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Aus der Ambulatorischen und Geburtshilflichen Tierklinik
der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
angefertigt in der
Abteilung Veterinärmedizin des Landesbetriebes Hessisches Landeslabor,
Standort Gießen
Kulturmorphologische, biochemische und molekularbiologische Untersuchungen
zur Differenzierung Koagulase-negativer Staphylokokken, isoliert aus
Hälftegemelksproben von Ziegen und deren Bedeutung für die Eutergesundheit
Inaugural Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
durch die Veterinärmedizinische Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von
Andrea Ehrenberg
aus Marne
Leipzig, 2011
2
Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Dekan: Prof.Dr.UweTruyen
Betreuer: Prof.Dr. Axel Sobiraj
Gutachter: Prof.Dr. Axel Sobiraj, Universitätstierklinikum, Ambulatorische und
Geburtshilfliche Tierklinik, Veterinärmedizinische
Fakultät der Universität Leipzig
Prof.Dr. Axel Wehrend, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andro-
logie der Groß-und Kleintiere mit Tierärztlicher
Ambulanz, Fachbereich Veterinärmedizin,
Justus-Liebig-Universität Gießen
Tag der Verteidigung: 07.06.2011
3
1 Einleitung ................................................................................................................ 1
2 Literaturübersicht .................................................................................................... 2
2.1 Mastitis der Ziege .................................................................................................... 2
2.1.1 Allgemeines ............................................................................................................ 2
2.1.2 Ursachen der Mastitisentstehung............................................................................ 7
2.1.3 Erreger .................................................................................................................... 8
2.1.4 Epidemiologie ......................................................................................................... 9
2.1.5 Bekämpfung .......................................................................................................... 10
2.2 Koagulase-negative Staphylokokken .................................................................... 11
2.2.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Staphylococcus ................................ 11
2.2.2 Nomenklatur ......................................................................................................... 12
2.2.3 Erkrankungen im Überblick ................................................................................... 13
2.2.4 Diagnostik ............................................................................................................. 13
2.3 Koagulase-negative Staphylokokken als Mastitiserreger bei der Ziege ................ 17
2.4 Koagulase-negative Staphlokokken als lebensmittelhygienisches Risiko ............. 19
3 Tiere, Material und Methoden ............................................................................... 20
3.1 Untersuchte Ziegen ............................................................................................... 20
3.1.1 Herdengröße und Betriebsstruktur ........................................................................ 20
3.1.2 Melktechnik und Melkhygiene ............................................................................... 21
3.2 Untersuchungsmaterial ......................................................................................... 23
3.3 Methoden .............................................................................................................. 23
3.3.1 Probennahme ....................................................................................................... 23
3.3.2 Makroskopische Untersuchung ............................................................................. 24
3.3.3 Zytologische Untersuchung .................................................................................. 24
3.3.4 Bakteriologische Untersuchung ............................................................................ 24
3.3.5 Auswahl der Feldisolate ........................................................................................ 25
Inhalt
4
3.3.6 Referenzstämme ................................................................................................... 25
3.3.7 Differenzierung isolierter Koagulase-negativer Staphylokokken ........................... 26
3.3.7.1 Kulturmorphologie ................................................................................................. 26
3.3.7.2 Biochemische Untersuchung ................................................................................ 27
3.3.7.3 Untersuchung der in-vitro-Empfindlichkeiten gegenüber Antibiotika ..................... 27
3.3.7.4 Durchführung der t-DNA-PCR .............................................................................. 28
3.3.7.4.1 Aufbereitung der bakteriellen DNA ................................................................. 29
3.3.7.4.2 DNA-Replikation mit der PCR ........................................................................ 30
3.3.7.4.3 Elektrophorese ............................................................................................... 30
3.3.7.5 Identifizierung der Staphylokokken-Feldisolate ..................................................... 31
4 Ergebnisse ............................................................................................................ 32
4.1 Ergebnisse der makroskopischen und zytobakteriologischen
Untersuchung ....................................................................................................... 32
4.1.1 Visuelle Milchuntersuchung .................................................................................. 32
4.1.2 Vorkommenshäufigkeit von Mastitiserregern ........................................................ 32
4.1.3 Ergebnisse der Bestimmung des Gehaltes an somatischen Zellen ...................... 33
4.2 Ergebnisse der Differenzierung isolierter Koagulase-negativer Staphylokokken .. 36
4.2.1 Ergebnisse der kulturmorphologischen Untersuchung .......................................... 36
4.2.2 Ergebnisse der biochemischen Identifizierung ...................................................... 41
4.2.3 Ergebnisse der Identifizierung mittels unterschiedlicher Sensitivität gegenüber
Antibiotika ............................................................................................................. 42
4.2.4 Untersuchung der Kulturen mittels t-DNA-PCR .................................................... 45
4.3 Ergebnisse der Differenzierung der Koagulase-negativen Staphylokokken .......... 47
4.4 Differenzierte KNS-Spezies in Bezug zu Herkunft und Zellzahl und
Hälftendifferenz ..................................................................................................... 50
5 Diskussion ............................................................................................................ 57
5.1 Makroskopische und zytobakteriologische Untersuchung .................................... 57
5.2 Ergebnisse der verschiedenen Methoden zur Spezies-Differenzierung isolierter
Koagulase-negativer Staphylokokken ................................................................... 59
5.2.1 Kulturmorphologische Untersuchung .................................................................... 59
5.2.2 Untersuchung mit dem ID32 Staph Test ............................................................... 59
5
5.2.3 Identifizierung mittels Empfindlichkeiten gegenüber Antibiotika ............................ 61
5.2.4 Untersuchung der Proben mittels t-DNA-PCR ...................................................... 62
5.3 Ergebnisse der Differenzierung der Koagulase-negativen Staphylokokken .......... 63
5.4 Prävalenz einzelner Staphylokokken-Spezies innerhalb der einzelnen Betriebe .. 66
5.5 KNS-Spezies in Bezug zur Zellzahl und Hälftedifferenz ....................................... 69
5.6 Wiederholter Erregernachweis .............................................................................. 73
6 Zusammenfassung ............................................................................................... 74
7 Summary .............................................................................................................. 76
8 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 78
9 Anhang ................................................................................................................. 95
6
Übersicht der verwendeten Abkürzungen und Einheiten
A Adenin
Abb. Abbildung
ABG Antibiogramm
Aqua bidest. Aqua bidestillata
Aqua dest. Aqua destillata
bzw. beziehungsweise
BUN Bakteriologische Untersuchung negativ
C. Corynebacterium
C Cytosin ◦C Grad Celsius
d. h. das heißt
DIN Deutsches Institut für Normung
DNA Desoxyribonucleinsäure
dNTP Desoxynucleosidtriphosphat
EDTA Ethylenediaminetetraaceticacid
et al. et alii (und Mitarbeiter)
etc. et cetera
G Guanin
g Gramm
g Erdbeschleunigung
GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung
H hora (Stunde)
ILP Intergenic spacer length polymorphism
iU International Units
kbp Kilo-Basenpaare
kg Kilogramm
l Liter
log Logarhythmus
m milli (10-3)
mg Milligramm
ml Milliliter
Mio Million
min Minute
mm Millimeter
Mol Absolute Menge einer Substanz
mmol Millimol
n Anzahl
P. Pseudomonas
PCR Polymerase Chain Reaction
PFGE Pulsfeldgelelektrophorese
7
pH pondus Hydrogenium (Wasserstoffionenkonzentration)
RNA Ribonucleinsäure
sec. Sekunde
S. Staphylococcus
spp. species
Str. Streptococcus
taq Thermus aquaticus
T Thymin
TBE Tris-Borat-EDTA
tDNA Transfer DNA
TE Tris-EDTA
tRNA Transfer RNA
U Umdrehungen
UV Ultraviolett
V Volt
w/v weight/volume
z.B. zum Beispiel
% Prozent
< kleiner als
< kleiner als oder gleich
> größer als
> größer als oder gleich
°C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
8
Für Tillmann
und
unsere Töchter
Neele und Solveigh
In tiefer Liebe
1
1 Einleitung
Koagulase-negative Staphylokokken werden bei Mastitiden kleiner Wiederkäuer häufig
nachgewiesen. Dabei wird die Bedeutung einzelner Staphylokokkenspezies unterschied-
lich beurteilt. Ursache für diese zum Teil widersprüchlichen Bewertungen ist sicherlich im
ubiquitären Vorkommen dieser Mikroorganismen und in der damit verbundenen schwieri-
gen Abgrenzung gegenüber der Kontaminationsflora zu sehen.
Auswertungen auf der Grundlage einmaliger Untersuchungen von einzelnen Fällen klini-
scher oder subklinischer Mastitiden bei Schaf und Ziege sind im Hinblick auf die Aussage
über die ätiologische Bedeutung isolierter Staphylokokkenspezies problematisch.
Zudem erweist sich die Diagnose der subklinischen Mastitis bei der Ziege als besonders
schwierig, da im Gegensatz zum Rind der Gehalt an somatischen Zellen starken
physiologischen Schwankungen unterliegt. Eine Erhöhung der Zellzahl allein kann
deshalb nicht unbedingt als Hinweis auf das Vorliegen einer Mastitis gewertet werden.
Um detailliertere Informationen über die pathogene Bedeutung einzelner Spezies Koagu-
lase-negativer Staphylokokken bei der Mastitis der Ziege zu erhalten, wurde in den Jah-
ren 1997 und 1998 die Eutergesundheitssituation von 12 Milchziegenherden unter-
schiedlicher Größe beobachtet. Dazu sollten Hälftegemelksproben aller laktierenden
Tiere vorzugsweise wiederholt zytobakteriologisch untersucht werden. Darüber hinaus
sollten in einer der 12 Herden kontinuierlich Gesamtbestandsuntersuchungen während
der beiden Laktationsperioden des Untersuchungszeitraumes durchgeführt werden.
Zur Differenzierung der aus den antiseptisch entnommenen Hälftegemelksproben isolier-
ten Staphylokokken sollte neben herkömmlichen Untersuchungsverfahren auch ein
molekularbiologisches Verfahren (t-DNA-Polymerase-Kettenreaktion) auf seine Eignung
zur Speziesdifferenzierung Koagulase-negativer Staphylokokken bei der Ziegenmastitis
getestet werden.
Mit der Auswertung der Befunde soll ein Beitrag zur Differenzierung einzelner Spezies
Koagulase-negativer Staphylokokken und deren Bedeutung insbesondere bei der
subklinischen Mastitis der Ziege geleistet werden.
2
2 Literaturübersicht
2.1 Mastitis der Ziege
2.1.1 Allgemeines
Für die Beurteilung der Eutergesundheit der Ziege gibt es noch keine allgemeingültigen
Kriterien (KNAPPSTEIN et al., 2007).
Gemäß der INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION (IDF, 1987) ist die gesunde Milch-
drüse einer Kuh definiert als frei von erkennbarer Mastitis, Strichkanal-Kolonisation,
anderen krankhaften Veränderungen oder Verletzungen und als übereinstimmend mit
den allgemeingültigen Standards für Normalität. Gleiche, gesunde Viertel eines Euters
geben weitgehend gleiche Milchmengen von identischer Zusammensetzung. Dem
stehen folgende Definitionen und Einteilungen bezüglich der Euterentzündungen
gegenüber:
1. Mastitis: Die Mastitis ist eine entzündliche Reaktion der Milchdrüse.
2. Ursachen: Mastitiden werden nach der hauptsächlichen Ursache für die Entzündung
in infektiöse (kontagiöse), traumatische und toxische Euterentzündungen eingeteilt.
Infektiöse Mastitiden kommen am weitaus häufigsten vor. Nichtinfektiöse Mastitiden wer-
den auch als unspezifische Mastitiden bezeichnet.
3. Pathogenese und Pathologie: Das pathologisch-anatomische Bild der Euterentzün-
dung hängt in hohem Maße von ihrer Schwere und Dauer ab (akute oder chronische Ga-
laktophoritis, hämorrhagisch-nekrotisierende Mastitis usw.).Pathogene Mikroorganismen
dringen meist über den Strichkanal, d.h. galaktogen ins Euter ein. In selteneren Fällen
können bestimmte Mikroorganismen auf hämatogenem oder lymphogenem Weg
eindringen.
Dem galaktogenen Eindringen von Mikroorganismen können entzündliche Reaktionen
des Euters folgen. Diese führen unter anderem zu einer erhöhten Permeabilität im
entzündeten Gewebe. In der Folge ändert sich die Zusammensetzung der Milch in Be-
zug auf Natrium, Chlorid, Serumproteine, Enzyme, somatische Zellen und andere
Milchbestandteile. Mit zunehmender Schwere der Mastitis nähert sich die
Zusammensetzung des Eutersekretes der Zusammensetzung des Blutserums.
4. Schwere und Dauer: Als klinische Mastitis wird eine Euterentzündung bezeichnet,
wenn makroskopische Veränderungen in der Milch auftreten oder wenn palpatorische
Anomalien des Euters festgestellt werden. Bei der subklinischen Mastitis treten keine
ohne Hilfsmittel feststellbaren Veränderungen der Milch oder des Euters auf.
Die akute Euterentzündung ist durch ihren plötzlichen Beginn charakterisiert, während
für die chronische Mastitis die lange Dauer kennzeichnend ist.
Nach BOSTEDT UND DEDIÉ (1996) können klinisch spezielle Ausprägungen der
Ziegenmastitis festgestellt werden. Die Mastitis gangraenosa geht mit schwersten Allge-
meinstörungen einher, oft liegt das Tier fest (Mastitis paralytica). Das Euter weist die Ver-
änderungen einer akuten Entzündung auf. Zusätzlich treten blaue Areale der Euterhaut
auf, die im Gegensatz zur vermehrt warmen Umgebung kalt sind. Das Eutersekret ist mit
3
Flocken durchsetzt und rötlich gefärbt.
Die Mastitis parenchymatosa ist bezüglich der klinischen Symptomatik der o.g. Mastitis
gangraenosa ähnlich, jedoch findet sich keine Blaufärbung der Euterhaut.
Die Mastitis indurativa ist durch einen Rückgang der Milchleistung ohne grobsinnliche
Veränderung des Milchsekretes gekennzeichnet. Im weiteren Verlauf zeigen sich abhän-
gig vom Erreger neben der Erhöhung der Zellzahl in der Milch auch Veränderungen des
Eutersekretes.
Ebenfalls mit Milchrückgang sowie gräulich-wässrig-flockigem Milchsekret geht die
Mastitis catarrhalis einher.
Die Mastitis apostematosa ist durch schwerste Allgemeinstörungen gekennzeichnet. Im-
mer zeigen sich mit Eiter gefüllte Erhebungen der Euterhaut. Diese Eiterherde können
auch auf Gelenke und andere Organsysteme übergehen (SASSHOFER et al., 1987).
Bei der subklinischen Mastitis ist neben dem Nachweis von Mikroorganismen die
Beurteilung der Zellzahl (ZZ), d.h. des Gehaltes an somatischen Zellen in der Milch, das
zweite wesentliche Diagnostikum.
Die DEUTSCHE VETERINÄRMEDIZINISCHE GESELLSCHAFT (DVG 1994, 2002) defi-
niert in Anlehnung an die IDF (1967) die subklinische Mastitis folgendermaßen: „Subklini-
sche Mastitiden sind Entzündungen des Euters ohne äußerlich erkennbare Symptome:
Der Zellgehalt in der Milch ist jedoch erhöht; in zwei aus drei Untersuchungen (Proben-
intervall von einer Woche) können Mastitiserreger nachgewiesen werden; die chemische
Zusammensetzung der Milch ist verändert.“
Ziegenmilch ist durch einen hohen Gehalt an Cytoplasmatischen Partikeln (CP) gekenn-
zeichnet. Diese entstehen durch apokrine Sekretion der milchbildenden Drüsenzellen.
Die CP stellen kernlose Bestandteile dieser Drüsenzellen dar und stehen folglich nicht im
Zusammenhang mit einer Abwehrreaktion des Euters.Werden bei der Erfassung der
Zellzahl die Cytoplasmatischen Partikel (CP) mitgezählt, wie es z.B. bei der
Zellzahlzählung mittels Coulter Counter der Fall ist, so liegt die Zellzahl in der Mitte der
Laktation eutergesunder Ziegen bei 500 000 bis 1 000 000/ml. Da die hohe Zahl an CP
der Ziege insbesondere bei partikelzählenden Verfahren demzufolge eine Erkrankung
vortäuschen kann, sind nur solche Methoden, die ausschließlich die somatischen Zellen
erfassen, zur Mastitisdiagnostik der Ziege geeignet (DULIN et al., 1982). Hierzu eignet
sich z.B. die Zellzahldiagnostik mittels Fossomatic® (fluoreszenzoptische
Zellzahlbestimmung).
Die Angaben in der Literatur über den durchschnittlichen somatischen Zellgehalt der
Milch eutergesunder Ziegen differieren aus den oben genannten Gründen. Nach
KNAPPSTEIN et al. (2007) wird der Milchzellgehalt bei der Ziege zudem durch das
Handling im jeweiligen Betrieb, den bakteriologischen Befund der Euterhälften, die
Laktationsanzahl und den Laktationsmonat beeinflusst.
4
In Tabelle 1 folgen Literaturangaben zur mittleren Zellzahl auf Einzeltierebene, wobei alle
aufgeführten Autoren die Zellzahl mittels Fossomatic® ermittelten. Das arithmetische Mit-
tel ist der Durchschnitt der zu mittelnden Zahlen, wogegen es sich beim geometrischen
Mittel um die xte Wurzel aus dem Produkt der x zu mittelnden Zahlen handelt.
Tabelle 1. Literaturangaben zur mittleren Zellzahl eutergesunder Ziegen
(fluoreszenzoptische Zellzahlbestimmung mittels Fossomatic®)
Autoren Zellgehalt/ml arith-
metrisches Mittel
Zellgehalt/mlgeo-
metrisches Mittel
KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al., 1992 270 000
DE CREMOUX et al., 1995 272 000
HAHN et al., 1992 337 000
DULIN et al., 1982 360 000
DEUTZ et al., 1990 415 000
PERNTHANER,1991 420 000
KRAMER, 1995 537 000
SCHODER et al., 1993 300 000 – 600 000
POUTREL und LERONDELLE, 1983 614 000
PETTERSEN, 1981 690 000
SCHÜPPEL und SCHWOPE, 1999 1 000 000
ROGUINSKY et al., 1980 1 100 000
MCDOUGALL et al., 2002 1 490 000
SHELDRAKE et al., 1981 438 000 – 1 684 000
Nach DVG-Richtlinien (1994, 2002) ist bei Kühen der gleichzeitige Nachweis von
Mastitiserregern aus dem Euter in Verbindung mit einer erhöhten Zellzahl ein sicherer
Hinweis auf das Vorliegen eines entzündlichen Geschehens. Ebenso ist die
Vierteldifferenz der Zellgehalte eines Tieres ein geeignetes Kriterium zur Beurteilung der
Eutergesundheit (GOEBEL, 2007; GOEBEL et al., 2008; BELKE, 2009) bei Kühen.
Bei einer Entzündung des Euters erhöht sich der Gehalt an somatischen Zellen in der
Milch. Diese Zellen sind Ausdruck der lokalen Infektabwehr. Es handelt sich dabei vor-
nehmlich um neutrophile Granulozyten, die aus dem Blut emigriert sind. In geringerem
Umfang kommen desquamierte Epithelzellen des Eutergewebes vor.
Hinsichtlich des physiologischen Zellzahlgrenzwertes auf Einzeltierebene, bzw.
Viertelgemelksebene bei Kühen gilt ein Grenzwert von 100 000 Zellen/ml (HESS und
EGGER, 1969; REICHMUTH, 1975; DOGGWEILER und HESS, 1983, DVG, 1994,
2002). Man kann also davon ausgehen, dass ab einer Zellzahl von 100 000 Zellen/ml
eine entzündliche Reaktion des Kuheuters besteht. Da der geometrische Zellzahlmittel-
wert von Ziegenmilch sowohl bei einzelnen Ziegen (PETTERSEN, 1981) als auch in ver-
5
schiedenen Beständen (SHELDRAKE et al., 1981) sehr viel höheren Schwankungen un-
terliegt als der Zellgehalt der Kuhmilch, ist die Festlegung eines Grenzwertes für diese
Tierart schwierig. In einer Untersuchung von SCHÜPPEL und SCHWOPE (1999) konnte
kein Zusammenhang zwischen Zellgehalten in der Ziegenmilch und subklinischen
Mastitiden hergestellt werden. SMITH und ROGUINSKY (1977) hingegen schlagen
einen Grenzwert von 1 500.000 Zellen/ml vor. Zellzahlen jenseits dieses Wertes seien
als krankhaft anzusehen. DULIN et al. (1982) geben hierfür eine obere Grenze von 1,7
Mio Zellen/ml an. Die Ergebnisse von Studien von MCDOUGALL et al. (2002) und
LUENGO et al. (2004) zeigen eine signifikante Zellzahlerhöhung bei infizierten
Ziegeneutern. MCDOUGALL et al. (2001) halten die Zellzahl für die beste indirekte
Möglichkeit, eine Aussage über den bakteriologischen Status des Ziegeneuters zu
treffen. POUTREL und LERONDELLE (1983) sowie HAHN et al. (1992) empfehlen einen
Grenzwert von 1 Millionen Zellen/ml für Ziegenmilch.
Neben weiteren klinischen Parametern zur Überprüfung des Eutergesundheitsstatus und
der Schalmtestreaktion (SCHALM, 1960) wird der Vergleich der Zellgehalte beider Euter-
hälften auf Einzeltierebene empfohlen (PETTERSEN, 1981; POUTREL und
LERONDELLE, 1983; DEUTZ et al., 1990; SMITH und SHERMAN, 1994). Laut
PETTERSEN (1981) weist ein Unterschied im Schalmtestscore von > 2 zwischen den
beiden Euterhälften eines Individuums auf ein Mastitisgeschehen hin. POUTREL und
LERONDELLE (1983) weisen darauf hin, dass ein gesundes Ziegeneuter in beiden
Euterhälften ähnliche Zellgehalte aufweist, während eine Erhöhung der Zellzahl in einer
Hälfte eines Euters auf einen entzündlichen Vorgang hinweist. BINDER (1986) verglich
die Zellzahlverläufe beider Hälften eines Euters. Demnach traten Schwankungen im Leu-
kozytengehalt auch in der nicht erkrankten Euterhälfte auf. Auch nach NESBAKKEN
(1978) und DULIN et al. (1982) hat die entzündete Euterhälfte Einfluss auf den
Gesamtzellgehalt und das Differentialzellbild der anderen Euterhälfte.
KLOPPERT et al. (2000) und EHRENBERG et al. (2002) stellten ebenfalls fest, dass der
Vergleich der Zellzahl zwischen den beiden Hälften eines Individuums ein geeignetes
Kriterium für die Mastitisdiagnostik bei der Ziege ist.
Da der exponentielle Zellzahlanstieg in der Ziegenmilch wesentlich ausgeprägter als in
der Kuhmilch ist, wurden die Zellzahlen nach einer von KLOPPERT et al. (2000) entwi-
ckelten Transformationsformel logarithmisch transformiert (Linear Somatic Cell Score,
SCS). Wenn sich bei der Kuh die Zellzahl verdoppelt, entspricht dies einer Vervierfa-
chung der Zellzahl bei der Ziege. Die Entwicklung der Transformationsformel für die
Ziege erfolgte in Anlehnung an den Linear Somatic Cell Score der Kuh (RENEAU, 1986).
Die für die Ziege entwickelte Transformationsformel lautet:
SCSZiege = log4 (Zellzahl/100000) + 2.
Tabelle 2 stellt den Zellzahlanstieg bei der Kuh im Vergleich zum Zellzahlanstieg bei der
Ziege dar.
6
Tabelle 2. Zellzahlklassen 1 bis 7 bei der Kuh und bei der Ziege gemäß
tierartspezifischer logarithmischer Transformation1)(KLOPPERT et al., 2000)
Intervall der
transformierten Zahlen
Intervall der
originalen Zahlen in Tausend
Klasse Kuh Ziege
1 [...,1) [0, 25) [0, 25)
2 [1, 2) [25, 50) [25, 100)
3 [2, 3) [50, 100) [100, 400)
4 [3, 4) [100, 200) [400, 1600)
5 [4, 5) [200, 400) [1600, 6400)
6 [5, 6) [400, 800) [6400, 25600)
7 [6, 7) [800, 1600) [25600, 102400)
1) SCSKuh = log2 (Zellzahl/100000) + 3; SCSZiege = log4 (Zellzahl/100000) + 2
Ausgehend von einer Starterklasse lassen sich bei der Ziege Zellzahlklassen bilden, indem die obere Klassengrenze jeweils
vervierfacht wird. Nach der Transformation folgten die Zellzahlen des Untersuchungsmaterials der Normalverteilung. Die Prüfung der
transformierten Ziegenzellzahlen (SCSZiege) auf Normalverteilung erfolgte nach DUFNER et al. (1992) mit dem Test von SHAPIRO
und WILK (Testniveau 5 %).
Bei der statistischen Auswertung der zytobakteriologischen Ergebnisse zeigte sich, dass
mit steigender Zellzahl die Wahrscheinlichkeit für einen Erregernachweis nur gering
zunimmt. Demgegenüber ließ sich jedoch aufzeigen, dass mit zunehmender
Zellzahldifferenz zwischen rechter und linker Euterhälfte eines Tieres die
Wahrscheinlichkeit für einen Erregernachweis auf der Hälfte mit der höheren Zellzahl
deutlich zunimmt.
Die Chance für einen positiven Erregernachweis bei gegebener (transformierter)
Zellzahldifferenz ließ sich auch mittels Odds Ratio beschreiben. Es wurden die
möglichen Differenzen mit dem Fall verglichen, dass beide Euterhälften die gleichen
Zellzahlen aufwiesen. Bei einem Wert Xdiff von 2 beispielsweise erhöht sich die Chance
eines Erregernachweises um den Faktor 9,4, bei vier um den Faktor 87,9 im Vergleich zu
den Fällen, bei denen in beiden Hälften gleiche Zellzahlen auftreten. Schon bei einer
Differenz von 1 erhöht sich die Chance für einen Erregernachweis um das Dreifache
(Tabelle 3). Es zeigte sich, dass, unabhängig vom Zellzahlniveau, bei einer deutlichen
Zellzahldifferenz zwischen den Euterhälften eines Tieres, die Chance für den Nachweis
eines Mastitiserregers hoch war.
7
Tabelle 3. Odds Ratios (OR) bezüglich Zellzahldifferenz und Erregernachweis bei
Ziegen (KLOPPERT et al., 2000)
OR (1,0) OR (2,0) OR (3,0) OR (4,0)
3,1 9,4 28,7 87,9
2.1.2 Ursachen der Mastitisentstehung
Die Milchdrüse ist ein stoffwechselaktives Organ, das über sein Gangsystem mit der
Tierumgebung in Verbindung steht. Diese Verbindung wird beim Milchentzug durch den
Menschen noch intensiviert. Durch die Erweiterung des Strichkanals beim Melken haben
Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, einen leichteren Zugang zum Euter. Die
anatomische Lage des Euters begünstigt zudem Verschmutzung und Traumen.
Besonders Ziegen in ausschließlicher Stallhaltung erleiden häufig Euterverletzungen, die
wiederum die Grundlage für Euterinfektionen sein können. Durch ihre extreme
Laktationsleistung im Verhältnis zum Körpergewicht ist die Ziege anfällig für Störungen
der Eutersekretion (BOSTEDT und DEDIÉ, 1996). Keime können prinzipiell von
saugenden Lämmern, Melkmaschinen, den Händen des Melkers, der Einstreu, etc. auf
das Euter übertragen werden.
8
2.1.3 Erreger
In Tabelle 4 werden potenzielle Erreger von Ziegenmastitiden dargestellt.
Tabelle 4. Mastitiserreger bei der Ziege
Mastitiserreger
Bakterien:
Staphylococcus. aureus1)
Koagulase-negative Staphylokokken2)
Streptococcus (Str.) agalactiae1)
Str. dysgalactiae 1)
Str. pyogenes1)
Str. uberis1)
Str. zooepidemicus1)
Escherichia coli 1)
Klebsiella pneumoniae1)
Corynebacterium(C.) ovis3)
C. pyogenes1) *
C. pseudotuberculosis3)
Brucella (B.) melitensis1)
B.abortus1)
Listeria monocytogenes2)
Mycobacterium (M.)bovis1)
M. tuberculosis1)
M.avium1)
Mannheimia haemolytica1)
Nocardia3)
Pseudomonas(P.) aeruginosa1)
P. pseudomallei4)
Yersinia pseudotuberculosis5)
Mykoplasmen:
Mycoplasma (M.) agalactiae1)
M. arginini8)
M. putrefaciens1)
M. mycoides subsp. capri1)
M. capricolum3)
M. mycoides3)
Hefepilze:
Candida-Spezies3)
Cyptococcus neoformans6)
Rhodotorula glutinis7)
Viren:
CAE-Virus (Caprine Arthrititis-
Encephalitis)3)
Andere:
Algen3)
1) TRÁVNICEK und FEDERIC,
2) BERGONIER et al., 2003
3) BOSTEDT und DEDIÉ, 1996
7
4) THOMAS et al., 1988
5) JONES, 1982
6) ALJABURI und KALRA, 1985
7) JAND und DHILLON, 1975
8) PRASAD et al., 1985
*Heute: Arcanobacterium pyogenes
9
Mastitiserreger können in major und minor pathogens unterteilt werden, abhängig vom
Schweregrad der Veränderung der physiologischen Zusammensetzung der Milch bzw.
der Höhe des Zellzahlanstiegs. Weiterhin werden Mastitiserreger abhängig von ihrem
natürlichen Reservoir in euter- bzw. umweltassoziierte Erreger unterschieden. Beim Rind
zählen zu den euterassoziierten majorpathogenen Erregern Streptococcus (Str.)
agalactiae und Staphylococcus (S.) aureus. Als umweltassoziierte Majorpathogene
gelten die Äskulin-positiven Streptokokken (Str. uberis, Str. parauberis, Enterokokken)
und Coliforme Keime sowie A. pyogenes, während Koagulase-negative Staphylokokken
(KNS), Corynebakterien und aerobe Bazillen zu den minorpathogenen Erregern gehören
(RÖDER, 1985; KLOPPERT et al., 2000).
