine
64
Skelettmuskelveränderungen zeigen, sollten ebenfalls mögliche
Fehlerquellen als Ursache der Resultate in Betracht gezogen werden.
4.4.3 Atoh8 beeinflusst die Herzentwicklung - Beobachtungen
In dieser Versuchsreihe wurden nach Ansatz der drei Testgruppen und
erfolgter Mikroinjektion der Morpholino-Substanzen zuerst Beobachtungen
an den lebenden Embryonen angestellt, bevor in-situ-Experimente
durchgeführt wurden, um erste Hinweise auf Veränderungen der Herzanlage
zu erhalten. Darüber hinaus könnten durch die Art der
Funktionsveränderungen bei atoh8-Knockdown erste Eingrenzungen
bezüglich betroffener Entwicklungsschritte und Signalwege erwogen werden.
Neben der bereits beschriebenen morphologischen Skelettveränderungen
und den damit einhergehenden Bewegungseinschränkungen wiesen die
Morphanten Anomalien in der Kontraktilität und Frequenz der Herzaktionen
auf. Zunächst erfolgte dabei die Beobachtung von Embryonen in 30 hpf-
Stadien. Hier zeigte sich sowohl bei den nicht injizierten als auch bei den
Kontrollsubstanz injizierten Embryonen ein schneller Rhythmus bei deutlicher
Kontraktilität, analog zu den von Nguyen beschriebenen Frequenzen um
etwa 140 Schläge/ Minute in diesem Stadium (Nguyen et al., 2008). Die
Herzaktion ähnelt dabei einer peristaltischen Welle. Morphanten dagegen
wiesen keine koordinierten Herzschläge bei nur mäßiger Kontraktilität auf,
sodass ein Bild leichter Muskelzuckungen entstand. Der Grundrhythmus
erschien deutlich verlangsamt.
Bei Betrachtung der Embryonen im 48 hpf-Stadium schien sich der gesamte
Ventrikel nach vorausgehender Vorhofkontraktion einheitlich zu kontrahieren,
das Bild der peristaltischen Kontraktionswelle verschwand, auch bedingt
durch die Veränderung der nicht mehr tubulär wirkenden Herzform. Die nur
geringen Überlebenszahlen in der Gruppe der Morphanten lassen dabei
jedoch keine eindeutigen Aussagen über Veränderungen der
Herzentwicklung und Differenzierungen zu beiden Kontrollgruppen zu, da
davon auszugehen ist, dass nur die Embryonen bis zu diesem Stadium
überlebt haben, bei denen die Morpholinoinjektion aufgrund verschiedener
Ursachen nicht geglückt ist oder nur unvollständig zur Wirkung gekommen ist
(vgl. Kapitel 4.2.1). Arrhythmien, die unter dem Einfluss eines atoh8-
65
Knockdowns mit dem Abschluss der kardialen Entwicklung entstünden, sind
daher aufgrund der nur geringen Zahl überlebender Embryonen in den für
diese Beobachtungen interessanten Entwicklungsstadien nur sehr schwer
nachweisbar.
4.4.4 Atoh8 beeinflusst die Herzentwicklung - Analyse der vmhc-in-
situ-Hybridisierung
Das Strukturprotein vmhc stellt einen wesentlichen Teil des kardial
spezifischen Myosins dar, welches für den Vorgang der Muskelkontraktion
unerlässlich ist (Alberts et al., 2002). Aufgrund der Spezifität seiner
Expression ausschließlich in ventrikulären Myokardiozyten können
spezifische vmhc- Sonden zur Markierung der frühen kardialen
Ventrikelentwicklung eingesetzt werden.
Es wurden in-situ-Hybridisierungen im Stadium 24 hpf- und im 48 hpf-
Stadium an allen drei Testgruppen durchgeführt. Zudem wurden, wie in
Kapitel 4.4.2 beschrieben, Doppelhybridisierungen mit vmhc und myod
durchgeführt.
In der mikroskopischen Analyse der Embryonen im Stadium 24 hpf war bei
der Gruppe der nicht injizierten sowie der Kontrollsubstanz injizierten
Embryonen eine tubuläre kardiale Struktur, wie zuvor beschrieben,
erkennbar. Die Form erscheint länglich bis leicht oval, die Anfärbung
ventrikulärer Strukturen scheint physiologisch entwickelt (s. Abb. 17A/B). Je
nach Ausrichtung des Embryos kann der spätere Ausflusstrakt des Bulbus
arteriosus beobachtet werden (s. Abb. 17B). Dabei hat die kardiale Fusion in
dem untersuchten Stadium bereits stattgefunden. Da nur eine Färbung
ventrikulärer Strukturen, nicht jedoch atrialer Strukturen nachweisbar ist,
erscheint die längliche Ausprägung des tubulären Systems nicht so deutlich
wie in durchgeführten ncx-1 Experimenten.
Die Analyse der Morphanten im gleichen Stadium ergab jedoch erstaunliche
Ergebnisse, da eine Vielzahl der beobachteten Embryonen keine ventrikuläre
Anfärbung durch den vmhc Marker zeigte. Nach den Ausführungen in Kapitel
4.4.1 jedoch müsste in diesem Stadium seit einigen Stunden definitiv eine
kardiale Färbung nachweisbar sein, sodass leichte Entwicklungsrückstände
durch die Manipulation während der Mikroinjektion dieses Ergebnis nicht
66
erklären könnten. Da hier die kardiale Anfärbung ausblieb, ließen sich
keinerlei sichtbare Herzstrukturen analysieren (s. Abb. 17C/D).
Abbildung 17. Vmhc/myod-in-situ-Hybridisierung 24 hpf.
A) Nicht injizierter Embryo, 24 hpf, vmhc/myod-in-situ-Hybridisierung. Ventrikuläre
Strukturen sind deutlich als oval-tubuläre Strukturen im proximalen Rumpf gefärbt
67
(schwarzer Pfeil), die vollständige Ausbreitung der Herzanlage ist aufgrund der
fehlenden Anfärbung des Atriums nicht sichtbar. Myod weist dabei eine
physiologische Skelettform mit differenzierter Somitenbildung nach (roter Pfeil).
B) Kontrollsubstanz injizierter Embryo, 24 hpf, vmhc/myod-in-situ-Hybridisierung. Keine
signifikanten morphologischen Veränderungen zu A). Im kranialen Abschnitt der
angefärbten ventrikulären Struktur wird vermutlich der spätere Ausflusstrakt, der
Bulbus arteriosus, als sichelförmige Aussparung deutlich.
C) Morphant, 24 hpf, vmhc/myod-in-situ-Hybridisierung, leicht sagittal rotiert. Es ist
keine Anfärbung durch die vmhc Sonde sichtbar, Herzstrukturen können somit nicht
analysiert werden. Die morphologisch veränderte Skelettform bei deutlichem myod
Signal weist die erfolgreiche Injektion und auch Hybridisierung nach (roter Pfeil).
D) Morphant, 24 hpf, vmhc/myod-in-situ-Hybridisierung in lateraler Sicht zum
Ausschluss von Verdeckungsphänomenen. Keine Veränderungen zu C) deutlich.
In einigen Embryonen der Morpholino-Gruppe war eine nur sehr geringe
Färbung im Rahmen einer deutlich verminderten vmhc-Genexpression
nachweisbar. Bei diesen Embryonen wiesen die Herzstrukturen
erwartungsgemäß hochgradige Anomalien auf. Die ventrikuläre Anfärbung
erschien rundlich, eine physiologische, tubuläre Form konnte nicht
beobachtet werden. Zudem ist die Fusion der paarig angelegten Strukturen
meist nicht erfolgt (vgl. Kapitel 4.4.6).
Wegen der signifikanten Anzahl ausbleibender Anfärbungen der
ventrikulären Strukturen in ersten Hybridisierungslinien wurden bereits
erwähnte Doppelhybridisierungen eingesetzt, welche die bisherigen
Ergebnisse bezüglich der kardialen Anfärbung bestätigten (s. Abb. 17).
Während die Färbung der ventrikulären Herzanlagen bei beiden
Kontrollgruppen deutlich ausgeprägt war, zeigte sich in der Gruppe der
Morphanten nur selten eine schwache Anfärbung stark veränderter, kardialer
Strukturen bei den sonst typischen, in Kapitel 4.3 beschriebenen
Skelettmuskelveränderungen, welche durch den zusätzlich eingesetzten
myod Marker hier ebenfalls zur Darstellung kamen (s. Abb. 17D).
Obwohl nach den Erkenntnissen aus Kapitel 4.4.3 keine signifikanten
Ergebnisse in embryonalen Stadien etwa 48 hpf zu erwarten sind, wurden
dennoch vmhc/myod-in-situ-Hybridisierungen an Embryonen dieser Stadien
durchgeführt. In beiden Kontrollgruppen zeigt sich eine deutliche ventrikuläre
Anfärbung mit Nachweis einer weitgehend bulbär geformten Herzhöhle (s.
68
Abb. 18 und vgl. Abb. 16). Wie erwartet findet aufgrund der fehlenden
Genexpression in diesem Stadium keine spezifische Anfärbung durch den
myod Marker mehr statt. Die überlebenden Morphanten dieses Stadiums
weisen nur geringgradige Deformitäten und leichte muskuläre
Veränderungen auf (vgl. Abb. 21G-I). Die Herzanlage ist strukturiert
angefärbt und nicht von beiden ausgewerteten Kontrollgruppen zu
unterscheiden.
Abbildung 18. Vmhc/myod-in-situ-Hybridisierung 48 hpf.
Nicht injizierter Embryo, 48 hpf, vmhc/myod-in-situ-Hybridisierung. Die Herzstruktur zeigt
sich als voluminöses Organ (roter Pfeil), dem früheren Dottersack aufliegend. Die
Ausprägung der physiologisch differenzierten Myotome ist im Schwanzbereich beobachtbar,
jedoch findet keine Anfärbung durch myod statt.
Mit hoher Wahrscheinlichkeit war der Knockdown bei diesen noch
überlebenden Embryonen nicht erfolgreich. Aufgrund der sonst hohen
Letalität und den nachgewiesenen massiven anatomischen Veränderungen
nach atoh8-Knockdown ist davon auszugehen, dass ein Gendefekt im atoh8
Gen zu lebensbedrohlichen Zuständen führen kann. Die hohe Sterberate ab
einem bestimmten Zeitpunkt der embryonalen Entwicklung ließe sich
beispielsweise dadurch erklären, dass erst ab einem Alter von etwa 24 hpf,
im 26+ Somiten-Stadium, erste koordinierte Herzmuskelkontraktionen, die
zur Bildung einer effizienten Blutzirkulation führen, nachweisbar sind
(Nguyen et al., 2008), sodass die Versorgung der embryonalen Zellen in
früheren Stadien zunächst über Diffusionsprozesse ohne Blutzirkulation
69
stattfinden kann. Erst mit der Abhängigkeit des Organismus von einer
suffizienten kardiovaskulären Zirkulation werden anatomische
Herzanomalien klinisch auffällig und können zum Tode des Fisches führen.
Zur statistischen Analyse der in-situ-Hybridisierungen von Embryonen im
Stadium 24 hpf wurde die Gruppe der Embryonen mit physiologischer
Herzausprägung der ausgewerteten Gruppe mit einer kardialen Anomalie
jeglicher Art gegenüber gestellt. Dabei wurden sowohl veränderte kardiale
Strukturen als auch vollständig fehlende kardiale Färbungen zunächst als
„Veränderung der Herzstruktur“ gewertet. Während in der Testgruppe der
nicht injizierten Embryonen keine Abweichung von der physiologischen
Herzkonfiguration nachweisbar war, wiesen mehr als 93% der Morphanten
im gleichen Stadium zuvor beschriebene kardiale Veränderungen auf.
Vergleichend dazu wurde in 20% der Kontrollsubstanz injizierten Embryonen
Veränderungen der kardialen Anfärbung nachgewiesen (s. Abb. 19). Die
Ergebnisse erbringen signifikante Unterschiede zwischen der
morphologischen Ausprägung aller drei Testgruppen; folglich besteht eine
hoch signifikante Abhängigkeit zwischen der Morpholinoinjektion und dem
Auftreten von kardialen Veränderungen mit p<0,001 (Chi-Quadrat-Test).
