Zeitschrift ffir Krebsforschung 66, 321--332 (1964)

Aus dem Pathologischen Institut der Universit~t Miinehen (Direktor: Prof. Dr. W. ]~i~NGEL~R)

Autoradiographisehe Un te r suehungen w~ihrend der experimentel len Carc inoments tehung im Respi ra t ions t rak t

des (]oldhamsters naeh Behand lung mit Di~ithylnitrosamin ~

Von

W. DONTENWILL und B. W1EBECKE

Mit 7 Textabbildungen

(Eingegangen am 4. Juli 1964)

Bei experimentellen Untersuehungen fiber die Histogenese der Tumoren im Respirationstrakt des Goldhamsters, bei dem spontan nur ganz vereinzelt sog. Lungenadenomatosen auftreten, fanden wir (Do~TENWILL und MooR), dab einzelne Abschnitte dieses anatomisch/ihnlieh gebauten Systems vSllig versehie- den reagieren. W/s nach Behandlung mit Dis sich im Bereich des Bronehialepithels nach metaplastisehen und proliferativen Epithelver/~nde- rungen infiltrierend waehsende Plattenepithelearcinome der Bronehien ent- wiekelten, land sich im Bereich der Trachea eine meist nur lokale, selten diffuse papill/ire Wucherung der Schleimhaut mit hochgradiger Stenosierung der Tracheal- lichtung.

Diese Beobaehtung veranlaBte uns zu klaren, ob beim Hamster bestimmte Abschnitte des Respirationstraktes wegen ihrer unterschiedlichen Zellneubildungs- rate versehieden auf carcinogene Substanzen reagieren. Diese K1/~rung sehien uns wichtig, weft bei Insufflationsversuchen mit Benzpyren beim Goldhamster (DosTESWILL und MoHI~) im Bereich der Trachea Carcinome auftraten, w/~hrend im Bereich der Mundhgh~e und der Backentaschen trotz hoher Konzentration der carcinogenen Substanz bei der Insufflation in diesem Bereich keine malignen Tumoren beobachtet wurden. Die untersehiedliche Reaktion einzelner Absehnitte eines morphologiseh oft gleiehartig aussehenden Systems erschien uns nicht alleine durch Dosis und Zeitfaktoren erkl/~rbar.

Autoradiographische Untersnchungen sollten zeigen, ob im Vergleich mit der Carcinogenese an der ttaut/ihnliche Ver/~nderungen entstehen, wie sie OEHL~T, CoT~ und B~c~E~ w/ihrend der Cancerisierung der Epidermiszelle der M/~use- haut nach Methylcholanthrenpinselung beschrieben haben. Insbesondere wollten wit kl/~ren, ob die untersehiedliche Reaktion der beiden Abschnitte des l~espira- tionstraktes dureh eine untersehiedliche Zellneubildungsrate oder durch unter- schiedliche Vorg/~nge w/~hrend der Cancerisierung erklgrbar ist.

Material und Methodik MS~nnliehe Goldhamster erhielten unterschiedliche 3/iengen yon Nitrosaminen, zum Teil

subcutan, zum Tell rectal bzw. durch Schlundsonde appliziert. Die Dosis und die Applika- tionsart ist jeweils in den Tabellen aufgefiihrt. [Die Goldhamster erhielten zwei- bis dreimal

* Die Untersuchungen wurden mit Unterstiitzung der Deutschen Forschungsgemeinschaft durchgefiihrt.