2.1.4 Epidemiologie
In Gebieten, die frei sind von durch Mykoplasmen verursachte Mastitiden, wird die
Mastitis der Ziege am häufigsten durch S. aureus hervorgerufen. Eine S. aureus-
Infektion kann subklinisch oder klinisch oder akut bis chronisch verlaufen (SMITH und
SHERMAN, 1994). Die akute klinische S. aureus-Mastitis der Ziege ist oftmals
katarrhalisch oder auch gangränös. S. aureus zählt bei der Ziege zu den wichtigsten
Erregern akuter Mastitiden (SMITH und ROGUINSKY, 1977; ROGUINSKY et al, 1980;
SHELDRAKE et al., 1981), während der Erreger bei der Kuh vorwiegend chronische
subklinische Mastitiden hervorruft (BLOBEL und SCHLIESSER 1994).
Koagulase-negative Staphylokokken zählen zu den umweltassoziierten Mastitiserregern
(SCHUKKEN et al., 1988). MANSER (1986) untersuchte 5 Ziegenherden mit klinisch
unauffälligen Euterbefunden. Bei 80% der bakteriologisch positiven Milchproben wurden
KNS nachgewiesen. In allen 5 untersuchten Herden waren KNS nachweisbar. Die
geometrischen Zellzahlmittelwerte von KNS-positiven, bzw. -negativen Gemelken
unterschieden sich nur in einer Herde signifikant.
In einer Studie aus Kalifornien wurden bei der Untersuchung von über 2000 Milchziegen
bei 17,5% der Tiere KNS aus der Milch isoliert (EAST et al., 1987).
RYAN und GREENWOOD (1990) fanden bei der Untersuchung von 4 australischen
Ziegenherden bei 13,3% der untersuchtenHälftegemelksproben KNS, während in einer
anderen australischen Studie keine KNS gefunden wurden (CHUBB und ORCHARD,
1985). Eine Untersuchung von TOMITA et al. (2003) wies in 63,5 % der bakteriell
infizierten Euterhälften KNS nach. GAUCHER et al. (2003) wiesen in 75% aller
bakteriologisch positiven Milchproben bei Ziegen KNS nach.
SCHAEREN und MAURER (2006) untersuchten den Eutergesundheitsstatus in 3
Ziegenherden im Verlauf eines Jahres. In 17,3 % der insgesamt 2152 untersuchten
Hälftegemelksproben wurden KNS festgestellt, die mit Abstand die am häufigsten
nachgewiesenen Erreger waren. Die Autoren konnten, mit Ausnahme von S. aureus,
keinen deutlichen Zusammenhang zwischen dem Nachweis von Erregern und einer
Zellzahlerhöhung feststellen.
10
Euterinfektionen mit Streptococcus agalactiae werden bei der Ziege nur sporadisch
nachgewiesen (SMITH und SHERMAN, 1994). Andere Streptokokkenspezies sind
ebenfalls nur selten im Euter von Ziegen nachweisbar. Ein seuchenhaftes Auftreten von
Mastitiden in einer Ziegenherde, hervorgerufen durch Streptococcus zooepidemicus, ist
von NESBAKKEN (1975) beschrieben worden. Dieses Mastitisgeschehenwar durch
schwerwiegende hygienische Mängel begünstigt worden.
2.1.5 Bekämpfung
Die Bekämpfung der Mastitis der Ziege richtet sich nach deren Ursache. Bevor eine
medikamentöse Therapie ins Auge gefasst wird, sollten mastitisbegünstigende Faktoren
beseitigt werden. Die Umgebung der Ziege, besonders die Liegefläche, sollte sauber und
trocken sein. Das Stallklima sollte hell und luftig sein. Bei ganzjähriger Stallhaltung soll-
ten die Tiere enthornt und die Klauen regelmäßig beschnitten werden, um die
Verletzungsgefahr insbesondere für das Euter zu minimieren (SMITH und ROGUINSKY,
1977).
Einen besonderen Schwerpunkt der Mastitsprophylaxe und -bekämpfung stellt die
Melkarbeit einschließlich der Melkhygiene dar. Das Reservoir für die wichtigsten
Mastitiserreger ist die Milchdrüse. Kontagiöse Erreger werden mit der Milch ausgeschie-
den und können über die Hand des Melkers, mehrfach benutzte Reinigungstücher oder
das Melkzeug übertragen werden. Zur Infektionsprophylaxe sollte das Euter unmittelbar
nach dem Milchentzug mit einer desinfizierenden Lösung behandelt werden
(Zitzendipping). Zur Verhinderung der Erregerausbreitung müssen kranke und
krankheitsverdächtige Tiere zuletzt gemolken werden. Tiere mit chronischer,
therapieresistenter Mastitis sollten frühzeitig aus dem Bestand entfernt werden
(DVG,1994, 2002).
Es hat sich gezeigt, dass eine antibiotische Behandlung des Ziegeneuters während der
Trockenstehphase zwei Drittel aller Staphylokokken-bedingten Infektionen eliminieren
kann (SMITH und ROGUINSKY, 1977). Diese Maßnahme sollte in Problemherden gene-
rell oder zumindest bei Einzeltieren mit Mastitisanamnese in der vorangegangenen
Laktation durchgeführt werden.
Beim Nachweis viraler Mastitiserreger wie dem Caprinen Arthritis-Encephalitis-Virus
(CAE) oder selteneren bakteriellen Erregern wie Mykoplasmen, Mykobakterien, Arcano-
bacteriumpyogenes etc. ist eine Therapie wenig erfolgversprechend. Aus Gründen der
Bestandsprophylaxe sollte das betroffene Tier gekeult werden.
Durch S. aureus verursachte Mastitiden sind schwer therapierbar, da der Erreger in
Mikroabszessen im Eutergewebe persistieren kann (SMITH und SHERMAN, 1994) und
dann einer antibiotischen Therapie sehr schwer bis gar nicht zugänglich ist. Auch die
Nachweisbarkeit ist schwierig, da S. aureus intermittierend ausgeschieden wird.
ADEGOKE (1981) isolierte aus Nasen- und Augenabstrichen von Ziegen Staphylokok-
ken, die er auf Resistenzen gegenüber verschiedenen Antiinfektiva untersuchte. Er wies
11
auf die Wichtigkeit einer in-vitro Resistenzprüfung hin, welche einer Therapie von
Staphylokokken-Infektionen vorgeschaltet sein sollte.
2.2 Koagulase-negative Staphylokokken
2.2.1 Taxonomie und Eigenschaften der Gattung Staphylococcus
Die Gattung Staphylococcus (S.) gehört zusammen mit den Gattungen Micrococcus,
Stomatococcus und Planococcus zur Familie der Micrococcaceae (SCHLEIFER, 1986).
Staphylokokken sind unbewegliche, grampositive und nicht sporenbildende Kugelbakte-
rien. Sie sind fakultativ anaerob, und die meisten Spezies können carotinoide Pigmente
aufbauen. Unter anaeroben Bedingungen wird Glukose zu D- und/oder L-Milchsäure
abgebaut. Staphylokokken sind überwiegend gegenüber dem antimikrobiellen Enzym
Lysostaphin empfindlich, aber Lysozym-resistent.
Es ist von diagnostischer Bedeutung, besonders Spezies der Gattung Micrococcus von
Staphylokokken abzugrenzen (SCHLEIFER, 1986). Im Gegensatz zu den Staphylokok-
ken können Mikrokokken keine Glukose zu D- und/oder L-Milchsäure im anaeroben Mi-
lieu abbauen, Ausnahmen bilden hier jedoch die Arten Staphylococcus saprophyticus,
Staphylococcus cohnii, Staphyococcus xylosus und Staphylococcus sciuri. Diese Sta-
phylokokken-Spezies können unter o.g. Wachstumsbedingungen ebenfalls keine Glu-
kose zu Säure fermentieren.
Bei den Mikrokokken gibt es wiederum wenige Stämme, die ausnahmsweise Milchsäure
bilden. Diese atypisch reagierenden Stämme können zu falschen Identifikationen führen.
Zur sicheren Abgrenzung der beiden Gattungen voneinander kann das Verhalten
gegenüber Lysostaphin herangezogen werden:
Staphylokokken werden unter Einwirkung von Lysostaphin aufgelöst, Mikrokokken hinge-
gen nicht (SCHLEIFER, 1986). Lysostaphin greift Glycyl-Glycin-Peptid-Bindungen an, die
in der Zellwand von Staphylokokken enthalten sind.
Nach FALK und GUERING (1983) können auch Bacitracin oder Erythromycin zur
Differenzierung von Mikrokokken und Staphylokokken relativ einfach eingesetzt werden.
Staphylokokken sind im Allgemeinen Bacitracin- und Erythromycin-resistent. Um das
Wachstum von Mikrokokken zu unterbinden, kann z.B. ein Selektivnährboden unter Zu-
satz von 0,4 µg Erythromycin pro ml Medium verwendet werden (BLOBEL und
SCHLIESSER, 1994).
Für die taxonomische Einteilung ist die Untersuchung der bakteriellen DNA hilfreich. Sta-
phylokokken weisen einen geringeren Guanin- und Cytosin-Gehalt ihrer DNA auf als
Mikrokokken. Folglich sind beide Gattungen nicht miteinander verwandt (BLOBEL und
SCHLIESSER, 1994).
Auch gegenüber Streptokokken können Staphylokokken relativ einfach abgegrenzt wer-
den. Morphologisch wachsen Staphylokokken auf einer Blutagarplatte „stecknadelkopf-
groß“, während die Kolonien von Streptokokken „Stecknadelstichgröße“ aufweisen.
Mikroskopisch zeigen sich Staphylokokken rund und traubenförmig, während Streptokok-
12
ken von ovoider Form sind und stärker in Ketten angeordnet sind (BLOBEL und
SCHLIESSER,1994).
Nahezu immer reagieren Streptokokken Katalase-negativ, während Staphylokokken
gewöhnlicherweise Katalase-positiv sind (FACKLAM und CAREY, 1985). Um atypisch
reagierende Bakterienisolate zu identifizieren, kann man sich des Benzidin-Tests bedie-
nen (DEIBEL und EVANS, 1960). DEIBEL und EVANS zufolge sind Streptokokken
Benzidin-negativ, während Staphylokokken hingegen Benzidin-positiv reagieren.
2.2.2 Nomenklatur
Staphylokokken werden in zahlreiche Arten unterschieden (BLOBEL und SCHLIESSER,
1994). Der derzeitige Wissensstand (März 2010) umfasst 66 Arten der Gattung Staphylo-
coccus. Die aktuelle Nomenklatur der Staphylokokkenspezies ist in Tabelle 5 (Anhang) in
alphabetischer Reihenfolge mit Autoren der Erst- bzw. Neubeschreibungen aufgeführt
(EUZÉBY, 2007). Weiterhin kann die aktuelle Nomenklatur im Internet unter
http.//www.bacterio.cict.fr/s/staphylococcus.html abgerufen werden.
KLOOS und SCHLEIFER (1986) differenzierten verschiedene Staphylokokkenarten an-
hand ihrer Zellwandzusammensetzung, der Koloniemorphologie, der Enzymaktivitäten,
der Bildung von Säure aus Kohlenhydraten, der Entstehung verschiedener Abbaupro-
dukte aus Glukose, der Antibiotikaresistenzen, des Nährstoffbedarfs, der Zusammenset-
zung der zellulären Fettsäuren, des Sauerstoffbedarfs und der Pha-genempfindlichkeit.
Die Autoren wiesen außerdem mit molekularbiologischen Untersuchungen nach, dass
alle Arten der Gattung Staphylococcus untereinander verwandt sind.
Aufgrund der unterschiedlichen Ausprägung der phänotypischen Merkmale und des
DNA-Verwandtschaftsgrades konnten nach BLOBEL und SCHLIESSER (1994) die da-
mals bekannten Staphylokokken-Arten in insgesamt 4 Gruppen aufgeteilt werden:
S. epidermidis-Gruppe: S. epidermidis, S. capitis, S. warneri, S. haemolyticus, S. homi-
nis, S. saccharolyticus
S. saprophyticus-Gruppe: S. saprophyticus, S. cohnii, S. xylosus
S. simulans-Gruppe: S. simulans, S. carnosus
S. sciuri-Gruppe: S. sciuri, S. lentus
S. aureus, S. auricularis, S. intermedius, S. hyicus und S. caseolyticus können in diese
oben genannten Gruppen nicht eingeordnet werden.
Ein weiteres wichtiges Merkmal zur Einteilung der Staphylokokken-Arten ist ihre Fähig-
keit, das Enzym Koagulase zu bilden. Insbesondere zur Abgrenzung vonS. aureus ist die
Koagulase-Reaktion von Bedeutung (BINDER, 1986). Beim Koagulase-Test wird ein
Tropfen Kaninchen-Plasma mit einer zu überprüfenden Bakterienkolonie verrieben. Ist
anschließend eine Verklumpung zu beobachten, ist das Bakterium als Koagulase-positiv
anzusprechen, bleibt die Verklumpung aus, ist das Testergebnis Koagulase-negativ.
13
Demzufolge werden Staphylokokken in Koagulase-positiv und Koagulase-negativ unter-
teilt. Einige Spezies können sowohl Koagulase-positiv als auch Koagulase-negativ
reagieren. Diese werden als Koagulase-variable Staphylokokken bezeichnet. In Tabelle 6
im Anhang wird diese Einteilung dargestellt.
Die Einteilung in Koagulase-positive und Koagulase-negative Staphylokokken wird heute
nicht nur als taxonomisches Merkmal gesehen, sondern ist gleichzeitig ein Kriterium für
die Pathogenität der verschiedenen Staphylokokken-Arten. Die in Tabelle 6 (Anhang)
genannten Koagulase-positiven Spezies sind allesamt Erreger von eitrigen
Infektionskrankheiten bei Menschen und Tieren (BLOBEL und SCHLIESSER, 1994).
2.2.3 Erkrankungen im Überblick
Die verschiedenen KNS-Arten haben unterschiedliche klinische Bedeutung in der
Veterinärmedizin. In Tabelle 7 im Anhang sind KNS-Spezies, die auch bei Ziegen
nachgewiesenwerden konnten, nach Herkunft und Pathogenität für Mensch und Tier
aufgeführt (BLOBEL und SCHLIESSER, 1994).
2.2.4 Diagnostik
Nach BLOBEL und SCHLIESSER (1994) ermöglicht die Untersuchung der Kulturmor-
phologie schon bei Betrachtung der Kulturen spezifische Wachstumseigenschaften von
KNS-Spezies zu erkennen. Diese Wachstumseigenschaften können zu deren Identifizie-
rung herangezogen werden.
Die auf Blutagar angezüchteten Staphylokokken bilden nach ca. 20 Stunden Bebrütung
bei 37°C glatte, gewölbte und undurchsichtigeKolonien, die einen Durchmesser von
1-6 mm haben. Sie sind aufgrund ihrer Größe gut von Streptokokkenkolonien zu unter-
scheiden, da Letztere wesentlich kleiner sind.
Viele Staphylokokkenarten bilden ein goldgelbes Pigment, besonders die Arten S.aureus
und S. chromogenes. Auch andere Staphylokokkenarten bilden Pigment, wie z.B. S.
haemolyticus, S. saprophyticus und S. sciuri, diese jedoch nur sporadisch. Eine
Differenzierung allein auf Grundlage der Kolonienpigmentierung ist demnach nicht
möglich (BLOBEL und SCHLIESSER, 1994).
Weiterhin kann auf Blutagar die Bildung von Hämolysinen beobachtet werden. Neben S.
aureus und S. intermedius, wo die Hämolyse einen wichtigen diagnostischen Hinweis
liefert, haben auch S. epidermidis, S. haemolyticus, S.simulans und S. warneri die
Fähigkeit zur Hämolyse. Jedoch lässt sich diese Fähigkeit bei den zuletzt genannten
Arten lediglich eher selten und nicht so stark ausgeprägt beobachten, so dass auch hier
die Beurteilung des Hämolysevermögens nicht zur Spezies-Diagnose ausreicht
(BLOBEL und SCHLIESSER, 1994).
Nach BISPING und AMTSBERG (1988) können bei einzelnen Staphylokokken-Spezies
Besonderheiten des kulturellen Wachstums unterschieden werden. S. hyicus wächst auf
14
Blutagar in weißen, anhämolysierenden Kolonien. S. epidermidis wächst auf vorgenann-
ten Nährböden in kleinen, weißen, selten gelb bis orange pigmentierten, leicht granulier-
ten Kolonien. S. saprophyticus bildet glatte, konvexe, weiße oder auch gelb-orange Kolo-
nien.
Tabelle 8 im Anhang stellt die Wachstumseigenschaften der Staphylokokken-Arten nach
BLOBEL und SCHLIESSER (1994) dar.
Um die Identifizierung verschiedener KNS zu erleichtern, ist es empfehlenswert, die
KNS-Isolate zunächst nach ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Antibiotikum Novobio-
cin in zwei Gruppen einzuteilen. Diese primäre Einteilung scheint auch für Identifizierung
von Mastitis-Isolaten der Ziege wichtig zu sein. Nach einer Untersuchung von
DEINHOFER und PERNTHANER (1993) sind Novobiocin-empfindliche Staphylokokken
potenziell euterpathogen für Ziegen. Die Autoren wiesen bei Infektionen des Euters mit
den Novobiocin-empfindlichen Stapylokokken-Spezies S. lugdunensis, S.chromogenes,
S. warneri, S. epidermidis und S. simulans eine Erhöhung der somatischen Zellen in der
Milch nach. Auch BEDIDI-MADANI et al. (1992) betonen die Notwendigkeit dieses Tests
für die orientierende taxonomische Einteilung von KNS tierischer Herkunft.
In Tabelle 9 werden die für Ziegen relevanten Novobiocin-empfindlichen KNS-Spezies
den Novobiocin-resistenten gegenübergestellt.
Tabelle 9. Einteilung von KNS nach ihrer Empfindlichkeit gegenüber
Novobiocin (BLOBEL und SCHLIESSER, 1994*)
Novobiocin-empfindlich Novobiocin-resistent
S. auricularis S. arlettae
S. capitis S. cohnii
S. caprae S. kloosii
S. chromogenes S. lentus
S. epidermidis S. saprophyticus
S. haemolyticus S. sciuri
S. hominis S. xylosus
S. lugdunensis S. gallinarum
S. schleiferi
S. simulans
S. warneri
*(KLOOS und SCHLEIFER, 1986; SCHLEIFER et al., 1984; BANNERMANN und KLOOS, 1991; HAJEK et al., 1986; KLOOS und
WOLFSHOHL, 1991; IGIMI et al., 1989; FRENEY et al., 1988; HAJEK et al., 1992; TANASUPAWAT et al, 1992 in: BLOBEL und
SCHLIESSER, 1994)
15
BLOBEL und SCHLIESSER (1994) empfehlen die Differenzierung unterschiedlicher
KNS-Spezies aufgrund folgender Merkmale:
1. Koloniegröße
2. Pigmentierung (KLOOS und SCHLEIFER 1975, 1975a)
3. „Clumping-Faktor“: Verklumpung von Staphylokokken-Kulturen
mitKaninchen- oder Humanplasma
4. Hämolyse
5. Oxidase-Test: Nachweis von Cytochrom C zur Abgrenzung von
Staphylokokken und Mikrokokken
6. Urease-Test
7. Thermonuclease-Nachweis
8. Acetoin-Nachweis
9. Nitratreduktion
10. Phosphatase-Aktivitäten
11. Säurebildung aus Kohlenhydraten
Um die Differenzierung von KNS für die Praxis durchführbar zu machen, entwickelten
DEVRIESE et al. (1994) ein vereinfachtes Schema, das auf biochemischen Reaktionen
und der Empfindlichkeitsprüfung gegenüber Antibiotika beruht (Tabelle 10).
Tabelle 10. Differenzierung von KNS aus Mastitismilch von Kühen (DEVRIESE et
al., 1994)
Spezies DNase Protease Novobiocin Desferoxamin Fosfomycin
S. hyicus + + S R S
S. chromogenes W + S R S
S. simulans - -/w S R S
S. warneri/
S. hämolyticus
- -/w S R R
S. epidermidis - -/w S S V
S. hominis - -/w S S R
Andere* -/w -/w R R V
W: weak, schwache Reaktion
V: variable Empfindlichkeit
* andere Novobiocin-resistente Spezies
S: sensibel
R: resistent
Zur Differenzierung mittels Antibiotikaempfindlichkeiten gibt JARLOV (1999) zu beden-
ken, dass Bakterien ihre Sensibilität gegenüber bestimmten antibiotischen Substanzen
ändern können. Sie können sowohl Resistenzen gegenüber zahreichen Antibiotika ent-
wickeln als auch resistenzbestimmende Plasmide verlieren und damit wieder empfindlich
16
gegenüber einem ehemals wirkungslosen Antibiotikum werden. Aus diesem Grund
könnte es bei der Bakterienidentifizierung mittels in-vitro Resistenztestung zu nicht rep-
roduzierbaren Ergebnissen kommen.
Systeme zur biochemischen Differenzierung von KNS-Spezies werden von kommerziel-
len Anbietern zur Verfügung gestellt. KLOOS und WOLFSHOHL (1982) und DEVRIESE
et al. (1985) setzten das API- STAPH System zur Identifizierung von KNS ein. In einer
Untersuchung von VERNOZY et al. (1994) wird ein Novobiocin-empfindliches Isolat mit-
tels ID32 STAPH System als S. warneri identifiziert, während eine Untersuchung mit
dem API-STAPH IDENT System S. xylosus ergibt. Auch BEDIDI-MADANI et al. (1992)
stellten unterschiedliche Resultate bei Verwendung verschiedener Identifikations-Sys-
teme (API-STAPH und ATB 32 STAPH) fest. In einer Studie von DEINHOFER und
PERNTHANER (1993) konnten 87% der untersuchten Stämme aus Schaf- und Ziegen-
milchen eindeutig mit dem ATB 32 STAPH-Test identifiziert werden. HARVEY und
GILMOUR (1988) verwendeten zur Identifizierung von Staphylokokken aus Ziegenmilch
unter anderem das API-STAPH System, welches S. caprae jedoch nicht erkennen
konnte und S. chromogenes fehlerhaft als S. hyicus spp. hyicus identifizierte.
MATTHEWS et al. (1990) verglichen das API Staph-Trac System mit dem Vitec Gram-
Positive Identification System (GPI). Das API -Staph-Trac System identifizierte 25% der
S. hämolyticus-Isolate und 100% der S. aureus-, S. capitis-, S. cohnii-, S. epidermidis-,
S. saprophyticus- und S. xylosus-Isolate richtig. S. chromogenes und S. simulans wur-
den jedoch fälschlich als S. intermedius interpretiert.
Tabelle 11 im Anhang stellt in der Literatur beschriebene Verfahren zur Identifizierung
von Koagulase-negativen Staphylokokken in einer Übersicht dar.
Tabelle 12 (Anhang) stellt Literaturangaben zur Antibiotikaempfindlichkeit Koagulase-
negativer Staphylokokken in einer Übersicht dar.
Darüber hinaus können Staphylokokkenstämme anhand des Nachweises speziesspezi-
fischer Gensequenzen mittels der Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reac-
tion, PCR) identifiziert werden. In einer Untersuchung von DE BUYSER et al. (1992)
werden ribosomale RNA-Sequenzen (16S rRNA) zur Identifikation verschiedener Sta-
phylokokken-Spezies genutzt. Es zeigte sich, dass diese Methode geeignet ist, gerade
bei Isolaten von Staphylokokken, die mit herkömmlichen Methoden nur unsicher einzug-
renzen sind, sichere Ergebnisse zu erhalten.
MATTHEWS (1994) entwickelte mit dem sogenannten DNA-Fingerprintingmittels PCR
ein Schema von DNA-Fragmenten der einzelnen Staphylokokken-Spezies. Anhand der
reproduzierbaren, typischen Bandenverläufe, die mit genetischem Material von
Referenzstämmen von Staphylokokken-Spezies erstellt wurden, konnte ein spezifisches
Profil einer jeden Staphylokokken-Spezies erarbeitet werden. Anschließend wurden
Staphylokokken-Isolate, die in boviner Mastitismilch gefunden wurden, mittels PCR
aufgearbeitet und deren Bandenmuster mit dem oben beschriebenen Schema vergli-
chen. Diese Analyse wurde sowohl visuell als auch mit Hilfe eines Laser-Dendrogramms
17
durchgeführt. Mit dieser Methode des DNA-Fingerprinting können Staphylokokken-Spe-
zies aus boviner Milch typisiert werden. Verglichen mit biochemischen Methoden hat laut
den Autoren das DNA-Fingerprinting den Vorteil, nicht von Variablen, die sich aus den
Bedingungen der kulturellen Anzüchtung oder eventuell auftretenden atypischen
biochemischen Reaktionen der Bakterien ergeben, abhängig zu sein.
MAES et al. (1997) untersuchten die Möglichkeit, KNS-Spezies mittels PCR-Analyse des
Längen-Polymorphismus im intergenetischen Zwischenraum, der zwischen den tRNA-
Genen liegt, zu identifizieren (tRNA intergenic spacer length polymorphism analysis,
tDNA-ILP-PCR). Vorgeschaltet waren phänotypische Untersuchungen, wie
Charakterisierung mittels ID 32 Staph System. Anschließend erfolgte die Analyse mittels
tDNA-ILP-PCR. Die spezifischen Bandenmuster waren eindeutig und reproduzierbar. Die
erhaltenen Muster von Isolaten aus Referenzstämmen wurden mit denen von KNS aus
klinischen Isolaten humaner Herkunft verglichen. Auf Spezies-Ebene zeigte sich eine
Übereinstimmung von tDNA-ILP Analysen mit denen der biochemischen
Untersuchungsergebnisse von 99%, auf Subspeziesebene von 96%. Die Autoren führten
den Nachweis, dass dieses Verfahren zur schnellen und genauen Identifizierung von
KNS des Menschen geeignet ist.
2.3 Koagulase-negative Staphylokokken als Mastitiserreger bei der Ziege
Lange Zeit wurde die ätiologische Bedeutung Koagulase-negativer Staphylokokken als
Erreger von Ziegenmastitiden unterschätzt. Untersuchungsergebnisse von SMITH und
ROGUINSKY (1977), DULIN et al. (1982) und POUTREL und LERONDELLE (1983) wie-
sen erstmals auf eine pathogene Bedeutung der Erreger für das Ziegeneuter hin. Die
letztgenannten Autoren fanden in KNS-positiven Euterhälften eine Verdopplung der Zell-
zahl gegenüber bakteriologisch negativen Euterhälften. Nach SHELDRAKE et al. (1981)
betrug der Anteil an KNS-positiven Euterhälften zwischen 36 bis 71% der bakteriologisch
positiven Euterhälften. Allerdings wurde in dieser Untersuchung kein Unterschied im Zell-
gehalt bakteriologisch negativer bzw. bakteriologisch positiver Ziegenmilch festgestellt.
Ebenfalls keinen Zellzahlunterschied zwischen KNS-positiven Euterhälften und solchen
ohne bakteriologischen Befund fanden PEREZ und SCHULZ (1979) sowie PETTERSEN
(1981). Auch MANSER (1986) erkannte keinen Zusammenhang zwischen Zellzahlerhö-
hung und KNS-Nachweis. In seinen Untersuchungen wurde lediglich in einer einzigen
Ziegenherde eine signifikante Erhöhung der Anzahl somatischer Zellen in der Milch in
Verbindung mit einem KNS-Nachweis festgestellt. OELFKEN (1993) spekulierte, dass
diese unterschiedlichen Untersuchungsergebnisse auf einen unterschiedlichen Effekt
einzelner KNS-Stämme auf das caprine Eutergewebe zurückgeführt werden könnten,
eventuell aufgrund der Pathogenität unterschiedlicher Spezies bzw. einzelner Stämme.
Verschiedene Autoren bzw. Arbeitsgruppen differenzierten Koagulase-negative Staphylo-
kokken, die aus Ziegenmilch isoliert wurden, mit unterschiedlichen Methoden. Die
verschiedenen KNS-Spezies wurden dabei in unterschiedlicher Häufigkeit nachgewiesen.
18
In Tabelle 13 im Anhang werden die nachgewiesenen KNS-Spezies jeweils in der Rei-
henfolge der beschriebenen Häufigkeit unter Angabe der angewandten Methode aufge-
listet.
Nach OELFKEN (1993) ist die unterschiedliche Nachweishäufigkeit der verschiedenen
Staphylokokkenspezies möglicherweise regional bedingt.
Der Autor fand in eigenen Untersuchungen und in einer von ihm durchgeführten Litera-
turrecherche nachfolgend aufgeführte Spezies gehäuft bei der Mastitis der Ziege vor:
1. S. simulans
2. S. caprae
3. S. xylosus
4. S. epidermidis
5. S. hominis
Andere Autoren bestätigen nur teilweise diese Ergebnisse. In einer Studie von WINTER
und BAUMGARTNER (1999) beispielsweise wurden weder S. caprae noch S. hominis
nachgewiesen. In einer Untersuchung von BEDIDI-MADANI et al. (1998) fehlte der
Nachweis von S. simulans sowie S. epidermidis . MAISI und RIIPINNEN (1991) konnten
S. caprae nicht isolieren.
DULIN et al. (1983) sehen Koagulase-negative Staphylokokken als „major pathogens“
an.
Nach VALLE et al. (1990) haben im Gegensatz zu Koagulase-positiven Staphylokokken
die Koagulase-negativen keine oder nur wenig Virulenzfaktoren. In einer späteren Studie
untersuchten VALLE et al. (1991) KNS aus Ziegenmilch von klinisch unauffälligen Zie-
gen. Es wurden vorwiegend Novobiocin-empfindliche Spezies nachgewiesen. Bei 35,5%
dieser Ziegen fanden die Autoren KNS in der Milch. Sie schlossen daraus, dass es einen
hohen Anteil an Ziegeneutern gibt, die subklinisch mit KNS infiziert sind.