Dabei besteht bei Morpholinoinjektion im Vergleich zur Kontrollinjektion eine
56fach höhere Chance kardiale Veränderungen aufzuweisen (OR=56,8 mit
95%-KI=[12,1; 267,0]). Die Angabe von Chancenverhältnissen kann nicht für
alle Testgruppen vergleichend erfolgen, da in der Testgruppe der nicht
injizierten Embryonen für ein Parameter kein Fall vorlag (=0).
Die Analyse der untersuchten Ergebnisse zeigt, dass die embryonale
Entwicklung kardialer Strukturen durch einen atoh8-Knockdown deutlich
beeinträchtigt wird. Da eine hohe Zahl an injizierten Embryonen keine
Färbung aufwies, wurde eine erneute Analyse der Ergebnisse mit stärkerer
Differenzierung der Anfärbung kardialer Strukturen durchgeführt (s. Kapitel
4.4.5).
70
Abbildung 19. Statistische Auswertung der vmhc-in-situ-Hybridisierung.
Das Diagramm veranschaulicht die Auswertung der vmhc-in-situ-Hybridisierung mit
prozentualen Angaben auf der y-Achse und je einem Triplet, bestehend aus der Menge nicht
injizierter, Kontrollsubstanz injizierter und Morphanten im 26+ Somiten-Stadium, für eine
nachweislich physiologische Herzkonfiguration und anatomische Veränderungen der
Herzkontur (inkl. nicht durch vmhc Sonde gefärbte kardiale Strukturen) auf der x-Achse. Die
Auswertung erfolgte nach den Maßgaben von Kimmel et al. Absolut ausgewertete
Embryonenzahlen finden sich rechtsständig im Kästchen. Nach Chi-Quadrat-Berechnungen
zeigten sich hoch signifikante Unterschiede zwischen der Morpholinoinjektion und beiden
Kontrollgruppen mit p<0,001. Eingeschränkte statistische Chancenanalyse, da eine
Testgruppe keine Fälle aufweist (absolut 0); ein faktischer Chancenvergleich zu nicht
injizierten Embryonen ist daher nicht möglich.
4.4.5 Atoh8 beeinflusst die vmhc-Genexpression
Nachdem sich infolge erster Analysen signifikante Ergebnisse bezüglich der
Herzformation nach atoh8-Knockdownexperimenten darstellten, in den in-
situ-Hybridisierungen viele der Morphanten jedoch keinen spezifischen
Nachweis einer vmhc Genexpression erbrachten und daher bislang zur
Gruppe der Embryonen mit „Veränderung der Herzkontur“ gewertet wurden,
veranschaulicht eine detaillierte Differenzierung der genannten Embryonen
den signifikanten Einfluss des atoh8-Knockdowns auf die vmhc
71
Genexpression selbst. Die zuvor als „mit Veränderung der Herzkontur“
bezeichneten Embryonen wurden in Embryonen mit angefärbter,
„veränderter Herzmorphologie“ und in Embryonen ohne Nachweis einer
kardialen Färbung unterteilt. Dabei zeigte sich bei den Morphanten in 75%
der Fälle keine Anfärbung, mehr als 18% wiesen bei schwacher Anfärbung
eine zu erwartende veränderte Herzmorphologie auf. Während die nicht
injizierten Embryonen wie bereits beschrieben keine Anomalien aufwiesen,
war bei 20% der mit Kontrollsubstanz injizierten Embryonen eine allgemeine
Veränderung nachweisbar. Von den 20% wiesen etwa 7% der Embryonen
dieser Gruppe keine spezifische kardiale Färbung auf (s. Abb. 20). Die
direkte Gegenüberstellung der Fälle ohne kardiale Anfärbbarkeit ergibt
erneut signifikante Unterschiede bezüglich aller drei Testgruppen. Es gilt
demnach eine hoch signifikante Abhängigkeit bezüglich der
Morpholinoinjektion und dem Ausbleiben einer kardialen Färbung durch eine
spezifische vmhc-Sonde mit p<0,001. Dabei besteht sowohl eine signifikant
höhere Chance durch Morpholinoinjektion eine verminderte vmhc
Genexpression im Vergleich zur Gruppe der nicht injizierten Embryonen zu
erreichen (s. Abb. 20, gekennzeichnet mit ***), als auch eine signifikant,
127fach höhere Chance im Vergleich zur Injektion mit Kontrollsubstanz
(OR=127,2 mit 95%-KI=[23,0; 702,8]).
Es resultiert demnach eine direkte Beeinflussung der für die Expression des
vmhc-Gens verantwortlichen Genregulation durch den hervorgerufenen
atoh8-Knockdown. Dieses Ergebnis bestätigt die in Kapitel 4.4.3 bereits
dargestellten Beobachtungen, da vmhc als Strukturprotein des kardialen
Myosins wesentlich an der Muskelkontraktion beteiligt ist und die
Kontraktilität nach Morpholinoinjektion und somit nach atoh8-Knockdown in
der folgenden embryonalen Entwicklung stark eingeschränkt zu sein schien.
72
Abbildung 20. Erweiterte statistische Auswertung de r vmhc-in-situ-
Hybridisierung.
Das Diagramm veranschaulicht die Auswertung der vmhc-in-situ-Hybridisierung mit
prozentualen Angaben auf der y-Achse und je einem Triplet, bestehend aus der Menge nicht
injizierter, Kontrollsubstanz injizierter und Morphanten, für eine nachweislich physiologische
Herzkonfiguration, anatomische Veränderungen der Herzmorphologie und für die Anzahl
nicht gefärbter kardialer Strukturen auf der x-Achse. Die Auswertung erfolgte nach den
Maßgaben von Kimmel et al. Absolut ausgewertete Embryonenzahlen finden sich
rechtsständig im Kästchen. Odds Ratio Berechnungen (OR) weisen eine signifikant höhere
Chance, fehlende Färbungen durch Morpholinoinjektion zu erreichen, nach. Eingeschränkte
statistische Chancenanalyse, da eine Testgruppe in zwei Merkmalen keine Fälle aufweist
(absolut 0); ein faktischer Chancenvergleich zu nicht injizierten Embryonen ist daher nicht
möglich, jedoch eindeutig sichtbar.
4.4.6 Atoh8 beeinflusst die Herzentwicklung - Analyse der ncx-1-in-
situ-Hybridisierung
Der Calciumkanal ncx-1 ist neben wenigen anderen Proteinstrukturen für
eine physiologische Calciumhomöostase während der zellulären Erregung
der Myokardiozyten durch die Regulation des Calciumausstromes nach
73
extrazellulär verantwortlich (Langenbacher et al., 2005). Folglich ist dieser
Kanal für den geregelten Ablauf der Kontraktion unerlässlich, bei Defekten in
seiner Struktur wurden sowohl ausgeprägte embryonale Schäden der
kardialen Entwicklung als auch diverse Formen der Arrhythmien
nachgewiesen (vgl. Kapitel 1.3.4). Im Gegensatz zu vmhc dient ncx-1 als
Marker atrialer und ventrikulärer Zellen, darüber hinaus deuteten
Veränderungen im Expressionsmuster nicht auf einen Funktionsverlust der
kontraktilen Elemente als viel mehr auf eine eingeschränkte Rhythmizität hin.
Neben der Untersuchung von vmhc als spezifischer Marker zur Analyse der
ventrikulären Kontraktilität wurde in den folgenden in-situ-Hybridisierungen
ncx-1 als Marker kardialer Strukturen genutzt. Über die Analyse der ncx-1
Genexpression selbst hinaus sollen durch die Herzfärbung weitere
Informationen über strukturelle Veränderungen nach atoh8-Knockdown im
Allgemeinen nachgewiesen werden, da in den vmhc-Hybridisierungen wegen
mangelnder Genexpressivität und somit mangelnder Färbung kardialer
Strukturen in der betroffenen Testgruppe keine eindeutigen Aussagen
bezüglich der anatomischen Konfiguration kardialer Strukturen getroffen
werden können.
Wie in vorigen Experimentanordnungen wurden die in-situ-Hybridisierungen
an allen drei Testgruppen mit Embryonen in den Stadien 24 hpf und 48 hpf
durchgeführt. Zudem wurden ebenfalls Doppelhybridisierungen mit ncx-1 &
myod zur Kontrolle eingesetzt, falls, wie bei dem vmhc-Marker, in der
Morpholinogruppe keine kardiale Färbung nachweisbar wäre. Im 26+
Somiten-Stadium war sowohl in der Testgruppe der nicht injizierten
Embryonen, als auch in der Gruppe der Kontrollsubstanz injizierten
Embryonen eine länglich-ovale kardiale Struktur durch eine spezifische
Anfärbung deutlich nachweisbar. Aufgrund einer Verstärkung der Anfärbung
im Bereich des epithelial-mesenchymalen Übergangs, welcher im Verlauf der
embryonalen Entwicklung durch Bildung von atrioventrikulären Kissen zur
Abgrenzung von Ventrikel und Atrium führt (vgl. Kapitel 1.1.5), lassen sich
die präformierten Herzhöhlen abgrenzen, dabei liegt die ventrikuläre Anlage
kranial (s. Abb. 21A/B). Vergleichend dazu weist eine signifikant höhere Zahl
an Morphanten im gleichen Stadium eine nur undifferenzierte Anfärbung
kardialer Strukturen auf. Eine längliche Färbung im Rahmen der Bildung
74
eines tubulären Systems ist nicht nachweisbar, es entsteht ein Bild einer
rundlich konfigurierten Ansammlung von Myokardiozyten. Eine
Differenzierung atrialer und ventrikulärer Bereiche ist demnach nicht möglich
(s. Abb. 21C). Darüber hinaus hat in den meisten Fällen dieses Stadiums
keine Fusion der paarig angelegten Strukturen stattgefunden, diese sollte in
Analogie zu Kapitel 4.4.1 jedoch im Stadium 24 hpf nahezu abgeschlossen
sein. Wegen der vermutlich unzureichenden Strukturierung kardialer
Strukturen unter dem Einfluss des Knockdowns ist vielfach eine nur sehr
schwache ncx-1-Färbung nachweisbar, da durch eine geringe Menge
funktionsfähiger Kardiomyozyten und der damit einhergehenden
unzureichenden Reifung des Organs folglich die ncx-1- Genexpression
verringert zu sein scheint.
Experimente mit Doppelhybridisierung bestätigen die beschriebenen
Ergebnisse (s. Abb. 21D-F). Neben den kardialen Veränderungen in der
Gruppe der Morphanten zeigen sich durch Anfärbung mittels myod-Marker
die typischen skelettalen Veränderungen wie beispielsweise die fehlende
Ausprägung der chevron-artigen Form der Somiten (s. Abb. 21F).
Wie in Kapitel 4.4.4 bereits ausgeführt weisen die Embryonen im Stadium 48
hpf keine myod-Anfärbbarkeit und somit keine aktive myod-Genexpression
mehr auf (s. Abb. 21G-I). Muskuläre Veränderungen sind in der Gruppe der
Morphanten in diesem Stadium nur geringfügig ausgeprägt (s. Abb. 21I).
Zudem sind Veränderungen in der embryonalen Herzentwicklung in keiner
der Testgruppen eindeutig nachweisbar.
75
Abbildung 21. Ncx-1/myod-in-situ-Hybridisierung.
A) Nicht injizierter Embryo, 24 hpf, ncx-1-in-situ-Hybridisierung. Tubuläre Anfärbung der
kardialen Anlage. Eine dunkle bogenförmige Struktur innerhalb der Färbung zeigt
das atrioventrikuläre Kissen, der rote Pfeil weist auf die ventrikuläre Seite hin.
B) Kontrollsubstanz injizierter Embryo, 24 hpf, ncx-1-in-situ-Hybridisierung, leicht
sagittal fotografiert. Keine Veränderungen zu A) nachweisbar. Der Übergang
zwischen atrialem und ventrikulärem Bereich ist deutlich erkennbar.
76
C) Morphant, 24 hpf, ncx-1-in-situ-Hybridisierung. Unstrukturierte Darstellung kardialer
Strukturen, ohne Abgrenzung einzelner Kammern. Die Anlage erscheint rundlich,
kein Nachweis tubulärer Anordnungen, deutliche Abschwächung der Färbung.
Zudem ist die paarige Anlage im Rahmen einer ausgebliebenen Fusion nachweisbar
(rote Pfeile).