322 W. DONTENWILL und B. W~E]3~eKE:

w6chentlich 0,4 cm a einer L6sung yon Digthylnitrosamin (1:250) subcutan oder rectal. Ein Teil der Tiere erhielt bei Versuehsbeginn zwei Injektionen yon Di~thylnitrosamin, diese Tiere wnrden 324 Tage nach der letzten Injektion get6tet]. Da in einer grogen Zahl yon Versuchstieren bereits frfiher gekl~rt werden konnte, dag die Art der Applikation fiir die Tumorentstehung bzw. die Art der Reaktion unerheblieh ist, war es m6glieh, aus versehie- denen Versuchsreihen Tiere fiir die autoradiographisehe Untersuehung zu verwenden. Naeh unterschiedlicher Behsndlungszeit v~rden die fiir die Untersuchung bestimmten Tiere jeweils morgens um 8Uhr (urn tsgeszeitliche Sehwankungen zu vermeiden) mit 3It-Thymidin behandelt. Die Tiere erhielten pro Gramm K6rpergewicht 2,0 #C a H-Thymidin mit einer si0ezifisehen Aktivit~t yon 1,9 C/m Moi intraperitone~l injiziert. Die Versnehstiere w~lrden 40 rain naeh der Thymidininjektion get6tet. Die entnommenen 0rgsne wurden in 4%igem, neutrM gepuffer~em Formol fixiert. Es wurden Stufensehnitte yon Lunge nnd Trachea bzw. bei einzelnen Versuchstieren yon Itaut, Zunge und MundhShlensehleimhaut sowie Leber ange- fertigt. Die 5 ,a dieken Parsffinsehnitte wurden in der yon OSI~LnRT beschriebenen Weise vorbehandelt, mit flfissiger Photoemulsion (Ilford) 7 bzw. 14 Tage exponiert. Naeh Ent- wicklung und Fixation erfolgte l~grbung mit HgmatoxylimEosin dureh die Emulsionsschieht. Bei allen Versuehstieren wurden sowohl bei der siebentggigen sis such bei der 14tggigen Expositionszeit Bestimmungen des aH-Msrkierungsindex durehgefiihrt. Die Auswertung der Antorgdiogrsmme geschah dutch Auszghlung der markierten Zellen der normalen Tra- cheal- und Bronchislsehleimhaut (es wurden nur kleine und mitt]ere Bronehien ohne Knorpel ausgewertet, da ~uch hier die meisten Careinome entstanden) sowie der Epithelvergnderungen bzw. Tumoren der Versuchstiere. Bei den 20 ansgezghlten Kontrollen wnrden bei jedem der 20 Versuehstiere zweimal 1000 Zellen ausgezghlt und die ZahI der markierten Zellen bestimmt. Als msrkierte Zellen galten slle Zellen mit mindestens fiinf SilberkSrnern fiber dem Kern- punkt. Nine exakte Bestimmung der Mitoserate war wegen des geringen Mitoseindex im Bereich dieser Gewebe nicht mSglieh.

l~ei den pspillgren und metaplastischen Vergnderungen der Traeheal- und Bronehial- schleimhaut wurden in Stufenschnitten untersehiedliche Zshlen yon Zellen ausgez~hlt, die Zahl der ausgezghlten Zellen richtete sieh nach der in den Schnitten gefundenen Menge der metaplastisehen und papillgren Epithelver~nderung. Gleichzeitig wurde neben der Bestim- mung des Markierungsindex die Lokalisation der markierten Zellen innerhalb der normalen Sehleimhaut, der metaplsstisehen und papill/~ren Epithelver~nderungen sowie der kleinen nnd grol3en Czreinome bestimmt. Um vergleichbare Werte gegenfiber anderen Versuchstieren zu erhalten (zu den Werten an der Hsut bei der Maus), wurde bei einzelnen Tieren der Msrkie- rungsindex an der I t sut erreehnet. Dieser Index entsprseh weitgehend dem Index der nor- malen Mgusehant (0~J~Ln~T u.a.).

Ergebnisse der Untersuchungen

Bei den Ergebnissen der Unte r suehungen mug unterschieden werden

1. zwisehen dem lV[arkierungsindex in der Sch le imhaut der Lunge und Trachea bei Normal t i e ren und dem Markierungs index bei den nach Behand lung mi t Ni t rosamin gefundenen metaplas t i sehen , papill/~ren und mal ignen Epi the lver -

/~nderungen und 2. der Loka l i sa t ion der mark ie r t en Zellen im Verlaufe des Caneerisierungs-

prozesses. Die morphologisehen Vers naeh Ni t ro saminbehand lung an der Tracheal- und BronchiMschle imhaut haben wir berei ts fr/ iher e ingehend beschr ieben (DozcTE~WILL und MoH~). W i t kSnnen uns deswegen auf die Be- sehreibung der au to rad iograph isehen Befunde an den metaplas t i sehen , papill/~ren und care inomatSsen Seh le imhau tvergnderungen besehr~nken.

Der Markierungs index bei unbehande l t en Tieren im Bereieh der Tracheal- seh le imhaut is t wesent l ich niedr iger als im Bereich der ~ugeren I I a n t ( Index ca. 30), der Zungensch le imhaut I und der MundhShlensehle imhaut . E r is t abe t deut l ieh hSher (Tabelle 1 und 2) als in der Bronehia lsehle imhaut . Wh" fanden

Untersuchungen w~hrend der experinmntellen Carcinomentstehung 323

Versuehs - Nr. L u n g e

2403--2422 (20 Tiere)

2320 2493 2544 2548 2564 2569 2570 2572

2318 2320 2548 2569 2544

2266 2267 2265 2564 2567 2570 2493

normal (kleine nnd mi~tlere Bronchien)

kleine Carcinome kleine Carcinome groi~e und kleine Carcinome mehrere kleine Carcinome gro~e und kleine Carcinome grol~es Carcinom kleine Carcinome kleine Carcinome

stark proliferierende Metaplasie stark proliferierende Metaplasie stark proliferierende Met~p]asie stark pro]iferierende Met~plasie stark pro]iferierende Metaplasie

proliferierende Metaplasie proliferierende Metaplasie proliferierende Metaplasie ioroliferierende Metaplasie proliferierende Me~plasie proliferierende Metaplasie proliferierende Metaplasie