Nach TRAVINICEK und FEDERICK (1994) wird die Spezies S. epidermidis zu 80% bei
subklinischen Ziegenmastitiden ermittelt.
Nach SMITH und SHERMAN (1994) tendieren Euterinfektionen durch S. epidermidis,
S.intermedius, S. caprae und S. hyicus häufig dazu, über eine gesamte Laktation zu per-
sistieren. Die Autoren vertreten die Meinung, dass KNS eher seltener die Ursache für
klinische Erkrankungen sind.
DEINHOFER und PERNTHANER (1995) fanden ein Erhöhung der Zellzahl in Verbin-
dung mit einer Infektion von S. epidermidis, S. simulans, S. lugdunensis, S. chromoge-
nes und S. warneri. Bei einer Infektion des Euters mit S. caprae und S. lentus wurde
keine Erhöhung der Zellzahl festgestellt.
Die Autoren fanden ausschließlich beim Nachweis von S. simulans klinische Mastitiden.
19
2.4 Koagulase-negative Staphlokokken als lebensmittelhygienisches Risiko
In der Literatur sind unterschiedliche Angaben bezüglich der Koagulase-negativen
Staphylokokken als Enterotoxinbildner zu finden. Diese Fragestellung wurde von
verschiedenen Arbeitsgruppen bezüglich des Nachweises von Staphylokokken-Enteroto-
xin (SE) und des Toxischen Schock-Syndrom-Toxins (TSST-1) z.T. mit unterschiedlichen
Resultaten bearbeitet.
BAUTISTA et al. (1988) konnten beispielsweise aus Schafsmilch Enterotoxin-produzie-
rende S. epidermidis, S. cohnii, S. haemolyticus und S. xylosus isolieren. VALLE et. al
beschrieben 1990 erstmals Enterotoxin-produzierende KNS. Ein Jahr später (VALLE et.
al 1991) wiesen die Autoren bei 16,5% der isolierten KNS in-vitro die Produktion von
TSST-1 nach. DA CUNHA et al. (2007) fanden bei 26,7% der untersuchten KNS-Stämme
Enterotoxine. FOSCHINO et al. (2002) untersuchten KNS aus Ziegenmilch auf Enteroto-
xine und konnten keine Toxinproduktion nachweisen, ebenso wie HARVEY und
GILMORE (1988), die in ihrem aus Ziegenmilch isolierten Untersuchungsgut keine
Enterotoxin-bildenden Isolate nachweisen konnten. Lediglich bei 35% der isolierten S.
aureus konnte eine SE-Bildung detektiert werden. Die Autoren wiesen darauf hin, dass
bisher kein Fall einer Lebensmittelintoxikation durch Staphylokokken aufgrund des
Genusses von Ziegenmilch bekannt geworden ist.
KREISWIRTH et al. (1987) wandten molekulare Methoden zum Enterotoxin/TSST-1-
Gen-Nachweis bei KNS an. Auch diese Autoren fanden keine positiven Isolate. Zu den
Berichten mit positivem Nachweis Enterotoxin-bildender KNS merken sie an, dass mögli-
cherweise durch die ausschließlich auf dem Plasma-Koagulase-Nachweis beruhende
Speziesdiagnose fälschlicherweise S. aureus-Isolate nicht als solche erkannt wurden.
Untersuchungen von KNS aus Kuh-, Schaf- und Ziegenmilch (ORDEN et al., 1992) erga-
ben, dass Isolate der Spezies S. xylosus, S. sciuri und S. epidermidis TSST-1 bzw. S.
xylosus-Isolate Staphylokokken-Enterotoxin-positiv waren.
DE LOURDES RIBEIRO DE SOUZA DA CUNHA et al. (2006) untersuchten verschie-
dene Lebensmittelproben auf KNS. Die isolierten KNS wurden auf Enterotoxin-Gene
untersucht. Die Ergebnisse führten die Autoren zu der Aussage, dass KNS Enterotoxine
produzieren können und diesbezüglich nicht ignoriert werden dürfen.
VERAS et al. (2008) fanden in ihrer Untersuchung von Milchprodukten mittels PCR Hin-
weise dafür, dass KNS die Fähigkeit zur Enterotoxinproduktion besitzen.
20
Tiere, Material und Methoden
2.5 Untersuchte Ziegen
2.5.1 Herdengröße und Betriebsstruktur
Untersucht wurden Milchziegen in 12 Beständen aus Mittel- und Südhessen über einen
Zeitraum von 2 Jahren. Die ein- bis zweimalige Untersuchung der klinisch unauffälligen
Milchziegenherden erfolgte im Rahmen der amtlichen Milchhygieneüberwachung. Häufi-
gere Untersuchungen wurden in ausgewählten Betrieben (insbesondere Betrieb 3)
durchgeführt (siehe Tabelle 16). Die größte Herde umfasste 160 Ziegen (mit 112
laktierenden Tieren), die kleinste Herde 4 Tiere.
Zum größten Teil waren Tiere der Rassen „Bunte Deutsche Edelziege“ (BDE), „Weiße
Deutsche Edelziege“ (WDE), „Thüringerwald-Ziege“, „Toggenburger“ und „Alpine-
Chamouson“ vertreten. Die großen Herden setzten sich aus Ziegen verschiedener Ras-
sen zusammen.
Die Tiere wurden mit einer Ausnahme in Tiefstreuställen gehalten, in 4 Beständen hatten
sie saisonal Weidegang. In einem Betrieb wurden die Ziegen im Offenstall mit ganzjähri-
gem Weidegang gehalten. Die Stallhygiene (Sauberkeit und Qualität der Einstreu und
des Futters, Sauberkeit der Futterbehältnisse bzw. Futtergassen, Frischluft,
Tageslichteinfall) war in allen Beständen gut bis sehr gut.
Abbildung 1 zeigt Tiere der seltenen Ziegenrasse „Thüringerwald-Ziege“ aus einem der
beprobten Betriebe.
Abb. 1 Thüringerwald-Ziegen
21
Tabelle 14 gibt einen Überblick über wesentliche Merkmale der Betriebe.
Tabelle 14. Übersicht über die Struktur der beprobten Betriebe
Betrieb Standort
Hessen
Tiere
n 1)
Rassen Haltung
1 Süd 160 BDE2), WDE3)
Toggenburger u. a.4)
Tiefstreustall mit Weidegang
2 Süd 140 BDE, WDE
Toggenburger u. a.
Tiefstreustall
3 Mitte 40 BDE Tiefstreustall mit Außenpaddock
4 Mitte 22 BDE, WDE
Thüringerwald-Ziege
Tiefstreustall mit Weidegang
5 Mitte 11 BDE Tiefstreustall
6 Mitte 15 BDE, WDE Tiefstreustall
7 Mitte 8 BDE Tiefstreustall mit Weidegang
8 Süd 4 BDE Tiefstreustall
9 Mitte 6 BDE Tiefstreustall mit Weidegang
10 Mitte 5 BDE Tiefstreustall
11 Mitte 8 WDE Tiefstreustall
12 Mitte 4 Thüringerwald- Ziege Offenstall
1) Maximale Anzahl der Milchziegen im Untersuchungszeitraum
2) Bunte Deutsche Edelziege
3) Weiße Deutsche
Edelziege4)und andere
2.5.2 Melktechnik und Melkhygiene
Der Milchentzug erfolgte in 7 der untersuchten Betriebe per Rohrmelk- bzw. Eimer-melk-
anlage. In diesen Betrieben und in einem Handmelkbetrieb waren auch Melkstände
installiert. In einem der untersuchten Betriebe erfolgte das Melken meist per Hand, ob-
wohl eine Eimermelkanlage vorhanden war. In allen Betrieben wurde regelmäßig die Vor-
melkprobe durchgeführt. In 4 Betrieben wurden die Ziegeneuter unabhängig vom Ver-
schmutzungsgrad vor jedem Melken intensiv gereinigt. In 3 dieser Betriebe wurden tro-
ckene Einmaltücher verwendet, in einem der Betriebe wurden frisch gewaschene Baum-
wolltücher verwendet. In den anderen 8 Betrieben wurde lediglich bei Bedarf eine Reini-
gung des Euters mit einem trockenen Einmaltuch durchgeführt, da Ziegeneuter bei guter
Stallhygiene im Normalfall sehr sauber und trocken sind. Grundsätzlich wurde in allen
untersuchten Betrieben ein Eutertuch nur für jeweils ein Tier verwendet. Lediglich in ei-
nem der Betriebe wurden die Zitzen nach dem Melken mit einer desinfizierenden Lösung
(„Zitzendipping“) behandelt. Insgesamt waren die Melkarbeit und die Melkhygiene in al-
len 12 Betrieben als gut bis sehr gut zu bezeichnen.
22
Tabelle 15 stellt die Art des Milchentzuges und die in den jeweiligen Betrieben durchge-
führten melkhygienischen Maßnahmen dar.
Tabelle 15. Übersicht über die Art des Milchentzuges und über die
melkhygienischen Maßnahmen in den untersuchten Betrieben
Betrieb Milchentzug Melk-
stand
Vor-
melken
Vorreinigung
des Euters
Zitzen-
desinfektion
1 Rohrmelkanlage Ja Ja Bei Bedarf Nein
2 Rohrmelkanlage Ja Ja Bei Bedarf Nein
3 Eimermelkanlage Ja Ja Zu jedem Melken Ja
4 Eimermelkanlage Ja Ja Zu jedem Melken Nein
5 Eimermelkanlage Ja Ja Bei Bedarf Nein
6 Eimermelkanlage,
Handmelken
Nein Ja Bei Bedarf Nein
7 Eimermelkanlage Ja Ja Zu jedem Melken Nein
8 Handmelken Nein Ja Bei Bedarf Nein
9 Handmelken Nein Ja Bei Bedarf Nein
10 Handmelken Nein Ja Bei Bedarf Nein
11 Eimermelkanlage Ja Ja Zu jedem Melken Nein
12 Handmelken Ja Ja Bei Bedarf Nein
Abb. 2 Eimermelkanlage eines Ziegenbetriebes
23
2.6 Untersuchungsmaterial
Das Untersuchungsmaterial stammt überwiegend aus anlässlich der Bestandsbesuche
entnommenen Hälftegemelksproben (89,8%). Dabei erfolgte die Probennahme
eigenhändig im Rahmen der Milchhygieneüberwachung. Abweichend davon wurden in
einigen Fällen Proben von Einzeltieren nach tierärztlicher Anweisung vom betreffenden
Landwirt eingesandt (10,2 % der untersuchten Hälftegemelksproben). Die Bestände
wurden im Untersuchungszeitraum 1 bis 17 Mal (Betrieb 3) beprobt. Tabelle 16 gibt eine
Übersicht über die Herkunft der insgesamt 2038 untersuchten Hälftegemelksproben.
Tabelle 16. Übersicht über die Herkunft der untersuchten Hälftegemelksproben
Betrieb Gesamt-
bestands-
untersuchungen
Hälfte-
gemelks-
proben
Einzeltier-
einsendungen
Hälfte-
gemelks-
proben
Proben
Gesamt1)
n n n n n
1 2 396 0 0 396
2 3 448 3 12 460
3 17 754 8 176 930
4 2 36 0 0 36
5 6 86 5 10 96
6 1 30 0 0 30
7 1 22 2 4 26
8 1 4 0 0 4
9 1 12 0 0 12
10 2 18 1 4 22
11 1 16 1 2 18
12 1 8 0 0 8
Gesamt 38 1830 20 208 2038
1) Insgesamt kamen in den Betrieben 6 Ziegen mit nur einer (laktierenden) Euterhälfte und 5 Ziegen mit Doppelstrichen vor. Diese
Tiere wurden nicht in die Auswertungen einbezogen.
2.7 Methoden
2.7.1 Probennahme
Es wurden Hälftegemelksproben von allen laktierenden Ziegen entnommen. Diese wur-
den als Anfangsgemelksproben unter antiseptischen Bedingungen gemäß IDF Standard
(INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION, 1981) entnommen.
Es wurden Milchröhrchen (Greiner, Frickenhausen) ohne Probenkonservierer verwendet,
da alle Proben am Tag der Entnahme im Labor bearbeitet wurden. Die Entnahme der
Hälftegemelksproben erfolgte zur Morgenmelkzeit. Nachdem das Euter vorgemolken und
trocken gereinigt war, wurden die Zitzenkuppen mittels Zellstoff, der mit 70%igem Etha-
24
nol (Merck, Darmstadt) getränkt war, desinfiziert. Dabei wurde für jede Zitze ein neuer
Zellstofftupfer verwendet. Anschließend wurden erneut einige Milchstrahlen aus jeder
Zitze verworfen. Dann erfolgte die Probennahme in die zuvor gekennzeichneten
Milchröhrchen. Letztere wurden erst kurz vor der Probennahme geöffnet und unmittelbar
danach wieder verschlossen. Um eine eventuelle Kontamination durch herabfallende
Tierhaare, Hautschuppen etc. der Probe zu verhindern, wurde das Milchröhrchen wäh-
rend der Probennahme nahezu waagerecht gehalten.Die Milchproben wurden anschlie-
ßend bei < 7°C zum Labor transportiert.
Bei den eingesandten Proben wurden, abweichend von der beschriebenen Vorgehens-
weise, Probenröhrchen mit Konservierer verwendet (Natrium-Borat). Der Landwirt wurde
vorab in die Technik der korrekten Probennahme eingewiesen. Die eingesandten Proben
wurden zum Teil als Doppelproben zur Abend- und Morgenmelkzeit genommen.
2.7.2 Makroskopische Untersuchung
Sowohl bei der tierärztlichen Probennahme im Milcherzeugerbetrieb als auch vor der Be-
stimmung des Gehaltes an somatischen Zellen im Labor wurden die Hälftegemelkspro-
ben visuell auf makroskopische Veränderungen (Flocken, Blutbeimengungen etc.)
untersucht.
2.7.3 Zytologische Untersuchung
Unmittelbar nach Ankunft der Proben im Labor wurde die zytobakteriologische Untersu-
chung eingeleitet.
Die Ermittlung des Gehaltes an somatischen Zellen erfolgte fluoreszenzoptisch mittels
Fossomatic® 360 (Foss Electric A/S, Dänemark).
Zur Darstellung der Mittelwerte der Zellzahlen wurde das geometrische Mittel berechnet,
um dem exponenziellen Anstieg somatischer Zellen in Ziegenmilch gerecht zu werden.
Für einige vergleichende Darstellungen wurden die Zellzahlen zusätzlich nach einer von
KLOPPERT et al. (2000) für die Ziege entwickelten Transformationsformel logarithmisch
umgeformt (Linear Somatic Cell Score, SCS). Die Transformationsformel lautet:
SCSZiege = log4 (Zellzahl/100000) + 2 (KLOPPERT et al., 2000; EHRENBERG et al.,
2002).
2.7.4 Bakteriologische Untersuchung
Die Erregeridentifizierung erfolgte mittels kulturell-bakteriologischer Untersuchung ge-
mäß dem IDF- Standard (INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION, 1981). Zur Erreger-
anzüchtung wurde Äskulin-Blutagar verwendet [Columbia-Agar-Basis (Merck, Darm-
stadt) mit 10% Rinderblut (Fiebig, Idstein/Taunus) und 0,1% Äskulin (Merck, Darmstadt)].
Mit einem Glasstab wurde jeweils ein Tropfen einer Hälftegemelksprobe (ca. 10µl) auf
25
der Hälfte einer Äskulin-Blutagar-Platte ausgestrichen.
Die beimpften Platten wurden bei 37°C unter aeroben Bedingungen bebrütet und nach
24 und 48 Stunden kulturmorphologisch beurteilt. Die Abgrenzung der Koagulase-negati-
ven Staphylokokken gegenüber S. aureus erfolgte zusätzlich mittels Plasmakoagulase-
und Clumping-Factor-Test. Die positive Clumping-Factor-Reaktion gilt als taxonomisches
Kriterium für S. aureus (KLOOS und SCHLEIFER, 1986).
Es erfolgte zudem eine halbquantitative Bestimmung des Keimgehaltes, der als
+/gering/bis zu 5,++/mäßig/6 bis15 oder +++/hoch/15 und mehr klassifiziert wurde.
Die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen wurden den betreffenden
Zellzahlergebnissen zugeordnet.KNS-Isolate wurden nach Abschluss der Untersuchung
in der Stammsammlung aufbewahrt. Zur Konservierung wurden die Kulturen in
Rinderserum, welches 5% Glukose enthielt, suspendiert, in Eppendorf-Gefäße
(Eppendorf-AG, Hamburg) gefüllt und bei -80°C tiefgefroren.Zur Reaktivierung wurden
die Feldstämme nach dem Auftauen mit 1 ml steriler Standard I-Nährbouillon (Merck,
Darmstadt) aufgelöst.
2.7.5 Auswahl der Feldisolate
Um sicher zu gehen, dass es sich bei den untersuchten KNS-Spezies um Keime aus
dem Euter und nicht etwa aus der Umgebungsflora handelt, erfolgte die Auswahl der
Feldisolate nach folgenden Kriterien: Neben dem Nachweis in Reinkultur sollte ein mäßi-
ger oder starker Keimgehalt (++ oder +++) vorgelegen haben. Von den in der Stamm-
sammlung aufbewahrten Isolaten erfüllten insgesamt 118 Kulturen diese Kriterien.
2.7.6 Referenzstämme
Um standardisierte Vergleichsmöglichkeiten sowohl für die kulturmorphologischen sowie
biochemischen, als auch für die Untersuchungen mittels PCR zu haben, wurden
Referenzstämme verwendet. In Tabelle 17 sind die in der vorliegenden Arbeit
verwendeten Referenzstämme mit der jeweiligen Bezugsquelle aufgelistet.
26
Tabelle 17. Referenzstämme und deren Bezugsquelle
Referenzstämme Bezugsquellen
S. auricularis (ATCC 33753) Prof. Lämmler, JLU Gießen1)
S. capitis (ATCC 27841) BioMérieux, Nürtingen
S. caprae (CCM 3573) DMSZ, Braunschweig2)
S. chromogenes (ICM 7470) Prof. Lämmler, JLU Gießen
S. cohnii (GH 137) Prof. Lämmler, JLU Gießen
S. epidermidis (ATCC 14990) BioMérieux, Nürtingen
S. hämolyticus (ATCC 29970) BioMérieux, Nürtingen
S. hominis subsp. Hominis (ATCC 27845) BioMérieux, Nürtingen
S. hyicus (ATCC 11249) DMSZ, Braunschweig
S. lentus (ATCC 49574) BioMérieux, Nürtingen
S. lugdunensis (ATCC 43809) BioMérieux, Nürtingen
S. saprophyticus (ATCC 43867) BioMérieux, Nürtingen
S. schleiferisubsp.schleiferi (ATCC 43808) Prof. Lämmler, JLU Gießen
S. sciuri (ATCC 29062) DMSZ, Braunschweig
S. simulans (ATCC 27848) DMSZ, Braunschweig
S. warneri (ATCC 27836) DMSZ, Braunschweig
S. xylosus (Kloos 162) Prof. Lämmler, JLU Gießen
1) Prof. Dr. Christoph Lämmler, Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Justus-Liebig-Universität Gießen
2) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DMSZ, Braunschweig
Zur Reaktivierung wurden die Referenzstämme ebenfalls mit 1 ml steriler Standard I-
Nährbouillon (Merck, Darmstadt) aufgelöst.
2.7.7 Differenzierung isolierter Koagulase-negativer Staphylokokken
2.7.7.1 Kulturmorphologie
Nach den Empfehlungen der Kommission zur Erarbeitung von Verfahrensrichtlinien für
mikrobiologische Diagnostik der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie,
Arbeitsgruppe Micrococcaceae (PETERS, 1992) wurden zunächst die Wachstumseigen-
schaften und die Koloniemorphologie zur Identifizierung der Kulturen herangezogen.
In die kulturmorphologische Untersuchung wurden die 17 Referenzstämme und die 118
Staphylokokken-Feldisolate einbezogen.Die Subkulturen wurden auf Schafblut-Agar-
Platten [Agar-Basis] (Merck, Darmstadt) mit Schafblut (Fiebig, Idstein/Taunus)] angelegt.
Sie wurden bei 37°C unter aeroben Bedingungen bebrütet und nach 24 und 48 Stunden
kulturmorphologisch beurteilt.
Die Beurteilung der Kulturen erfolgte nach folgenden Kriterien:
27
Größe der Kolonien, Form, Farbe, Oberflächenbeschaffenheit und Glanz sowie
Hämolyseform.
Die kulturmorphologischen Eigenschaften nach 48 Stunden Wachstum wurden
dokumentiert.
Die verschiedenen Kulturmorphologietypen der Referenzstämme und der Feldisolate
wurden mit fortlaufenden Nummern (M1 bis Mx) bezeichnet. Das
Wachstumsverhalten der Feldisolate wurde mit dem Morphologietyp der
Referenzstämme verglichen.
2.7.7.2 Biochemische Untersuchung
Die 17 Referenzstämme und 35 zufällig ausgewählte Feldisolate wurden mittels ID 32
Staph Testsystems (BioMérieux, Nürtingen) nach Anleitung des Herstellers untersucht.
Das Testsystem ist mit 26 miniaturisierten enzymatischen Reaktionen ausgestattet. Fol-
gende Reaktionen können nachgewiesen werden: Urease, Esculinhydrolyse,
Nitratreduktion, Acetoinbildung, alkalische Phosphatase, Argininarylamidase,
Arginindihydrolase, ß-Galactosidase, ß-Glucuronidase, Ornithindecarboxylase,
Pyrridonyl-Arylamidase, Novobiocinresistenz sowie die Säurebildung aus Arabinose,
Cellobiose, Fructose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannit, Mannose, Raffinose, Ribose,
Saccharose, Trehalose, Turanose und N-Acetyl-Glucosamin.
Der zu untersuchenden Kultur auf Columbia-Schafblut-Agar wurden einige Kolonien mit
einer sterilen Öse entnommen und in 3 ml Aqua dest. nach McFarland-Standard (Nr. 0,5)
suspendiert. Mit je 55 µl dieser Bakteriensuspension wurden die Vertiefungen der Test-
streifen beimpft; zusätzlich wurden laut Anweisung des Herstellers die Reaktionen
Urease, Arginindihydrolase und Ornithindecarboxylase mit je 2 Tropfen Paraffinöl
versehen.
Nach einer 24-stündigen Inkubationszeit bei 37°C wurde die Auswertung nach Hersteller-
angaben durchgeführt. Die Auswertung des biochemischen Profils erfolgte mittels
APILAB-Software.
2.7.7.3 Untersuchung der in-vitro-Empfindlichkeiten gegenüber Antibiotika
Sowohl die 17 Referenzstämme als auch die 118 ausgewählten Staphylokokken-Feldiso-
late wurden auf ihre Empfindlichkeiten gegenüber Antiinfektiva getestet (Resistenztest).
Der Nachweis der In-vitro-Sensitivität gegenüber den verwendeten Antibiotika wurde im
Agar-Diffusionsverfahren geführt(AVID-Methodensammlung, 1993). Hierzu wurden mit
Hilfe einer sterilen Öse 3 - 5 Kolonien der zu untersuchenden Kulturen in 3 ml einer
Standard I-Nährbouillon (Merck, Darmstadt) verbracht und suspendiert. Die beimpfte
Bouillon wurde anschließend für 2 Stunden bei 37°C bebrütet.
Die bebrütete Bouillon wurde auf einen Müller-Hinton-Agar (Merck, Darmstadt)
28
aufgegossen und durch vorsichtiges Schwenken gleichmäßig verteilt. Die Restflüssigkeit
wurde abgegossen und die eventuell verbleibende Restflüssigkeit am Außenrand der
Platte mit einem Tupfer entfernt.Mit Hilfe eines Applikationsstempels (Oxoid Disc
Dispenser, Hampshire, England)wurden handelsübliche Antibiotika-Plättchen auf den
Nährboden verbracht. Zur Erstellung eines Resistenzmusters zur Speziesdifferenzierung
wurden die in Tabelle 18 aufgeführten antibiotischen Substanzen verwendet.
Tabelle 18. Verwendete Antibiotika für den Empfindlichkeitstest:
Wirkstoff Hersteller Wirkstoffkonzentration/Plättchen
Novobiocin Oxoid, Hamphshire, England 30 µg
Desferrioxamin Mast Group, Merseyside, U.K. 1000 µg
Fosfomycin Oxoid, Hampshire, England 50 µg
Polymyxin B Oxoid, Hampshire, England 300 iU
Furazolidon Oxoid, Hampshire, England 50 µg
Die Beurteilung der Hemmzonen erfolgte nach 24stündiger Inkubation der Müller-Hinton-
Platten bei 37°C in aerober Atmosphäre. Tabelle 19 zeigt die Hemmhof-Grenzwerte mit
entsprechenden Literaturquellen, nach denen die Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika
beurteilt wurde.
Tabelle 19. Beurteilung der Hemmhofzonen unter Angabe der Literaturquelle
Antibiotikum Beurteilung (Durchmesser) Literaturquelle
Empfindlich Resistent
Novobiocin > 16 mm < 16 mm DEVRIESE et al., 1994
Desferrioxamin > 18 mm < 18 mm DEVRIESE et al., 1994
Fosfomycin > 30 mm < 30 mm DEVRIESE et al., 1994
Polymyxin B > 12 mm < 12 mm WHO, 1982
Furazolidon > 17 mm < 17 mm VON RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
Die verschiedenen Resistenzmuster der Referenzstämme und der Feldisolate wurden
mit fortlaufenden Nummern (R1 bis Rx) bezeichnet. Die Ergebnisse der Untersuchung
der Referenzstämme wurden mit den Ergebnissen der Untersuchung der Feldstämme
verglichen.
2.7.7.4 Durchführung der t-DNA-PCR
Die molekulare Identifizierung mittels der t-DNA-PCR wurde nach Angaben von MAES et
al. (1997) durchgeführt. Die Ergebnisse der Untersuchung der 17 Referenzstämme wur-
den mit den Ergebnissen der Untersuchung der 118 Feldisolate verglichen.
29
2.7.7.4.1 Aufbereitung der bakteriellen DNA
Die Subkulturen der zu untersuchenden Feldisolate und Referenzstämme wurden auf
Schafblut-Agar angelegt und 24 h bei 37°C aerob bebrütet. 3 - 4 Einzelkolonien wurden
in ein Eppendorf-Gefäß (Eppendorf GmbH, Hamburg) verbracht und in 50 µl TE-Puffer
und 1 µl Lysostaphin (Sigma, Taufkirchen) suspendiert.
Es wurde ein TE-Puffer mit folgender Zusammensetzung verwendet:
Tris-HCL (10 mmol/l) 1,21 g
EDTA (1 mol/l) 372,50 mg
Aqua dest. 1000,0 mg
pH-Wert : 7,5
Die Suspension wurde für 1 h im Wasserbad bei 37°C inkubiert. Nach Hinzugabe von
1 µl Proteinase K (Qiagen GmbH, Hilden) wurde diese Suspension für 24 h bei 37°C
bebrütet. Zur Inaktivierung der Proteinase K wurde der Ansatz 15 min gekocht und im
Anschluss auf Eis abgekühlt. Es wurde dann 5 min bei 10 000 U/min zentrifugiert. Bis zur
weiteren Bearbeitung wurden die Proben auf Eis gelegt oder eingefroren.
Der Mastermix wurde unter sterilen Bedingungen nach dem folgenden Protokoll pipettiert.
Die Angaben gelten für jeweils einen Reaktionsansatz:
Aqua dest. 14,25 µl
10x Polymerasepuffer (Sigma, Steinheim) 2,00 µl
dNTP-Mix (Perkin-Elmer, Crailsheim) 0,40 µl
Primer T5A (pmol/µl), (MWG-Biotech, Ebersberg) 1,00 µl
Primer T3B (20 pmol/µl), (MWG-Biotech, Ebersberg) 1,00 µl
Taq-Polymerase (Promega, Mannheim) 0,25 µl
Die oben angegebenen Mengen wurden mit der Anzahl der durchzuführenden Reakti-
onsansätze multipliziert. Der Mastermix mit einem Volumen von 19 µl je Portion wurde in
gekennzeichnete, dünnwandige Reaktionsgefäße mit einem Volumen von 0,2 ml (Ep-
pendorf GmbH, Hamburg) pipettiert. Von den vorbereiteten Proben im TE-Puffer wurde
jeweils 1 µl in die entsprechenden Reaktionsgefäße verbracht, dabei wurde zur Vermei-
30
dung unspezifischer Reaktionen auf Eis pipettiert, bei geschlossenem Deckel durch-
mischt und anschließend zentrifugiert (14 000 U, 5 min).
Die verwendeten Primer mit den Sequenzen für T5A (5’-GTC CGG TGC TCT AAC CAA
CTG AG-3’) und T3B (5’- AGG TCG CGG GTT CGA ATC C-3’) wurden ursprünglich von
WELSH und MCCLELLAND (1991) beschrieben.
2.7.7.4.2 DNA-Replikation mit der PCR
Für die Amplifikation kam ein DNA-Thermal-Cycler (Perkin-Elmer Gene Amp 2400 PCR
System, Norwalk, USA) zum Einsatz. Der Thermocycler führte zunächst eine initiale De-
naturierung der DNA bei 94°C für 30 sec durch. Anschließend folgten 40 Zyklen für das
Primer-Annealing bei 50°C für 30 sec, danach die 2minütige Extensionsphase bei 72°C
(WELSH, MCCLELLAND, 1992). Die Proben wurden bis zum Auftragen in ein Gel bei
4°C aufbewahrt.
2.7.7.4.3 Elektrophorese
Um das Gel für die Elektrophorese herzustellen, wurden zunächst 0,7 g Agarose (Biorad,
München) in 35 ml 1x TBE-Puffer aufgelöst und bis zur Klärung erhitzt.