D) Nicht injizierter Embryo, 24 hpf, ncx-1/myod-in-situ-Hybridisierung. Die kardialen
Strukturen stellen sich wie in A/B) dar, zudem sind v-förmige Somiten nachweisbar
(blauer Pfeil).
E) Kontrollsubstanz injizierter Embryo, 24 hpf, ncx-1/myod-in-situ-Hybridisierung. Keine
Veränderungen zu D) abgrenzbar.
F) Morphant, 24 hpf, ncx-1/myod-in-situ-Hybridisierung. Die Anfärbung der Herzstruktur
ist in Analogie zu C) deutlich schwächer als in den Kontrollen. Zudem fehlt die
beschriebene Differenzierung zu einer tubulären Form (roter Pfeil). Die Morphologie
des Schwanzes ist deutlich verändert, es sind Krümmungen und „Knicke“ erkennbar.
Die Anlage der Somiten schien zu erfolgen, eine V- Form durch migrierte adaxiale
Zellen ist jedoch nicht nachweisbar (blauer Pfeil).
G) Nicht injizierter Embryo, 48 hpf, ncx-1/myod-in-situ-Hybridisierung, zur
Herzdarstellung leicht sagittal rotiert. Das ausgereifte Herz ist dargestellt (roter
Pfeil). Die Strukturen erhalten nach erfolgter Rotation die Form reifer Herzhöhlen.
Myod-Expression ist nicht mehr nachweisbar (blauer Pfeil). Beginnende
Pigmentierung.
H) Kontrollsubstanz injizierter Embryo, 48 hpf, ncx-1/myod-in-situ-Hybridisierung,
seitliche Aufnahme. Keine morphologisch-anatomischen Veränderungen zu G)
nachweisbar. In der seitlichen Aufnahme ist das muskuläre System effizienter
beurteilbar, es zeigt sich eine deutliche v-förmige Ausprägung der Myotome, jedoch
keine Färbung durch myod-Marker (blauer Pfeil)
I) Morphant, 48 hpf, ncx-1/myod-in-situ-Hybridisierung, zur Herzdarstellung leicht
sagittal rotiert. Im Vergleich ist keine Anomalie des gefärbten Herzens nachweisbar
(roter Pfeil). Geringgradige Deformität (Biegung) der Rumpf-/Schwanzform. Das
muskuläre System scheint im Vergleich zu H), bezogen auf myod, bei
eingeschränkter Beurteilbarkeit nicht nachweislich beeinträchtigt (blauer Pfeil).
Statistische Analysen der in-situ-Hybridisierungen mit Embryonen im 24 hpf-
Stadium aller Testgruppen ergaben dabei signifikante Ergebnisse (s. Abb.
22). Während in mehr als 78% der Embryonen der Testgruppe der nicht
injizierten Tiere eine physiologische Herzkonfiguration nachweisbar war,
zeigte sich diese nur in etwa 44% der Morphanten. Mehr als 55% der
Morphanten wiesen wie zuvor beschriebene, deutliche Anomalien mit teils
sehr gering ausgeprägter, in wenigen Fällen gar fehlender Anfärbung
77
kardialer Strukturen auf. Dabei erbrachte die Unterscheidung zwischen
Anomalie und geringer bis fehlender Anfärbung, anders als bei der
Auswertung der vmhc Resultate, keine hoch signifikanten Ergebnisse (vgl.
Kapitel 4.4.7). Vergleichend dazu konnte eine physiologische
Herzdarstellung in mehr als 85% der mit Kontrollsubstanz injizierten
Embryonen nachgewiesen werden. Es zeigten sich signifikante Unterschiede
zwischen den Ergebnissen der Morpholinoinjektion und beiden
Kontrollgruppen, woraus sich eine hoch signifikante Abhängigkeit der
Morpholinoinjektion und dem Auftreten von Veränderungen der embryonalen
Herzentwicklung mit p<0,001 (Chi-Quadrat-Test) ergibt.
Abbildung 22. Statistische Auswertung der ncx-1-in-situ-Hybridisierung.
Das Diagramm veranschaulicht die Auswertung der ncx-1-in-situ-Hybridisierung mit
prozentualen Angaben auf der y-Achse und je einem Triplet, bestehend aus der Menge nicht
injizierter, Kontrollsubstanz injizierter und Morphanten im 26+ Somiten- Stadium, für eine
nachweislich physiologische Herzkonfiguration und allgemein anatomische Veränderungen
der Herzstruktur (inkl. Verminderung der Anfärbung) auf der x-Achse.
Ergebniswichtung: In der Morpholino- Testgruppe weisen alle Embryonen der Gruppe
„Veränderung der Herzstruktur“ anatomische Veränderungen der Herzstruktur bei meist
unterschiedlichem Färbeverhalten auf. In den Kontrollgruppen dagegen beinhaltet die
78
Gruppe „Veränderung der Herzstruktur“ in den meisten Fällen jeweils reine Veränderungen
der Anfärbung ohne Nachweis anatomischer Defekte kardialer Strukturen. Die
morphologische Auswertung erfolgte nach den Maßgaben von Kimmel et al. Absolut
ausgewertete Embryonenzahlen finden sich rechtsständig im Kästchen. Nach Chi-Quadrat-
Berechnungen zeigten sich hoch signifikante Unterschiede zwischen der Morpholinoinjektion
und beiden Kontrollgruppen mit p<0,001
Die Chance nach einem atoh8-Knockdown anatomische veränderte
Herzstrukturen aufzuweisen liegt dabei im Vergleich zur Kontrollinjektion um
mehr als 7fach höher (OR=7,1 mit 95%-KI=[3,7; 13,6]), im Vergleich zur
Testgruppe der nicht injizierten Embryonen um mehr als 4fach höher
(OR=4,5 mit 95%-KI=[2.7: 7.7]). Aufgrund der nicht vernachlässigbaren
Werte der gewerteten Veränderungen in den beiden Kontrollgruppen wurden
diese gegenübergestellt, wobei sich hier erwartungsgemäß kein signifikanter
Unterschied (p=0,143 im Chi-Quadrat-Test) ergab.
Ncx-1 weist neben der Analyse der vmhc-Genexpression als weiterer Marker
myokardialer Zellen eine Beeinflussung der embryonalen Herzentwicklung
durch Knockdown des atoh8-Gens nach.
4.4.7 Kein direkter Einfluss auf die ncx-1-Genexpression
Obwohl Veränderungen der kardialen Genese mittels ncx-1-in-situ-
Hybridisierungen nachgewiesen wurden, findet keine eindeutige
Beeinflussung der ncx-1-Genexpression selbst statt. Zwar ist in einer Vielzahl
der Morphanten nur eine schwache Anfärbung der beobachteten Strukturen
erkennbar, doch bedeutet dies, dass zumindest eine geringe Menge mRNA
des ncx-1-Gens exprimiert wurde und der Knockdown, anders als bei dem
vollständig fehlenden Nachweis einer vmhc-Expression, keinen direkten
Effekt auf die Regulation dieses Gens besitzt. Vielmehr ergibt sich bei
Betrachtung der Morphanten der Verdacht, dass die ncx-1-Genexpression
der anatomisch malformierten Zellen durch ausgeprägte Störungen der
kardialen Reifung und Determinierungs- sowie Differenzierungsstörungen
myokardialer Zellen im Rahmen des atoh8-Knockdowns selbst beeinträchtigt
ist, sodass es zu uneinheitlichen, schwach ausgeprägten
Expressionsmustern kommt.
79
Analog zur Auswertung der vmhc-Ergebnisse wurden die als „kardial
verändert“ gewerteten Embryonen aller drei Testgruppen ebenfalls genauer
betrachtet. Obwohl ca. 30% der 55% veränderter Herzstrukturen aus der
Testgruppe der Morphanten (s. Abb. 22) eine abgeschwächte kardiale, ncx-
1-Anfärbung bei meist zusätzlich deutlich veränderter Morphologie
aufwiesen, sind nur vereinzelte, stark malformierte Embryonen bei weiterhin
nachweisbarer myod-Anfärbung (bei veränderter muskulärer Morphologie,
wie zuvor beschrieben) vollständig kardial ungefärbt. Eine signifikante
Abhängigkeit zwischen dem atoh8-Knockdown und einem direkten Einfluss
auf die ncx-1-Genexpression oder deren Genregulation ist demnach sowohl
wegen der geringen Zahl vollständig ungefärbter Embryonen als auch wegen
der in der Auswertung nicht unterschiedenen Faktoren „wenig Färbung/ keine
Färbung“ nicht darstellbar, allerdings dennoch nicht sicher auszuschließen.
In beiden Kontrollgruppen wurden zudem bestimmte Anzahlen der in Abb. 22
als „verändert“ bezeichneten Embryonen ausschließlich aufgrund der
verminderten kardialen Färbung zu der Gruppe „verändert“ gezählt, obwohl
keine auffälligen, anatomischen Strukturveränderungen, im Vergleich zur
Gruppe der Morphanten, nachweisbar waren. Eine direkte Abhängigkeit der
ncx-1-Genexpression von atoh8 erscheint demnach bei dem Nachweis von
Veränderungen der Färbeintensität, die sich ebenfalls in untersuchten
Kontrollgruppen zeigen, zunehmend unwahrscheinlich (19% der 22%
„veränderter“ kardialer Strukturen aus der Testgruppe der nicht injizierten
Embryonen und 8% der 14 % aus der Gruppe der Kontrollsubstanz injizierten
Embryonen weisen geminderte kardiale Färbungen bei sonst physiologischer
kardialer und muskulärer Struktur auf). Die Wichtung der in Abbildung 22
dargestellten Art der „Veränderung der Herzstruktur“ liegt bei der Testgruppe
der Morphanten demnach auf der Beobachtung struktureller, kardialer
Veränderungen bei zusätzlich verändertem Färbeverhalten, bei den
Kontrollgruppen hingegen eher ausschließlich auf der Beobachtung eines
Unterschiedes im Färbeverhalten, da hier in den meisten Fällen keine
strukturellen Auffälligkeiten nachweisbar waren.
Da schlussfolgernd in allen untersuchten Testgruppen zu gewissen Anzahlen
Embryonen verminderter Färbung beobachtbar waren, ist eine Beeinflussung
der Anfärbung durch andere Faktoren ebenfalls nicht auszuschließen (vgl.
80
Kapitel 5.1). Sowohl der Zustand der Embryonen einzelner Testreihen, als
auch Effekte im Rahmen der Injektion oder der in-situ-Hybridisierung sowie
die Beschaffenheit der eingesetzten Sonde können zu Veränderungen des
spezifischen Färbeverhaltens und demnach zu den beschriebenen
Verminderungen der Färbung in allen untersuchten Testgruppen, nicht nur in
der Gruppe der Morphanten, geführt haben, sodass die Wahrscheinlichkeit
einer direkten Abhängigkeit der ncx-1-Genexpression von atoh8 gering ist.
81
5. Diskussion
5.1 Etablierung der Mikroinjektionen
Zur Untersuchung des Einflusses des Transkriptionsfaktors atoh8 auf die
Entwicklung des Herzens und der Somiten während der Embryonalphase
des Zebrafisches wurden Knockdown-Experimente durchgeführt. Den
wesentlichen Faktor des Experimentes stellt dabei die Durchführung der
Mikroinjektion in Zebrafischembryonen nach Mullins dar (Mullins, 2010).
Für die Versuchsreihen wurden Zebrafischeier in möglichst frühen
Entwicklungsstadien verwendet. Dies setzt ein konsequentes Ansetzen und
anschließendes Beobachten der angesetzten Fische voraus, um möglichst
direkt nach dem Ablaichen die Eier abzuschöpfen. Auf diese Weise
gewonnene Embryonen wurden für alle Versuchsanordnungen in drei
Testgruppen aufgeteilt. Neben der Morpholinoinjektion in einer Testgruppe
erfolgte die Injektion einer Kontrollsubstanz, bestehend aus mismatch
Morpholinos, in eine zweite Testgruppe. Die dritte Testgruppe wurde nicht
injiziert. Somit ließen sich Defekte, die in der Gruppe der Morphanten
entstanden, in beiden Kontrollgruppen jedoch nicht beobachtbar waren, auf
den Knockdown selbst zurückführen. Da die Mikroinjektion in solch frühen
Stadien einen hoch manipulativen Eingriff darstellt, ist die Injektion einer
Kontrollsubstanz in einer zweiten Testgruppe somit unerlässlich.