Tabelle

Z ~ h l d e r

a u s g e - z ~ h l t e n Zellen

je2000

4376 991

2225 1175 2241 1025 1108 1035

935 2097 1992 1221 1002

Zahl d e r markierten

ZeEen

je 1000 0 ~+3 ,15

'~--0 ,85

247 33

122 80 83 32 37 93

70 126 78 81 51

120 76

258 39 50 50

249

M a r - kierungs -

i n d e x

~

0,85

58 33 55 68 38 31 33 90 .^+40

M: ~'--19 75 58 39 71 51 ~ + 1 3

M : ~ - - 2 9 63

158 99 37 5O 23 38

B e h a n 4 1 n n g

DANA reef. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. NANA subc. DANA subc. DANA subc.

DANA rect. DANA rect. D~NA subc. DANA subc. DANA subc.

DANA rect. DANA rect. DANA rect. DXNA snbc. DANA subc. DANA subc. DANA subc.

2231 2259 2494 2495 2496 2545 2547 2566 2568 2571 2573

2574 2776 2543 2260 2491 2575

mittdgradige Met~plasie mittelgradige Metaplasie mittelgradige Metaplasie mittelgradige Metaplasie mi~telgr~dige Met~plasie mittelgradige Metap]asie mittelgr~dige Metaplasie mittelgradige Metaplasie mittelgradige Metap]asie mittelgradige Metaplasie mittdgradige Met~plasie

leichte Metaplasie leichte Metaplasie leichte Metaplasie leichte Metaplasie leichte Metaplasie leichte Metaplasie

106 118 20

160 39 35 10 22 20 11 41

26 44

6 17 86

I

M:

M:

90 41 25 61 45 33 41 35 54 41 57

18 22 12 i7

9 13

15_+

DANA reef. DANA feet. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DiNA subc. D~NA subc. DANA subc.

DANA subc. DANA subc. DA-NA subc. DANA rect. DANA subc. DANA subc.

h a n d - l u n g s - d a u e r

Tage

94 90

121 121 133 133 133 133

95 95

121 133 121

40 40 40

133 133 133 88

14 40 88 88 88 88 88

133 133 133 133

133 133 121 40 88

133

beim Hamste r einen niedrigeren Markierungsindex als KOBURG in der Bronchial- schleimhaut yon Mgusen und LVCAS von Rat ten . Die Proliferat ionsrate war in der Trachea wesentlich h6her Ms in den Bronchien. Wir haben bei den Kont ro l len die Abschni t te der Tracheal- bzw. Bronchialsch]oimhaut ausgezgh]t (mitt lere u n d kleine Bronch ien - -Trachea zwischen Kehlkopf u n d Bifurkation), we bei den

324 W. DONTENWILL und B. WIEBECKE:

Tabelle 2

V e r s u c h s - N r .

2403--2422 (20 Tiere)

normM

T r a c h e a

Z a h l Z a h l d c r d e r m a r -

a u s g e - k i e r t e n z ~ h l t e n Z e l l e n Z e l l e n

2r - k i e r u n g s -

index

5,6

B e h a n d l u n g

2230 2318 2320 2333 2346 2354 2491 2492 2493 2494 2495 2496 2543 2544 2545 2546 2547 2548 2564 2566 2567 2568 2569 2570 2571 2572 2573 2574 2575 2576

2348 2349 2350 2356 2357

2543 2544 2546 2567 2571 2566 2567 2569 2572 2547 2496 2495 2493 2492

beginnendes Papillom kleines Papillom kMnes Papillom beginnendes Papillom grol?es Papillom groges Papillom kleines Papillom grol3e und kleine Papillome kleine Papillome kleine Papillome Papillom groges Papillom kMnes Papillom groBes Papillom grol3es Papillom groges Papillom grol3es Papillom grol3es P~pillom groges Papillom kleines Papillom grol3e und kMne Papillome kMnes Papillom grol~es Papillom kleines Papillom kleines Papillom kleines Papillom groBes Papillom groi~es Papillom kleines Papillom gro$es Papillom

kMnes Papillom groges Papillom groBes Papillom grol3es Papillom groBes Papillom

leichte his mittelgradige Metaplasie leichte bis mi$telgradige Metaplasie Mchte bis mittelgradige Metaplasie ]eichte bis mittelgr~dige Met~plasie leichte bis mittelgradige Metap]asie leichte bis mittelgradige Metaplasic Mchte bis mittelgradige Metaplasie leichte bis mittelgradige Metapl~sie leichte bis mittelgradige Metaplasie leichte bis mi~iGelgradige Mctaplasie leichte bis mittelgradige Metaplasie ]eichte bis mittelgradige Metaplasie leichte bis mittelgradige Metaplasie leichte his mittelgradige Met~plasie

2201 2040 2154 3070 ~009

1068 2000 1016 1026 1540 933

1026 1147 1018 1060 825

1257 1069 846

76 37 43 22 20

38 65 37 19 73 1 19 24 70 38 44 86 54 52

37 36 53 43 4O 60 27 29 3O 33 75 75 33 23 25 38 21 23 24 35 38 25 37

163 61 37 27 27 6O 39 ~_9+121

lV[: ~ 21 35 18 2O 4 5

1~-k19 M: ~'--12

35 34 37 19 47 12 19 21 69 36 53 69 51 61

~ : 40 +29 --21

DANA rect. DANA rect. DANA rect. DANA rect. DANA rect. DANA rect. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. D~NA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. Ds subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc.