Ausgangslösung für den 1x TBE-Puffer war ein 10x TBE-Puffer mit folgender Zusam-
mensetzung:
EDTA (50 mmol/L) 40 ml
Borsäure 55 g
Tris-Basis 108 g
Aqua dest. ad
pH-Wert: 8,0
1000 ml
Die auf auf 50 - 60°C abgekühlte Agarose wurde in eine Elektrophoresekammer (Elekro-
phoresekammer BM100, Boehringer Ingelheim, Heidelberg) mit eingesetztem Taschen-
kamm gegossen, wobei eventuell aufgetretene Luftbläschen entfernt wurden. Nach
Erstarren des Gels wurde der Kamm entfernt. Auf das Gel wurde dann ca. 1 – 2 mm hoch
der 1x TBE-Puffer aufgegossen. Das Probenmaterial wurde mit dem sogenannten Stopp-
mix folgender Zusammensetzung10%ig eingefärbt:
31
Bromphenolblau 0,25% 0,083 g
Glycerin 30% 10,0 ml
Aqua bidest. 23,3 ml
ad 33,3 ml
Anschließend wurden in jeden Slot mindestens 8 µl Probenmaterial bzw. 3 µl Marker
eingefüllt. Als Längenstandard wurde der Marker VIII mit 0,019 – 1,11 kbp (Böhringer
Mannheim) verwendet. Dieses Gemisch zeigt ein typisches Muster von 17 Fragmenten
unterschiedlicher Größe: 1114, 900, 692, 501, 489, 404, 320, 242, 190, 147, 124, 110, 67,
37, 34 (2x), 26, 19.
Die Laufzeit der Elektrophorese betrug 60 min bei einer Spannung von 100 V. Im An-
schluss wurde der Laufpuffer abgegossen und das Gel mit einer Ethidiumbromid-Lösung
[2,5 µl Ethidiumbromid (Sigma, Steinheim) in 50 ml sterilem, demineralisiertem Wasser]
eingefärbt. Für diesen Färbevorgang wurde das Gel 20 min in einem Kippschüttler ge-
schwenkt. Das gefärbte Gel wurde anschließend 2 bis 3mal mit TBE-Puffer gespült.
Das Gel wurde mittels des Geldokumentationssystems Gel Doc 1000 (Biorad, München)
unter Verwendung der Software Molekular-Analyst (Biorad, München) ausgewertet.
Die verschiedenen Amplifikatmuster der Referenzstämme und der Feldisolate wurden mit
fortlaufenden Nummern (A1 bis Ax) bezeichnet.
2.7.7.5 Identifizierung der Staphylokokken-Feldisolate
Zur Identifizierung der 118 Kulturen wurde neben dem Ergebnis der t-DNA-PCR (Amplifi-
katmuster) zusätzlich der ABG-Typ (Resistenzmuster) herangezogen. Zur Identifizierung
von Spezies, die in beiden Verfahren identische Muster bzw. Typen ergaben, wurde zu-
sätzlich die Beurteilung der Kulturmorphologie herangezogen. Das Auswertungsschema
ergab sich aus dem Reaktionsverhalten der Referenzstämme.
32
3 Ergebnisse
3.1 Ergebnisse der makroskopischen und zytobakteriologischen Untersuchung
3.1.1 Visuelle Milchuntersuchung
Von den 2038 insgesamt untersuchten Hälftegemelksproben waren 2029 (99,6%)
makroskopisch unauffällig. In 9 Fällen (0,4%) aus 2 Betrieben (Betrieb 2 und 3) lagen
sichtbare Sekretveränderungen vor (Abweichungen in der Milchkonsistenz bzw. Blut in
der Milch).
3.1.2 Vorkommenshäufigkeit von Mastitiserregern
Beim weitaus größten Teil der untersuchten Hälftegemelksproben wurden keine
Mastitiserreger nachgewiesen. Bei 83,6% der Proben aus den Gesamtbestandsuntersu-
chungen bzw. bei 82,7% aller 2038 untersuchten Proben verlief die kulturell-bakteriologi-
sche Untersuchung mit einem negativen Ergebnis. Unter den bakteriologisch positiven
Proben (16,4% der Proben aus den Gesamtbestandsuntersuchungen bzw. 17,3% aller
untersuchten Proben) dominieren Koagulase-negative Staphylokokken mit einer
Nachweisrate von 10,7 bzw. 10,4%. Tabelle 20 stellt die Ergebnisse der kulturellen
Untersuchung der Hälftegemelksproben dar.
Tabelle 20. Nachweishäufigkeit von Mastitiserregern in den Hälftegemelksproben
im gesamten Untersuchungszeitraum
Ergebnis der
kulturbakteriologischen
Untersuchung
Betrieb 1 – 12
Hälftegemelksproben
Gesamtbestands-
untersuchungen
Einzel-
einsendungen
Gesamtheit
aller Proben
n % n % n %
Kulturell negativ 1530 83,6 155 74,5 1685 82,7
KNS 195 10,7 16 7,7 211 10,4
Staphylococus aureus 10 0,5 5 2,4 15 0,7
Äsk.-positive Streptokokken 12 0,7 4 1,9 16 0,8
Corynebacterium spp. 47 2,6 18 8,7 65 3,2
Andere 16 0,9 4 1,9 20 1,0
Mischkultur/Kontamination 20 1,1 6 2,9 26 1,3
Gesamt 1830 100 208 100 2038 100
Anmerkung: In 4 der 9 Hälften mit Sekretveränderungen wurden Mastitis-Erreger nachgewiesen (in 2 Fällen Koagulase-negative
Staphylokokken, in einem Fall Corynebacterium spp. und in einem Fall S. aureus). Diese 9 Fälle sind in der Tabelle enthalten.
Tabelle 21 stellt die bestandsspezifische Vorkommenshäufigkeit von Mastitiserregern in
den Hälftegemelksproben auf der Grundlage der Gesamtbestandsuntersuchungen dar.
33
Tabelle 21. Bestandsspezifische Nachweishäufigkeit von Mastitiserregern in den
untersuchten Hälftegemelksproben (Gesamtbestandsuntersuchungen)
Ergebnis der
kulturellen
Untersuchung
Betrieb
1 2 3 4 5 6
n % n % n % n n % n % n %
Negativ 315 79,6 360 80,4 677 89,8 28 77,8 69 80,2 21 70,0
KNS 64 16,2 50 11,2 43 5,7 8 22,2 14 16,3 4 13,3
S. aureus 3 0,8 3 0,7 1 0,1 0 0,0 0 0,0 1 3,3
Äsk.-pos. Scc. 1 0,3 1 0,2 3 0,4 0 0,0 2 2,3 1 3,3
Coryneb. spp. 4 1,0 24 5,4 17 2,3 0 0,0 0 0,0 1 3,3
Andere 3 0,8 4 0,9 8 1,1 0 0,0 0 0,0 1 3,3
Kontamination1) 6 1,5 6 1,3 5 0,7 0 0,0 1 1,2 1 3,3
Gesamt 396 100 448 100 754 100 36 100 86 100 30 100
Tabelle 21. Bestandsspezifische Nachweishäufigkeit von Mastitiserregern in den
untersuchten Hälftegemelksproben (Gesamtbestandsuntersuchungen)
Ergebnis der
kulturellen
Untersuchung
Betrieb
7 8 9 10 11 12
n % n % n % n % n % n %
Negativ 20 90,9 2 50,0 4 33,3 11 61,1 15 100 8 100
KNS 1 4,5 1 25,0 5 41,7 4 22,2 1 0,0 0 0,0
S. aureus 0 0,0 0 0,0 0 0,0 2 11,1 0 0,0 0 0,0
Äsk.-pos. Scc. 1 4,5 0 0,0 2 16,7 1 5,6 0 0,0 0 0,0
Coryneb. spp. 0 0,0 1 25,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
Andere 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
Kontamination1) 0 0,0 0 0,0 1 8,3 0 0,0 0 0,0 0 0,0
Gesamt 22 100 4 100 12 100 18 100 16 100 8 100
1)Mischkultur und Kontamination
3.1.3 Ergebnisse der Bestimmung des Gehaltes an somatischen Zellen
Tabelle 22 und 23, bzw. Abbildung 3 stellen die Ergebnisse der Bestimmung des
Gehaltes an somatischen Zellen (geometrischer Mittelwert) auf Betriebsebene bzw. in
Bezug zum Ergebnis der kulturbakteriologischen Untersuchung dar.
34
Tabelle 22. Geometrischer Mittelwert der Zellzahl der Hälftegemelksproben pro ml
Milch bei den Gesambestandsuntersuchungen in Bezug zu den Herkunftsbetrieben
Betrieb
Anzahl der untersuchten
Hälftegemelksproben
Geometrischer Mittelwert
der Zellzahl in Tausend
1 396 187
2 448 693
3 754 389
4 36 301
5 86 265
6 30 332
7 22 343
8 4 123
9 12 210
10 18 333
11 16 120
12 8 461
Gesamt 1830
Tabelle 23. Geometrischer Mittelwert der Zellzahl pro ml Milch der gesamten
Hälftegemelksproben in Bezug zum Ergebnis der kulturbakteriologischen Untersuchung
Ergebnis der kulturellen
Untersuchung
Anzahl der untersuchten
Hälftegemelksproben
Geometrischer Mittelwert
der Zellzahl in Tausend
Kulturell negativ 1530 222
KNS 195 301
Staphylococus aureus 10 765
Äsk.-positive Streptokokken 12 559
Corynebacterium spp. 47 298
Andere 16 337
Mischkultur/Kontamination 20 335
Gesamt 2038
35
222
301
765
559
298
337
335
Kulturell negativ
KNS
Staphylococus aureus
Äsk.-positive Streptokokken
Corynebacterium spp.
Andere
Mischkultur/Kontamination
Geometrischer Mittelwert der Zellzahl in Tausend
20Proben
1530Proben
195 Proben
10Proben
12Proben
47Proben
16Proben
Abb. 3 Geometrischer Mittelwert der Zellzahl pro ml Milch der gesamten
Hälftegemelksproben in Bezug zum Ergebnis der kulturbakteriologischen Untersuchung
Tabelle 24 stellt die Zellzahl (geometrischer Mittelwert) der Euterhälften mit KNS-
Nachweis der Zellzahl der korrespondierenden Euterhälften ohne Erregernachweis
gegenüber.
Tabelle 24. Vergleich der Zellzahl beider Euterhälften bei Ziegen mit einseitigem
Nachweis von Koagulase-negativen Staphylokokken
Betrieb
Tiere
n
Geometrischer Mittelwert der Zellzahl in Tausend
Euterhälften mit Nachweis
von KNS
Korrespondierende Euterhälften
ohne Erregernachweis
1 34 655 213
2 23 486 164
3 21 453 386
4 6 931 427
5 6 494 322
6-12 7 247 157
Gesamt 97 524 236
36
Bei 97 der untersuchten Ziegen wurden auf einer Euterhälfte Koagulase-negative
Staphylokokken nachgewiesen, während auf der anderen Hälfte desselben Tieres kein
Erregernachweis geführt wurde. Bei 7 Ziegen wurde auf beiden Euterhälften KNS
nachgewiesen. Der geometrische Mittelwert des Gehaltes an somatischen Zellen liegt
bei den Euterhälften mit KNS-Nachweis bei 524 000 Zellen/ml, bei den korrespondieren-
den, bakteriologisch negativen Euterhälften bei 236 000 Zellen/ml.
3.2 Ergebnisse der Differenzierung isolierter Koagulase-negativer Staphylokokken
3.2.1 Ergebnisse der kulturmorphologischen Untersuchung
Nachfolgende Abbildungen (Abb. 4S. chromogenes, Abb. 5 S. hyicus, Abb. 6 S.
epidermidis) machen charakteristische, gut erkennbare kulturmorphologische
Unterschiede einzelner KNS-Spezies deutlich. Beispielhaft sind hier die KNS-Spezies S.
chromogenes, bzw. S. hyicus herausgestellt, deren unterschiedliche Pigmentierung
diese ansonsten mittels t-DNA-PCR schwer unterscheidbaren Spezies differenzieren
half.
Abb. 4 Referenzstamm S. hyicus
37
Abb. 5 Referenzstamm S. chromogenes
Abbildung 6 zeigt S. epidermidis, der regelmäßig typischerweise unpigmentierte, sehr
kleine Kolonien von ca. 2,5 mm Durchmesser zeigt.
Abb. 6 Referenzstamm S. epidermidis
Tabelle 25 stellt die Ergebnisse der kulturmorphologischen Untersuchung der
Referenzstämme dar. Die verschiedenen Morphologietypen wurden mit fortlaufenden
Nummern bezeichnet (M1 bis M9).
38
Tabelle 25. Ergebnisse der kulturmorphologischen Untersuchung der KNS-Referenzstämme
Referenzstamm Kulturmorphologie Morphologietyp
S. cohnii grau, glänzend, stecknadelkopfgroß M1
S. hämolyticus grau, glänzend, stecknadelkopfgroß M1
S. schleiferi grau, glänzend, stecknadelkopfgroß M1
S. hominis grau, glänzend, stecknadelkopfgroß M1
S. simulans grau-weiß, glänzend, stecknadelkopfgroß M1
S. lugdunensis grau-gelb, glänzend, stecknadelkopfgroß M2
S. xylosus gelb-grau, glänzend, stecknadelkopfgroß M2
S. chromogenes weiß-gelb, glänzend, stecknadelkopfgroß M2
S. saprophyticus weiß-gelb, glänzend, stecknadelkopfgroß M2
S. lentus weiß-gelb, stecknadelkopfgroß M3
S. caprae grau-weiß, stecknadelkopfgroß M4
S. hyicus grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte
der Kolonien, klein1)
M5
S. capitis weiß, glänzend, klein M6
S. epidermidis weiß-grau, glänzend, sehr klein M7
S. auricularis grau, glänzend, sehr klein M7
S. sciuri grau-weiß, glatt, glänzend, erhabenes
Zentrum, groß2)
M8
S. warneri grau-gelb, glänzend, stecknadelkopfgroß, δ-
Hämolyse
M9
1) kleiner als stecknadelkopfgroß
2) größer als stecknadelkopfgroß
Die Kulturmorphologie von 76 der 118 untersuchten Feldstämme (64,4%) ließ sich 8 der
Morphologietypen der Referenzstämme zuordnen. Bei den verbleibenden 42 Feldstäm-
men zeigten sich 16 weitere Morphologietypen, die mit weiteren fortlaufenden Nummern
bezeichnet wurden (M10 bis M25). Tabelle 26 zeigt die Ergebnisse der kulturmorphologi-
schen Untersuchung aller 118 Feldstämme.
39
Tabelle 26. Ergebnisse der kulturmorphologischen Untersuchung der KNS-
Feldstämme
Morphologietyp Kulturmorphologie
n
%
M1 grau, grau-weiß, glänzend, stecknadelkopfgroß 26 22,0
M2 grau-gelb, gelb-grau, weiß-gelb, glänzend,
stecknadelkopfgroß
12 10,2
M3 weiß-gelb, stecknadelkopfgroß 1 0,8
M4 grau-weiß, stecknadelkopfgroß 7 5,9
M5 grau-blass, weiß-blass, feucht, weißer Punkt in der
Mitte der Kolonien, klein
16 13,6
M6 weiß, glänzend, klein 7 5,9
M7 weiß-grau, grau, glänzend, sehr klein 4 3,4
M8 grau-weiß, glatt, glänzend, erhabenes Zentrum, groß 0 0
M9 grau-gelb, weiß-gelb, glänzend, stecknadelkopfgroß,
δ-Hämolyse
3 2,5
M10 grau-blass, grau, feucht, stecknadelkopfgroß 8 6,8
M11 grau, stecknadelkopfgroß 3 2,5
M12 grau-blass, feucht, klein 1 0,8
M13 grau, grau-weiß, blassgrau, glänzend, klein 6 5,1
M14 grau, klein 1 0,8
M15 grau-weiß, erhabenes Zentrum 1 0,8
M16 weiß, glänzend, stecknadelkopfgroß 2 1,7
M17 weiß, klein 1 0,8
M18 gelb, gelb-weiß, deckfarben, stecknadelkopfgroß 4 3,4
40
Morphologietyp Kulturmorphologie
n
%
M19 gelb, klein 1 0,8
M20 gelb, grau-gelb, größer 3 2,5
M21 grau, grau-weiß, glänzend, stecknadelkopfgroß, δ-
Hämolyse
5 4,2
M22 weiß-gelb, gelblich, stecknadelkopfgroß, δ-Hämolyse 4 3,4
M23 weiß, glänzend, stecknadelkopfgroß, δ-Hämolyse 1 0,8
M24 weiß, stecknadelkopfgroß, δ-Hämolyse 1 0,8
M25 weiß, klein, δ-Hämolyse 1 0,8
Gesamt 118 100
1) kleiner als Stecknadelkopfgroß
2) größer als stecknadelkopfgroß
Tabelle 27 stellt die Ergebnisse der kulturmorphologischen Untersuchung von 12 Isolaten
einer Ziege dar.
Tabelle 27. Ergebnisse der kulturmorphologischen Untersuchung 12 verschiede-
ner KNS-Isolate aus einer Euterhälfte einer Ziege1)
Datum2)
Kulturmorphologie Morphologietyp
21.05. weiß, stecknadelkopfgroß, δ-Hämolyse M24
26.05. grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
26.05. weiß-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
24.06. grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
18.07. grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
23.07. grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
28.08. grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
05.09. weiß-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
16.10. grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
22.10. grau-blass, feucht, klein M12
22.10. weiß, klein M17
18.11. grau-blass, feucht, weißer Punkt in der Mitte der Kolonien, klein M5
1) Betrieb 3, Ziege 35, rechte Hälfte, Probennahme über die gesamte Laktation, Auflistung in chronologischer Reihenfolge
2)Datum der Untersuchung, alle Proben entstammen derselben Laktationsperiode
41
3.2.2 Ergebnisse der biochemischen Identifizierung
Bei der biochemischen Untersuchung der 17 KNS-Referenzstämme mit dem ID32
Staph-Test konnte der überwiegende Teil der untersuchten Kulturen eindeutig identifiziert
werden (Tabelle 28 im Anhang). Bei der Untersuchung der 35 Feldisolate hingegen
erwiesen sich die Ergebnisse in den meisten Fällen als nicht interpretierbar. Es konnten
nur 4 Kulturen (11,4%) identifiziert werden. In 31 Fällen (88,6%) war keine oder nur eine
zweifelhafte Identifizierung (Tabelle 31) möglich.
Tabelle 28 (Anhang) gibt eine Übersicht über die Ergebnisse der biochemischen Reaktio-
nen.
Tabelle 29 (Anhang) und Tabelle 30 (Anhang) stellen die Ergebnisse der Untersuchun-
gen aller 17 Referenzstämme und der 4 identifizierten Feldstämme nach Auswertung
mittels APILAB-Software dar. Tabelle 32 stellt beispielhaft die Ergebnisse der Untersu-
chung von 12 Isolaten von einer Ziege zusammen (Ziege 35 aus Betrieb 3). Die Auswer-
tung mittels APILAB-Software führte zu 8 verschiedenen Ergebnissen. Eine Einteilung
nach unterschiedlichen Reaktionsmustern (Auswertung der Angaben in Tabelle 28) er-
gab bei diesen Kulturen insgesamt 9 verschiedene Muster (B1 bis B9).
Tabelle 31. Gesamtergebnis der biochemischen Untersuchung der KNS-
Feldstämme, Auswertung mittels APILAB-Software
Qualität Feldstämme
n %
Identifiziert 4 11,4
Nicht identifiziert 31 88,6
Gesamt 35 100
42
Tabelle 32. Ergebnisse der biochemischen Untersuchung der 12 Isolate aus einer
Euterhälfte einer Ziege1), Auswertung mittels APILAB-Software
Datum Biochemischer
Typ
Ergebnis ID 32 Staph-Test
21.05. B4 S. hyicus/xylosus/hominis
26.05. B9 S. hyicus/xylosus/hominis
26.05. B1 S. hyicus/xylosus/hominis
24.06. B2 S. hämolyticus/warneri/simulans/equorum/hominis
18.07. B2 S. hämolyticus/warneri/simulans/equorum/hominis
23.07. B8 S. hämolyticus/warneri/equorum/simulans/hominis
28.08. B7 S .hämolyticus/warneri/eqourum/simulans/hominis/lentus
05.09. B6 S. warneri/epidermidis/hominis/equorum/capitis
16.10. B1 S. hominis/chromogenes/aureus
22.10. B3 S. xylosus/sciuri
22.10. B1 S. equorum/simulans
18.11. B5 S. epidermidis
1) Betrieb 3, Ziege 35, rechte Hälfte, Probennahme über die gesamte Laktation, Auflistung in chronologischer Reihenfolge
3.2.3 Ergebnisse der Identifizierung mittels unterschiedlicher Sensitivität
gegenüber Antibiotika
Im Agardiffusionstest zeigten die 17 Referenzstämme gegen die 5 Antibiotika insgesamt
7 verschiedene Reaktionsmuster. Diese Resistenzmuster wurden mit fortlaufenden Num-
mern bezeichnet (R1 bis R7). Eine eindeutige Zuordnung zwischen KNS-Spezies und
Resistenzmuster im Agardiffusionstest gelang lediglich bei 3 Referenzstämmen (S.
epidermidis, S. hominis, S. xylosus). Alle übrigen Muster ließen sich mehreren KNS-
Spezies zuordnen. Die Muster R3 und R4 konnten jeweils 2 Spezies (S.
saprophyticus/S. sciuri bzw. S. cohnii/S. lentus) zugeordnet werden. Jeweils 5 KNS-
Spezies zeigten identische Resistenzmuster (R1 bzw. R2) im Agardiffusionstest. Tabelle
33 zeigt die Ergebnisse des Resistenztests der Referenzstämme.
43
Tabelle 33. Reaktionsmuster der 17 KNS-Referenzstämme im Agardiffusionstest
Referenzstamm
Antbiotikum
Resistenz-
muster
Novo-
biocin
Desferi-
oxamin
Fosfo-
mycin
Poly-
myxin B
Furazo-
lidon
S. auricularis E R R E E R1
S. capitis E R R E E R1
S. caprae E R R E E R1
S. hämolyticus E R R E E R1
S. warneri E R R E E R1
S. chromogenes E R E E E R2
S. hyicus E R E E E R2
S. lugdunensis E R E E E R2
S. simulans E R E E E R2
S. schleiferi E R E E E R2
S. cohnii R R E E E R3
S. lentus R R E E E R3
S. saprophyticus R R R E E R4
S. sciuri R R R E E R4
S. epidermidis E E E E E R5
S. hominis E E R E E R6
S. xylosus R R E R E R7
Im Resistenztest entsprachen die Reaktionsmuster von 93 der 118 KNS-Feldstämme
(78,8%) einem der 7 Reaktionsmuster der Referenzstämme. Bei den übrigen 25
Feldstämmen traten insgesamt 6 weitere Reaktionsmuster (Resistenzmuster) auf, die mit
fortlaufenden Nummern bezeichnet wurden (R8 bis R13). Tabelle 34 stellt die Ergebnisse
der Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeiten aller 118 Feldstämme dar.
44
Tabelle 34. Reaktionsmuster der 118 KNS- Feldstämme im Agardiffusionstest
Resis-
tenz-
muster
Antibiotikum
n
% Novo-
biocin
Desferi-
oxamin
Fosfo-
mycin
Poly-
myxin B
Furazo-
lidon
R1 E R R E E 34 28,8
R2 E R E E E 34 28,8
R3 R R E E E 5 4,2
R4 R R R E E 7 5,9
R5 E E E E E 10 8,5
R6 E E R E E 2 1,7
R7 R R E R E 1 0,8
R8 E R R R E 9 7,6
R9 E R E R E 8 6,8
R10 E R E E R1) 4 3,4
R11 R R R R E 2 1,7
R12 E E R R E 1 0,8
R13 E R R E R1) 1 0,8
Gesamt 118 100
1) 5 Feldisolate reagierten resistent gegenüber Furazolidon. Sie wurden als Mikrokokken eingestuft und dementsprechend nicht in die
Untersuchung mittels t-DNA-PCR einbezogen
Alle 12 Isolate aus einer Euterhälfte einer Ziege (Betrieb 3, Ziege 35, rechte Hälfte)
reagierten im Resistenztest identisch (Resistenzmuster R2).
45
3.2.4 Untersuchung der Kulturen mittels t-DNA-PCR
Bei der Untersuchung der Referenzstämme mittels t-DNA-PCR ließen sich insgesamt 10
verschiedene Amplifikatmuster (A1bis A10) unterscheiden. Verschiedene Spezies
Koagulase-negativer Staphylokokken zeigten identische Muster ihrer Amplifikate. Eine
eindeutige Zuordnung unter den in die Untersuchung einbezogenen Referenzstämmen
war bei nur 6 KNS-Spezies möglich.11 der eingesetzten Referenzstämme zeigten keine
eindeutigen Amplifikatmuster in der t-DNA-PCR. Drei dieser Muster konnten jeweils 2
Referenzstämmen, und ein Muster konnte 5 Referenzstämmen zugeordnet werden.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
M: Marker, 1-3: S. simulans, 4-6: S. xylosus,
7-9: S. epidermidis, 10: Aqua dest.
Abb. 7 t-DNA-PCR von Referenzstämmen
Tabelle 35 informiert über die Zuordnung vorgenannter Amplifikatmuster zu den
untersuchten KNS-Referenzstämmen.
46
Tabelle 35. Ergebnisse der Untersuchung der 17 KNS-Referenzstämme
mittelst-DNA-PCR
Referenzstamm Amplifikatmuster
S. chromogenes A1
S. hyicus A1
S. epidermidis A1
S. saprophyticus A1
S. xylosus A1
S. caprae A2
S. simulans A2
S. lentus A3
S. sciuri A3
S. auricularis A4
S. lugdunensis A4
S. hominis A5
S. capitis A6
S. hämolyticus A7
S. warneri A8
S. cohnii A9
S. schleiferi A10
Bei der Untersuchung der KNS-Feldstämme mittels t-DNA-PCR ließen sich insgesamt
85 Isolate den Amplifikatmustern A1 bis A3 und A5 der Referenzstämme zuordnen (Ta-
belle 36). Bei den 28 verbleibenden Feldstämmen zeigten sich 27 weitere unterscheid-
bare Amplifikatmuster, die jedoch keinem Referenzstamm-Amplifikatmuster zuzuordnen
waren.
Tabelle 36. Ergebnisse der Untersuchung der Feldstämme mittels t-DNA-PCR
Amplifikatmuster n %
A1 45 39,8
A2 37 32,7
A3 2 1,8
A5 1 0,9
A11-A37 28 24,8
Gesamt 113 100
47
Die 12 Isolate aus einer Euterhälfte einer Ziege (Betrieb 3, Ziege 35, Probennahme über
die gesamte Laktation) wiesen das gleiche Amplifikatmuster (A1) (Abb. 8) auf.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
M: Marker, 1-9: Proben der Ziege 35, 10: Aqua dest.
Abb. 8 Amplifikatmuster der Ziege 35
3.3 Ergebnisse der Differenzierung der Koagulase-negativen Staphylokokken
Von den 118 präsumtiv als KNS bezeichneten Feldisolaten erwiesen sich 5 als Mikro-
kokken (Tabelle 34 unter 4.2.3). 69 Feldstämme (58,5%) konnten 9 verschiedenen KNS-
Spezies zugeordnet werden. Die Zuordnung erfolgte aufgrund des Vergleiches mit den
Amplifikat- und Resistenzmustern der Referenzstämme (Tabelle 37). Lediglich S. homi-
nis zeigte ein eindeutiges Amplifikat- und Resistenzmuster (A5 und R6). Bei den übrigen
KNS-Spezies wurde die Kombination des jeweiligen Amplifikat- bzw. Resistenzmusters
zur Identifikation herangezogen. Da die Referenzstämme von S. hyicus und S. chromo-
genes mit A1 und R2 identische Muster aufwiesen, wurde in diesen Fällen die Kultur-
morphologie zur Differenzierung mit berücksichtigt.
Tabelle 37 stellt die Amplifikat- und Resistenzmuster der Referenzstämme dar. Tabelle
38 gibt eine Übersicht über das Gesamtergebnis der Speziesdifferenzierung der KNS-
Feldstämme. In Tabelle 39 (Anhang) werden im Einzelnen die Amplifikat- und Resis-
tenzmuster der Feldstämme aufgeführt, die nicht einem Referenzstamm zuzuordnen
waren.Tabelle 39 gibt das Gesamtergebnis der Untersuchung der 12 Isolate aus einer
Euterhälfte einer Ziege (Betrieb 3, Ziege 35, Probennahme über die gesamte Laktation)
wieder.