Da das Injektionsvolumen vom Kapillardurchmesser abhängig ist, müssen
die erzeugten Kapillarspitzen stets die gleichen Eigenschaften aufweisen.
Darüber hinaus ist das Injektionsvolumen nur über den zugeführten
Injektionsdruck einstellbar, sodass unter exakt gleichen Bedingungen und
Einstellungen gearbeitet werden muss.
Die Mikroinjektion erfolgte jeweils im Ein- bis Zwei-Zell-Stadium, um durch
einen Knockdown möglichst früh in die embryonale Entwicklung einzugreifen
und eine gleichmäßige Verteilung der injizierten Substanz in allen sich
teilenden Zellen zu gewährleisten. Dabei spielt auch der exakte Ort der
platzierten Injektion eine wesentliche Rolle, da mit der Zunahme der
Entfernung der Substanz vom animalen Pol eine Diffusion erschwert würde.
Darüber hinaus sind beide Injektionssubstanzen fluoreszenzmarkiert, sodass
82
eine erfolgreich platzierte Mikroinjektion mikroskopisch nachweisbar ist (s.
Abb. 6).
Der Injektionsvorgang betrug bei exakter Vorbereitung in jeder Gruppe nur
wenige Minuten, um Verzögerungen und damit unterschiedliche
Entwicklungsstadien zum Zeitpunkt der Injektionen zu vermeiden. So konnte
ausgeschlossen werden, dass beobachtete Entwicklungsdefekte nur
aufgrund von Injektionen, die zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung
durchgeführt wurden, stattgefunden haben.
Nach erfolgter Injektion wurden die Embryonen in E3-Medium gewaschen
und in diesem Medium bis zum entsprechenden Fixationszeitpunkt inkubiert.
Dabei ist auf die sorgfältige Aussortierung gestorbener Embryonen in
regelmäßigen Abständen zu achten, um hohen Nitritgehalten durch
Zersetzungsprozesse vorzubeugen. Durch mehrfache Medienwechsel kann
zudem eine bakterielle Besiedlung vermieden werden.
Trotz aller Hygienemaßnahmen bestehen teils deutliche Unterschiede in der
Beschaffenheit und im Zustand der Embryonen, welche sich durch die
verschiedenen tragenden Muttertiere erklären. Sowohl dem Alter als auch
den individuellen Zuständen der Tiere kommt dabei eine große Bedeutung
zu. Schwankungen der Sterberaten sowie zeitliche Verschiebungen der
embryonalen Entwicklungsprozesse können durch diese Faktoren deutlich
beeinflusst sein. Daher wurden die Sterberaten der Testgruppen in den
Versuchsanordnungen miteinander verglichen und es zeigten sich dennoch
deutlich ausgeprägte Unterschiede zwischen der Gruppe der Morphanten
und beiden Kontrollgruppen (vgl. Kapitel 4.2.1). Insbesondere die hohe
Sterberate nach 30-40 hpf lässt auf starke Beeinflussung durch den
Knockdown der atoh8-Genexpression schließen.
In Assoziation zu der kardialen Entwicklung korreliert dieser Zeitpunkt mit
dem Einsetzen effizienter Herzaktivität, sodass von einer Beeinträchtigung
des kardiovaskulären Systems, die im Verlauf zum Tode des Embryos führen
kann, auszugehen ist (vgl. Kapitel 4.4.4).
Da der zeitliche Ablauf der Entwicklung in der Untersuchung verschiedener
Aspekte von großer Bedeutung sein kann, wurden beispielsweise vor der
Untersuchung kardialer Defekte Vorversuche durchgeführt, um
nachzuweisen, dass unter den gegebenen Versuchsbedingungen bestimmte
83
Entwicklungsschritte zu bestimmten Zeiten erfolgen und nicht deutlich von
den Vorgaben von Kimmel et al. abweichen (vgl. Kapitel 4.4.1).
5.2 In-situ-Hybridisierung
Durch die in dieser Arbeit genutzte Art der whole mount in-situ-Hybridisierung
nach Westerfield ist die Visualisierung eines für das jeweils untersuchte Gen
spezifische Expressionsmuster im gesamten Embryo möglich (Westerfield,
1995). Auf diese Weise konnte das atoh8-Genexpressionsmuster in
verschiedenen Stadien der Zebrafischentwicklung beobachtet werden.
Darüber hinaus wurden durch die Nutzung spezifischer Sonden sowohl
Auswirkungen auf bestimmte Gewebe als auch Veränderungen spezifischer
Expressionsmuster selbst beobachtet und die vielfältigen Einflüsse eines
atoh8-Knockdowns auf Skelett- und Herzmuskulatur veranschaulicht.
Von wesentlicher Bedeutung für die Ergebnisse der Versuchsreihe ist die
Qualität der zur Hybridisierung eingesetzten Sonden bzw. Marker. Sind diese
nicht spezifisch, finden entweder keine, oder unspezifische Hybridreaktionen
statt, sodass in nachfolgenden Anfärbungen keine nachvollziehbaren
Expressionsmuster dargestellt würden. Daher ist eine Prüfung vor dem
Beginn der Versuchsreihe mittels Sequenzierungen während der
Sondenherstellung (vgl. Kapitel 3.4.2) und mittels in-situ-Hybridisierungen an
nicht injizierten Embryonen zur Kontrolle des Expressionsmusters
unerlässlich.
Um sowohl während des Hybridisierungsvorgangs als auch während der
Farbreaktion einheitliche Ergebnisse zu erzeugen wurden
Hybridisierungsplatten mit 24 Einzelkammern genutzt, sodass alle
Testgruppen unter gleichen Bedingungen mit exakt gleichen Zeitintervallen
hybridisiert wurden. Dieses Vorgehen erlaubt Aussagen über Unterschiede
im Färbeverhalten, die beispielsweise bei der Analyse des vmhc-
Genexpressionsmusters nachweisbar waren.
Analysen des ncx-1-Expressionsmusters verdeutlichen die Schwierigkeiten
der Ergebnisinterpretation. Zwar können im Rahmen der Beobachtung
verändert gefärbter, kardialer Strukturen signifikante Einflüsse eines atoh8-
Knockdowns nachgewiesen werden, doch würden Veränderungen der
beobachteten Färbungsintensität auch Hinweise auf eine direkte
84
Beeinflussung auf die Regulation der Genexpression des untersuchten Gens
geben können. Man würde eine ausbleibende Färbung und signifikante
Unterschiede zu beiden Kontrollgruppen erwarten, wie es bei vmhc
tatsächlich der Fall ist. Liegt jedoch lediglich eine Verminderung der
Farbintensität vor, ist ein direkter Einfluss auf die Genexpression oder deren
Signalwege nicht auszuschließen. Allerdings können andere Faktoren, wie
beispielsweise durch den Knockdown ausgelöste frühe Entwicklungsdefekte,
die zu schlecht differenzierten Zellen und verminderten Zellzahlen führen, im
selben Maße zu einer verminderten Expression des beobachteten Gens
führen, ohne direkt prägenden Effekt des Knockdowns auf das untersuchte
Gen oder dessen Aktivierung (vgl. Kapitel 4.4.7). Ist eine verminderte
Färbung in einer höheren Anzahl in allen Testgruppen nachweisbar, muss
eine Ursache in der Versuchsdurchführung selbst gesucht werden. Dabei ist
das RNase-freie Arbeiten von großer Bedeutung, um den
Hybridisierungsprozess nicht zu gefährden. Die Spezifität der eingesetzten
Sonden könnte mittels Sequenzierungen und weiterer Versuchsreihen
überprüft werden. Darüber hinaus muss eine Vermischung der drei
Testgruppen sicher ausgeschlossen sein.
Um bei fehlender Anfärbung einer Testgruppe nach in-situ-Hybridisierungen
mit Einsatz einer hoch spezifischen Sonde, welche beispielsweise
ausschließlich kardiale Strukturen darstellt, nachzuweisen, dass eine in-situ-
Hybridisierung dennoch erfolgreich war, wurden Doppelhybridisierungen
durchgeführt. Als Kontrollmarker wurde myod zur spezifischen
Skelettmuskelfärbung genutzt (vgl. Kapitel 4.4.2).
5.3 Atoh8 beeinflusst die Skelettmuskelentwicklung
Diverse Studien haben bereits eine vielfältige Beeinflussung verschiedener
Organsysteme während der Embryogenese des Zebrabärblings durch den
bHLH Transkriptionsfaktor atoh8 veranschaulicht (vgl. Kapitel 1.2). In dieser
Arbeit konnte unter anderem die ausgeprägte Beeinträchtigung der
Skelettmuskelreifung während der Embryogenese unter atoh8-Knockdown
nachgewiesen werden.
In einer Vielzahl der Morphanten wurden bereits ohne in-situ-Experimente
anatomische Defekte des muskulären Systems nach etwa 24 hpf beobachtet.
85
Mikroskopisch konnten ausgeprägte Deformierungen des Rumpfes bis zur
Schwanzspitze mit unzureichender Entwicklung einer typischen
Stromlinienform gezeigt werden. Dabei stellten sich in vielen Fällen
„Einknickungen“ im Bereich des Schwanzes dar, welche eine physiologische
Bewegung nahezu unmöglich machten. Diesen ersten Ergebnissen folgend
wurden zur gezielten Analyse und besseren Abgrenzbarkeit einzelner
Strukturen in-situ-Hybridisierungen mit den bereits dargestellten Markern an
Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien durchgeführt.
5.3.1 Pax3a-Analysen
Zur Darstellung der frühen muskulären Embryogenese wurde zunächst ein
pax3a-Marker eingesetzt, da pax3a nach Hammond als wichtiger Marker der
frühen muskulären Stammzellen in den Dermomyotomen der lateralen
Somiten gilt (Hammond et al., 2007). Obwohl, wie von Epstein beschrieben,
bereits in frühen Stadien, 12 hpf, eine nachweisliche Genexpression in
neuronalen Strukturen stattgefunden hat (Epstein et al.,1991), wurde nur
eine unspezifische Färbung noch undifferenzierter erster muskulärer
Strukturen beobachtet, da in diesem Stadium die Prägung von Somiten erst
einsetzt. Pax3a ist darüber hinaus wesentlich an der Induktion der
muskulären Regulationsfaktoren, wie beispielsweise myod und myf5 beteiligt,
da mit der Abnahme der pax3a-Expression eine Hochregulation der
Expression muskulärer Regulationsfaktoren bereits beobachtet wurde
(Maroto et al., 1997; Yusuf and Brand-Saberi, 2006). Dieser Effekt konnte in
dieser Versuchsreihe ebenfalls gezeigt werden, denn bei der Beobachtung
von Embryonen aller Testgruppen im 26+ Somiten-Stadium zeigte sich
neben der deutlichen neuralen Färbung eine nur sehr schwache Anfärbung
muskuläre Strukturen im Rahmen einer verminderten Genexpression. Da
pax3a die Differenzierung von Progenitorzellen zu Myoblasten (Yokoyama
and Asahara, 2011) steuert, diese nach 24 hpf mit Fortschreiten der
myogenen Differenzierung jedoch weitgehend abgeschlossen ist und zu dem
Zeitpunkt der Beobachtung die verschiedenen muskulären
Regulationsfaktoren für eine weitere myogene Differenzierung verantwortlich
sind, ist der Nachweis der verminderten pax3a-Genexpression in den
Somiten zum Zeitpunkt der Beobachtung nach 24 hpf durchaus plausibel.
86
Andererseits ist infolge der Ergebnisse auch eine verminderte Spezifität der
genutzten Sonde als Ursache möglich. Da jedoch ein deutliches
Expressionsmuster neuronaler Strukturen nachweisbar war, erscheint diese
Ursache unwahrscheinlicher. Zudem erfolgte eine schwache Färbung
myogener Strukturen, sodass eine Deutung der verminderten Spezifität
bezüglich ausschließlich myogener Strukturen nicht zutreffend ist.
Durch die geringe Anfärbung kann auch ein direkter Einfluss des
Transkriptionsfaktors atoh8 auf die pax3a-Expression somit weder bewiesen
noch ausgeschlossen werden. Dennoch erscheint eine direkte Beeinflussung
nicht wahrscheinlich, da, wie Hammond und Maroto experimentell
nachwiesen, eine regulative Korrelation zwischen pax3 und den MRFs
besteht (Maroto et al., 1997; Hammond et al., 2007). Myod-Experimente
wiesen jedoch eine myod-Expression unter Knockdown nach, sodass
demnach auch frühere Entwicklungsschritte, pax3 eingeschlossen, nicht
prägend beeinflusst sein können.