DANA subc. D~NA subc. DANA subc. DANA subc. D~NA subc.

DANA subc. DANA subc. DiaNA subc. D~NA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. DANA subc. D~i~NA subc. D~NA subc. DANA subc. DANA subc.

Bo- h a n d - l u n g s - dauer Tage

24 95 95 87

112 87 88 88 88 88 88 88

121 121 121 121 121 121 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133 133

2>( 2x 2x 2x 2x

121 121 121 133 133 133 133 133 133 124 90 90 90 90

Untersuehungen w~hrend der experimentellen Careinomentstehung 325

Versuchst ieren die papil ls metaplas t i schen und mal ignen Epi the lvers

gen gefunden wurden.

Nach kurzer Behandlungszeit erkennt man in den Absehnitten der TraeheMschleimhaut, wo spiiter die papill~ren Wueherungen gefunden werden, umschriebene metaplastische Ver- ~nderungen des Epithels mit etwa vier bis seehs Epithellagen. In diesen Metaplasien ist der Markierungsindex deutlieh erh6ht (s. Tabelle 2). Wir haben diese Vergnderungen Ms Anfangs- stadien der Papillome bezeiehnet. Bei Anfangsstadien der Papillome findet sieh keine ein- deutige Zunahme des Markierungsindex in der umgebenden Sehleimhaut, nur im Bereieh der sp~teren Papillomentstehung ist eine deutliehe Zunahme des Markierungsindex siehtbar. In den mehrsehiehtigen metapla- stisehen fli~ehenhaften Epithet vergnderungen, die den Papil- lomen vorausgehen, erkennt man eine Markierung in meh- reren Lagen der gewueherten Schleimhaut (Abb. 1 b). W~h- rend bei der normMen Tracheal- sehleimhaut nur wenige Zellen der Basalzellsehicht markiert sind, finden sieh in den begin- nenden metaplastisehen bzw. papill~iren EpithelverSmderun- gen aueh in mittleren und hShe- ren Lagen markierte Zellen. Bei grSl3eren papill~ren Wueherun- gen (Abb. 2) der Trachea ist die Markierung in l~dbereinstim- mung mit den Befunden yon O~n~, COT~ und BOo~ bei der Caneerisierung an der Haut vorwiegend in den basa- len Sehiehten der Papillome naehweisbar. Die Zahl der mar- b kierten Zellen ist wesentlieh Abb. 1. a NormMe TracheMsehleimhaut mit regelmM~iger Sehieh- geringer als bei den papill~ren tung ties Epithels und einer markierten Zelle an tier Basis (Vergr. Wueherungen der ttaut bei 400faeh). b Mittelgradige Metaplasie des Traehealepithels. Starke

Zunahme der markierten Zellen vorwiegend an tier Basis gleichartiger Methodik der (Vergr. 250fach) Autoradiographie.

Entspreehend der im Vergleieh zur Haut geringen Zellneubildungsrate der normalen Traehealsehleimhaut ist auch bei den TracheMpapillomen eine geringere Zahl markierter Ze]len in der Basalzellschieht naehweisbar als in dan Hautpapillomen. Die Papil]ome sind sehr unterschiedlich gebaut, einze]ne zeigen zwei bis drei Ze]lagen fiber dem gef~greichen Stroma, andere zeigen zehn und mehr Zellreihen, so dug bier bei der Auszghlung des Markie- rungsindex untersehiedliehe Werte entstehen kSnnen (Abb. 3, 4a und b). Der Markierungs- index ist bei den mehrsehiehtigen papilliiren Wueherungen meist niedriger als bei den Papil- lomen, die nur einzelne Zellagen an der Oberfl~ehe erkennen lassen. In Papillomen linden sieh kaum markierte Zellen in den oberen Zellagen. Dieser Befund ~ndert sieh nieht im Ver- laufe der VergrSgerung der papill~ren Epithelwueherung. Der Markierungsindex in den metaplastischen Epithelvergnderungen der umgebenden TraeheMsehleimhaut, die meist nur mitt]ere Grade erreiehen, ist ebenso hoeh wie im Bereieh der papill~ren Wueherungen. In den metaplastisehen Ver~nderungen sind nieht nur ZeUen im Bereich der Interferenzzone an der Basis des Epithels markiert, es linden sich auch einzelne markierte Ze]len in den oberen Sehiehten der mittelgradigen Metaplasien (Abb. 1 b).