48
Tabelle 37. Amplifikat- und Resistenzmuster der 17 KNS-Referenzstämme
Referenzstamm Amplifikatmuster Resistenzmuster
S. chromogenes1) A1 R2
S. hyicus A1 R2
S. epidermidis A1 R5
S. saprophyticus A1 R4
S. xylosus A1 R7
S. caprae A2 R1
S. simulans A2 R2
S. lentus A3 R3
S. sciuri A3 R4
S. auricularis A4 R1
S. lugdunensis A4 R2
S. hominis A5 R6
S. capitis A6 R1
S. hämolyticus A7 R1
S. warneri A8 R1
S. cohnii A9 R3
S. schleiferi A10 R2
1) Da die Referenzstämme von S. chromogenes und S. hyicus die gleichen Amplifikat- und Resistenzmuster aufwiesen, wurden zur
weiteren Differenzierung typische kulturmorphologische Eigenschaften mit herangezogen (siehe Tabelle 25)
49
Tabelle 38. Speziesdifferenzierung der KNS-Feldstämme
Amplifikatmuster Resistenzmuster Speziesdiagnose Feldstämme
n %
A1 R2 S. chromogenes 3 2,5
A1 R2 S. hyicus1) 17 14,4
A1 R5 S. epidermidis 8 6,8
A1 R4 S. saprophyticus 4 3,4
A1 R7 S. xylosus 1 0,8
A2 R1 S. caprae 25 21,2
A2 R2 S. simulans 8 6,8
A3 R3 S. lentus 2 1,7
A5 R6 S. hominis 1 0,8
R10 Mikrokokken 4 3,4
R13 Mikrokokken 1 0,8
Nicht zuzuordnen 44 37,3
Gesamt 118 100,0
1) Die hohe Vorkommenshäufigkeit von S. hyicus resultiert aus dem 12maligem Nachweis bei einer Ziege
(Betrieb 3, Ziege 35)
Tabelle 39. Gesamtergebnis der Untersuchung von 12 KNS-Isolaten einer Ziege1)
Lfd. Nummer
Datum Morphologie-typ
Biochemischer Typ
Resistenz-muster
Amplifikat-muster
1 21.05. M24 B4 R2 A1
2 26.05. M5 B9 R2 A1
3 26.05. M5 B1 R2 A1
4 24.06. M5 B2 R2 A1
5 18.07. M5 B2 R2 A1
6 23.07. M5 B8 R2 A1
7 28.08. M5 B7 R2 A1
8 05.09. M5 B6 R2 A1
9 16.10. M5 B1 R2 A1
10 22.10. M12 B3 R2 A1
11 22.10. M17 B1 R2 A1
12 18.11. M5 B5 R2 A1 1)
Betrieb 3, Ziege 35, rechte Hälfte, Probennahme über die gesamte Laktation, Auflistung in
chronologischer Reihenfolge
50
3.4 Differenzierte KNS-Spezies in Bezug zu Herkunft und Zellzahl und
Hälftendifferenz
S. caprae wurde in allen 6 Betrieben, in denen sich KNS weiter differenzieren ließen
(Betrieb 1 bis 4 sowie Betrieb 6 und 9), nachgewiesen. S. epidermidis wurde nur in Be-
trieb 1 nachgewiesen, während S. simulans in 3 Betrieben (Betrieb 1, 2 und 4) auftrat. S.
hyicus konnte ebenfalls in 3 Betrieben nachgewiesen werden (Betrieb 1, 3 und 6). S.
saprophyticus und S. lentus wurden in jeweils 2 Betrieben (Betrieb 1 und 3, Betrieb 2
und 3) nachgewiesen, während S. chromogenes nur in Betrieb 2 auftrat. S. hominis und
S. xylosus traten jeweils nur einmal auf (Betrieb 3 bzw. Betrieb 1).
In Betrieb 3, in dem der gesamte Bestand laktierender Ziegen über den Untersuchungs-
zeitraum insgesamt 17mal untersucht wurde und in dem seitens des Betriebes zusätzlich
Teilbestandsproben eingesandt wurden (siehe Tabelle 16 unter 3.2), konnte bei zwei
Tieren ein wiederholter Erregernachweis geführt werden (Tabelle 41). S. hyicus konnte
bei der Ziege mit der Identifikationsnummer 35 (Ziege 35) insgesamt 12mal in der rech-
ten Euterhälfte nachgewiesen werden, während auf der zugehörigen linken Hälfte jeweils
kein Erregernachweis gelang. Bei der Ziege mit der Identifikationsnummer 39 (Ziege 39)
konnte S. caprae 3mal in Folge auf der linken Hälfte nachgewiesen werden, während auf
der rechten Hälfte kein Erregernachweis möglich war.
Tabelle 40 stellt die Ergebnisse der Differenzierung der KNS-Isolate in Bezug zu Pro-
beneingangsdatum, Herkunft auf Betriebs- und Einzeltierebene sowie Gehalt an somati-
schen Zellen dar.
51
Tabelle 40. Ergebnisse der Differenzierung der Koagulase-negativen
Staphylokokken (n = 69) in Bezug zu Probenahmedatum, Herkunft auf Betriebs-
und Einzeltierebene sowie Gehalt an somatischen Zellen
Betrieb 1 Ziege Rechte Hälfte Linke Hälfte
Jahr*/
Tag Monat
ZZ1) x
1000
Mikobiologisches
Ergebnis
ZZ1) x
1000
Mikrobiologisches
Ergebnis
I / 27.05. 62 3867 S. epidermidis 120 Negativ
I / 27.05. 39 1099 S. epidermidis 1711 Negativ
I / 27.05. 33 2213 S. epidermidis 321 Negativ
I /27.05. 19 98 Negativ 2195 S. epidermidis
I / 27.05. 50 1450 S. epidermidis 1347 S. simulans
I / 27.05. 114 5079 S. caprae 3754 Negativ
I / 27.05. 30 73 Negativ 1204 S. caprae
I / 27.05. 123 479 S. caprae 503 KNS (nicht ident.)2)
I / 27.05. 403) 601 S. hyicus 10 Corynebac. spp.4)
II / 28.04. 40 483 KNS (nicht ident.) 812 S. epidermidis
II / 28.04. 87 354 S. epidermidis 22 Negativ
II / 28.04. 28 1264 S. epidermidis 299 Negativ
II / 28.04. 148 1917 S. caprae 689 Negativ
II / 28.04. 15 2773 S. caprae 778 Negativ
II / 28.04. 127 865 S. caprae 230 Negativ
II / 28.04. 44 262 Negativ 465 S. caprae
II / 28.04. 88 37 Negativ 464 S. caprae
II / 28.04. 51 18 Negativ 893 S. caprae
II / 28.04. 10 1137 Negativ 912 S. caprae
II / 28.04. 137 2608 S. caprae 3698 Corynebac. spp.
II / 28.04. 59 339 S. caprae 807 KNS5)
II / 28.04. 56 1105 S. xylosus 186 Negativ
II / 28.04. 31J 54 S. saprophyticus 37 Negativ
II / 28.04. 149 92 S. saprophyticus 170 Negativ
II / 28.04. 84 286 S. saprophyticus 37 Negativ
II / 28.04. L3 1339 S. simulans 276 Negativ
II / 28.04. 119 184 Negativ 2803 S. simulans
II / 28.04. 90 1358 S. simulans 3301 KNS (nicht ident.)
II / 28.04. 17 578 S. hyicus 800 S. hyicus
52
Betrieb 2 Ziege Rechte Hälfte Linke Hälfte
Datum ZZ1) x
1000
Mikobiologisches
Ergebnis
ZZ1) x
1000
Mikrobiologisches
Ergebnis
I / 16.12. 62 339 Negativ 1478 S. caprae
I / 16.12. 117 1365 S. caprae 496 Negativ
I / 16.12. 67 5141 S. caprae 7741 S. caprae
I / 16.12. 59 290 S. caprae 2808 S. simulans
I / 16.12. 45 2495 S. simulans 117 Negativ
I / 16.12. 61 14348 S. chromogenes 493 Negativ
I / 16.12. 77 7 Negativ Sekretv.6) S. chromogenes
I / 16.12. 93 13725 Äsk.-pos. Scc.5) 933 S. chromogenes
I / 16.12. 6 91 Corynebac. spp. 856 S. lentus
Betrieb 3 Ziege Rechte Hälfte Linke Hälfte
Datum ZZ1) x
1000
Mikobiologisches
Ergebnis
ZZ1) x
1000
Mikrobiologisches
Ergebnis
I / 21.05. 35 778 S. hyicus 328 Negativ
I / 26.05. 35 371 S. hyicus 247 Negativ
I / 26.05. 35 367 S. hyicus 223 Negativ
I / 24.06. 35 1303 S. hyicus 131 Negativ
I / 18.07. 35 3307 S. hyicus 247 Negativ
I / 23.07. 35 1340 S. hyicus 91 Negativ
I / 28.08. 35 1778 S. hyicus 143 Negativ
I / 05.09. 35 3068 S. hyicus 203 Negativ
I / 16.10. 35 1810 S. hyicus 2567 Negativ
I / 22.10. 35 888 S. hyicus 307 Negativ
I / 22.10. 35 1295 S. hyicus 461 Negativ
I / 18.11. 35 1881 S. hyicus 243 Negativ
I / 26.05. 38 743 Negativ 694 S. hyicus
I / 18.11. 39 378 Negativ 3587 S. caprae
I / 29.12. 39 12177 Negativ 12213 S. caprae
II / 08.01. 39 6 Negativ Sekretv. S. caprae
I / 08.01. 2 480 Negativ 2262 S. caprae
I / 16.10. 16 1498 S. saprophyticus 900 S. caprae
I / 19.03. 18 348 S. hominis 402 Mischkultur
I / 21.05. 33 83 S. lentus 36 Negativ
53
Betrieb 4 Ziege Rechte Hälfte Linke Hälfte
Datum ZZ1) x
1000
Mikobiologisches
Ergebnis
ZZ1) x
1000
Mikrobiologisches
Ergebnis
II / 03.07. Silke 527 Negativ 1150 S. simulans
II / 03.07. Diarea 6185 S. caprae 1168 S. simulans
Betrieb 6 Ziege Rechte Hälfte Linke Hälfte
Datum ZZ1) x
1000
Mikobiologisches
Ergebnis
ZZ1) x
1000
Mikrobiologisches
Ergebnis
II / 15.06. Samuela 531 S. hyicus 59 Negativ
II / 15.06. Salome 7742 S. caprae 3756 Coryneb.spp.
Betrieb 9 Ziege Rechte Hälfte Linke Hälfte
Datum ZZ1) x
1000
Mikobiologisches
Ergebnis
ZZ1) x
1000
Mikrobiologisches
Ergebnis
II / 12.08. Suse 420 S. caprae 705 Äsk.-pos. Scc.
*Untersuchungsjahr 1)
Zellzahl/ml Milch 2)
Koagulase-negative Staphylokokken, nicht identifiziert 3) Doppelt auftretende Tiere, fett
gekennzeichnet 4)
Corynebacterium spp. 5)
Äskulin-positive Streptokokken 6)
Sekretveränderung
In den meisten Fällen liegt auf der Hälfte mit Erregernachweis ein im Vergleich mit der
zugehörigen bakteriologisch negativen Hälfte deutlich höherer Zellgehalt vor. Der geo-
metrische Mittelwert der Euterhälften mit Nachweis von S. caprae liegt mit1 377 000
Zellen/ml um das 4,8fache höher als der geometrische Mittelwert der zugehörigen Euter-
hälften ohne Erregernachweis mit 288 000 Zellen/ml. Der geometrische Mittelwert der
Euterhälften mit Nachweis von S. epidermidis liegt mit1 449 000 Zellen/ml um das
7,7fache höher als der geometrische Mittelwert der zugehörigen Euterhälften ohne Erre-
gernachweis mit 187 000 Zellen/ml. Der geometrische Mittelwert der Euterhälften mit
Nachweis von S. xylosus liegt mit 1 238 000 Zellen/ml um das 3,2fache höher als der
geometrische Mittelwert der zugehörigen Euterhälften ohne Erregernachweis mit
391 000 Zellen/ml. Im Falle des Nachweises von S. saprophyticus und S. hyicus sind die
entsprechenden geometrischen Mittelwerte um der Faktor 1,8 bzw. 2,7 gegenüber den
bakteriologisch negativen Hälften erhöht.
Beim Nachweis von S. caprae, S. epidermidis und S. simulans differiert der SCSZiege des
geometrischen Mittelwertes gegenüber der zugehörigen bakteriologisch negativen Hälfte
um 1,1, bzw. 1,4 und bei S. simulans um 1,5. Beim Nachweis von S. xylosus und S. hyi-
cus differiert der SCSZiege gegenüber der zugehörigen bakteriologisch negativen Hälfte
um 0,8, beim Nachweis von S. saprophyticus um 0,5.
Tabelle 41 stellt den Gehalt an somatischen Zellen von Ziegenhälften mit identifizierten
KNS dem Zellgehalt der zugehörigen bakteriologisch negativen Hälfte gegenüber.
54
Tabelle 41. Gehalt an somatischen Zellen und Somatic Cell ScoreZiege1)von
Ziegenhälften mit differenzierten Koagulase-negativen Staphylokokken im
Vergleich mit der zugehörigen Hälfte ohne Erregernachweis
S. caprae2)
Hälfte mit Erregernachweis Hälfte ohne Erregernachweis
Zellzahl x 10004) SCSZiege Zellzahl x 10004) SCSZiege
5079 4,8 3754 4,6
3587 4,6 378 3
2262 4,2 480 3,1
1917 4,1 689 3,4
1478 3,9 339 2,9
1365 3,9 496 3,2
1204 3,8 73 1,8
912 3,6 1137 3,8
893 3,6 18 0,8
465 3,1 262 2,7
464 3,1 37 1,3
Mittel 13773) 3,9 2883) 2,8
S.epidermidis
Hälfte mit Erregernachweis Hälfte ohne Erregernachweis
Zellzahl x 10004) SCSZiege Zellzahl x 10004) SCSZiege
3867 4,6 120 2,1
2213 4,2 321 2,8
2195 4,2 98 2
1264 3,8 299 2,8
1099 3,7 1711 4
354 2,9 22 0,9
Mittel 14493) 3,9 1873) 2,5
55
S. simulans
Hälfte mit Erregernachweis Hälfte ohne Erregernachweis
Zellzahl x 10004) SCSZiege Zellzahl x 10004) SCSZiege
2803 4,4 184 2,4
2495 4,3 117 2,1
1339 3,9 276 2,7
1150 3,8 527 3,2
Mittel 18123) 4,1 2373) 2,6
S. saprophyticus
Hälfte mit Erregernachweis Hälfte ohne Erregernachweis
Zellzahl x 10004) SCSZiege Zellzahl x 10004) SCSZiege
286 2,8 37 1,3
92 1,9 170 2,4
54 1,6 37 1,3
Mittel 1123) 2,1 623) 1,6
S. hyicus2)
Hälfte mit Erregernachweis Hälfte ohne Erregernachweis
Zellzahl x 10004) SCSZiege Zellzahl x 10004) SCSZiege
778 3,5 328 2,9
694 3,4 743 3,4
531 3,2 59 1,6
Mittel 6593) 3,4 2433) 2,6
1) SCSZiege = log4 (Zellzahl/100000) + 2
2) Tiere mit wiederholtem Nachweis desselben Erregers (Ziege 35 und Ziege 39 aus Betrieb 1, Tabelle 41) wurden jeweils nur einmal
in die Auswertung einbezogen) 3) Geometrisches Mittel
4) jeml Milch
Bei Ziege 35 liegt mit einer Ausnahme der Zellgehalt auf der Euterhälfte mit Nachweis
von S. hyicus höher als auf der Euterhälfte ohne Erregernachweis. Die Zellzahlen unter-
liegen auf beiden Euterhälften mehr oder weniger großen Schwankungen. Der geometri-
sche Mittelwert der Euterhälfte mit Nachweis von S. hyicus liegt insgesamt mit 1 239 000
Zellen/ml um das 4,6fache höher als der geometrische Mittelwert der zugehörigen Euter-
hälften ohne Erregernachweis mit 268 000 Zellen/ml. Der SCSZiege des geometrischen
Mittelwertes differiert gegenüber der zugehörigen bakteriologisch negativen Hälfte um
1,1.
Tabelle 42 und Abbildung 9 stellen die Zellzahlverläufe der korrespondierenden Euter-
hälften bei der Ziege 35 mit 12maligem Nachweis von S. hyicus dar.
56
Tabelle 42. Gehalt an somatischen Zellen und Somatic Cell ScoreZiege1)beim
wiederholten Nachweis von S. hyicus in der Euterhälften einer Ziege im Vergleich
mit der zugehörigen Hälfte ohne Erregernachweis
S. hyicus, Ziege 35 aus Betrieb 3
Datum
Hälfte mit Erregernachweis Hälfte ohne Erregernachweis
Zellzahl x 10003) SCSZiege Zellzahl x 10003) SCSZiege
I / 21.05. 778 3,5 328 2,9
I / 26.05. 371 2,9 247 2,7
I / 26.05. 367 2,9 223 2,6
I / 24.06. 1303 3,9 131 2,2
I / 18.07. 3307 4,5 247 2,7
I / 23.07. 1340 3,9 91 1,9
I / 28.08. 1778 4,1 143 2,3
I / 05.09. 3068 4,5 203 2,5
I / 16.10. 1810 4,1 2567 4,3
I / 22.10. 888 3,6 307 2,8
I / 22.10. 1295 3,8 461 3,1
I / 18.11. 1881 4,1 243 2,6
Mittel 12392) 3,8 2682) 2,7
1) SCSZiege = log4 (Zellzahl/100000) + 2
2) Geometrisches Mittel
3)je ml Milch
Abb. 9 Somatic Cell ScoreZiege beim wiederholten Nachweis von S. hyicus in der
Euterhälfte einer Ziege im Vergleich mit der zugehörigen Hälfte
ohne Erregernachweis
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
I / 2
1.0
5.
I / 2
6.0
5.
I / 2
6.0
5.
I / 2
4.0
6.
I / 1
8.0
7.
I / 2
3.0
7.
I / 2
8.0
8.
I / 0
5.0
9.
I / 1
6.1
0.
I / 2
2.1
0.
I / 22.1
0.
I / 1
8.1
1.
Score
Probe
SCS Ziege
Hälfte mit Erregernachweis Hälfte ohne Erregernachweis
57
4 Diskussion
4.1 Makroskopische und zytobakteriologische Untersuchung
In den 12 untersuchten Milchziegenherden wurde ein guter Eutergesundheitsstatus
vorgefunden. 99,6% der untersuchten Hälftegemelksproben (2029 von 2038 Proben)
waren optisch unverändert. Bei 82,7% dieser Proben führte die bakteriologische
Untersuchung zu einem negativen Ergebnis. Diese Beobachtungen stimmen mit den
Erfahrungen des hessischen Eutergesundheitsdienstes und der amtlichen
Milchhygieneüberwachung aus den Jahren 1995 bis 2009 überein (SCHLEZ, 2009;
KLOPPERT, 2009). Eine Untersuchung von OELFKEN (1993) in 5 Ziegenbeständen
brachte ähnliche Ergebnisse. Hier waren 77,7% der Hälftegemelksproben ohne
Erregernachweis. Entsprechend lag auch in einer australischen Studie von RYAN und
GREENWOOD (1990) nur bei 16,7% der untersuchten Euterhälften von Milchziegen
eine bakterielle Infektion vor.
Unter den bakteriologisch positiven Proben dominieren in der vorliegenden Studie
Koagulase-negative Staphylokokken. Bei den Gesamtbestandsuntersuchungen wurden
KNS in 10,7% der Hälftegemelksproben nachgewiesen. Andere Bakterien traten
wesentlich seltener auf (Corynebacterium spp. 2,6%, Äskulin-positive Streptokokken
0,7%, S. aureus 0,5%). Das Vorherrschen Koagulase-negativer Stapylokokken bei der
subklinischen Mastitis der Ziege stimmt weitgehend mit den Literaturangaben überein.
So wurden in einer Studie von MANSER (1986) in 5 kalifornischen, klinisch unauffälligen
Ziegenherden bei 80% der bakteriologisch positiven Milchproben KNS nachgewiesen.
RYAN und GREENWOOD (1990) fanden bei der Untersuchung von 4 australischen
Ziegenherden in 13,3% der Euterhälften KNS. TOMITA et al. (2003) und GAUCHER et
al. (2003) fanden in 63,5% bzw. 75% aller bakteriologisch positiven Ziegenmilchproben
KNS. Auch SCHAEREN und MAURER (2006) wiesen in einer schweizerischen Studie
KNS als häufigste Erreger in 17,3% der untersuchten Hälftegemelksproben nach,
während die Nachweisrate für Corynebacterium bovis und S. aureus bei 5,3 bzw. 0,6%
lag. Demgegenüber wurden in einer australischen Studie von CHUBB und ORCHARD
(1985) keine KNS nachgewiesen, hier dominierten Koagulase-positive Staphylokokken,
wie S. aureus.
Der geometrische Mittelwert der Zellzahl aller Hälftegemelksproben aus den
Gesamtbestandsuntersuchungen korrelierte bei den 3 Betrieben mit den meisten
untersuchten Proben nicht mit dem Anteil bakteriologisch positiver Proben (Tabelle 43).
58
Tabelle 43. Geometrischer Mittelwert des Gehaltes an somatischen Zellen in Bezug
zum Anteil bakteriologisch positiver Hälftegemelksproben
Betrieb Geometrischer Mittelwert
der Zellzahl1)/ml
Bakteriologisch positive
Hälftegemelksproben in %1)
1 187 000 20,4
3 389 000 11,2
2 693 000 19,6
1) siehe Tabelle 21 und 22
Nach KNAPPSTEIN et al. (2007) gibt es für die Beurteilung der Eutergesundheit der
Ziege noch keine allgemeingültigen Kriterien. In der Literatur finden sich
dementsprechend sehr unterschiedliche Angaben zum physiologischen Zellgehalt
(Tabelle 1). Während beispielsweise ROGUINSKY et al. (1980) bei eutergesunden
Herden 1 100 000 Zellen/ml als arithmetischen Mittelwert angeben, liegt nach
KALOGRIDOU-VASSILIADOU et al. (1992) dieser Mittelwert bei nur 270 000 Zellen/ml.
Ebenso unterschiedlich sind die Angaben zum geometrischen Mittelwert der Zellzahl bei
eutergesunden Ziegenherden. Sie liegen zwischen 337 000 Zellen/ml (HAHN et al.,
1992) und 1 490 000 Zellen/ml (MCDOUGALL et al., 2002).
Einen Zellzahlgrenzwert für Ziegenmilch zur Abgrenzung eines physiologischen Zustan-
des gegenüber einem pathologischen Geschehen festzulegen erscheint daher weder auf
tierindividueller noch auf Bestandsebene möglich. Bakteriologisch negative Hälftege-
melksproben wiesen in der vorliegenden Studie sowohl hohe als auch niedrige
Zellzahlen auf. Zu vergleichbaren Ergebnissen kamen auch PETTERSEN (1981) und
SHELDRAKE et al. (1981). Eine geringe Zahl somatischer Zellen stellt zwar einen Hin-
weis auf eine gesunde Euterhälfte dar, jedoch ist ein hoher Zellgehalt nicht gleichbedeu-
tend mit dem Verdacht auf eine Infektion einer Euterhälfte mit pathogenen Keimen.
Selbst bei einem Zellgehalt von > 10 Millionen Zellen/ml liegt die
Nachweiswahrscheinlichkeit für einen Erreger bei nur 50% (KLOPPERT et al., 2000;
EHRENBERG et al., 2002). Dies macht deutlich, dass bei der Ziege ein erhöhter
Zellgehalt sowohl physiologisch als auch pathologisch sein kann.
Beim Vergleich der Zellzahl beider Euterhälften eines Individuums mit einseitigem KNS-
Nachweis (n = 97) ergab sich in der vorliegenden Studie bei den Hälften mit KNS-Nach-
weis ein geometrischer Mittelwert von 524 000 Zellen/ml und bei den korrespondieren-
den Hälften derselben Ziegen ohne Erregernachweis ein geometrischer Mittelwert von
236 000 Zellen/ml (Tabelle 24).
Vergleicht man die Höhe der Zellzahl der beiden Hälften desselben Ziegeneuters
miteinander, so erweist sich dieser Hälftenvergleich als geeignet, um anhand des Unter-
schiedes des Zellzahlgehaltes der beiden Hälften den Verdacht auf eine einseitige
subklinische Mastitis aussprechen zu können. KLOPPERT et. al (2000) und
EHRENBERG et. al (2002) wiesen nach, dass mit zunehmender Differenz des Zellgehal-
59
tes zwischen den Hälften einer Ziege die Wahrscheinlichkeit für einen Erregernachweis
auf der Hälfte mit der höheren Zellzahl zunimmt. Zu diesem Ergebnis kamen auch
PETTERSEN (1981), POUTREL und LERONDELLE (1983), DEUTZ et al. (1990) sowie
SMITH und SHERMAN (1994).
4.2 Ergebnisse der verschiedenen Methoden zur Spezies-Differenzierung
isolierter Koagulase-negativer Staphylokokken
4.2.1 Kulturmorphologische Untersuchung
Die Kulturmorphologie erwies sich als wenig geeignet zur Speziesdifferenzierung Koagu-
lase-negativer Staphylokokken. Die Referenzstämme von S. cohnii, S. hämolyticus, S.
schleiferi, S. hominis und S. simulans zeigten die gleiche oder eine annähernd identische
Morphologie auf Blut-Festnährstoffböden. Ebenso zeigten die Referenzstämme von S.
lugdunensis, S. xylosus, S. chromogenes und S. saprophyticus eine gleiche oder sehr
ähnliche Kulturmorphologie. Auch für die Kulturen von S. epidermidis und S. auricularis
konnten keine eindeutigen Unterscheidungskriterien gefunden werden (Tabelle 25).
Insgesamt traten bei den 17 Referenzstämmen 9 unterscheidbare Morphologietypen auf.
Nach BLOBEL und SCHLIESSER (1994) können KNS-Spezies schon durch reines Be-
trachten der Wachstumseigenschaften unterschieden werden. Dies konnte in der vorlie-
genden Studie nicht bestätigt werden. Die Unterschiede der Koloniemorphologie von ver-
schiedenen KNS-Spezies erschienen für das bloße Auge in vielen Fällen nicht
spezifizierbar. Nur in solchen Fällen, wo starke morphologische Unterschiede erkennbar
waren, wie deutliche Größenunterschiede der Kolonien, unterschiedliche Pigmentierung
oder Oberflächenbeschaffenheit, war die Untersuchung der Koloniemorphologie hilfreich.
Als alleinige Methode zur KNS-Spezies-Differenzierung erwies sich die Koloniemorpholo-
gie jedoch als zu ungenau und daher nicht geeignet.
Den 9 unterscheidbaren Morphologietypen der verwendeten Referenzstämme ließen
sich immerhin 76 (64,4%) der 118 Feldstämme zuordnen. Bei den verbleibenden 42
Feldstämmen zeigten sich 16 weitere von der Morphologie der Referenzstämme abwei-
chende Morphologietypen.
4.2.2 Untersuchung mit dem ID32 Staph Test
Alle 17 Referenzstämme und eine Auswahl von 35 Feldstämmen wurden mit dem ID32
Staph Test untersucht. Bei den Referenzstämmen konnten 11 Stämme (64,7%) mit die-
ser Methode identifiziert werden (Tabelle 29). Bei der Untersuchung der Feldstämme
konnten jedoch nur 4 Isolate (11,4%) identifiziert werden (Tabelle 30 und 31). Besonders
auffällig war das Ergebnis der Untersuchung von 12 Isolaten derselben Ziege (Tabelle
32), die zu 8 unterschiedlichen Ergebnissen geführt hat. Demgegenüber zeigten diese
12 Feldstämme bei der Untersuchung mittels t-DNA-PCR jeweils das gleiche Amplifikat-
muster sowie im Empfindlichkeitstest gegenüber Antibiotika das gleiche Resistenzmus-
60
ter. Der ID32 Staph Test erwies sich in der vorliegenden Arbeit somit als ungeeignet für
die Untersuchung von Feldstämmen.
Hinweise zu widersprüchlichen oder fehlerhaften Ergebnissen bei Systemen zur
biochemischen Differenzierung finden sich auch in der Literatur. In einer Untersuchung
von VERNOZY et al. (1994), die Isolate aus Ziegenkäse untersuchten, wird ein Novobio-
cin-empfindliches Isolat mittels ID32 STAPH-System als S. warneri identifiziert, während
eine Untersuchung mit dem API-STAPH IDENT-System S. xylosus ergibt. Auch BEDIDI-
MADANI et al. (1992) stellten bei der Untersuchung von Isolaten aus Ziegenmilch unter-
schiedliche Resultate bei Verwendung verschiedener Identifikations-Systeme (API-
STAPH und ATB 32 STAPH) fest. HARVEY und GILMOUR (1988) verwendeten zur
Identifizierung von Staphylokokken aus Ziegenmilch unter anderem das API-STAPH-Sys-
tem, welches S. caprae jedoch nicht erkennen konnte und S. chromogenes fehlerhaft als
S. hyicus subsp. hyicus identifizierte. CHESNEAU et al. (1992) untersuchten mittels ID32
Staph-System Isolate aus Proben humanen Ursprungs, aus Ziegenmilch- und
Geflügelproben sowie Lebensmittelproben. Hier fällt besonders auf, dass das ID32
Staph-System keine einzige der KNS-Spezies, die von Ziegenmilchproben stammten,
identifizieren konnte, während die zum Vergleich angewandte rRNA Gen-Restriktions-
Methode sämtliche KNS-Isolate aus den Ziegenmilchproben (S. caprae und S.
chromogenes) identifizieren konnte. Die Ergebnisse des ID32 Staph-Tests haben bei der
Untersuchung von Isolaten, insbesondere aus Ziegenmilchproben, offensichtlich eine zu
hohe Fehlerquote. Erklärungsansätze dafür finden sich in der Literatur allerdings nicht.
MATTHEWS et al. (1990) verglichen das API Staph-Trac-System mit dem Vitec Gram-
Positive Identification-System (GPI). In der Studie wurden Isolate aus Kuhmilchproben
untersucht. Das API Staph-Trac-System identifizierte 25% der S. hämolyticus-Isolate und
100% der S. aureus-, S. capitis-, S. cohnii-, S. epidermidis-, S. saprophyticus- und S.
xylosus-Isolate richtig. S. chromogenes und S. simulans wurden jedoch fälschlich als S.
intermedius identifiziert. Vorteile des ID32 Staph-Tests sind die relativ einfache Handha-
bung und die schnelle Ergebnisermittlung. Da in der vorliegenden Arbeit die Teststreifen
jedoch nicht mittels Lesegerät ausgewertet werden konnten, zeigten sich Probleme in
der Auswertung der Farbreaktionen. Beispielsweise wurde beim ID 32 Staph-Test eine
Novobiocinresistenz ermittelt, während dieselben Isolate in der Resistenzprüfung mittels
Agardiffusionstest gegenüber Novobiocin empfindlich reagierten. Dies ist auf einen un-
deutlichen Farbumschlag im ID 32-Test zurückzuführen. Die Autoren VERNOZY et al.