Um jedoch einerseits zu beweisen, dass nach 24 hpf die physiologische
pax3-Genexpression deutlich abgenommen hat und um andererseits
auszuschließen, dass ein atoh8-Knockdown die Genexpression
beeinträchtigt, könnten zunächst weitere in-situ-Hybridisierungen mit der von
Tsukamoto beschriebenen weiteren Isoform des pax3-Genproduktes pax3b
durchgeführt werden (Tsukamoto et al., 1994) um vergleichende Analysen
beider Expressionsmuster in entsprechenden Stadien durchführen zu
können. Darüber hinaus wären immunhistochemische Antikörperversuche
gegen exprimierte pax3-Transkriptionsfaktoren möglich, sodass auf
Proteinebene die Abnahme der Genexpression mit fortschreitender
Differenzierung nachgewiesen werden könnte. Im Rahmen der
Antikörpertests kann anhand der Untersuchung verschiedener Stadien
darüber hinaus eine direkte Beeinflussung des pax3-Signalweges durch
atoh8 verifiziert oder negativiert werden. Ob eine Abhängigkeit beider
Transkriptionsfaktoren voneinander besteht, könnte von medizinischer
Relevanz sein, da bereits neuromuskuläre Erkrankungen wie das
Waardenburg-Syndrom mit pax3-Gendefekten assoziiert sind (Moase and
Trasler, 1992).
87
5.3.2 Myod-Analysen
Aufgrund der nur schwachen Färbung muskulärer Strukturen ließen die in-
situ-Hybridisierungen mit pax3a bezüglich der durch den atoh8-Knockdown
hervorgerufenen Skelettmuskeldefekte in der entsprechenden Testgruppe
jedoch keine neuen Erkenntnisse zu, sodass ein weiterer spezifischer
Marker zur Untersuchung der entsprechenden Strukturen genutzt wurde.
Dabei sollte der Marker sowohl spezifisch für die embryonale Entwicklung
der Skelettmuskulatur sein als auch in späteren Stadien eine
Nachweisbarkeit aufweisen. Dabei fiel die Wahl auf den zu den muskulären
Regulationsfaktoren zählenden Transkriptionsfaktor myod. Aufgrund der
nach Tapscott und Rudnicki beschriebenen ausgeprägten Beeinflussung der
Differenzierung von Fibro- zu Myoblasten und der damit einhergehenden
Induktion funktionsfähiger Skelettmuskelzellen eignet sich die Verwendung
eines spezifischen myod-Markers hervorragend zur Analyse der muskulären
Differenzierung in Stadien, in denen beispielsweise bereits eine Suppression
der pax3-Expression erfolgt (Rudnicki et al., 1993; Tapscott, 2005).
Die verdeutlichten Resultate der myod-in-situ-Hybridisierungen an
Embryonen im 26+ Somiten-Stadium konnten signifikante Veränderungen
der embryonalen Entwicklung der Skelettmuskulatur infolge eines atoh8-
Knockdowns nachweisen. Aufgrund des myod-Expressionsmusters wurde
gezeigt, dass die von Devoto beschriebene v-förmige Ausprägung der
Somiten (Devoto et al., 1996; van Eeden et al., 1996) nicht stattfindet.
Anstelle differenzierter, deutlich voneinander abgrenzbarer Somiten sind in
der Gruppe der Morphanten zumeist wolkenförmige Anordnungen myogener
Zellmassen nachweisbar.
Versuche mit Embryonen älterer embryonaler Stadien (48 hpf) wiesen in
allen untersuchten Testgruppen eine deutlich verminderte myod-
Genexpression auf. Die muskulären Defekte in der Gruppe der Morphanten
ließen sich auch in diesem Stadium bestätigen. Wie bereits beschrieben
kommt myod die größte Funktionalität während der frühen myogenen
Differenzierung zu (Kadi et al., 2005). Diese ist jedoch nach mehr als 48 hpf
abgeschlossen, wie die kompartimentierten Somitenstrukturen beider
Testgruppen des gleichen Stadiums in Analogie zu den anatomischen
Beschreibungen Kimmels verdeutlichen (Kimmel et al., 1995). So ist eine
88
Verminderung der nachweisbaren myod-Genexpression schlüssig, denn
auch nach Tapscott findet nach den ersten zellulären Determinierungen über
verschiedene Regulationsmechanismen eine zwar dauerhafte, aber sehr
geringfügige myod-Expression auch in den sich weiter differenzierenden
Myoblasten zur Umstellung einer spezifischen Proteinproduktion statt, um
eine Ausdifferenzierung der Zellen zu gewährleisten (Tapscott, 2005).
Trotz der beobachteten ausgeprägten Defekte der embryonalen
Differenzierung muskulärer Strukturen muss in Analogie zur dennoch
stattfindenden Anfärbung und somit myod-Expression eine Bildung
funktionsfähiger Myozyten angenommen werden, da Rudnicki und Kassar-
Duchossoy beschreiben, dass die Anwesenheit von myod zur Induktion
funktionsfähiger Myozyten genügt (Rudnicki et al., 1993; Kassar-Duchossoy
et al., 2004). Diese Ergebnisse weisen deutliche Differenzen zu Yao et al.
auf, wonach der atoh8-Knockdown die Expression von myod stört (Yao et al.,
2010). Da jedoch eine eindeutige Färbung muskulärer Strukturen in allen drei
Testgruppen nach myod-in-situ-Hybridisierung mit gleicher Intensität
stattfindet und sich aufgrund anatomisch defekter Anordnung der myogenen
Zellen lediglich ein anderes Muster darstellt, weist dies auf eine ausgeprägte
Beeinflussung der Skelettmuskelentwicklung, jedoch keinesfalls auf eine
direkte Beeinflussung der myod-Expression hin. Aufgrund der ungenügenden
Entwicklung zu physiologischen Myotomen und der vermutlich
ausbleibenden Septierung und Anordnung von Muskelfaserbündeln wird trotz
erhaltener zellulärer Funktion eine gerichtete, koordinierte Bewegung
dennoch nur unzureichend möglich sein.
Atoh8 wird aufgrund der Ergebnisse ein großer Einfluss auf die
Differenzierung von Zellpopulationen, welche für die Ausprägung
strukturierter Somiten und der Ausprägung von Myosepten von wesentlicher
Bedeutung sind, zugeschrieben. Nach myod-in-situ-Hybridisierungen wurden
bandförmige, zelluläre Anfärbungen von vermutlich nicht der physiologischen
Entwicklung entsprechenden, undifferenzierten, myogenen
Zellansammlungen anstelle der Ausbildung von Somiten teilenden
Myosepten nachgewiesen. Darüber hinaus ergeben die Ergebnisse
durchgeführter Dünnschnittanalysen deutliche Hinweise darauf, dass durch
einen atoh8-Knockdown Defekte in der Entwicklung der von Thisse
89
beschriebenen adaxialen Region der Somiten (Thisse et al., 1993)
entstehen. Bereits durch Felsenfeld wurden während der embryonalen
Entwicklung in der adaxialen Region der Somiten insbesondere als
Pionierzellen bezeichnete myogene Vorläuferzellen nachgewiesen
(Felsenfeld et al., 1991). Die Resultate der atoh8-Knockdown Experimente
weisen diesbezüglich auf eine signifikante Beeinflussung exakt dieser
Zellpopulation hin, da einige der beobachteten Defekte direkt mit der
Funktion der Pionierzellen assoziiert sind. Einerseits wies van Eeden eine
Migration der zunächst adaxial liegenden Pionierzellen nach lateral und
anterior nach (van Eeden et al., 1996), sodass sich eine von Devoto als v-
förmige Ausprägung der Somiten beschriebene Form bildet (Devoto et al.,
1996). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Ausprägung dieser
typischen Somitenform nach atoh8-Knockdown ausbleibt. Andererseits
differenzieren Pionierzellen im Verlaufe der embryonalen Entwicklung zudem
zu langsamen Muskelfasern, entlang der migrierten Pionierzellen entsteht
dabei ein horizontales Myoseptum, welches spätere epaxiale von hypaxialen
Muskelanteilen trennt (Devoto et al., 1996; Kimmel et al., 1995). Eine klare
Abgrenzung von horizontalen Myosepten kann in Morphanten ebenfalls nicht
beobachtet werden, sodass in Zusammenschau der Resultate eine
Abhängigkeit der „pioneer cells“ von dem Transkriptionsfaktor atoh8 als sehr
wahrscheinlich gilt. Eine signifikante Beeinflussung der Pionierzellen
bestätigte sich zudem durch weitere, von M. Breuer durchgeführte Analysen
der zu den muskulären Regulationsfaktoren gehörenden
Transkriptionsfaktoren myf5 und myog (Breuer, 2013). Weitere
Versuchsreihen zur genauen Analyse der Entwicklung der Pionierzellen
sollten sich anlehnend an die Ergebnisse anschließen. Eine von Hatta bereits
beschriebene Expression des Homeobox Proteins Engrailed findet spezifisch
in Pionierzellen statt (Hatta et al., 1991), sodass beispielsweise über weitere
in-situ-Hybridisierungen oder immunhistochemische Versuche eine
spezifische Anfärbung zur detaillierten Analyse dieser Zellen erreicht werden
kann.
Wie Devoto bereits nachgewiesen hat, existieren neben den langsamen,
roten Muskelfasern, welche überwiegend aus den Pionierzellen entstehen,
auch schnelle, weiße Muskelfasern (Devoto et al., 1996). Im Gegensatz zu
90
den im Verlauf oberflächlich liegenden langsamen Muskelfasern befinden
sich die weißen Muskelfasern eher in den tiefen Schichten der
Skelettmuskulatur (Hirsinger et al., 2004; Ochi and Westerfield, 2007).
Aufgrund der Abhängigkeit der Pionierzellen von atoh8 sind bei Defekten im
atoh8-Gen im Rahmen der Entwicklung insbesondere Defekte der
oberflächlich gelegenen langsamen Muskelfasern zu erwarten. Bezogen auf
klinische Aspekte würden kongenitale Myopathien ableitbar sein, die
insbesondere durch Defekte der Stütz- & Haltemuskulatur bzw. der Anteile
der Skelettmuskulatur, die für eine kontinuierliche Leistung über längere Zeit
bei geringem Kraftaufwand verantwortlich sind, gekennzeichnet wären
(Silbernagl and Despopoulos, 2012).
Basierend auf den Erkenntnissen könnten sich weiterführende Experimente
mit der genauen Ausprägung der verschiedenen Muskelfaserarten
beschäftigen und somit eine eventuelle Abhängigkeit der Embryogenese
langsamer Muskelfasern von atoh8 nachweisen. Beispielsweise würde die
Analyse der slow myosin heavy chain (smhc)-Genexpression (Devoto et al.,
1996) spezifische Resultate bezüglich der Entstehung von Defekten in
langsamen Muskelfasern darstellen, da eine spezifische Expression in
Pionierzellen und im Laufe der Entwicklung schließlich in langsamen
Muskelfasern nachgewiesen wurde (Devoto et al., 1996; Hatta et al., 1991).
Darüber hinaus könnte eine exakte Analyse exprimierter smhc-
Proteinstrukturen in langsamen Muskelfasern durch immunhistochemische
Antikörper-Experimente ebenfalls auf Proteinebene stattfinden.
5.4 Atoh8 beeinflusst die kardiale Entwicklung
Neben den beschriebenen Effekten auf die Skelettmuskelentwicklung
beeinflusst atoh8 auch die Embryogenese der kardialen Muskulatur. Erste
Hinweise ergaben sich durch atoh8-in-situ-Hybridisierungen, welche eine
spezifische atoh8-Genexpression in kardialen Anlagen nachwiesen.