Bei der Beurteilung der Ver~nderungen der Bronchialsehleimhaut bezeiehnen wir Epithet vergnderungen als leiehte Metap]asien bzw. als ~bergangsepithe], die eine flgehenhafte Epithelproliferation mit geringer Vermehrung der Epithellagen erkennen lassen und bei denen gleiehzeitig Vergnderungen an der ZeltgrOl~e und Zellform siehtbar werden (Polymorphie),

326 W. DONTENWILL und B. WIEBECKE:

Abb. 2. Klcine Papillome der Trachea. 5~arkierte Zellen vorwiegcn4 in den basalen Zellagen (Vergr. 250fach)

Abb. 3. :Papiliom der Trachea mit schmaler und breiter EpithelIage (Vergr. ~:0fach)

die wir bereits friiher beschrieben haben. Metaplasien mit deutlicher Epithelatypie und einer Verdickung der Schleimhaut in den k]einen Bronchien auf bis vier Zellen bezeichnen wir als mittelgr~dige Met~plusie und als proliferierende ~etaplasie die Epithelver~nderungen, die mit deutlichen fl~chenh~ften zottigen Proliferationen der Schleimhaut und starker Zu-

Untersuchungen wghrend der experimentellen Careinomentstehung 327

nahme der Zellschiehten einhergehen. Als hoehgradig proliferierende Metaplasien haben wir die Ver~nderungen angesehen, die zu einer starken Lumeneinengung der Bronehien dureh flgehenhafte papill~re polymorphe Epithelproliferation fiihren.

Der Markierungsindex steigt bereits im Bereieh der leichten und mittelgradigen Meta- plasien st~rk an (s. Tabelle 1, Abb. 5a). Er erreieht in z~hlreiehen metaplastisehen Epithet- bezirken eine H6he, die k~um von den prolifer~erenden Metaplasien und yon den infiltrierend waehsenden Careinomen iibersehritten wird. Ausgezi~hlt wurden dabei immer nur die Bron- ehien oder Bronehialabsehnitte mit morphologiseh faBbaren metaplastisehen Veriinderungen.

b Abb. ~a. Papillomausschnitte mit sehmaler Epithellage. Vor~'iegend basale Zellen markiert.

~{[arkierungs~nclex relativ heeh (Vergl'. 400fach) Abb. 4b. Papillomaussehnitt mit breiter Epithellage. Vorwiegend basale Zellen markiert.

~{arkierungsindex relativ niedrig (Vergr. 400faeh)

Da die Epithelver~hlderungen meist diffus waren, konnten ganze BronchiMquersehnitte aus- gezghlt werden, Die unterschiedIiehe Zghl der ausgez~hlten Zellen ist dureh die untersehied- liehe GrSBe und Ausdehnung der Met~plasien im Bereieh der Lunge bedingt. Bei den starker proliferierenden metaplastisehen Vergnderungen steigt der 31[arkierungsindex im Vergleieh zu den mittelgradigen und proliferierenden Metaplasien nieht sehr wesentlieh an, er zeigt aueh beim Vergleieh zwisehen den proliierierenden metaplastisehen Ver~nderungen und den infiltrierend waehsenden Careinomen keinen eindeutigen Untersehied. Die autoradiographi- sehen Befunde deeken sieh weitgehend mit den Iriiher besehriebenen morphologisehen Befun- den im Bereieh der untersuehten Epithelveri~nderungen. Aueh bei den KerngrSgenmessungen (DoNTENWlLL und M o ~ ) sahen wir zwisehen den papilliiren metaplastisehen Vergnderungen und den infiltrierend waehsenden Lungencarcinomen keine signifikanten Unterschiede in der KerngrN3enverteilungskur re.

WS~hrend der Markierungsindex im Bereieh der metaplastisehen Vergnderungen und der Careinome keine eindeutigen Untersehiede erkennen l~Bt, zeigen sieh im Verlauf der Caneeri- sierung Ver~inderungen, die zum Teil den Befunden an der Mgusehaut nach Methyleholan- threnbehandlung (OsHLEaT, COTg und B/]egNEg) entspreehen. Ahnlieh wie an der Mgusehaug

3 2 8 W . DONTENWILL u n d B . WIEBECKE:

b

Abb . 5. ~ B r o n c h u s m i t mi~ te lg rad iger Metap]as ie , v o r w i e g c n d basa le Zcl len m a r k i c r t (Vergr. ~00fach). b Pro l i fc r i e rende ~r der B r o n c h i a l s c h l e i m h a u t . S t a r k e Z u n a h m e tier m a r k i e r t e ~ Zellen. Mark ie r t e Zel len in verschiedenext L a g e n des p ro l i f e r i e r t en Ep i the ] s e r k e ~ n b a r . S t a r k e E r h S h n n g der