(1994) berichten ebenfalls von der Schwierigkeit, die Farbumschläge eindeutig zu inter-
pretieren. Auffällig ist, dass in der vorliegenden Arbeit mit dem ID32 Staph-Test Refe-
renzstämme relativ gut identifiziert werden konnten, nicht aber die Feldstämme. In einem
Labor, wo es sich naturgemäß bei den zu untersuchenden Proben um Feldstämme han-
delt, ist die Anwendung des ID32 Staph-Tests aus diesem Grund wenig zielführend und
nicht empfehlenswert.
61
4.2.3 Identifizierung mittels Empfindlichkeiten gegenüber Antibiotika
Die Empfindlichkeit gegenüber den Antiinfektiva bzw. Antibiotika Novobiocin, Desferioxa-
min, Fosfomycin und Polymyxin B gilt als geeignetes Kriterium zur Spezies-Differenzie-
rung der Koagulase-negativen Staphylokokken (DEVRIESE et al. 1978, 1983;
FORSGREN und WALDER, 1983 ; HÉBERT et al., 1988; CASALS und
PRINGLER,1989; LÄMMLER, 1990; LINDSAY und RILEY, 1991; BEDIDI-MADANI et al.,
1992;TUTEJA et.al., 1993;BLOBEL und SCHLIESSER, 1994; DEVRIESE et al., 1994;
DEINHOFER und PERNTHANER, 1993; MONSEN et al., 1998). Mittels der Prüfung der
Sensibilität gegenüber Furazolidon (von RHEINBABEN und HADLOK, 1981) lassen sich
Mikrokokken von Staphylokokken abgrenzen.
Im Resistenztest gegenüber Novobiocin, Desferioxamin, Fosfomycin und Polymyxin B
zeigten die 17 Referenzstämme insgesamt 7 verschiedene Reaktionsmuster. Im
Empfindlichkeitstest stimmten jeweils die Ergebnisse von S. auricularis, S.capitis, S. cap-
rae, S.hämolyticus und S. warneri überein, ebenso die Ergebnissevon S. chromogenes,
S. hyicus, S. lugdunenis, S. simulans und S. schleiferi sowie von S. cohnii und von S.
lentus bzw. S. saprophyticus und S. sciuri (Tabelle 33). Das Ergebnis zeigt jedoch, dass
diese Methode alleine nicht ausreicht, um Staphylokokken eindeutig zu identifizieren.
DEVRIESE et. al (1994) kombinieren die Resistenzprüfung (Novobiocin, Desferioxamin,
Fosfomycin) mit biochemischen Untersuchungen (DNase und Protease) (Tabelle 10).
Zur Differenzierung mittels Antibiotikaempfindlichkeiten merkt JARLOV (1999) an, dass
Bakterien ihre Sensibilität gegenüber bestimmten antibiotischen Substanzen ändern
können. Sie könnten sowohl Resistenzen gegenüber zahlreichen Antibiotika entwickeln
als auch resistenzbestimmende Plasmide verlieren und damit wieder empfindlich gege-
nüber einem ehemals wirkungslosen Antibiotikum werden. Aus diesem Grund könnte es
bei der Bakterienidentifizierung mittels in-vitro Resistenztestung zu nicht reproduzierba-
ren Ergebnissen kommen. Diese Aussage gilt jedoch für klinisch angewandte Antibiotika.
Da die in dieser Studie verwendeten antibiotischen Substanzen jedoch nicht zur Be-
handlung von Tieren angewendet werden, ist die Resistenzbildung sehr selten. Im Re-
sistenztest entsprachen die Reaktionsmuster von 93 der insgesamt untersuchten 118
Feldstämme (78,8%) einem der 7 Reaktionsmuster der Referenzstämme. Bei den übri-
gen 25 Feldstämmen traten insgesamt 6 weitere Reaktionsmuster (Resistenzmuster)
auf. Die 12 Isolate aus einer Euterhälfte einer Ziege (Betrieb 3, Ziege 35, rechte Hälfte,
Nachweis über die gesamte Laktation) reagierten im Resistenztest immer gleich. Dies
wurde als Indiz dafür gewertet, dass es sich um denselben Feldstamm handelt. 5 Feld-
isolate erwiesen sich als resistent gegenüber Furazolidon und wurden deshalb als Mi-
krokokken angesprochen. Diese Feldstämme wurden nicht in die weitere Untersuchung
mittels t-DNA PCR einbezogen. 103 der 118 untersuchten Feldstämme (87,3%) erwie-
sen sich als Novobiocin-empfindlich. Nach DEINHOFER und PERNTHANER (1993) ist
die Novobiocin-Empfindlichkeit als Hinweis zu werten, dass es sich bei diese Stämmen
um potenziell euterpathogene KNS handelt.
62
4.2.4 Untersuchung der Proben mittels t-DNA-PCR
Durch den Einsatz molekularbiologischer Methoden kann ein Untersuchungsergebnis
wesentlich schneller als mit bakteriologisch-kulturellen Untersuchungsmethoden ermittelt
werden. Hier ist die Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), die 1985 von Kary
B. Mullis in Kalifornien entwickelt wurde, eine der am häufigsten angewendeten Verfah-
ren. Bei der PCR werden in vitro gezielt bestimmte DNA-Abschnitte, die zwischen zwei
bekannten DNA-Sequenzen liegen, mit Hilfe von speziellen Oligonukleotidprimern
vervielfältigt. Ein etabliertes Verfahren stellt hierzu die Darstellung der 16S-23S rDNA
„intergenic spacer“-Region dar. Dieser Abschnitt innerhalb der genannten ribosomalen
Gene hat je nach Spezies sowohl eine variable Länge als auch eine variable Sequenz
und ist aus diesem Grund geeignet für die Genus-, Spezies- oder Stammdifferenzierung
einzelner Bakterien. FORSMAN et al. (1997) und auch MENDOZA et al. (1998) wende-
ten diese Methode mit Erfolg bei Staphylokokken an.
MAES et al. (1997) überprüften die tRNA „intergenic spacer“-Region (tDNA-ILP) auf ihre
Eignung zur Identifikation von Staphylokokken-Spezies. Weitere Autoren hatten bereits
auf Spezifität und Eignung dieser Methode für die Identifikation verschiedener Bakterien-
Spezies hingewiesen (WELSH und MCCLELLAND, 1991; WELSH und MCCLELLAND,
1992; MCCLELLAND et al., 1992). Die tDNA-ILP variiert innerhalb nahe verwandter
Bakterienspezies signifikant und kann aus diesem Grund zur Differenzierung innerhalb
einer Gattung angewendet werden (WELSH und MCCLELLAND, 1991). MAES et al.
(1997) untersuchten dies anhand verschiedener Referenzstämme und klinischer Isolate
humaner Herkunft. Im Ergebnis zeigte sich, dass jede Staphylokokkenspezies ein indivi-
duelles, reproduzierbares Bandenmuster zeigte. Mit Ausnahme von 3 S.aureus-Isolaten
und einem S. hämolyticus-Isolat, die variable Muster aufwiesen, waren die Bandenmus-
ter von Referenzstamm und Klinik-Isolaten der gleichen Staphylokokken-Spezies nicht
unterscheidbar. Die Amplifikatmuster der Spezies S. saprophyticus und S. xylosus ähnel-
ten sich.
In der vorliegenden Arbeit sollte die Eignung der t-DNA-PCR für die Differenzierung von
Koagulase-negativen Staphylokokken tierischer Herkunft überprüft werden. Um die
Reproduzierbarkeit der Methode zu überprüfen, wurden von jedem der 17 Referenz-
stämme drei Ansätze angefertigt. Die Ansätze derselben Staphylokokkenspezies erga-
ben jeweils identische Amplifikatmuster. Die Muster waren zum Teil von denen anderer
Staphylokokken-Spezies unterscheidbar, zum Teil ähnelten sich jedoch Bandenmuster
bestimmter Staphylokokken-Spezies.
Insgesamt zeigten die 17 Referenzstämme bei der Untersuchung mittels t-DNA-PCR nur
10 eindeutig voneinander unterscheidbare Amplifikatmuster. Nicht oder kaum zu unter-
scheiden waren die Amplifikatmuster von S. chromogenes,S. hyicus, S. epidermidis, S.
saprophyticus und S. xylosus. Zudem waren jeweils die Muster von S. caprae und S.
simulans sowie von S. lentus und S. sciuri bzw. S. auricularis und S. lugdunensis gleich
(Tabelle 35). Somit zeichnete sich ab, dass mit alleiniger Anwendung dieser Methode die
63
Feldstämme nicht eindeutig identifiziert werden konnten.
Bei der Untersuchung der Feldstämme ließen sich insgesamt 85 der 113 Isolate (75,2%)
diesen 10 Amplifikatmustern der Referenzstämme zuordnen. Bei den 28 übrigen Feld-
stämmen zeigten sich dann noch 27 weitere unterschiedliche Muster (Tabelle 39 im An-
hang).
Die 12 Isolate aus einer Euterhälfte einer Ziege (Betrieb 3, Ziege 35, Probennahme über
die gesamte Laktation) wiesen jeweils das gleiche Amplifikatmuster auf. Dies lässt in
Verbindung mit dem Ergebnis aus dem Resistenztest den Schluss zu, dass es sich bei
den Isolaten um denselben Feldstamm handelt.
Für die Interpretation der Ergebnisse der t-DNA-PCR stand keine computergestützte
Analyse zur Verfügung. Dementsprechend gestaltete sich die Auswertung mit dem blo-
ßen Auge als sehr schwierig. Kleinste Fehler im Elektrophoresegel können dazu führen,
dass sich das Bandenmuster verfälscht und dass insbesondere kleine Banden nicht oder
nur sehr schwierig zu erkennen sind. Eine zusätzliche Unsicherheit kann durch die Qua-
lität der anschließenden Ausdrucke hinzukommen. Anders als auf dem Computerbild-
schirm finden sich feine Banden auf dem Ausdruck des Ergebnisses häufig nicht wieder.
MAES et al. (1997) berichten in ihrer Untersuchung von ähnlichen Schwierigkeiten. Aus
diesem Grund empfehlen die Autoren die Verwendung eines automatischen Laser- Fluo-
reszenz- Sequenzers und die Auswertung der Bandenmuster mittels computererstellten
Dendrogramms. Nur dann könnten auch sehr ähnliche Bandenmuster verschiedener
KNS-Spezies identifiziert werden.
4.3 Ergebnisse der Differenzierung der Koagulase-negativen Staphylokokken
Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der Untersuchung mittels t-DNA-PCR und des
Resistenztests konnten von den 118 präsumtiv als KNS bezeichneten Feldisolaten 69
(58,5%) einer Spezies zugeordnet werden. Bei der Abgrenzung von S. hyicus gegenü-
ber S. chromogenes wurde zusätzlich die Kulturmorphologie mit berücksichtigt, da die
jeweiligen Referenzstämme die gleichen Amplifikat- und Resistenzmuster aufwiesen.
5 der aufgrund der kulturmorphologischen Untersuchung präsumtiv als KNS
angesprochenen Kokken erwiesen sich im Resistenztest als Mikrokokken (Tabelle 34).
Insgesamt konnten die 69 Feldisolate 9 verschiedenen KNS-Spezies zugeordnet wer-
den.
Die Ergebnisse der Differenzierung der KNS-Spezies entsprechen im Prinzip den Anga-
ben anderer Autoren, die ebenfalls KNS aus Ziegenmilchproben untersuchten. Bei der
Interpretation der Ergebnisse aus der Literatur ist jedoch zu berücksichtigen, dass meist
unterschiedliche Methoden zur Speziesdifferenzierung der KNS angewandt wurden (Ta-
belle 11 im Anhang). Dementsprechend sind die jeweiligen Resultate nur bedingt
miteinander vergleichbar.
Mit 25 der 118 präsumtiv als KNS bezeichneten Feldstämme (21, 2%) ist S. caprae
64
die am häufigsten nachgewiesene Spezies im Untersuchungsmaterial dieser Studie.
Auch FOSCHINO et al. (2002) isolierten bei der Untersuchung von Ziegenmilchproben
unter den KNS hauptsächlich diese Spezies. BERGONIER et al. (2003) geben ebenfalls
S.caprae als die am häufigsten nachgewiesene Spezies in Ziegenmilch an. BINDER
(1986), DE BUYSER et al. (1987), OELFKEN (1993) und BEDIDI-MADANI et al. (1998)
beschreiben ebenfalls das gehäufte Vorkommen von S. caprae. Im Gegensatz dazu
konnten ORDEN et al. (1991), MAISI und RIIPINEN (1991) sowie WINTER und
BAUMGARTNER (1999) S. caprae in Ziegenmilch nicht nachweisen. Dies könnte auf die
von den vorgenannten Autoren angewandte Methode zurückzuführen sein. Die Untersu-
chungen wurden mit dem API-Staph-System durchgeführt, welches nach HARVEY und
GILMOUR (1988) Probleme mit der Identifikation der KNS-Spezies S. caprae hat.
Nach BLOBEL und SCHLIESSER (1994) leitet sich der Name „S. caprae“ aus dem Um-
stand ab, dass dieses Bakterium zuerst aus Ziegenmilchproben isoliert wurde. S. caprae
wurde bisher weder aus Kuhmilch noch aus Schafmilchproben isoliert, jedoch spielt S.
caprae unter anderem auch in der Humanmedizin sowohl bei nosokomialen als auch bei
Infektionen außerhalb des Krankenhauses eine Rolle (VANDENESCH et al., 1995). Das
ursprüngliche Habitat von beim Menschen isolierten S. caprae-Stämmen ist nicht be-
kannt. Die Autoren vermuten, dass S. caprae ein Kommensale der menschlichen Haut
sein kann. Weiterhin vermuten die Autoren, dass S. caprae vom Tier auf den Menschen
übertragen werden kann.
Als S. hyicus wurden 17 der 118 untersuchten Feldstämme (14,4%) identifiziert. Dabei
stammen 12 der Isolate von der rechten Euterhälfte nur einer Ziege. Dieser wiederholte
Nachweis ist ein eindeutiges Indiz für eine persistierende Infektion. In Verbindung mit der
erhöhten Zellzahl der betroffenen rechten Euterhälfte im Vergleich mit der Zellzahl der
nicht infizierten linken Euterhälfte kann von einer chronischen subklinischen Mastitis ge-
sprochen werden. In dem Stall, in dem die Ziege gehalten wurde (Betrieb 3), waren auch
Schweine untergebracht. S. hyicus wird sowohl als Erreger der exsudativen Epidermitis
des Schweines (BLOBEL und BRÜCKLER, 1984; LÄMMLER 1990), als auch als Besied-
ler von Haut und Schleimhaut verschiedener Haustiere isoliert (DEVRIESE et al, 1983a;
TAKEUCHI et al., 1988). In Ziegenmilch wird er nach POUTREL und LERONDELLE
(1983), POUTREL (1984), DE BUYSER et al. (1987) sowie MAISI und RIIPINEN (1991)
ebenfalls nachgewiesen.
S. epidermidis und S. simulans traten mit jeweils 8 Nachweisen auf (6,8%). In der Litera-
tur wird S. simulans oft als die am häufigsten aus Ziegenmilch isolierte Spezies beschie-
ben (POUTREL, 1984; DE BUYSER et al, 1987; HARVEY and GILMOUR, 1988;
ORDEN et al.,1991; MAISI and RIIPINEN, 1991; OELFKEN, 1993; DEINHOFER und
PERNTHANER, 1995; WINTER und BAUMGARTNER, 1999). Der KNS-Spezies wird
eine noch bedeutendere Rolle als Erreger von klinischen und subklinischen Mastitiden
des Rindes zugeschrieben (JARP,1991). Beim Menschen ist S. simulans an eitrigen
Infektionen und Krankenhausinfektionen beteiligt (PARISI, 1985; PULVERER et al.,
65
1987a, b; BARCS et al., 1989; PATRICK, 1990).
Der Nachweis von S. epidermidis in Ziegenmilch wird von zahlreichen Autoren beschrie-
ben (PETTERSEN, 1981; BINDER, 1986; DE BUYSER et al., 1987; GILMOUR and
HARVEY, 1990; ORDEN et al., 1991; MAISI and RIIPINEN, 1991; OELFKEN, 1993;
DEINHOFER und PERNTHANER, 1995; WINTER und BAUMGARTNER, 1999). Der
Anteil von S. epidermidis an den KNS-Spezies ist hierbei sehr unterschiedlich. Seiner
Bezeichnung entsprechend ist S. epidermidis ein apathogener Besiedler der Haut von
Mensch und Tier (SCHLEIFER und KLOOS, 1975; DEVRIESE et al., 1985; KLOOS und
SCHLEIFER, 1986). Bei Verletzungen der Haut bzw. Veränderungen der Hautflora kann
diese Spezies jedoch ebenso wie andere KNS-Spezies zum Infektionserreger werden
(PARISI, 1985; PULVERER et al., 1987a). Auch bei S.epidermidis stellt sich ebenso wie
bei S. caprae die Frage der ursprünglichen Herkunft des Erregers. BURRIEL (1998) fand
auffällige Unterschiede bei der Untersuchung von Milch- und Fleischschafen. Aus subkli-
nisch infizierten Eutern von Milchschafen wurden die Spezies S. warneri und S.
epidermidis am häufigsten isoliert. Da diese Staphylokokken typisch für das Vorkommen
auf der menschlichen Haut sind, führt die Autorin diese Infektionen auf den täglichen
Kontakt mit dem Melkpersonal zurück. Bei Untersuchung von Milch der Fleischschafe
wurden die beiden Spezies nicht isoliert. Dies führt die Autorin darauf zurück, dass
Fleischschafe seltener Kontakt mit Menschen haben.
WINTER (1996) untersuchte das Mastitisgeschehen dreier Milchschafherden. Sie iso-
lierte 42 KNS-Stämme, von denen der Großteil als S. epidermidis identifiziert wurde.
Nach BLOBEL und SCHLIESSER (1994) wird S. saprophyticus auf der Haut und im
Urogenitaltrakt des Menschen gefunden. Aus Ziegenmilch wird die Spezies selten iso-
liert (BINDER, 1986; DEINHOFER und PERNTHANER, 1995). Im Untersuchungsmate-
rial wurde S.saprophyticus in 4 Fällen (3,4% der 118 untersuchten Feldstämme)
nachgewiesen.
S. chromogenes wurde 3mal nachgewiesen (2,5% der Feldstämme). Diese Spezies
wird von JARP (1991) als Verursacher klinischer und subklinischer Mastitiden beim Rind
beschrieben. Auch in Ziegenmilch ist S. chromogenes vielfach nachgewiesen worden
(POUTREL, 1984; DE BUYSER et al., 1987; HARVEY and GILMOUR, 1988;
DEINHOFER und PERNTHANER, 1995; BEDIDI-MADANI et al., 1998; WINTER und
BAUMGARTNER, 1999). BERGONIER et al. (2003) finden S. chromogenes sehr häufig
in Schafmilch.
S. lentus wurde in 2 Fällen nachgewiesen (1,7% der 118 Feldstämme). Die Spezies
wurde in zahlreichen Untersuchungen von der Haut und aus dem Euter von Ziegen und
Schafen isoliert (KLOOS et al., 1976a; SCHLEIFER et al., 1983; KLOOS and
SCHLEIFER, 1986; DEINHOFER und PERNTHANER, 1993). POUTREL (1984a, b) be-
schreibt S. lentus im Zusammenhang mit der Ziegenmastitis.
S. xylosus und S. hominis wurden jeweils nur einmal isoliert (je 0,8% der untersuchten
Feldstämme). S. xylosus wird im Zusammenhang mit klinischen und subklinischen
66
Mastitiden bei der Ziege von verschiedenen Autoren beschrieben (POUTREL, 1984;
BINDER, 1986; ORDEN et al., 1991; OELFKEN, 1993; CONTRERAS et al., 1997;
BEDIDI-MADANI et al., 1998). Jedoch variiert die Nachweishäufigkeit zum Teil erheblich.
OELFKEN (1993) führt dies auf regionale Variationen zurück. Nach DE BUYSER et al.
(1992) ist S. xylosus oft in der Hautflora der Ziegeneuter vertreten. DELARRAS und
LABAN (1981) wiesen die Spezies in Ziegenfleisch und Ziegenmilchprodukten nach.
S. hominis wurde von der Haut gesunder Menschen isoliert (KLOOS und SCHLEIFER,
1975, 1986). Diese Spezies kommt eher selten beim Tier vor (BLOBEL und
SCHLIESSER, 1994).
Die KNS-Spezies S. auricularis, S. capitis, S. sciuri, S. cohnii, S. hämolyticus, S.
lugdunensis, S. schleiferi und S. warneri wurden im Untersuchungsmaterial nicht
nachgewiesen. In anderen Arbeiten wurden diese Spezies zum Teil ebenfalls nicht oder
in nur sehr geringem Maße in Ziegenmilch identifiziert. (DE BUYSER et al., 1987; MAISI
and RIIPINEN, 1991; OELFKEN, 1993; DEINHOFER und PERNTHANER, 1995;
BEDIDI-MADANI et al., 1998; WINTER und BAUMGARTNER, 1999). Allerdings fand
KALOGRIDOU-VASSILIADOU (1991) in Ziegenmilch unter anderem S.capitis als
domininerende Spezies. S. capitis wird am häufigsten von der menschlichen Kopfhaut
isoliert, was dieser Spezies ihren Namen gab (BLOBEL und SCHLIESSER, 1994). Auch
hier ist es letztlich unklar, ob es sich bei um einen echten Erreger aus dem Ziegeneuter
handelt oder um eine Kontaminante. Die Spezies S. lugdunensis wird von BLOBEL und
SCHLIESSER (1994) in engen Zusammenhang mit dem Menschen gebracht, hier
besonders in Beteiligung an eitrigen Infektionen.
4.4 Prävalenz einzelner Staphylokokken-Spezies innerhalb der einzelnen Betriebe
Betrieb 1
Der Betrieb 1 war mit 160 Milchziegen die größte untersuchte Ziegenhaltung. Die Herde
setzte sich aus verschiedenen Ziegenrassen (Tabelle 14) zusammen und wurde im Tief-
streulaufstall mit Weidegang gehalten. 12 der insgesamt 25 als S. caprae identifizierten
Feldstämme stammen allein aus diesem Betrieb (Tabelle 41). Die außergewöhnliche
Häufung einer Bakterienspezies in den Hälftegemelksproben eines Betriebes könnte als
Hinweis auf die Pathogenität bzw. Kontagiosität dieses Erregers gewertet werden.
Die Spezies S. epidermidis wurde mit 8 Isolaten nur im Betrieb 1 nachgewiesen. Bei
zwei Tieren wurde der Nachweis von S. epidermidis aus beiden Euterhälften erbracht.
Die Euter der Tiere des Betriebes 1 wurden vor dem eigentlichen Melkvorgang lediglich
vorgemolken und nicht routinemäßig vorgereinigt (15). Bezieht man die Melkhygiene in
die Gesamtbetrachtung mit ein, liegt die Überlegung nahe, dass S. epidermidis eventuell
von den Händen der melkenden Personen auf die Ziegen übertragen wurde. Nach
POUTREL (1984a) kann S. epidermidis Mastitiden hervorrufen. Der Infektionsdruck in
Betrieb 1 ließe sich gegebenenfalls durch entsprechende melkhygienische Maßnahmen
(Händewaschen vor dem Melken, Tragen von Handschuhen, Euterreinigung mit
67
Einmaltüchern, Zitzendesinfektion mit einem geeigneten Mittel unmittelbar nach dem
Melken) verringern.
Die Annahme, dass die Spezies S. epidermidis durch die Hände der melkenden Perso-
nen auf die Ziegeneuter übertragen werden könnte, wird allerdings durch die Ergebnisse
des Betriebes 2 entkräftet. In diesem mit 140 Ziegen zweitgrößten Betrieb wurde die
Spezies S. epidermidis nicht nachgewiesen, obwohl ebenfalls keine regelmäßige
Euterreinigung und auch keine Zitzendesinfektion durchgeführt wurde. Um hier Klarheit
bezüglich der Herkunft von S. epidermidis im Betrieb 1 erhalten zu können, bedarf es
weiterführender Untersuchungen, welche im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht
vorgesehen waren.
Eher selten wurden in Betrieb 1 S.simulans mit 4 Isolaten, S. hyicus mit 3 Isolaten (bei
einer Ziege beidseitig), S. saprophyticus mit 3 Isolaten und S. xylosus mit einem Isolat
nachgewiesen. Auch bei S. saprophyticus gilt die Haut des Menschen als normales Habi-
tat (BLOBELl und SCHLIESSER, 1994). Somit kann diese Spezies auch als Kontami-
nante in Milchproben vorkommen oder durch den Kontakt des Menschen mit dem Tier
die betreffenden Ziegeneuter besiedeln.
Betrieb 2
In Betrieb 2 wurden verschiedene Ziegenrassen in Tiefstreulaufstall, jedoch ohne Weide-
gang, gehalten (Tabelle 14). Hier dominiert S. caprae mit 5 Isolaten unter den
differenzierten Isolaten. Die Spezies S. chromogenes wurde 2mal nachgewiesen. Zur
Prävalenz von S. chromogenes bei Ziegen gibt es verschiedene Literaturangaben; in den
Untersuchungen von HARVEY und GILMOUR (1988) und WINTER und
BAUMGARTNER (1999) wird S. chromogenes gehäuft aus Ziegenmilchproben isoliert,
in anderen Untersuchungen wird S. chromogenes nicht oder selten nachgewiesen
(POUTREL und LERONDELLE,1983; POUTREL,1984; OELFKEN, 1993). Ebenfalls
zweimal wurde S. simulans nachgewiesen.
Die KNS-Spezies S. lentus wurde nur einmal nachgewiesen.
Betrieb 3
In Betrieb 3, in dem der gesamte Bestand laktierender Ziegen über den Untersuchungs-
zeitraum 17mal untersucht wurde und in dem seitens der Betriebsleitung zusätzlich Ein-
zeltierproben eingesandt wurden (Tabelle 16), konnte bei 2 Tieren ein wiederholter Erre-
gernachweis geführt werden (Tabelle 41). S. hyicus konnte bei der Ziege mit der Identifi-
kationsnummer 35 insgesamt 12mal in der rechten Euterhälfte nachgewiesen werden,
während auf der zugehörigen linken Hälfte jeweils kein Erregernachweis geführt wurde.
Bei der Ziege mit der Identifikationsnummer 39 konnte S. caprae auf der linken Hälfte in
3 aufeinander folgenden Untersuchungen nachgewiesen werden, während auf der
rechten Hälfte ebenfalls kein Erreger nachweisbar war. Insgesamt wurde S. hyicus in
68
diesem Betrieb13mal nachgewiesen. S. caprae wurde insgesamt 5mal nachgewiesen
und je 1mal S. saprophyticus, S. lentus und S. hominis.
Wenn die Mehrfachbeprobungen entsprechend berücksichtigt werden, entspricht auch in
diesem Betrieb die Gesamtverteilung der jeweiligen KNS-Spezies den Ergebnissen
anderer Untersuchungen. Die Spezies S. caprae dominiert, alle anderen nachgewiese-
nen Spezies kommen seltener vor. Interessant am Betrieb 3 sind die Ergebnisse der
Mehrfachbeprobungen über einen längeren Zeitraum hinweg. Die Ziege 35 wurde z.B.
über eine gesamte Laktationsperiode hinweg monatlich beprobt, zum Teil zur Morgen-
und Abendmelkzeit desselben Tages. Durch den wiederholten Nachweis von S. hyicus
aus der rechten Euterhälfte der Ziege 35 kann davon ausgegangen werden, dass es sich
bei dieser isolierten Spezies um einen tatsächlichen Mastitiserreger handelt (DVG 1994,
2002).
Der Mehrfachnachweis der KNS-Spezies S. caprae, der bei Ziege 39 dreimal auf der
linken Euterhälfte geführt wurde, weist ebenfalls darauf hin, dass es sich um einen aus
dem Euter isolierten Mastitiserreger handelt.
Betriebe 4, 6 und 9
Bei den Betrieben 4, 6 und 9 handelte es sich um kleinere Ziegenbestände. Aus diesen
drei Betrieben konnten insgesamt 6 Feldstämme eindeutig einer Staphylokokken-Spe-
zies zugeordnet werden. S. caprae trat in jedem dieser Betriebe einmal auf. In Betrieb 9
handelt es sich dabei um das einzige identifizierte Isolat. In Betrieb 4 trat zusätzlich S.
simulans 2mal auf, davon einmal auf der zugehörigen Hälfte der Ziege mit S. caprae-
Nachweis. In Betrieb 6 trat S hyicus zusätzlich einmal auf. Auch wenn die untersuchten
Bestände zahlenmäßig klein waren, so konnten auch hier KNS-Spezies nachgewiesen
werden, die laut Literaturangaben bei der Ziege regelmäßig isoliert werden (Tabelle 13
im Anhang).
Alle Betriebe
S. caprae wurde in allen 6 Betrieben, in denen KNS-Spezies identifiziert werden konnten
(Betrieb 1 bis 3, 4, 6 und 9), nachgewiesen (Tabelle 41). Damit erwies sich die Spezies
als der am weitesten verbreitete Mastitiserreger in den untersuchten Betrieben. In den
Betrieben 1 bis 3 war die Spezies zudem auch der am häufigsten nachgewiesene Masti-
tiserreger. Diese Ergebnisse finden ihre Bestätigung in vielen Literaturangaben. In den
Studien von POUTREL (1984), BINDER (1986), DE BUYSER et al. (1987), OELFKEN
(1993), DEINHOFER und PERNTHANER (1995) und BEDIDI-MADANI et. al (1998) ge-
hört S.caprae zu den am häufigsten nachgewiesenen KNS-Spezies bei der Ziege.