Basierend auf Nguyens Ausführungen über die Entwicklung kardialer
Funktionen des Zebrafisches (Nguyen et al., 2008) wurde nach atoh8-
Knockdown-Experimenten in einer Vielzahl untersuchter Embryonen der
Morpholino-Gruppe eine ausgeprägte Veränderung der kardialen
Kontraktilität nachgewiesen, die Rhythmik schien im Vergleich zu beiden
91
Testgruppen ebenfalls verändert. Aufgrund der Komplexität der embryonalen
Entwicklung des kardiovaskulären Systems wurden Embryonen aller
Testgruppen in verschiedenen Stadien beobachtet. In den Morpholino-
Gruppen war die Sterberate bereits nach mehr als 30 hpf deutlich erhöht. So
erhärtet sich der Verdacht, dass atoh8 ausgeprägten Einfluss auf die
Entwicklung des kardiovaskulären Systems hat. Exakt in dem Abschnitt der
embryonalen Entwicklung gewinnt nämlich das kardiovaskuläre System
durch den Beginn einer suffizienten Blutzirkulation zunehmend an
Bedeutung. Aufgrund dieser Annahmen wurden in Analogie zur Auswertung
muskulärer Strukturen erneut in-situ-Hybridisierungen zur Analyse kardialer
Veränderungen durchgeführt. Die genutzten Marker färben dabei jeweils
spezifisch kardial exprimierte Gene, deren translatierte Proteinstrukturen
essentiell für die zuvor beschriebenen kardialen Funktionen sind.
5.4.1 Vmhc-Analysen
Nach Yelon findet eine spezifische vmhc- Genexpression in den sich zu
ventrikulären Myokardiozyten entwickelnden Zellen der kardialen Anlagen
des Zebrafisches statt (Yelon et al.,1999). Darüber hinaus stellt vmhc einen
essentiellen Anteil des Motorproteins Myosin dar, sodass ein Defekt des
Gens zu ausgeprägten Veränderungen der myokardialen Kontraktilität führt
(Alberts et al., 2002). Vmhc kann deshalb sehr gut als Marker für erste
Versuchsreihen verwendet werden.
Zunächst wurden mittels in-situ-Hybridisierungen verschiedener Stadien nicht
injizierter Embryonen die spezifisch kardiale Anfärbung und die im Rahmen
der kardialen Fusion erfolgende Migration der von Stainier und Yelon
beschriebenen paarig angelegten tubulären Systeme nach medial
nachgewiesen (Stainier et al., 1993; Yelon et al., 2000). Daran anschließend
wurden Versuchsreihen mit allen drei Testgruppen gleicher Stadien (26+
Somiten-Stadium) mit überraschenden Ergebnissen durchgeführt. Während
in beiden Kontrollgruppen den Maßgaben von Stainier entsprechende
kardiale (ventrikuläre) Strukturen, deutlich angefärbt, beobachtet wurden, war
in einer signifikanten Embryonenzahl der Morpholino-Gruppe keine kardiale
Färbung nachweisbar. Zwar ist die Interpretation von anatomischen Defekten
durch die fehlende Anfärbung dieser Testgruppe nicht präziser möglich,
92
jedoch verweist dieses Ergebnis auf eine direkte oder auch indirekte
Abhängigkeit der vmhc-Genexpression von dem Transkriptionsfaktor atoh8.
Durch den Einsatz von Doppelhybridisierungen wurden die Resultate
bestätigt. Anhand der myod-Färbung wurde einerseits eine erfolgreiche
Hybridisierungsreaktion nachgewiesen, andererseits wurden bezüglich der
spezifischen vmhc-Anfärbung gleiche Resultate wie in den
Einzelhybridisierungen erzielt. Die Frage nach der unzureichenden Spezifität
der eingesetzten vmhc-Sonde kann aufgrund des positiven Nachweises in
beiden Kontrollgruppen verworfen werden, sodass die Ergebnisse für eine
signifikante Beeinflussung durch atoh8-Knockdown sprechen. Da in den
Versuchen mit Knockdown des atoh8-Gens, nicht mit Knockout, gearbeitet
wurde, sind in der Testgruppe der Morphanten geringe Embryonenzahlen mit
leichter kardialer Anfärbung, allerdings bei prägnant veränderter kardialer
Struktur, erklärbar. Aufgrund der Verdünnung der Morpholinokonzentration
während der fortschreitenden Zellteilungen kann in einigen Zellen wieder
eine atoh8-Expression stattfinden und die nachfolgende Regulation
bestimmter Gene, die bislang gestört war, ausgelöst werden. Bis zu dem
Zeitpunkt determinierte Defekte werden dadurch allerdings nicht verändert.
Auch in der Testgruppe der mit Kontrollsubstanz injizierten Embryonen
wurde im Vergleich zu den nicht injizierten Embryonen eine geringe Anzahl
kardial veränderter Strukturen, bzw. schwach angefärbter Strukturen
nachgewiesen. Da sich im Vergleich zur Gruppe der Morphanten dennoch
signifikante Unterschiede zeigen, sind die beobachteten Veränderungen in
der Kontrollgruppe am ehesten durch die Manipulation embryonaler Zellen
während der Durchführung der Mikroinjektion selbst entstanden.
Die beobachtete Beeinflussung der vmhc-Expression in der Morpholino-
Gruppe unterstreicht die Beobachtungen an lebenden Embryonen der
gleichen Testgruppe bezüglich der nur schwach ausgeprägten myokardialen
Kontraktilität, denn Defekte im Motorprotein Myosin führen zum
Funktionsverlust kontraktiler Strukturen. Von Seidman wurde in
humanmedizinischen Forschungen bereits die große Bedeutung von
Defekten in verschiedenen myosin heavy chain-Genen (mhc) nachgewiesen,
da Defekte in bestimmten Formen der Myosinketten zu familiären, dilatativen
und obstruktiven Kardiomyopathien führen können (Seidman and Seidman,
93
2001). Andere Studien haben beispielsweise den Einfluss funktionsfähiger
Myosinketten auf die strukturelle Entwicklung des Herzens nachgewiesen, da
einzelne Formen der menschlichen, schweren Myosinkette mit der Bildung
von Vorhofsepten assoziiert sind, denn Genmutation betroffener Gene
verursachen Vorhofseptumdefekte (Ching et al., 2005). Durch den
Knockdowneffekt und der resultierenden Beeinflussung der vmhc-
Genexpression wird es folglich nicht nur zur reinen Funktionseinschränkung
bezüglich der kontraktilen Leistung kommen, es werden darüber hinaus
strukturelle Defekte im Rahmen der embryonalen Entwicklung aus dem
Mangel an vmhc hervorgehen.
Die beobachteten Resultate geben Anlass zur Untersuchung einiger
Schlüsselstellen genau der Abfolgen aktivierter Gene, die während der
embryonalen Entwicklung des Zebrafisches zur Induktion und Steuerung der
vmhc-Genexpression führen. Neben der direkten Beeinflussung der vmhc-
Genexpression könnte atoh8 nämlich gleichermaßen die zur vmhc-
Produktion obligaten Faktoren beeinflussen, sodass daraus die beobachteten
Effekte resultieren. Wie bereits beschrieben sind vielfältige Mechanismen an
der Induktion und Steuerung der vmhc-Genexpression beteiligt (vgl. Kapitel
1.3.3). So ist beispielsweise das pan-Gen wesentlich an der Initialisierung zur
Differenzierung myokardialer Vorläuferzellen beteiligt (Stainier et al., 1996),
Yelon wies dabei nach, dass darüber hinaus eine signifikante Abhängigkeit
der frühen vmhc-Genexpression von der pan-Aktivität besteht (Yelon et al.,
1999). Transkriptionsfaktoren wie hand2 (Yelon et al., 2000), gata5 und fgf8
(Reiter et al., 1999) sind neben der myokardialen Differenzierung ebenfalls
an der Induktion der vmhc-Expression beteiligt. Darüber hinaus sind weitere
Transkriptionsfaktoren der gata-Familie an der Induktion der vmhc-
Genexpression beteiligt, denn Park beschrieb mittels Promotoranalysen,
dass gata4 und gata6 ebenfalls essentielle Schlüsselfunktionen in der
Induktion übernehmen (Park et al., 2009). In jüngsten atoh8-Studien konnten
Rawnsley und Kollegen eine Beeinflussung und Regulierung des
Transkriptionsfaktors gata4 durch atoh8 während der Embryogenese des
Zebrafisches nachweisen (Rawnsley et al., 2013). Da folglich bei atoh8-
Knockdown eine fehlgesteuerte Regulierung der gata4-Expression erfolgt,
muss die von gata4 regulierte Induktion der vmhc-Expression ebenso
94
beeinträchtigt sein; es resultiert in Analogie zu den Beobachtungen eine
verminderte bzw. fehlende vmhc-Genexpression.
Während der embryonalen Entwicklung findet jedoch nicht nur eine
Steuerung der Induktion der vmhc-Expression statt, sondern auch eine
Regulierung und Suppression während der Expression. Das Homeobox
Protein nkx2.5, ein spezifischer Transkriptionsfaktor des präkardialen
Mesoderms (Chen et al., 1996), trägt beispielsweise zur selektiven vmhc-
Genexpression ventrikulärer Zellen durch Suppression in atrialen Zellen bei
(Jin et al., 2009). Da jedoch in einer Vielzahl der Morphanten aufgrund der
vmhc-Beeinflussung erst gar kein Expressionsmuster nachweisbar war, sind
Rückschlüsse bezüglich der atrialen Suppression im Verlauf nicht möglich.
Eine Abhängigkeit des Transkriptionsfaktors nkx2.5 von atoh8 kann daher
nicht beurteilt werden.
Abbildung 23 stellt eine Übersicht der wichtigsten Entwicklungsschritte der
kardialen Embryogenese mit möglichen Punkten der atoh8- Beeinflussung
dar.
Es wäre interessant ob mittels weiterer in-situ-Hybridisierungen oder
immunhistochemischer Analysen eine manifeste Abhängigkeit der für die
vmhc-Genexpression erforderlichen Regulation von atoh8 nachweisbar wäre.
Aufgrund der Ergebnisse würde insbesondere die Untersuchung der
Regulation und der Epistase der Gene atoh8-gata4-vmhc sinnvoll sein.
5.4.2 Ncx-1-Analysen
In dieser Versuchsreihe wurde als Marker der in-situ-Hybridisierungen ncx-1
genutzt. Nachdem die vmhc-Hybridisierungen signifikante Ergebnisse
lieferten, jedoch aufgrund der damit verbundenen fehlenden kardialen
Anfärbbarkeit in der Gruppe der Morphanten keine prägnanten Aussagen
über anatomische Veränderungen kardialer Strukturen ermöglicht wurden,
sollte der Einsatz des ncx-1-Markers mehr Aufschluss über strukturelle
Veränderungen bringen. Darüber hinaus wurde mit vmhc bereits die
Kontraktilität beleuchtet. Mittels ncx-1-Analysen soll dagegen der Einfluss
des Knockdowns auf die Rhythmik der Herzaktionen betrachtet werden, da
Beobachtungen an lebenden Morphanten den Verdacht einer Beeinflussung
der kardialen Rhythmik nahe legten. Langenbacher wies bereits nach, dass
95
der Natrium-Calcium-Austauscher-1 über die Induzierung eines
Calciumausstromes nach extrazellulär nach vollendeter Kontraktion
wesentlich an der intrazellulären Calcium-Homöostase beteiligt ist und
Defekte dieses Gens zu ausgeprägten Arrhythmien führen (Langenbacher et
al., 2005). Weitere Studien haben darüber hinaus gezeigt, dass die ncx-1-
Aktivität bereits während der Embryonalentwicklung kardialer Strukturen von
wesentlicher Bedeutung ist (Rottbauer et al., 2001).
Die Ergebnisse veranschaulichen den signifikanten Einfluss des atoh8-
Knockdowns auf die strukturelle Entwicklung des Herzens. Aufgrund
fehlender Abgrenzbarkeit einzelner Herzhöhlen und offensichtlichen
Defekten in der Ausbildung der von Stainier beschriebenen tubulären
Systeme im entsprechenden Stadium ist anhand der Anfärbung im Vergleich
zu beiden Kontrollgruppen lediglich eine undifferenzierte Ansammlung
myokardialer Zellen beobachtbar. Eine Septierung einzelner Herzhöhlen
scheint demnach nicht zu erfolgen. Eine kardiale Fusion beider tubulärer
Vorläufersysteme (Stainier et al., 1993), wie sie während der physiologischen
Entwicklung im 26+ Somiten-Stadium bereits stattgefunden hat (vgl. Kapitel
4.4.1), ist nicht nachweisbar; meist sind noch paarig angelegte,
undifferenzierte Strukturen angefärbt. Diese Beobachtungen ließen sich auch
hier durch die Durchführung von Doppelhybridisierungen bestätigen.