I~Srnchenzah l in groBen, z .T . p o l y m o r p h e n K c r n c n (Vergr. ~00fach)

a b

Abb . 6 a u. b. Begi~nend.es in f i l t r a t ives W a c h s t u m k le iner Carc inome . F~oher fSrmiger D u r c h b r u c h a n e incr u m s c h r i e b e n e n Stelle der Me tap la s i eu ohne n a c h w e i s b a r e Z u n a h m e der m a r k i e r t e u Zellen

(Vergr. 100 la th )

Untersuehungen wiihrend der experimentellen Carcinomentstehung 329

linden sich bei der normalen BronchiMschleimhaut nur Zellen in der Basalschicht markiert. Da die Zahl der Mitosen augerordentlieh gering ist, ist eine genaue Bestimmung des Mitose- index nich~ mSglieh. Die Zahl der nmrkierten Zellen nimmt sehon bei der leichten Metaplasie (Abb. 5a) im Bereieh der BasMzellsehicht zu, es linden sieh jetzt hier auch oft nebeneinander liegende Ketten yon markierten Zellen. Im Verlanfe der Zellproliferation, der Vermehrung der Zellagen, entsteht eine veriinderte Lokalisation der markierten Zellen. In sti~rkeren meta- plastisehen Epithelver~nderungen liegen die markierSen Zellen nicht nut in der Basalsehieht sondern auch in mittleren und oberen Sehiehten des proliferierenden Epithels (Abb. 5b). Insbesondere bei s~rker papill~ren Me~aplasien sind in allen Lagen des proliferierten Epithels

a b Abb, 7 a u. b. l~Iarkierte Zellen in grof3em Careinom. GrOgere Dich~e der markierten Zeilen in den

t~ndgebieten (a) 400lathe Vergr. Geringe ~arkierung im Zentrum (b) Vergr. 250faeh

markierte Zellen naehweisbar. In diesen metaplastischen Ver/~nderungen ist der Markierungs- index deutlich erh6ht, Bei mehreren Versuehstieren konnten wit sowohl den Markierungsindex als aueh die LokMisation der markierten Zellen bei beginnenden Careinomen un~ersuehen. Man erkennt dabei (Abb. 6a und b) immer in einem ganz umschriebenen Bezirk ldeiner oder mittlerer Bronchien den begirmenden Durchbrueh der metaplastischen Epithelwueherungen durch die Bronehialwand und die allmghliehe f~eherfSrmige Ausbreitung yon der Dureh- bruehstelle aus in das Lungenparenehym. Der Durchbrueh erfolgt nie fl/iehenhaft. An der Durehbruehstelle finder sieh keine stgrkere Zella~ypie oder vermehrte Markierung der Zellen der BronehiMsehleimhautmegaplasien. Der Markierungsindex ist im Bereieh der kleinen Carcinome nieht hSher als in den proliferierenden Metaplasien. In den kleinen beginnenden Careinomen sind die markiergen Zellen in allen Absehnitten des Careinoms gleichm~Big ver- teilt siehtbar, w~hrend in grogen, ganze Lungenlappen infiltrierenden Carcinomen die markier- ten Zellen sieh insbesondere im Bereich der Peril0herie finden, 5~hnlieh wie das bei den Mitosen vieler Tumoren beschrieben wurde (Abb. 7).

B e s p r e c h u n g der Be funde

~ h n l i c h wie bei den B e o b a c h t u n g e n y o n O~gLnRT, COTs u n d B ~ ; ' c ~ n n

w/~hrend der Caneer i s i e rung de r M S u s e h a u t n a c h M e t h y l c h o l a n t h r e n b e h a n d l u n g

330 W. DONTENWILL und B. WIEBECKE:

fand sich am Anfang der dutch Nitrosamine erzeugten Epithelver~nderungen in Lunge und Trachea eine Vermchrung der markierten Zellen, insbesondere im Bereich der Basalzellschieht bzw. der Interferenzzone.

Die Ver~nderungen im Bereich der Trachea sind mit den papill/~ren tIyper- plasien der Haut weitgehend vergleichbar. Durch starke Vermehrung der Zellen der Basalzellsehieht entstehen papillgre Wucherungen der Schleimhaut. W~hrend die metaplastischen Epithelver/inderungen/~hnliehe Bilder zeigen wie die fl~chen- haften Metaplasien der Bronchialschleimhaut, entwiekelt sich bei fortschreitender papill/irer Wucherung der Trachea ein Bild, das dem der papill/~ren Wueherung der Haut gleicht, d.h. die markierten Zellen sind nut in den basalen Lagen der papill/~ren Tumoren siehtbar, nut selten linden sieh in den hyperplastisehen Wueherungen der Trachealsehleimhaut markierte, zur DNS-Synthese fghige Zellen in den oberen Zellagen. In den hyperplastisehen Epithelvergndcrungen der Trachea ist eine der ~ul~eren Haut ghnliche Schiehtung erkennbar. Der Mar- kierungsindex der Papillome erreicht hie Werte wie bei der Naut. Bei Beriick- sichtigung des Proliferationsindex der normalen Traehealsehleimhaut ist die Steigerung des Index etwa gleieh wie bei der Caneerisierung der Naut. Den niedrigsten Markierungsindex zeigten die Papillome bei den Versuchstieren, die nut zwei Injektionen DANA erhalten batten (Stop-Versuche) und bei denen zwi- sehen der Behandlung und der Untersuehung ein groger Zeitraum lag. Der Index betrug nur etwa ein Drittel der bei den fibrigen Papillomen gefundenen Werte.