S. simulans konnte in 3 Betrieben nachgewiesen werden (Betrieb 1,2 und 4). Auch hier
zeigt sich eine Übereinstimmung mit der Literatur. In vielen Studien wird S. simulans bei
der Ziege nachgewiesen (POUTREL und LERONDELLE,1983; POUTREL, 1984; DE
BUYSER et al. 1987; HARVEY und GILMOUR,1988; MAISI und RIIPINEN,1991;
69
ORDEN et al.1992; OELFKEN, 1993; DEINHOFER und PERNTHANER,1995; WINTER
und BAUMGARTNER,1999).
Ebenfalls in 3 Betrieben (Betrieb 1, 3 und 6) wurde die Spezies S. hyicus nachgewiesen.
Es gibt nur wenige Arbeiten über Ziegenmilch, in denen S. hyicus nachgewiesen wurde
(POUTREL und LERONDELLE,1983; POUTREL,1984; DE BUYSER et al. ,1987; MAISI
und RIIPINEN, 1991).
S. saprophyticus und S. lentus wurden in jeweils 2 Betrieben (Betrieb 1 und 3, Betrieb 2
und 3) nachgewiesen, während S. chromogenes nur in Betrieb 2 auftrat. Auch hier fin-
den sich Übereinstimmungen mit der Literatur. Vorgenannte Spezies werden lediglich
sporadisch nachgewiesen (Tabelle 13 im Anhang).S. epidermidis wurde nur in Betrieb 1
nachgewiesen. S. hominis und S. xylosus traten jeweils nur einmal auf (Betrieb 3 bzw.
Betrieb 1).
Stellt man die Resultate dieser Untersuchung der Literatur gegenüber, zeigen sich Über-
einstimmungen bezüglich der Prävalenz von KNS-Spezies bei der Ziege (Tabelle 13 im
Anhang). Es gibt jedoch auch in der Literatur starke Unterschiede in der Häufigkeit der
Nachweise der betreffenden KNS-Spezies. Laut OELFKEN (1993) könnte dies regional
bedingt sein. Sicherlich kommen weitere Faktoren wie Haltung, Fütterung und Melkhy-
giene hinzu. Letztendlich gibt es jedoch einige KNS-Spezies, die regelmäßig aus dem
Ziegeneuter isoliert werden. Laut OELFKEN (1993) sind dies S. simulans, S. caprae, S.
xylosus, S.epidermidis und S. hominis.
4.5 KNS-Spezies in Bezug zur Zellzahl und Hälftedifferenz
S. caprae
Aus insgesamt 25 Ziegenmilchproben wurde die KNS-Spezies S. caprae isoliert (Tabelle
38). Bei 11 Ziegen und insgesamt 13mal (bei einer Ziege wurde der Erreger 3mal
nachgewiesen) wurde auf der korrespondierenden Hälfte kein Erreger nachgewiesen.
Der geometrische Mittelwert von 11 ausgewerteten Euterhälften mit Nachweis von S.
caprae liegt mit 1 377 000 Zellen/ml um das 4,8fache höher als der geometrische Mittel-
wert der zugehörigen Euterhälften ohne Erregernachweis mit 288 000 Zellen/ml. Dies
spricht ebenso wie der 3malige Nachweis bei derselben Ziege eindeutig für eine euterpa-
thogene Eigenschaft der Spezies. Der SCSZiege des geometrischen Mittelwertes differiert
entsprechend um 1,1 (Tabelle 42).Bei der Ziege mit 3maligem Nachweis lag zum letzten
Untersuchungszeitpunkt sogar eine Sekretveränderung auf der betroffenen Hälfte vor
(Tabelle 41).
BINDER (1986) ermittelt für mit S. caprae infizierte Euterhälften eine Erhöhung des
Leukozytengehaltes der betreffenden Hälfte. In der Arbeit von BINDER (1986) werden
zudem für S. caprae und S. sciuri die höchsten Medianwerte des Zellgehaltes von mit
KNS infizierten Euterhälften festgestellt. Nach POUTREL und LERONDELLE (1983)
entwickelt sich der Zellgehalt von nicht infizierten Eutern bei der Ziege auf beiden Hälften
etwa auf dem gleichen Niveau. Starke Unterschiede der Zellzahlhöhe im
70
Euterhälftenvergleich können auf eine Infektion einer Hälfte hinweisen. Diese Beobach-
tung bestätigt BINDER (1986) in ihrer Untersuchung.
S. epidermidis
Aus insgesamt 8 Ziegenmilchproben wurde die KNS-Spezies S. epidermidis isoliert.
Sämtliche mit S. epidermidis infizierten Hälften weisen hohe Zellzahlen auf, in 5 Fällen
auch mit einer deutlichen Zellzahldifferenz gegenüber der korrespondierenden Hälfte. In
zwei Fällen wurden auf der anderen Euterhälte ebenfalls KNS nachgewiesen. Der
geometrische Mittelwert der Euterhälften mit Nachweis von S. epidermidis liegt mit
1 449 000 Zellen/ml um das 7,7fache höher als der geometrische Mittelwert der
zugehörigen Euterhälften ohne Erregernachweis mit 187 000 Zellen/ml. Der SCSZiege
des geometrischen Mittelwertes differiert gegenüber der zugehörigen bakteriologisch
negativen Hälfte deutlich um 1,4.
Auch dieses Ergebnis findet seine Entsprechung in der Literatur. BINDER (1986), DE
BUYSER et al. (1987), OELFKEN (1993), DEINHOFER und PERNTHANER (1995) stell-
ten bei Infektionen mit S. epidermidis einen erhöhten Zellgehalt der betroffenen Hälfte
fest. OELFKEN (1993) gibt für S. epidermidis-Infektionen einen durchschnittlichen
Zellgehalt von über 1 Millionen Zellen/ml an.
S. simulans
Die KNS-Spezies S. simulans wurde ebenfalls aus insgesamt 8 Hälftegemelksproben
isoliert. Bei den Eutern, wo lediglich auf einer Hälfte der Erregernachweis geführt werden
konnte, verursachte S. simulans eine deutlich erhöhte Zellzahl gegenüber der nicht infi-
zierten Hälfte. Der geometrische Mittelwert der Euterhälften mit Nachweis von S. simu-
lans liegt mit 1812 000 Zellen/ml um das 7,6fache höher als der geometrische Mittelwert
der zugehörigen Euterhälften ohne Erregernachweis mit 237 000 Zellen/ml. Der SCSZiege
des geometrischen Mittelwertes differiert gegenüber der zugehörigen bakteriologisch
negativen Hälfte deutlich um 1,5. Die Eigenschaft von S. simulans, im caprinen Euter
eine Entzündungsreaktion mit erhöhter Zellzahl hervorzurufen, wird von anderen Autoren
bestätigt (POUTREL, 1984; DULIN et al., 1983; KALOGRIDOU-VASSILIADOU, 1991;
DEINHOFER und PERNTHANER, 1993 und 1995).
S. saprophyticus
Aufgrund der geringen Anzahl von S. saprophyticus-Nachweisen kann nur eine vage
Aussage bezüglich der Auswirkung auf die Zellzahl gemacht werden. In den 3 Fällen, in
denen ein positiver Erregernachweis auf jeweils einer Hälfte geführt wurde, lag in 2 Fäl-
len ein gegenüber der anderen Hälfte kaum erhöhter Zellgehalt vor. Insgesamt liegt bei
den 3 betroffenen Ziegen die Zellzahl beider Hälften auf einem niedrigen Niveau (Tabelle
42). Geht man dennoch von einer subklinischen Mastitis aus, ließe sich folgern, dass der
Erreger bestenfalls eine milde Immunantwort hervorruft.
71
S. saprophyticus wird auch in anderen Untersuchungen eher selten aus Ziegenmilch iso-
liert (BINDER, 1986; DEINHOFER und PERNTHANER, 1995).
S. chromogenes
Auch bezüglich S. chromogenes kann aufgrund der mit nur 3 Fällen geringen Zahl an
Nachweisen nur vermutet werden, dass es sich um einen Mastitiserreger handelt. In ei-
nem Fall konnte eine stark erhöhte Zellzahl mit Hälftedifferenz gegenüber der bakteriolo-
gisch negativen Hälfte im betreffenden Euter beobachtet werden, und in einem weiteren
Fall lag auf der betroffenen Hälfte eine Sekretveränderung vor. In der Arbeit von
CONTRERAS et al. (1997) findet sich S. chromogenes unter den am häufigsten isolier-
ten KNS aus Ziegenmilch. In der genannten Untersuchung zeigte S. chromogenes zu-
dem die Fähigkeit, im caprinen Euter über einen längeren Zeitraum zu persistieren.
DEINHOFER und PERNTHANER (1995) wiesen für S. chromogenes-Infektionen im Zie-
geneuter einen Anstieg der Zellzahl nach, ebenso wie CONTRERAS et al. (1997). Je-
doch können diese Autoren aufgrund der geringen Nachweisrate keine statistisch gesi-
cherten Aussagen über den Einfluss von S. chromogenes auf die Zellzahl machen.
S. hyicus
Von insgesamt 17 S. hyicus-Isolaten stammen 12 von einer einzelnen Ziege. Bei dem
betreffenden Tier wurde diese Spezies über eine gesamte Laktationsperiode hinweg aus
der rechten Euterhälfte isoliert. Dieses Ergebnis ist besonders interessant, da nur wenige
Untersuchungen mit vergleichbarer Beprobungsfrequenz und -häufigkeit in der Literatur
beschrieben werden. Mit einer Ausnahme liegt der Zellgehalt auf der Euterhälfte mit
Nachweis von S. hyicus kontinuierlich höher als auf der Euterhälfte ohne Erregernach-
weis. Die Zellzahlen unterliegen bei der betroffenen Ziege auf beiden Euterhälften mehr
oder weniger großen Schwankungen. Der geometrische Mittelwert der Euterhälfte mit
Nachweis von S. hyicus liegt insgesamt mit 1 239 000 Zellen/ml um das 4,6fache höher
als der geometrische Mittelwert der zugehörigen Euterhälfte ohne Erregernachweis mit
268 000 Zellen/ml. Der SCSZiege des geometrischen Mittelwertes differiert gegenüber der
zugehörigen bakteriologisch negativen Hälfte um 1,1 (Tabelle 43).
Laut Literaturangaben wird die Spezies S. hyicus eher selten aus Ziegenmilch isoliert.
POUTREL (1983) untersuchte Ziegeneuter zweimal innerhalb derselben Laktationspe-
riode. Er isolierte aus vier Euterhälften S. hyicus, jedoch konnte bei diesen Euterhälften
bei der wiederholten Untersuchung S. hyicus nicht mehr nachgewiesen werden. Anhand
der vorliegenden Untersuchungsergebnisse zeigt sich die Fähigkeit dieser Spezies, im
Euter zu persistieren und eine subklinische Mastitis hervorzurufen. Auch bei den anderen
Ziegen verursacht S. hyicus mit Ausnahme von zwei Fällen eine Erhöhung der Zellzahl
der betroffenen Hälfte. Die Autoren MAISI und RIIPINEN (1991) sprechen demgegenü-
ber S. hyicus eine nur geringe Pathogenität für das Ziegeneuter zu. Sie beobachteten,
dass S. hyicus nur in Kombination mit anderen KNS-Spezies eine Immunantwort des
72
Ziegeneuters hervorrufen kann. POUTREL (1984) dagegen spricht S. hyicus durchaus
pathogene Eigenschaften für das Ziegeneuter zu, da er aus klinischen Mastitiden
Reinkulturen von S. hyicus isolieren konnte.Auch in dieser Arbeit wurde S. hyicus in
Reinkultur isoliert; es wurde zusätzlich eine deutliche Zellzahlerhöhung der betreffenden
Euterhälfte festgestellt, was den Verdacht erhärtet, dass die KNS-Spezies S. hyicus bei
der Ziege subklinische Mastitiden verursachen kann.
S. lentus, S. hominis und S. xylosus
Die oben genannten KNS-Spezies wurden jeweils nur zwei- bzw. einmal nachgewiesen.
Bei der Ziege mit Nachweis von S. xylosus auf einer Euterhälfte lag eine gegenüber der
korrespondierenden Euterhälfte deutlich erhöhte Zellzahl vor. Bei den Ziegen mit Nach-
weis von S. lentus und S. hominis wurde entweder auf der anderen Euterhälfte ebenfalls
ein Erregernachweis geführt und/oder die Zellzahl lag in einem ähnlich hohen Bereich.
Die geringe Anzahl der Isolate lässt keine Rückschlüsse auf die Pathogenität zu.
DEINHOFER und PERNTHANER (1993) konnten für mit S. lentus infizierte Hälften eine
nur schwache Veränderung des Milchzellgehaltes feststellen. POUTREL (1984a, 1984b)
vermutet für S. lentus-Stämme unterschiedliche Virulenzen, da er sowohl aus klinisch
gesunden, als auch erkrankten Ziegeneutern S. lentus isolieren konnte. Mehrere Autoren
(DEVRIESE et al., 1985; GUTIERREZ et al., 1990) geben zu bedenken, dass Novobio-
cin-resistente Staphylokokken einen großen Bestandteil der Ziegenhautflora darstellen.
Novobiocin-resistente KNS-Spezies, die aus Euterhälften ohne Zellzahlerhöhung isoliert
werden, könnten aus dem Strichkanal bzw. der Zitzenzisterne stammen (WATKINS et al.,
1991).
Bei S. hominis handelt es sich um eine Novobiocin-empfindliche KNS-Spezies und damit
um einen potenziellen Mastitis-Erreger der Ziege (DEINHOFER und PERNTHANER,
1995). BINDER (1986) stellt in ihrer Untersuchung besonders durch Infektionen durchS.
xylosus eine Erhöhung des Zellgehaltes in der betroffenen Euterhälfte fest. Auch DE
BUYSER (1987) und OELFKEN (1993) machen diese Beobachtung, jedoch gibt letztge-
nannter Autor zu bedenken, dass aufgrund der geringen Probenanzahl keine gesicherte
Aussage getroffen werden kann.
Insgesamt ist festzustellen, dass die Untersuchung der Zellzahl zweier korrespondieren-
der Euterhälften ein sicheres Kriterium zur Feststellung einer subklinischen Mastitis ist.
Zahlreiche Studien haben sich damit befasst, einen Zellzahlgrenzwert zu ermitteln, ab
welchem von einer subklinischen Mastitis gesprochen werden kann. Aufgrund der, im
Vergleich zum Kuheuter, völlig anderen physiologischen Verhältnisse im Ziegeneuter ist
diese Methode jedoch nicht zielführend.
Wird jedoch das Zellzahlniveau der beiden korrespondierenden Euterhälften einer Ziege
verglichen, so lässt sich aus der einseitigen Zellzahlerhöhung der Verdacht einer
subklinischen Mastitis ableiten. Die Ergebnisse dieser Untersuchung bestätigen dies (Ta-
73
bellen 41 bis 43) eindrucksvoll. Auch andere Autoren sprechen sich für den Vergleich der
Hälftedifferenz zur Beurteilung der Eutergesundheit aus (PETTERSEN, 1981; POUTREL
und LERONDELLE, 1983; DEUTZ et al., 1990; SMITH und SHERMAN, 1994;
KLOPPERT et al.,2000; GOEBEL, 2007; GOEBEL et al., 2008).
4.6 Wiederholter Erregernachweis
Neben dem Vorkommen in Reinkultur, dem gehäuften Auftreten innerhalb einer Herde
und der erhöhten Zellzahl (Hälftedifferenz) gilt der wiederholte Nachweis einer Spezies in
derselben Euterhälfte als ein weiteres wesentliches Kriterium für die Pathogenität einer
KNS-Spezies.
Die gute Eutergesundheit der im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersuchten
Ziegenherden ist einer der wesentlichen Gründe dafür, dass es trotz wiederholter
Gesamtbestandsuntersuchungen und 2038 untersuchten Hälftegemelksproben (Tabelle
16) nur bei 2 Ziegen gelungen ist, eine KNS- Spezies bei demselben Tier mehrfach
nachzuweisen. Dies gelang nur in Betrieb 3, der 17mal beprobt wurde und in dem S. hyi-
cus bei einer Ziege 12mal auf der rechten Hälfte und S. caprae bei einer anderen Ziege
3mal auf der linken Seite nachgewiesen werden konnte.
74
5 Zusammenfassung
Andrea Ehrenberg
Kulturmorphologische, biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur
Differenzierung Koagulase-negativer Staphylokokken, isoliert aus Hälftegemelksproben
von Ziegen und deren Bedeutung für die Eutergesundheit
Ambulatorische und Geburtshilfliche Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der
Universität Leipzig
angefertigt in der
Abteilung Veterinärmedizin des Landesbetriebes des Hessischen Landeslabors, Gießen
Eingereicht im Januar 2011
77 Seiten, 9 Abbildungen, 43 Tabellen, 171 Lit., 1 Anhang mit 22 Tabellen
Schlüsselwörter: Milchziegen, Koagulase-negative Staphylokokken, Hälftegemelkspro-
ben, Kulturmorphologie, Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika, API STAPH Test, t-DNA-
PCR, Zellzahl, Mastitis-Diagnose
Über einen Zeitraum von 2 Jahren wurden in 12 hessischen Milchziegen-Betrieben
unterschiedlicher Größe Hälftegemelksproben von allen laktierenden Ziegen entnom-
men. Die Bestandsuntersuchungen erfolgten teilweise wiederholt, wobei ein Bestand
insgesamt 17mal beprobt wurde.
Die kulturell-bakteriologische Untersuchung von 2038 Hälftegemelksproben verlief bei
83,6 % der Proben mit einem negativen Ergebnis. Unter den 16,4% bakteriologisch
positiven Proben dominierten Koagulase-negative Staphylokokken mit einer Nachweis-
rate von 10,7%.
Insgesamt 4 Verfahren wurden auf ihre Eignung zur Differenzierung von 17
Referenzstämmen und 118 isolierten KNS-Feldstämmen überprüft. Die Referenzstämme
wurden ausgewählt nach Literaturangaben über bei caprinen Mastitiden häufig
nachzuweisenden KNS-Spezies. Neben der kulturmorphologischen Beurteilung auf
bluthaltigen Nährböden wurde die biochemische Identifizierung mittels ID32 Staph-Test,
die Prüfung der in-vitro-Sensitivität gegenüber den Antibiotika Novobiocin, Desferioxa-
min, Fosfomycin und Polymyxin B im Agardiffusionstest sowie die t-DNA-PCR ange-
wandt. Insbesondere die Ergebnisse der molekularbiologischen Untersuchung mittels t-
DNA-PCR sollten den Untersuchungsergebnissen der 3 phänotypischen Methoden
gegenübergestellt werden.
Durch keines der angewandten Verfahren konnten die Referenzstämme und die Feldiso-
late eindeutig identifiziert werden. Bedingt durch die erwartungsgemäß schwer unter-
scheidbare Kulturmorphologie erwies sich dieses Verfahren bereits bei der Beurteilung
75
der Referenzstämme als ungeeignet. Mittels biochemischer Identifizierung wurden zwar
die Referenzstämme relativ gut erkannt, jedoch erwies sich dieser Test bei der Identifizie-
rung der Feldstämme als ungeeignet. Auch im eingesetzten Agardiffusionstest waren
bereits die 17 Referenzstämme nicht eindeutig unterscheidbar. Lediglich bei 3 KNS-Spe-
zies war eine eindeutige Zuordnung zwischen KNS-Spezies und Resistenzmuster gege-
ben. Auch bei der Untersuchung der 17 Referenzstämme mittels t-DNA-PCR zeigten ver-
schiedene Spezies Koagulase-negativer Staphylokokken identische Muster ihrer Amplifi-
kate.
Letztendlich gelang nur mittels der Kombination der Ergebnisse der in-vitro-
Resistenzprüfung mit den Ergebnissen der t-DNA PCR-Untersuchung sowohl die Identifi-
zierung der Referenzstämme als auch des überwiegenden Teils der Feldisolate. Unter
den Referenzstämmen wies S. hominis als einzige Spezies sowohl ein eindeutiges
Amplifikat- und auch Resistenzmuster auf. Die Identifizierung von 6 weiteren KNS-Spe-
zies gelang nur durch die Kombination dieser Muster. Die Referenzstämme von S. hyi-
cus und S. chromogenes wiesen identische Resistenz- und Amplifikatmuster auf, waren
aber aufgrund der typischen Kulturmorphologie eindeutig unterscheidbar. Von den 118
präsumtiv als KNS identifizierten Feldisolaten konnten durch die in der vorliegenden Ar-
beit beschriebene Vorgehensweise insgesamt 69 (58,5%) eindeutig einer KNS-Spezies
zugeordnet werden.
Dabei handelte es sich um die Spezies S. caprae, S. epidermidis, S. simulans, S. hyicus,
S. saprophytikus, S. chromogenes, S. lentus, S. xylosis und S. hominis. Am häufigsten
wurde S. caprae nachgewiesen, S. lentus, S. xylosus und S. hominis traten nur verein-
zelt auf. Aufgrund der erhöhten Zellzahl, des Erregernachweises in Reinkultur sowie des
Vergleiches mit der kultur-bakteriologisch negativen Euterhälfte gilt die ätiologische Be-
deutung des jeweils betreffenden Isolates als wahrscheinlich.
Auch gelang der wiederholte Erregernachweis auf der identischen Euterhälfte für S. hyi-
cus (12mal) und S. caprae (3mal).
76
6 Summary
Andrea Ehrenberg
Examination of morphology of cultures, biochemistry and molecular biology to differenti-
ate Coagulase-negative Staphylococci, isolated from half milk samples of dairy goats
and its relevance to udder health
Large Animal Clinic for Theriogenology and Ambulatory Services, Faculty of Veterinary
Medicine, University of Leipzig
carried out in the
Abteilung Veterinärmedizin des Landesbetriebes des Hessischen Landeslabors, Gießen
Submitted in January 2011
77 Pages, 9 figures, 43 tables, 171 lit., 1 appendix with 22 tables
Keywords: Dairy-goat, coagulase-negative staphylococci, half milk samples, culture mor-
phology, antibiotic sensivity, API Staph Test, t-DNA-PCR, somatic cell counts, mastitis
diagnosis
Over a period of two years there were taken half milk samples of all lactating goats of 12
hessian dairy-goat-farms of variable size. Half milk samples were taken once or several
times and one live-stock was being probed for seventeen times.
The bacteriological and cultural examination of 2038 half milk samples had a negative
result in 83.6 % of all. Within 16.4 % of bacteriological positive samples Coagulase-nega-
tive-Staphylococci dominated with 10.7%.
Four methods were investigated with regard to their ability to differentiate 17 reference
strains and 118 isolated CNS-field strains. The reference strains were chosen after biblio-
graphical references which told about CNS -strains that are often found with caprine
mastitis. The morphology of cultures on blood agar was evaluated. In addition, the bio-
chemistrical identification took place with the help of ID32 Staph Test, in-vitro-sensitivity
against the antibiotics novobiocin, desferioxamin, fosfomycin and polymyxin b was tested
with agar-diffusion-test as well as t-DNA-PCR was used. Particularly t-DNA-PCR should
be compared to the results of the 3 phenotypical methods.
These methods being applied could identify neither the reference strains nor the samp-
lings isolated of goats milk. As expected, it was difficult to differentiate morphology of cul-
tures, so that this method was regarded as inapplicable to evaluate even the reference
strains.
Reference strains could be identified by biochemical identification, but this method was
77
not suitable to identify the field strains. In the agar-diffusion-test there were also difficul-
ties in identifying even the 17 reference strains clearly. There were just 3 CNS-species
which could be exactly assigned to CNS-Species and pattern of resistance.
Examinating the 17 reference strains using t-DNA-PCR there were different CNS-Spe-
cies showing identical patterns of amplifications.
Finally it was useful to combine the results of the in-vitro-sensitivity-tests and the t-DNA-
PCR examination to identify the reference strains as well as the biggest part of the field
isolates. Within the reference strains S. hominis existed as the only species which had a
definite pattern of amplification and resistance. 6 other CNS-Species could only be
identified by combining combining the patterns only. Reference strains of S. hyicus and
S.chromogenes showed identical patterns of amplification and resistance, but these
species could be differentiated because of their typical culture morphology.
With these in this paper described methods it was possible to identify 69 (58.5%) CNS-
field strains out of 118.
The species S. caprae, S. epidermidis, S. simulans, S. hyicus, S. saprophyticus, S. chro-
mogenes, S. lentus, S. xylosus and S. hominis were found. S. caprae was detected most
frequently, S. lentus, S. xylosus and S. hominis were just found sporadically.
Because of the increased cell amount, the proof of agents in pure culture and the
comparison with the bacteriological negative udder the etiological impact of the isolate is
likely.
Furthermore, the same agent on one identic udder half could be found, which was S. hy-
icus (12 times) and S. caprae (3 times).
78
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95
8 Anhang
Tabelle 5. Nomenklatur der Gattung Staphylococcus (S.)
Spezies-Bezeichung Erstmals beschrieben von:
S. arlettae SCHLEIFER et al. ,1985
S. aureus ROSENBACH, 1884
S. aureus subsp. anaerobius DE LA FUENTE et al., 1985
S. aureus subsp. aureus ROSENBACH, 1884, HOWEY et al., 1990
S. auricularis KLOOS und SCHLEIFER, 1983
S. capitis KLOOS und SCHLEIFER, 1975
S. capitis subsp. capitis KLOOS und SCHLEIFER, 1975, BANNERMANN und
KLOOS, 1991
S. capitis subsp. urealyticus BANNERMANN und KLOOS, 1991
S. caprae DEVRIESE et al., 1983
S. carnosus SCHLEIFER und FISCHER, 1982
S. carnosus subsp. carnosus SCHLEIFER und FISCHER, 1982, PROBST et al., 1998
S. carnosus subsp. utilis PROBST et al., 1998
S. caseolyticus SCHLEIFER et al., 1982
S. chromogenes DEVRIESE et al., 1978, HÁJEK et al. 1986
S. cohnii SCHLEIFER und KLOOS, 1975
S. cohnii subsp. cohnii SCHLEIFER und KLOOS, 1975
S. cohnii subsp. urealyticus KLOOS und WOLFSHOHL, 1991
S. condimenti PROBST et al., 1998
S. delphini VARALDO et al., 1988
S. epidermidis WINSLOW und WINSLOW, 1908
S. equorum SCHLEIFER et al., 1985
S. equorum subsp. equorum SCHLEIFER et al., 1985
S. equorum subsp. linens PLACE et al, 2003
S. felis IGIMI et al., 1989
S. fleurettii VERNOZY-ROZAND et al., 2000
S. gallinarum DEVRIESE et al., 1983
S. haemolyticus SCHLEIFER und KLOOS, 1975
S. hominis KLOOS und SCHLEIFER, 1975
S. hominis subsp. hominis KLOOS und SCHLEIFER, 1975
S. hominis subsp. novobiosepticus KLOOS et al., 1998
S. hyicus DEVRIESE et al., 1978
S. hyicus subsp. chromogenes DEVRIESE et al., 1978
96
Tabelle 5. Nomenklatur der Gattung Staphylococcus (S.)