Der Vorgang der Fusion ist bislang weitgehend unverstanden, nur einzelne
verantwortliche Komponenten für die Induktion der Migration beider
Vorläufersysteme nach medial sind erfasst. Atoh8 könnte demnach die
Expression des bHLH Transkriptionsfaktors hand2 (Yelon et al., 2000) oder
des miles apart-Gens (mil) (Kupperman et al., 2000) beeinflussen, denn für
beide Gene ist eine Wirkung auf die kardiale Fusion nachgewiesen. Yelon
wies darüber hinaus nach, dass eine Population endodermaler Zellen,
welche ebenfalls im Rahmen der Embryogenese nach medial wandert, mit
myokardialen Vorläuferzellen in Kontakt steht und an der Fusion beteiligt ist
(Yelon, 2001). Weitere Studien konnten diesbezüglich zeigen, dass
Mutationen im mil-Gen neben Differenzierungsstörungen endodermaler
Zellen mit kongenitalen Herzanomalien einher gingen (Alexander et al., 1999;
Kikuchi et al., 2000). Es erscheint demnach sinnvoll, weitere Untersuchungen
bezüglich dieser Gene mittels spezifischer in-situ-Hybridisierungen
96
darzustellen und unter dem Einfluss von atoh8-Knockdown-Experimenten zu
analysieren. Des Weiteren könnte eine spezifische Untersuchung der von
Yelon beschriebenen endodermalen Zellen bezüglich einer Abhängigkeit von
atoh8 untersucht werden.
Da der Nachweis voneinander abgrenzbarer Herzhöhlen in der Gruppe der
Morphanten nicht gelang, stellt sich nach den Beobachtungen die Frage
nach einer defekten Ausbildung atrioventrikulärer Septen. Wie zuvor
beschrieben liegt zumindest nach humanmedizinischen Untersuchungen
nach Ching eine Abhängigkeit der Ausbildung atrialer Septen vom
Vorhandensein bestimmter Myosinketten vor (Ching et al., 2005). Aufgrund
der Ergebnisse der vmhc-Analysen könnte daher eine Beeinträchtigung der
Septierung durch die defekte vmhc-Genexpression in Knockdown-
Experimenten stattfinden, jedoch ist fraglich, ob die Untersuchungen auf den
Zebrafisch projizierbar sind.
Auch Defekte in der Ausprägung der von Eisenberg beschriebenen
atrioventrikulären Kissen, die im Laufe der embryonalen Entwicklung zu
atrioventrikulären Klappen und somit zur strukturierten Teilung zwischen
Vorhof und Ventrikel führen, (Eisenberg and Markwald, 1995), sind im
Rahmen eines atoh8-Knockdowns möglich. Da nach Walsh das jekkl-Gen
wesentlich an der Entwicklung der Herzklappen beteiligt ist, könnten in
nachfolgenden Experimenten Abhängigkeiten dieses Gens von der atoh8-
Präsenz untersucht werden (Walsh and Stainier, 2001).
Im Allgemeinen würde man bei einer derart frühen Beeinflussung der
embryonalen Entwicklung, insbesondere der frühen kardialen
Progenitorzellen, durch atoh8-Knockdown erwarten, dass somit nicht nur
einzelne Abfolgen, sondern komplexe Entwicklungsschritte im Verlauf gestört
sein müssen. So würden neben einer fehlerhaften vmhc-Expression und
neben der vielen bereits zuvor beschriebenen, möglichen
Genbeeinflussungen auch einige weitere Prozesse wie beispielsweise die
von Veerkamp und Kollegen dargestellten zellulären Migrationsprozesse im
Verlauf nur fehlerhaft ablaufen und kardiale Malformationen würden
resultieren (Veerkamp et al., 2013).
Die statistische Analyse der Ergebnisse verweist neben den signifikanten
Veränderungen in der Testgruppe der Morphanten jedoch auch in beiden
97
Kontrollgruppen zu jeweils bestimmten Anzahlen auf kardiale
Veränderungen. Diese Auffälligkeit erklärt sich durch die Wichtung der
beobachteten Veränderungen, denn sowohl veränderte Anfärbungen als
auch morphologisch-strukturelle Veränderungen wurden als „Veränderung“
gewertet. Während sich in der Morpholino-Gruppe in hohem Maße
anatomische Defekte kardialer Strukturen bei teils schwacher Färbung
zeigten, wurden in den Kontrollgruppen zumeist lediglich Veränderungen der
Anfärbung bei sonst physiologischer Herzformation beobachtet.
Einerseits bedeutet dies, dass eine direkte Beeinflussung der ncx-1-
Expression durch atoh8 aufgrund einer nachweisbaren Färbung in allen
Testgruppen offenbar nicht stattfindet. Insbesondere in der Gruppe der
Morphanten würde in Analogie zu den vmhc-Ergebnissen bei direkter
Beeinflussung eine signifikant ausbleibende Färbung erwartet werden, es
zeigte sich jedoch in den meisten Fällen eine, wenn auch teils schwache,
Färbung. Demnach können beobachtete Veränderungen der kardialen
Rhythmik, die nach Pogwizd bei Defekten im ncx-1-Gen bis zum plötzlichen
Herztod führen können (Pogwizd et al., 1999), nicht direkt auf eine
Beeinflussung der ncx-1-Expression zurückgeführt werden.
Andererseits müssen Faktoren vorhanden sein, die das Färbeverhalten der
eingesetzten Sonde beeinflussen, da in allen Testgruppen zu bestimmten
Anzahlen verminderte Anfärbungen beobachtbar waren. Verminderte
Anfärbungen allein in der Morpholino-Gruppe ließen den Schluss einer
geringeren ncx-1-Expression durch die Verringerung der effektiv
differenzierten Zellzahl aufgrund von entstandenen Malformationen zu. Die
ncx-1-Genexpression selbst bliebe dabei allerdings von atoh8 unbeeinflusst.
Da jedoch in allen Testgruppen Farbveränderungen beobachtbar waren,
können beispielsweise Eigenschaften der in den in-situ-Hybridisierungen
eingesetzten Sonde eine mögliche Ursache dieser Beobachtung sein.
Möglich wäre weiterhin eine instabile Anfärbung, die zu den Ergebnissen
führt. Darüber hinaus könnte es aus ungeklärten Ursachen zu einer
tatsächlichen Abnahme der Expression ab einem bestimmten Stadium auch
in den Kontrollen kommen.
98
Abbildung 23. Schritte der kardialen Embryogenese.
Die Abbildung veranschaulicht die wichtigsten Schritte der kardialen Embryogenese und die
Beeinflussung einzelner Schritte durch verschiedene Gene. Atoh8 scheint nach den
Ergebnissen an verschiedenen Stellen der Entwicklung eine Rolle zu spielen, von Rawnsley
und Kollegen nachgewiesen ist der Einfluss auf gata4 (Rawnsley et al., 2013).
5.4.3 Embryonen in späteren Entwicklungsstadien
Die Ergebnisse der Versuchsreihen haben deutlich erhöhte Sterberaten der
Embryonen aus den Morpholino-Testgruppen ab einer Altersgrenze von etwa
30 hpf gezeigt. Nach 48 hpf haben nur noch geringe Anzahlen dieser
Testgruppen überlebt, sodass hier eine Strukturanalyse von Skelett- &
Herzmuskulatur zur Ergebnisverfälschung führen würde. Es ist nämlich
davon auszugehen, dass ausschließlich diejenigen Embryonen dieser
Gruppe überlebten, in denen beispielsweise die Morpholinoverteilung nur
unzureichend geglückt ist und somit der Knockdown insbesondere in
prägenden Anfangsstadien der Entwicklung nur mäßig erfolgreich war.
99
Folglich hat atoh8 derart tief greifende Einflüsse auf die embryonale
Entwicklung des Zebrafisches, dass der Knockdown des Gens zu
lebensbedrohlichen Anomalien führt. Da sich gezeigt hat, dass die Sterberate
erst ab einer bestimmten Altersgrenze deutlich zunimmt, liegt die Vermutung
nahe, dass die ausgeprägten Anomalien des kardialen Systems, wie sie in
dieser Arbeit nachgewiesen werden konnten, zum vermehrten Sterben der
Embryonen führen. In Analogie zu Nguyens Beobachtungen, nach denen in
Embryonen ab dem 26+ Somiten-Stadium erste koordinierte kardiale
Kontraktionen im Sinne eines Pumpvorganges erfolgen (Nguyen et al.,
2008), findet also frühestens ab etwa 24 hpf mit der Ausprägung des
Gefäßsystems die Ausbildung einer kardiovaskulären Zirkulation statt
(Kimmel et al., 1995). Zuvor werden die embryonalen Zellen über
Diffusionsvorgänge versorgt. Demnach erfolgt die zelluläre Versorgung ab 24
hpf zunehmend über das kardiovaskuläre System. Ergeben sich während der
embryonalen Entwicklung ausgeprägte Defekte des kardiovaskulären
Systems, ist der Organismus nicht dauerhaft lebensfähig.
Wegen der geringen Anzahl an Morpholino-Embryonen im 48 hpf-Stadium
war die Untersuchung der Kontraktilität und Rhythmik des Herzens nicht
möglich, jedoch ergab die Beobachtung früherer Stadien Hinweise auf
Veränderungen der Rhythmik. Es ist allerdings fraglich, ob einzelne Proteine,
wie Ionenkanäle, die zur Aufrechterhaltung der Elektrolythomöostase dienen,
durch atoh8 beeinflusst werden und so zu Arrhythmien führen können oder
ob tiefgreifende Schäden in der strukturellen Entwicklung des Herzens eine
koordinierte, rhythmische Kontraktilität ausschließen. So differenzieren sich
beispielsweise am atrioventrikulären Übergang, welcher, wie in dieser Arbeit
beschrieben wurde, durch atoh8-Knockdown maßgeblich verändert ist,
gelegene Myokardiozyten zu langsam leitenden Zellen und gewähren
koordinierte Erregungsüberleitungen auf den Ventrikel (Chi et al., 2008).
Auch die Ausbildung eines Trabekelwerkes mit zunehmender Myokarddicke
führt zur Koordination der Reizweiterleitung, sodass eine defekte
Myokardstruktur mit ausgeprägten Arrhythmien einhergehen kann (Sedmera
et al., 2003).
Die durch den atoh8-Knockdown hervorgerufenen Veränderungen der
Differenzierung myokardialer Strukturen sind einerseits signifikant
100
ausgeprägt, andererseits sind genaue Zuordnungen einzelner, betroffener
Regulationsmechanismen, die für die Ausprägung bestimmter Merkmale
verantwortlich sein könnten, äußerst schwierig zu treffen, da, wie in vorigen
Kapiteln bereits deutlich wird, multiple, ineinander greifende
Regulationsmechanismen die embryonale Entwicklung bestimmen. Zelluläre
Differenzierungsprozesse werden über teils komplexe Aktivierung bestimmter
Abfolgen von Genen induziert und gesteuert. Zudem sind viele embryonale
Prozesse der kardialen Entwicklung nur unvollständig verstanden, sodass
vielfach eine Beeinflussung von bislang nur teils nachvollziehbaren
Signalkaskaden auch nur unzureichend nachweisbar ist.
101
6. Zusammenfassung
In verschiedenen Studien mit Zebrabärblingen wurde bereits der vielfältige
Effekt des bHLH Transkriptionsfaktors atoh8 auf verschiedene Gewebe
während der Embryonalentwicklung nachgewiesen (Wang et al., 2009).
Infolge dessen wurde während der embryonalen Entwicklung des
Zebrafisches eine Transkription des atoh8-Gens sowohl in der sich
differenzierenden Skelettmuskulatur, als auch in der kardialen Anlage
beobachtet (Yao et al., 2010).
Die Beobachtungen führen zu der Fragestellung, inwiefern die strukturierte
Entwicklung unterschiedlicher Gewebe durch die Anwesenheit von atoh8
geprägt ist. Daher beschäftigt sich diese Arbeit mit dem Einfluss des
Transkriptionsfaktors atoh8 auf die embryonale Entwicklung der Skelett- &
Herzmuskulatur des Zebrafisches.