Im Bereich der Bronchialschleimhaut sind die Vorg/~nge wesentlieh kompli- zierter als im Bereieh der Trachea bzw. der Naut. W/~hrend anf~nglieh ledig- lich eine Zunahme des Markierungsindex in der Basalzellsehieht der mittleren und kleinen Bronehien sichtbar wird, finder sich spgter bei den flgehenhaften hyperplastischen Ver/~nderungen der Sehleimhaut nieht nur eine Vermehrung der markierten Zellen, also der Zellen, die zur DNS-Synthese und zur Teilung f&hig sind, sondern jetzt sind aueh /ihnlich wie bei dem lJbergang der Papillome in Carcinome der I-Iaut in mehreren Lagen der metaplastischen, zum Teil poly- morphen Epithelver/~nderungen markierte Zellen siehtbar. Der Markierungsindex nimmt abet im Verlauf der Caneerisierung nieht eindeutig zu, d.h. die mittel- gradigen und papillgren metaplastischen Epithelvergnderungen zeigen bereits einen Markierungsindex, der dem der infiltrierend wachsenden Careinome ent- spricht. Die K6rnehenzahl der in den N[etaplasien gefundenen markierten Zellen unterseheidet sieh nach unseren bisherigen Beobaehtungen nicht eindeutig yon der K6rnehenzahl der in Careinomen gefundenen markierten Zellen. Bei unseren karyometrischen Untersuehungen war die Zahl der grogen, offenbar polyploiden Kerne in proliferierenden Metaplasien und Careinomen ebenfalls gleieh. Diese Untersuchungen zeigen auch eine weitgehende iJbereinstimmung mit den yon SA~DI~ITT~ eytophotometriseh erhobenen Befunden am gleiehen Material. Es ist anzunehmen, dab bereits im Stadium der proliferierenden Metaplasie eine Caneerisierung von Zellen erfolgt ist, dab abet die l~Jberwindung yon Gewebs- sehranken bzw. das biologiseh maligne Waehstum noch yon anderen Faktoren abh/ingig ist. Unsere Untersuehungen lassen annehmen, dab aueh Generations- zeit, DNS-Synthesezeit und Mitosedauer in den proliferierenden papill/~ren Metaplasien und in den Careinomen gleieh sind. Wir m6chten auf Grund der er- hobenen Befunde annehmen, dab die von D6~.M~, TuLImuS und O~gL~gT w/thrend der Caneerisierung angenommene Verk/irzung der Differenzierungsphase

Untersuchungea w~hrend der experimentellen Carcinomentstehung 331

der Zellen bereits in den papill~tren McLaplasien vorhanden ist. Der gleichbleibende Marlderungsindex in kleinen und groi~en Papillomen sowie bei sehwaehen und starken Metaplasien spricht eher ffir eine Xnderung der Generationszeit vor Beginn der proliferativen und metaplastischen Ver~nderungen. Die Dauer der D~qS- Synthesezeit und Dauer und Zahl der Mitosen konnten vorwiegend wegen tech- nischer Sehwierigkeiten (Colchicinresistenz usw. ) nicht bestimmt werden.

In den infiltrierend waehsenden Carcinomen ist bei kleinen Tumoren in allen Bereiehen eine Markierung sichtbar, d.h. alle Zellen sind zur Zellteilung befi~higt bzw. nehmen an der Zellvermehrung teil. Bei grSl~eren Tumoren ist eine deutliche Zunahme der markierten Zellen in den Aui]enzoncn der Tumorknoten erkennbar, offenbar finder also die Tumorvermehrung insbesondere in den gut vaseularisierten ~tul~eren Schiehten start, i~hnlich wie das bereits bei zahlrcichen Transplantations- und Spontantumoren beschrieben wurde und wie dies offenbar aueh bei den Unter- suehungen yon LEscg, ScmnssL~ und 0EKL~]CT der Fall war. Die Durehbrueh- stellen der proliferierenden Metaplasien zeigen keine yon den umgebenden Meta- plasien eindeutig abweiehende Markierung.