Spezies-Bezeichung Erstmals beschrieben von:
S. hyicus subsp. hyicus DEVRIESE et al., 1978
S. intermedius HÁJEK, 1976
S. kloosii SCHLEIFER et al., 1985
S. lentus KLOOS et al., 1976
S. lugdunensis FRENEY et al., 1988
S. lutrae FOSTER et al., 1997
S. microti NOVÁKOVÁ et al., 2010
S. muscae HÁJEK et al., 1992
S. nepalensis SPERGSERr et al., 2003
S. pasteuri CHESNEAU et al., 1993
S. pettenkoferi TRULZSCH et al., 2002, TRULZSCH et al., 2007
S. piscifermentans Tanasupawat et al., 1992
S. pseudintermedius Devriese et al., 2005
S. pulvereri Zakrzewska-Czerwinska et al., 1995
S. saccharolyticus Kilpper-Bälz und Schleifer, 1981
S. saprophyticus Shaw et al., 1951
S. saprophyticus subsp. bovis Hájek et al., 1996
S. saprophyticus subsp. saprophyticus Shaw et al., 1951
S. schleiferi Freney et al., 1988
S. schleiferi subsp. coagulans Igimi et al., 1990
S. schleiferi subsp. schleiferi Freney et al., 1988
S. sciuri Kloos et al., 1976
S. sciuri subsp. carnaticus Kloos et al., 1997
S. sciuri subsp. lentus Kloos et al., 1976
S. sciuri subsp. rodentium Kloos et al., 1997
S. sciuri subsp. sciuri Kloose et al., 1976
S. simiae Pantucek et al., 2005
S. simulans Kloos und Schleifer, 1975
S. succinus Lambert et al., 1998
S. succinus subsp. casei Place et al., 2002
S. succinus subsp. succinus Lambert et al., 1998
S. vitulinus Webster et al., 1994
S. warneri Kloos und Schleifer, 1975
S. xylosus Schleifer und Kloos, 1975
97
Tabelle 6. Einteilung der Staphylokokken nach Koagulase-Bildung
(ICBS-Subcommittee on taxonomy of Staphylococci and Micrococci,1965)
Koagulase-positive
Staphylokokken
Koagulase-negative
Staphylokokken
Koagulase-variable
Staphylokokken
S. aureus S. arlettae S. hyicus
S. delphini S. auricularis
S. intermedius S. capitis
S. schleiferi subsp. coagulans S. caprae
S. schromogenes
S. cohnii
S. epidermidis
S. gallinarum
S. haemolyticus
S. hominis
S. kloosii
S. lentus
S. lugdunensis
S. saprophyticus
S. schleiferi
S. sciuri
S. simulans
S. warneri
S. xylosus
98
Tabelle 7. Pathogene Bedeutung verschiedener KNS-Spezies (nach BLOBEL und
SCHLIESSER, 1994)
Spezies Herkunft Pathogenität
S. arlettae Haut und Nasenbereich Geflügel,
Ziegen
Keine Angaben
S. auricularis Äußeres Ohr Mensch,
Ziege
Otitis externa Mensch
S. capitis Kopfhaut Mensch, Milch Ziege Wundinfektionen,
Urogenitaltraktinfektionen
Mensch
S. caprae Milch Ziege Keine Angaben
S. chromogenes Haut Rind, Schwein, Geflügel
Milch Rind, Ziege
Klinische und subklinische
Masititis Rind
S. cohnii Urogenitaltrakt Mensch
Milch Ziege
Wundinfektionen,
Urogenitaltraktinfektion,
Endokarditis, Septikämie
Mensch, jedoch ungeklärte
Bedeutung
S. epidermidis Haut, Schleimhaut Mensch, Tier Postoperative Infektionen,
Harnwegsinfektionen,
Otitiden, Wundinfektionen
Mensch
Mastitis Rind, Schaf, Ziege
S. gallinarum Haut und Nase Hühner Pathogene Bedeutung
unbekannt
S. haemolyticus Haut Mensch, Affe
Eitrige Infektionen Mensch,
Tier, pathogene Bedeutung
ungeklärt
Mastitis Rind
S. hominis Haut Mensch
Mastitismilch Rind
Bedeutung ungeklärt
S. hyicus Haut gesunder und kranker
Schweine
Haut Rind, Pferd, Esel, Geflügel
Exsudative Epidermitis
Schwein
Septische Polyarthritis
Schwein
Infektionserreger Tier
Mastitis Rind
99
Spezies Herkunft Pathogenität
S. intermedius Haut und Schleimhaut
Fleischfresser, Pferd, Taube,
Mensch, Menschenaffe
Wundinfektionen, Otitis
externa, Pyodermie,
Mastitis Hund, Katze
S. kloosii Haut Wildtier, Haustier Bedeutung ungeklärt
S. lentus Haut, Euter Ziege, Schaf Mastitis Ziege
Harnweginfektionen Nerz
S. lugdunensis Klinisches Untersuchungsmaterial
Mensch
Haut-, Schleimhaut-, Blut-
und Gefäßinfektionen,
Endokarditis, Peritonitis,
Osteomyelitis Mensch
S. saprophyticus Haut, Urogenitaltrakt Mensch,
Säugetiere
Lebensmittel
Harnwegsinfektionen
Mensch
S. schleiferi Klinisches Untersuchungsmaterial
Mensch
Keine Angaben zur
Bedeutung
S. schleiferi
subsp. Coagulans
Ohr Hund Otitis externa Hund
S. sciuri Haut Nager, Huftiere,
Fleischfresser, Beuteltiere, Mensch
Mastitis Rind, Schaf, Ziege
S. simulans Haut Mensch, klinisches
Untersuchungsmaterial Mensch,
Tier
Septikämie, Endokarditits,
Harnwegsinfektionen
Mensch
Mastitis Rind, Ziege
S. warneri Haut Mensch, Menschenaffen,
Affen, Haustiere
Septikämie, Endokarditis,
Konjunktivitis, Harnwegs-
und Wundinfektionen
Mensch
Mastitis Rind
S. xylosus Haut Mensch, Affe, Säugetiere Mastitis Rind, Ziege
Sonstige path. Bedeutung
ungeklärt
100
Tabelle 8. Wachstumseigenschaften der Staphylokokken-Kolonien auf Agar
(BLOBEL und SCHLIESSER, 1994)
Staphlykokken-
Spezies
Wachstumseigenschaften, Aussehen der Kolonien
S. arlettae Durchmesser 6-8 mm, opak, gelb, beige
S. aureus glatt, erhöht, glänzend, rund, Durchmesser 6-8 mm, grau,
grauweiß, gelblich, gelborange, orange
S. capitis glatt, leicht konvex, glänzend, Durchmesser 1-3 mm,
unpigmentiert
S. caprae rund, leicht konvex, opak, glänzend, Durchmesser 1-6 mm,
unpigmentiert
S. chromogenes leicht konvex, rund, glatter Rand, glänzend, Durchmesser 3-8 mm,
gelb, orange, cremefarben
S. cohnii konvex, rund, glatt, glänzend, opak, Durchmesser 4-6,5 mm,
unpigmentiert, leicht gelblich
S. epidermidis glatt, schleimig, erhöht, glänzend, rund, durchscheinend, opak,
Durchmesser 2,5 – 6 mm, unpigmentiert, selten gelblich,
bräunlich, violett
S. haemolyticus glatt, erhaben- leicht konvex, glänzend, rund, opak, Durchmesser
5 – 9 mm, unpigmentiert, manche gelblich
S. hominis glatt – leicht gewölbt, rund, glänzend oder stumpf, opak,
Durchmesser 3 – 5 mm
S. hyicus konvex, rund, glänzend, opak, Durchmesser 4 – 7 mm,
unpigmentiert
S. intermedius konvex, rund, glatt, glänzend, durchscheinend, grau-weiß,
Durchmesser 5 – 6,5 mm, unpigmentiert
S. lentus rund, opak, konvex, glatt, glänzend, weiß, creme, gelblich,
Durchmesser 2,2 – 3,5 mm
S. lugdunensis glatt oder raue, regelmäßige/unregelmäßige Ränder, teils gelb,
Durchmesser 1 – 4 mm
S. saprophyticus erhöht – leicht konvex, rund, einheitlich, glatt, glänzend, opak,
Durchmesser 5 – 9 mm, unpigmentiert, auch gelb, gelb-orange
S. schleiferi uneinheitlich, irregulär, gekräuselt/galtt, glänzend, leicht konvex,
Durchmesser 3 – 5 mm, unpigmentiert
101
Tabelle 8. Wachstumseigenschaften der Staphylokokken-Kolonien auf Agar
(BLOBEL und SCHLIESSER, 1994)
Staphlykokken-
Spezies
Wachstumseigenschaften, Aussehen der Kolonien
S. schleiferi coagulans leicht konvex, opak mit glatter, glänzender Oberflächer,
Durchmesser 1,5 – 2 mm, unpigmentiert
S. sciuri erhaben mit erhöhtem Zentrum, glatt, glänzend, rund, opak,
Durchmesser 7 – 11 mm, grau-weiß mit
gelblichem/cremefarbenen Ton
S. simulans erhaben, rund, einheitlich, glatt, leicht glänzend durchscheinend –
opak, Durchmesser 5 – 7,5 mm, grau-weiß und unpigmentiert
S. warneri glatt, erhaben mit leicht erhöhtem Zentrum, glänzend, einheitlich,
durchscheinend bis opak, Durchmesser 3 – 6 mm, meist gelblich-
grau, gelb oder gelb-orange oder unpigmentiert
S. xylosus erhaben bis leicht konvex, rund, glatt bis rau, matt bis glänzend,
opak, Durchmesser 5 – 10 mm, meist orange-gelb, gelblich-grau,
grau-weiß, gelblich oder unpigmentiert
102
Tabelle 11. Herkömmliche Verfahren zur Identifizierung von Koagulase-negativen
Staphylokokken
Spezies Autoren Morphologie/
Antibiogramm
Bio-
chemie
Herkunft
Staphylococcus
(S.) arlettae
SCHLEIFER et al.,
1984
Morphologie,
Novobiocin
Glukose Tier
S. auricularis KLOOS und
SCHLEIFER,
1983, 1986
Morphologie,
Novobiocin
Glukose Mensch
S. capitis KLOOS und
SCHLEIFER,
1975, 1986
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Morphologie,
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit Mensch
Ohne Angaben
S. caprae DEVRIESE et. al,
1983
Morphologie,
Novobiocin
Glukose, Mannit Tier
S. chromogenes DEVRIESE et al.,
1994
KLOOS und
SCHLEIFER, 1986
Novob/Deferi/
Fosfom1)
DNase, Protease
Glukose, Mannit
Tier
Tier
S. cohnii SCHLEIFER und
KLOOS, 1975b
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Morphologie,
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit Mensch
Ohne Angaben
S. epidermidis DEVRIESE et al.,
1994
SCHLEIFER und
KLOOS, 1975b
CASALS und
PRINGLER (1989)
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Novob/Deferi/
Fosfom
Morphologie
Polymyxin
Polymyxin
DNase, Protease
Glukose, Mannit
Tier
Mensch
Ohne Angaben
Ohne Angaben
103
Spezies Autoren Morphologie/
Antibiogramm
Bio-
chemie
Herkunft
S. hämolyticus DEVRIESE et al.,
1994
SCHLEIFER und
KLOOS, 1975b
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Novob/Deferi/
Fosfom
Morphologie
Polymyxin
DNase, Protease
Glukose, Mannit
Tier
Mensch
Ohne Angaben
S. hyicus DEVRIESE et al.,
1994
DEVRIESE, 1977
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Novob/Deferi/
Fosfom
Morphologie
Polymyxin
DNase, Protease
Glukose, Mannit
Tier
Tier
Ohne Angaben
S. hominis KLOOS und
SCHLEIFER,
1975, 1986
DEVRIESE et al.,
1994
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Morphologie
Novob/Deferi/
Fosfom
Polymyxin
Glukose, Mannit
DNase, Protease
Mensch
Tier
Ohne Angaben
S. lentus KLOOS et al.,
1976a
SCHLEIFER et al.,
1983
MONSEN et al.,
1998
Morphologie,
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit Tier
Verschiedene
Spezies
S. lugdunensis FRENEY et al.,
1988
MONSEN et al.,
1998
Morphologie,
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit Mensch
Verschiedene
Spezies
S. saprophyticus SCHLEIFER und
KLOOS, 1975b
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Morphologie,
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit Mensch
Ohne Angaben
S. schleiferi FRENEY et al.,
1988
MONSEN et al.,
1998
Morphologie,
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit Mensch
Verschiedene
Spezies
104
Spezies Autoren Morphologie/
Antibiogramm
Bio-
chemie
Herkunft
S. sciuri KLOOS et al.,
1976a
KLOOS und
SCHLEIFER, 1986
HELTBERG and
BRUUN, 1983
Morphologie,
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit Tier
Ohne Angaben
S. simulans KLOOS und
SCHLEIFER,
1975, 1986
DEVRIESE et al.,
1994
MONSEN et al.,
1998
Morphologie
Novob/Deferi/
Fosfom
Polymyxin
Glukose, Mannit
DNase, Protease
Mensch
Tier
Verschiedene
Spezies
S. warneri KLOOS und
SCHLEIFER,
1975, 1986
DEVRIESE et al.,
1994
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Morphologie
Novob/Deferi/
Fosfom
Polymyxin
Glukose, Mannit
DNase, Protease
Mensch
Tier
Ohne Angaben
S. xylosus SCHLEIFER und
KLOOS, 1975b
DEVRIESE et al.,
1985
HELTBERG und
BRUUN, 1983
Morphologie
Morphologie,
Furazolidon
Novobiocin
Polymyxin
Glukose, Mannit
DNase,
Oxidase,
Aesculin,
Protease,
Hyaluronidase
Phosphatase
Staphylokinase
Nitrat
Und weitere
Mensch
Tier
Ohne Angaben
1)Novobiocin/Desferioxamin/Fosfomycin
105
Tabelle 12. Übersicht zur Antibiotikaempfindlichkeit Koagulase-negativer Staphylokokken
Spezies Novo-biocin
Autoren Desferi-oxamin
Autoren Fosfo- mycin
Autoren Poly- myxin B
Autoren Furazo-lidon
Autoren
S. arlettae
R1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. auricularis
E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. capitis E
1)fast
alle
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
R10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992
E8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. caprae
E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
V10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. chromogenes
E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
11)
DEVRIESE et al., 1994
E11)
DEVRIESE et al., 1994
R9)
HÉBERT et al., 1988
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. cohnii
R1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
R10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992
E8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. epidermidis
E1)fast
alle
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
E8)
/E11)
8)MONSEN
et al., 1998 11)
DEVRIESE et al., 1994 E
6)/R
10)/
V11)
6)FORSGREN und
WALDER, 1983 10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992 11)
DEVRIESE et al., 1994
E4)
/R8)
/R9
)
4)TUTEJA et.al., 1993
8)MONSEN et al.,
1998 9)
HÉBERT et al., 1988
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. gallinarum
R1)
/R3)
1)BLOBEL und
SCHLIESSER, 1994 3)
DEVRIESE et al., 1983 R
8)
MONSEN et al., 1998
E10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992
R8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. hämolyticus
E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
R11)
DEVRIESE et al., 1994
E8)
/R8)52%
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. hominis
E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
E8)
/E11)
8)MONSEN
et al., 1998 11)
DEVRIESE et al., 1994 E
6)/R
11)
6)FORSGREN und
WALDER, 1983 11)
DEVRIESE et al., 1994
E8)89%
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. hyicus
E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
R11)
DEVRIESE et al., 1994
E11)
DEVRIESE et al., 1994
R5)
/E7)
/R9
)
5)DEVRIESE et al.,
1978 7)
LÄMMLER, 1990 9)
HÉBERT et al., 1988 E
2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
106
Spezies Novo-biocin
Autoren Desferi-oxamin
Autoren Fosfo- mycin
Autoren Poly- myxin B
Autoren Furazo-lidon
Autoren
S. lentus
R1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
E8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. lugdunensis E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
E8)
/R8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. saprophyti-cus R
1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
R10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992
E8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. schleiferi E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
E8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. sciuri R1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994 R
8)
MONSEN et al., 1998
E8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. simulans E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
R8)
/R11)
8)MONSEN
et al., 1998 11)
DEVRIESE et al., 1994 E
11)
DEVRIESE et al., 1994
E8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. warneri E1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
R8)
/R11)
8)MONSEN
et al., 1998 11)
DEVRIESE et al., 1994 R
10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992
R8)71%
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
S. xylosus R1)
BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
R8)
/R11)
8)MONSEN
et al., 1998 11)
DEVRIESE et al., 1994 V
10)
BEDIDI-MADANI et al., 1992
R8)
MONSEN et al., 1998
E2)
von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
E empfindlich; R resistent; V variabel 1) BLOBEL und SCHLIESSER, 1994
2) von RHEINBABEN und HADLOCK, 1981
3) DEVRIESE et al., 1983
4) TUTEJA et.al., 1993
5) DEVRIESE et al., 1978
6) FORSGREN und WALDER, 1983
7) LÄMMLER, 1990
8) MONSEN et al., 1998
9) HÉBERT et al., 1988
10) BEDIDI-MADANI et al., 1992
11) DEVRIESE et al., 1994
107
Tabelle 13. Vorkommen von Koagulase-negativen Staphylokokken in Ziegenmilch1)
Spezies Autoren Nachweismethode
S. epidermidis
S. simulans
S. hyicus
POUTREL und
LERONDELLE (1983)
Differenzierung nach PLOMMET
(1962)
S. epidermidis
S. caprae
S. simulans
S. haemolyticus
S. sciuri
S. xylosus
S. cohnii
S. hyicus ssp. chromogenes
S. hyicus ssp. hyicus
POUTREL (1984) Devriese-Schema
S. xylosus
S. hämolyticus
S. caprae
S. epidermidis
S. sciuri
S. saprophyticus
S. auricularis
BINDER (1986) Morphologie
Biochemische Charakterisierung
S. caprae
S. epidermidis
S. xylosus
S. hyicus
S. lentus
S. hämolyticus
S. simulans
S. cohnii
S. chromogenes
DE BUYSER et al. (1987) Devriese-Schema
Differenzierung nach SCHLEIFER
et al. (1983)
S. epidermidis
S. simulans
S. chromogenes
S. caprae
S. xylosus
S. hominis
S. cohnii
HARVEY und GILMOUR
(1988)
MPI-Vorgehen (HARVEY and
GILMOUR, 1985)
API-STAPH-System
108
Tabelle 13. Vorkommen von Koagulase-negativen Staphylokokken in Ziegenmilch1)
Spezies Autoren Nachweismethode
S. epidermidis
S. hyicus
S. warneri
S. simulans
S. hominis
S. xylosus
S. sciuri
S. capitis
MAISI und RIIPINEN
(1991)
API-STAPH-System
S. epidermidis
S. xylosus
S. simulans
S. sciuri
ORDEN et al. (1992) API-STAPH-System
S. simulans
S. caprae
S. xylosus
S. epidermidis
S. capitis
S. sciuri
S. hominis
S. auricularis
S. lentus
S. hämolyticus
OELFKEN (1993) API-STAPH-System
Lysostaphin-Test
S. epidermidis
S. caprae
S. lentus
S. simulans
S. capitis
S. lugdunensis
S. xylosus
S. chromogenes
S. hominis
S. arlettae
S. warneri
S. sciuri
S. saprophyticus
DEINHOFER und
PERNTHANER (1995)
ATB 32 Staph-System
S. caprae
S. xylosus
S. warneri
S. chromogenes
S. capitis
S. gallinarum
S. cohnii
S. hominis
S. lugdunensis
BEDIDI-MADANI et. al (1998)
API-STAPH-System,
ID32 Staph-System
109
Tabelle 13. Vorkommen von Koagulase-negativen Staphylokokken in Ziegenmilch1)
Spezies Autoren Nachweismethode
S. epidermidis
S. chromogenes
S. simulans
S. warneri
S. xylosus
S. lentus
S. equorum
S. intermedius
WINTER und
BAUMGARTNER (1999)
API-STAPH-System,
Furazolidon-Empfindlichkeit
S. caprae
S. warneri
S. simulans
S. chromogenes
S. epidermidis
S. xylosus
S. hämolyticus
S. capitis
S. cohnii
S. lugdunensis
S. equorum
S. hominis
VIRDIS et al. (2010) API ID32 Staph System
1)Auflistung in der Reihenfolge der jeweils beschriebenen Nachweishäufigkeit
110
Tabelle 28. Ergebnis der biochemischen Untersuchung mittels ID32 Staph-Test
Stamm
Ure
ase
Arg
nin
dih
yd
rola
se
Orn
ithin
decarb
oxyla
se
Esculin
hyd
roly
se
Glu
co
se
Fru
kto
se
Man
no
se
Maltose
Lacto
se
Tre
halo
se
r
Mm
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finose
Niratr
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uktion
Aceto
inbild
un
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ala
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ase
Arg
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Alk
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hosp
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se
Pyrr
idonyl-
Ary
lam
idase
Novo
bio
cin
resis
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N-A
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osm
in
Tu
ran
ose
Ara
bin
ose
ß-G
lucu
ronid
ase
Rib
ose
Cello
bio
se
S. caprae
1) - + - - + + + - + + - - + + - - + - - - - - - - - -
S. hyicus - - - - + + - - + + - - + - - - + - - + + - - - - -
S. epidermidis - + - - + + - - - - - - + + - - - - - - - - - - - -
S. simulans + + - - + + - - + + + - + - + - - - - + + - - + - -
S. saprophyticus + - - - + + - - + + - - - + + - - - + + + - - - - -
S. chromogenes + + - - + + + - + + - - + - - - + - - + + + - - + -
S. lentus + - - + + + + + + + + + + - - - - - + + + + - - - +
S. hominis + - - - + + - + - + - - + - - - - - - - + + - - - -
S. xylosus + - - - + + - + + + + - + - + - + - + + + + + + - -
S. schleiferi - + - - + - + - - - - - - + - - + - - - - - - - - -
S. capitis - + - - + + + - - - + - + - - - - - + + - - - - - -
S. warneri - - - - + + - + + + - - + - - - - - + + - - - - + -
S. intermedius + - - - + + + + + + + + + - + - + - + + + - - - + -
S. hämolyticus - + - - + + - + + + + - + - - - - - - + - - - - - -
S. cohnii - - - - + + - + - + + + - - - - - - + - - - - - - -
S. auricularis - - - - + + - + - + - - - - - + - - - + - + - - - -
S. lugdunensis + - + - + + + + + + - - + - - - - - + + + - - - - -
2;3, I/29.12.2) - + - - + + + - + - - - + - - - - - - - - - - - - -
16;3, I/16.10. + + - - + + + + + + - - + + - - + - - + + + - - - -
39;3, I/29.12. - + - - + + + + + - - - + + - - + - + - + - - - - -
39;3, II/08.01. - + - - + + + + + - - - + + - - + - + + + - - - - -
39;3, I/18.11. - + - - + + + + + - - - + + - - + - + - - - - - - -
2;3, II/08.01. - - + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + - + +
67;2, I/16.12. - + - - + + + + - - + - + + - - - - + + - - - - - -
111
Tabelle 28. Ergebnis der biochemischen Untersuchung mittels ID32 Staph-Test
Stamm
Ure
ase
Arg
nin
dih
ydro
lase
Orn
ithin
decarb
oxyla
se
Esculin
hydro
lyse
Glu
cose
Fru
kto
se
Ma
nnose
Ma
ltose
Lacto
se
Tre
halo
ser
Mm
annit
Rra
fin
ose
Niratr
eduktio
n
Aceto
inbild
ung
ß-G
ala
cto
sid
ase
Arg
inin
ary
lam
idase
Alk
alis
che P
hosphata
se
Pyrr
idonyl-A
ryla
mid
ase
Novobio
cin
resis
tenz
Sacharo
se
N-A
cety
lglic
osm
in
Tu
ranose
Ara
bin
ose
ß-G
lucuro
nid
ase
Rib
ose
Cello
bio
se
59;2, I/16.12. + + - - + + + - + - - - - + - - - - - - - - - - - -
35; 3, I / 21.05. - - - - + + - - - - - - + - - - - - - + - + - + - -
35; 3, I / 26.05. - - - + + + - - + + - - + - - - - - - + + - - + - -
35; 3, I / 26.05. - - - - + + - - + + - - + - - - + - - + + + - + - -
35; 3, I / 24.06. - - - - + + - - + + + - + - - - - - - + + + - + - -
35; 3, I / 18.07. - - - - + + - - + + + - + - - - - - - + + + - + - -
35; 3, I / 23.07. - - - - + + - - + + + - + - - - + - - + + + - + - -
35; 3, I / 28.08. - - - - + + - - + + + - + - - - - - - + + + - - - -
35; 3, I / 05.09. - - - - + + - - + + - - + - - - + - - + + + - - - -
35; 3, I / 16.10. - - - - + + - - + + - - + - - - + - - + + + - + - -
35; 3, I / 22.10. - - - - - + - - + - - - + - - - - - - + - + - + - +
35; 3, I / 22.10. - - - - + + - - + + - - + - - - + - - + + + - + - -
35; 3, I / 18.11. - - - - + + - - + + - - + - - - + - - + + - - + - -
50;1, I/27.05. + + - + + + + + + - + + + + - - + - - + + - - - + +
59;2, I/16.12. - + - - + + + - + + - + - + + - - - - + + - - - - -
50;1, I/27.05. - + - - + + - - + + + - + - + - - - - - + + - - + -
45;2, I/16.12. - + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + - + + + +
16;3, I/16.10. + - - - + + - + + + + - - + + - - - + + + - - - - -
93;2, I/16.12. - - + + + + + + - + + + + + + - + - - + + - + - + +
77;2, I/16.12. + - + + + + + + + + + + + + + - + - + + + - + - + +
6;2, I/16.01. + - - - + + + + + + + - + + + + + - + + + + + + - -
18;3, I/28.08. - - - - - + - - - - - - + - - - - - - - - - - - - -
18;3, I/19.03. - + + - + + - + + - - - + + - - - - - + - + - - - -
1)
Referenzstamm 2)
Feldstamm (Bezeichnung der Ziege, Betrieb, Jahr, Datum der Untersuchung)
112
Tabelle 29. Ergebnisse der biochemischen Untersuchung der Referenzstämme,
Auswertung mittels APILAB-Software
Referenzstamm Spezies Qualität
S. auricularis S. auricularis/S. hominis Zweifelhaft für S. auricularis
S. capitis S. capitis Sehr gut
S. caprae S. caprae 94,7%
S. chromogenes S. chromogenes 96,9%, gut
S. cohnii S. cohnii /S. kloosii Gut für S. cohnii
S. epidermidis S. epidermidis /S. capitis Gut für S. epidermidis
S. hämolyticus S. hämolyticus Gut
S. hominis S. hominis Sehr gut
S. hyicus S. chromogenes/S. hyicus Zweifelhaft
S. lentus S. lentus Sehr gut
S. lugdunensis S. lugdunenesis Akzeptierbar
S. saprophyticus S. saprophyticus /S. simulans Zweifelhaft für S. saprophyticus
S. schleiferi S. schleiferi Gut
S. sciuri S. sciuri Gut
S. simulans S. simulans 99,9%, sehr gut
S. warneri S. warneri/ S. capitis Gut für S. warneri
S. xylosus S. xylosus Sehr gut
113
Tabelle 30. Biochemischen Identifizierung von Feldstämmen, Auswertung mittels
APILAB-Software
Feldstamm KNS-Spezies Qualität
671) ;2, I/16.12. S. capitis 99,9%, sehr gut
59; 2, I/16.12. S. capitis/S.epidermidis
39; 3, II/08.01. S. chromogenes/caprae 68,9% für S. chromogenes
22, 2% für S. caprae
2;3, I/08.01. S. lentus/xylosus unakzeptierbar
39; 3, I/29.12. S. epidermidis/S. hominis/S.
aureus/S. capitis
unakzeptierbar
39; 3, I/18.11. S. capitis/S. epidermidis/S.
hominis/S. aureus/S. caprae
gut für S. capitis
16; 3, I/16.10. S. hominis/S. aureus 68,6% für S. hominis
31,3% für S. aureus
50; 1, I/27.05. S. simulans unakzeptierbar
45; 2, I/16.12. kein Ergebnis unakzeptierbar
59; 2, I/16.12. S. simulans/S. chromogenes/S.
equorum
keine Angabe
50; 1, I/27.05. S. lentus unakzeptierbar
16; 3, I/16.10. S. saprophyticus 99,9%, ausgezeichnet
35; 3, I/21.05. S.hämolyticus/S. warneri/S.
simulans/S. equorum/S. hominis
keine Angabe
35; 3, I/26.05. S. xylosus/S. sciuri keine Angabe
35; 3, I/26.05. S. equorum/S. simulans keine Angabe
35; 3, I/24.06. S.warneri/S. epidermidis/S.
hominis/S. equorum/S: capitis
keine Angabe
35; 3, I/18.07. S. hyicus/S. xylosus/S. hominis keine Angabe
35; 3, I/23.07. S. hyicus/S. simulans Zweifelhaft
35; 3, I/28.08. S. hämolyticus/S. warneri/S.
equorum/S. simulans/S. hominis
keine Angabe
114
Feldstamm KNS-Spezies Qualität
35; 3, I/05.09. S.hämolyticus/S. warneri/S.
equorum/S. simulans/S:
hominis/S. lentus
keine Angabe
35; 3, I/16.10. S. hyicus/S.xylosus/S.hominis keine Angabe
35; 3, I/22.10. S. epidermidis keine Angabe
35; 3, I/22.10. S. hyicus/S. xylosus/S. hominis keine Angabe
35; 3, I/18.11. S. hominis/S. chromogenes/S.
aureus
keine Angabe
77; 2, I/16.12. S. lentus/S. xylosus/S. gallinarum Unakzeptierbar
93; 2, I/16.12. S. lentus Unakzeptierbar
6; 2, I/16.12. S. sciuri/S. lentus ausgezeichnet für S. sciuri
2; 3, I/08.01. S. capitis/S. caprae/S.
schleiferi/S. lentus/S. xylosus
keine Angabe
18; 3, I/19.03. S. epidermidis/S. hominis/S.
gallinarum/S. xylosus
Unakzeptierbar
32; 3, S. hominis/S. warneri Akzeptierbar
6; 2, I/16.12. S. xylosus/S.sciuri unakzeptierbar für S. xylosus
zweifelhaft für S. sciuri
1)Bezeichnung der Ziege, Betrieb, Jahr, Datum der Untersuchung
115
Tabelle 39. Amplifikat- und Resistenzmuster der nicht zuzuordnenden Feldstämme
Amplifikat- muster
Resistenz- muster
n
%
A1 R1 2 1,7
A1 R3 1 0,8
A1 R6 1 0,8
A1 R8 3 2,5
A1 R9 3 2,5
A1 R11 1 0,8
A1 R12 1 0,8
A2 R8 3 2,5
A2 R11 1 0,8
A11 R9 2 1,7
A12 R4 1 0,8
A13 R2 1 0,8
A14 R9 1 0,8
A15 R8 1 0,8
A16 R2 1 0,8
A17 R9 1 0,8
A18 R8 1 0,8
A19 R1 1 0,8
A20 R1 1 0,8
A21 R1 1 0,8
A22 R3 1 0,8
A23 R2 1 0,8
A24 R1 1 0,8
A25 R1 1 0,8
A26 R5 1 0,8
A27 R5 1 0,8
A28 R4 1 0,8
A29 R9 1 0,8
A30 R1 1 0,8
A31 R1 1 0,8
A32 R2 1 0,8
A33 R4 1 0,8
A34 R2 1 0,8
A35 R2 1 0,8
A36 R8 1 0,8
A37 R3 1 0,8
Zuzuordnen1)
74 62,7
Gesamt 118 100
1)
siehe Tabelle 37
Danksagung Für ihren Beitrag zum Gelingen dieser Arbeit möchte ich mich ganz herzlich bedanken bei: Prof. Dr. Axel Sobiraj für die Überlassung des Themas und den überaus hilfreichen Anmerkungen bei der Durchsicht der Arbeit Dr. Michael Zschöck für die geduldige Betreuung der Arbeit Dr. Wilfried Wolter für seine Hilfe aus dem Hintergrund Katharina Kreider und Katrin Welsch,die mir halfen, dem Computer Diagramme und sonstige Geheimnisse zu entlocken Allen Mitarbeitern des Landesbetriebes Hessisches Landeslabor Gießen für die unermüdliche und immer freundliche Einweisung in die verschiedenen Untersuchungs-methoden des Labors Meiner Familie für ihre Geduld und Verständnis. Zu guter Letzt gilt mein ganz besonderer Dank meiner Kollegin und lieben Freundin Dr. Bärbel Kloppert. Sie wich nie von meiner Seite, weder fachlich noch menschlich, ermutigte mich immer wieder und versprühte grenzenlosen Optimismus.
„Freunde sind Gottes Entschuldigung für Verwandte.“
George Bernard Shaw