Zur spezifischen Darstellung der jeweils untersuchten Gewebe wurden whole
mount in-situ-Hybridisierungen mit gewebespezifischen Markern an
Zebrafischembryonen unterschiedlicher Stadien durchgeführt; durch
Anfärbung der Hybridreaktionen entsteht ein für das jeweils spezifisch
beobachtete Gen typisches Expressionsmuster auf mRNA-Ebene. Zur
Untersuchung des atoh8-Einflusses auf die betrachteten Gewebe wurden
Knockdown-Experimente durchgeführt. Diese erfolgten mittels Einsatz
spezifischer Morpholinos, welche per Mikroinjektion in die
Zebrafischembryonen eingebracht wurden. Anatomisch-morphologische
Analysen wurden nach den Grundlagen, beschrieben von Kimmel und
Stainier (Kimmel et al., 1995; Stainier et al., 1993), durchgeführt.
Während pax3a-in-situ-Hybridisierungen aufgrund der während der
Embryonalentwicklung sehr frühen Einflüsse des pax3-Gens auf die
myogene Differenzierung keine signifikanten Ergebnisse in den
beobachteten Embryonenstadien lieferten, verdeutlichen Resultate aus
myod-in-situ-Hybridisierungen dieser Arbeit den ausgeprägten Einfluss des
Transkriptionsfaktors atoh8 auf die Entwicklung der für die Embryogenese
der Skelettmuskulatur verantwortlichen Somiten. Unter atoh8-Knockdown
traten signifikante Defekte der beobachteten Somitenstrukturen auf, wobei im
102
Gegensatz zu den Beobachtungen Yaos (Yao et al., 2010) keine direkte
Beeinflussung auf die myod-Genexpression selbst nachweisbar war. Darüber
hinaus wurde eine defekte Ausprägung horizontaler Myosepten der
Somitenstrukturen mit aufgehobener v-Form (Devoto et al., 1996)
nachgewiesen, eine differenzierte Darstellung adaxialer Zellstrukturen in
Knockdown-Versuchen war ebenso nicht möglich.
Analysen der kardialen Entwicklung wurden im Rahmen dieser Studie analog
durchgeführt. Beobachtungen an zunächst lebenden Knockdown-
Embryonen verdeutlichten den Effekt auf die Entwicklung kardialer Anlagen.
Einerseits wurden im Vergleich zu Nguyens Ausführungen (Nguyen et al.,
2008) ausgeprägte Veränderungen der Kontraktilität bei arrhythmischer
Aktivität beobachtet, andererseits nahm die Sterberate der atoh8-
Morphanten ab Stadien, in denen die kardiovaskuläre Zirkulation zunehmend
an Bedeutung gewinnt (Kimmel et al., 1995) massiv zu.
Mittels in-situ-Hybridisierungen wurden daher spezifisch eingesetzte Marker
zur Untersuchung zweier verschiedener Gene unterschiedlicher, kardialer
Funktionsbereiche analysiert, sodass Rückschlüsse auf Kontraktilität und
Rhythmik des Herzens ermöglicht wurden.
Untersuchungen von in-situ-Hybridisierungen mit vmhc-Marker erbrachten
aufgrund der nicht nachweisbaren kardialen Färbung der Morphanten keine
eindeutigen Hinweise auf anatomische Strukturveränderungen, allerdings
konnte durch das Färbeverhalten erstmalig eine signifikante, direkte
Abhängigkeit der vmhc-Genexpression von dem Transkriptionsfaktor atoh8
nachgewiesen werden. Aufgrund der damit verbundenen eingeschränkten
Funktion des Myosins sind charakteristische, myokardiale Kontraktionen
nicht möglich. Die Entstehung von kongenitalen Kardiomyopathien wäre
begünstigt, wie Seidman in humanmedizinischen Studien über verschiedene
mhc-Proteine nachweisen konnte (Seidman and Seidman, 2001). Da die
Steuerung der vmhc-Genexpression auf der regulierten Aktivierung
unterschiedlicher Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise gata4 beruht, ist
eine exakte Zuordnung der durch atoh8 beeinflussten Kaskaden bislang nicht
möglich. Es erhärtet sich jedoch der Verdacht einer Beeinflussung der
Abfolge der Gene atoh8-gata4-vmhc, da nach Park dem gata4-Gen eine
Schlüsselrolle in der Induktion der vmhc-Genexpression zukommt (Park et
103
al., 2009) und gata4 selbst nachweislich durch atoh8 beeinflusst wird
(Rawnsley et al., 2013).
Durch die Darstellung des nach ncx-1-in-situ-Hybridisierungen angefärbten
Expressionsmusters wurden signifikant ausgeprägte, kardiale
Strukturveränderungen nach Knockdown nachgewiesen. Eine direkte
Beeinflussung des ncx-1-Gens selbst konnte dabei im Gegensatz zu vmhc-
Resultaten allerdings nicht nachgewiesen werden, sodass Rückschlüsse auf
die Beeinträchtigung der kardialen Kontraktionsrhythmik durch
möglicherweise hervorgerufene Defekte in der ncx-1-Genexpression im
Rahmen des atoh8-Knockdowns nicht möglich waren. Aufgrund von
Veränderungen der kardialen Anfärbung aller untersuchten Testgruppen
sollte die Spezifität der in den in-situ-Hybridisierungen eingesetzten ncx-1-
Sonde überprüft werden. Dennoch weisen die in den Morphanten
beobachteten kardialen Strukturveränderungen einerseits auf eine
Beeinflussung der kardialen Fusion (Yelon, 2001) der zunächst paarig
angelegten tubulären Vorläuferstrukturen als auch auf eine Beeinträchtigung
der Strukturierung des atrioventrikulären Überganges hin.
Aufgrund der beobachteten, spezifischen Veränderungen myogener
Strukturen, könnten sich nachfolgende Experimente mit der Frage der
Beeinflussung der für die Ausprägung horizontaler Myosepten und
Ausbildung typischer Somitenformen verantwortlichen pioneer cells
(Felsenfeld et al., 1991) beschäftigen. In dem Zusammenhang wäre die
Untersuchung einer Beeinflussung auf die Differenzierung langsamer
Muskelzellen hoch interessant, da pioneer cells nachweislich an deren
Entstehung beteiligt sind.
Anlehnend an die Resultate dieser Arbeit bleiben kardiale Veränderungen in
Hinblick auf die Auswirkung des atoh8-Gens auf die für die kardiale Fusion
verantwortlichen Gene weiterhin abzuklären. Auch die Untersuchung des
Einflusses auf Faktoren, welche an der embryonalen Abtrennung von Atrium
und Ventrikel und an der nach Eisenberg damit verbundenen Entwicklung
der Herzklappen beteiligt sind, erscheint sinnvoll. Darüber hinaus wäre eine
genaue Darstellung der Signalkaskade, die zur Beeinflussung der vmhc-
Genexpression durch den Transkriptionsfaktor atoh8 führt, überaus
interessant.
104
7. Literaturverzeichnis
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8. Anhang
A1. Stand-Alone-Unit.
Die Zebrafische werden zu je etwa 25 Fischen/ Box in einer konstruierten Anlage gehalten,
die aufgrund genauer Einhaltung bestimmter Wasserparamter und zirkadianer Rhythmik
eine artgerechte Haltung ermöglicht.
A2. Chemische Strukturformeln von Morpholino und DN A im Vergleich.
113
A3. Injektionsvorbereitungen.
Abgeschöpfte Embryonen werden entnommen, mittels E3-Medium in Schalen gespült und
zur Mikroinjektion unter dem Mikroskop auf eine Agarose-Gel Platte ausgerichtet (s. Abb. 3).
Das mittlere Foto zeigt einen Embryo im 4-Zell-Stadium; für eine Mikroinjektion ist der
Embryo in seiner Entwicklung bereits grenzwertig weit fortgeschritten.
Kreuztabelle
Injektion
keine Morpholino Gesamt
Anzahl 227 58 285 normal
% innerhalb von Injektion
98,3% 35,2% 72,0%
Anzahl 4 107 111
InSitu MyoD
veränderte Myotome % innerhalb von
Injektion 1,7% 64,8% 28,0%
Anzahl 231 165 396 Gesamt
% innerhalb von Injektion
100,0% 100,0% 100,0%
A4. Schematische Darstellung einer Vier-Felder-Tafe l.
Die Excel-Tabelle veranschaulicht die Konstruktion von Vier-Felder-Tafeln zur statistischen
Prüfung je zwei voneinander abhängiger Merkmale mittels Chi-Quadrat-Testungen und
anschließenden Odds-Ratio-Berechnungen. Die zu verwerfende Nullhypothese war bei den
Analysen stets die Unabhängigkeit des Auftretens von Veränderungen von der
Mikroinjektion.
114
Danksagung
Zuerst möchte ich mich bei der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität
Bochum bedanken, die eine Promotion im Rahmen einer Forschungsarbeit
ermöglicht hat.
Für ihre tatkräftige Unterstützung im Rahmen des strukturellen Aufbaus der
Studie, ihre außerordentlichen Hilfeleistungen und konstruktive Kritik, möchte
ich mich insbesondere bei Frau Prof. Dr. Brand-Saberi bedanken.
Auch Frau A. Conrad möchte ich für ihre Hilfe bei Terminkoordinationen
danken.
Ein weiterer Dank geht an Frau Dr. Chankiewitz, die besonders an der
Bereitstellung der eingesetzten Sonden beteiligt war und die Etablierung der
Zebrafischanlage und Tierhaltung koordiniert hat.
Ganz besonders danken möchte ich Frau U. Ritenberg, Frau M. Otto und
Frau S. Wulf für ihre intensive technische Unterstützung sowohl im Bereich
der Tierpflege als auch in der Anfertigung von Schnittpräparaten und in-situ-
Hybridisierungen.
Zuletzt möchte ich M. Breuer und Dr. N. Maricic für ihre Unterstützung
danken.
Vielen Dank!
115
Kevin Bockholt 18.06.1988
Angestrebte Tätigkeit
Arzt für Dermatologie
Berufserfahrung & Praktika
Praktisches Jahr 08.2012-12.2012 Dermatologie, Prof. Dr. Szeimies, Knappschaftskrankenhaus Recklinghausen 12.2012-04.2013 Innere Medizin, Dr. Kühne, Prosper- Hospital Recklinghausen 04.2013-07.2013 Chirurgie, PD. Dr. Jakschik, Prosper- Hospital Recklinghausen
Famulaturen 03.2010 Anatomie, Prof. Dr. Brand-Saberi, Ruhr-
Universität Bochum 08.2010 Plastische Chirurgie/ Dermatologie, Gachon University, Südkorea (Seoul) 09.2011 Allgemeinmedizin, Dr. Wilimzig,
allgemeinmedizinische Praxis Dorsten 03.2011 Orthopädie/ Rheumatologie, Tygerberg Hospital, Südafrika (Kapstadt)
Promotion seit 10.2010 Dissertation im Rahmen der Forschungsarbeit: „Influence of transcriptional factor Atoh8 on skeletal and cardiac muscle development of zebrafish“, Prof. Dr. Brand-Saberi, Abteilung für embryologische Anatomie der Ruhr-Universität Bochum 11.2011 Vortrag: „Atoh8-Knockdown and muscle development“
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02.2012 Poster: „Einfluss von Atoh8 auf die Muskelentwicklung“
Hochschule Schulbildung bes. Kenntnisse/ Interessen
Zusätzliche berufliche Erfahrungen 02.2010 Vorpräparator im Organanatomie Kurs, Ruhr-Universität Bochum
04.2010-06.2010 studentische Hilfskraft im Biochemie Praktikum 11.2010 Workshop: Chirurgie zum Mitmachen WS 2010/2011 English for Medical Students, Abschlussnote 1,3 2007-2013 Studium der Humanmedizin an der Ruhr- Universität Bochum 09.2009 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
(Physikum) mit der Gesamtnote „gut“
11.2013 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung mit der Gesamtnote “gut” bestanden
11.2013 Approbation als Arzt 1998-2007 Gymnasium Petrinum Dorsten,
(allg. Hochschulreife) Abiturnote 1,2
1994-1998 Albert-Schweitzer Grundschule Dorsten seit 2007 Stipendiat der Hans-Böckler Stiftung mit Studienstipendium 2008-2013 stellvertr. Stipendiatengruppensprecher Bochum und Ansprechpartner im Cluster Medizin 2007-2013 Jugendleiter der IGBCE-Ortsgruppe Hervest-Dorsten