Die meisten Careinome treten an Orten der normalerweise niedrigsten Pro- ]iferationsrate auf (kleine und mittlere Bronehien). Die Orte mit hoher Pro- liferationsrate (Bifnrkation und Trachea) zeigen trotz friiherer und st~rkerer Proliferation selten und wesentlieh sp~ter ein infiltratives malignes Wachstum. Die organotropen Faktoren zeigen offenbar keine Beziehnng zur Proliferations- rate der einzelnen Gewebe.

Zusammeniassung Dutch Nitrosamine erzeugte papill~tre Hyperplasien der Trachealschleimhaut

zeigen fast ausschliel~lieh in der Basalzellschicht eine autoradiographiseh nach- weisbare DNS-Synthese. Bei fl~chenhaften Schleimhautmetaplasien besteht aueh eine geringe DNS-Synthese in hSheren Zellagen. Der Markierungsindex ist etwa gleich dem der Metap]asien und Careinome des Bronchialbaums. Die DNS- synthetisierenden Zellen der Bronehialschleimhaut liegen bei leichten Metaplasien in der Basalsehicht, bei proliferierenden Metaplasien auch in hSheren Zellagen. Bei kleinen Carcinomen sind sic diffus verteilt, bei grol~en Carcinomen linden sic sich vorwiegend in den Randzonen. Der SH-Markierungsindex steigt schon bei leiehten Metaplasien stark an und wird auch yon proliferierenden Metaplasien und Careinomen nieht iiberschritten. D~s infiltrative Wachstum geht nicht mit einer Vermehrung der DNS-synthetisierenden Zellen einher. Die organotropen Faktoren der Nitrosamine zeigen offenbar keine Beziehungen zur Proliferationsrate einzelner Gewebe. Die meisten Carcinome treten an Orten normalerweise niedriger Proliferationsrate (kleine und mittlere Bronchien) auf. Von der Trachealsehleim- haut mit ihrem hSheren normalen SH-Markierungsindex geht trotz frfiherer nnd starkerer Proliferation selten ein infiltratives Wachstum aus. Bei papillaren Traehealhyperplasien vermindert sich die Zahl DNS-synthetisierender Zellen naeh Absetzen der Careinogenbehandlung stark.

Autoradiographic Studies During Experimental Carcinogenesis of the Respiratory Tract of the Gold Hamster Induced by Di-ethylnitrosamine

Summary The papillary hyperplasias of the tracheal mucosa induced by nitrosamines

show almost exclusively in the basal cell layer an autoradiographieally demon- Z. Xrebsforsch., ]~d. 66 9.3

332 W. DONWENW~LL und B. WIEBECKE : Experimentelle Carcinomentstehung

s t rable D N A synthesis . I n p laque- l ike me tap las ia s of the mueosa there is as well a sl ight D N A synthes is in the upper cell layers . The label l ing index is abou t the same as t h a t for the metap las ias and carc inomas of the bronchia l t ree. I n mi ld metap]as ias the D N A synthes iz ing cells of the bronchia l mucosa are in the basa l l aye r ; in prol i fera t ing metap las ias t h e y are also in the upper cell layers. I n small carc inomas t h e y are diffusely d i s t r ibu ted . I n larger carc inomas t h e y are found chiefly a t the margins . The aH-Iabel l ing index increases sha rp ly in s l ight me tap ia s i a s and is no t exceeded b y pro l i fe ra t ing metap las ia s and e a r d n o m a s . In f i l t r a t i ve g rowth does no t go a long wi th an increase of t he D N A synthes iz ing

cells. The organot ropie factors of n i t rosamines a p p a r e n t l y are no t r e la ted to the

r a t e s of prol i fera t ion of ind iv idua l t issues. Most of the carc inomas appea r in the regions of no rma l ly low ra tes of pro l i fe ra t ion (small and medium-s ized bronchi). A n in f i l t ra t ive growth seldom arises f rom the t rachea] mueosa wi th i ts high normal ~tI- label l ing index, in spi te of i t s earl ier and more in tense prol i ferat ion. I n pap i l l a ry hyperp las ias of the t r achea the n u m b e r of D N A synthes iz ing cells is r educed sha rp ly af te r t r e a t m e n t wi th the carcinogen ceases.

Literatur

I)OEt~IE~, P., u. W. OE~ILERT: Untersuchungen fiber die unterschiedliche Wirkung yon Cocarcinogenen und Carcinogenen auf die Epidermis der Maus. Beitr. path. Anat. 129, 307 (1963/64).

- - H. TuLrsIvs u. W. 0n]tLERT: Untersuchungen fiber die Generationszeit, DNS-Synthese- zeit und Mitosedauer yon Zellen der hyperplastischen Epidermis und des Plattenepithel- carcinoms der Maus nach iKethy]cholanthrenpinselung. Z. Krebsforsch. 66, 11--28 (1964).

DO~T~WILL, W.: Experimentelle Untersuchungen zur Genese des Lungenearcinoms. Arzneimittel-Forseh. (1964), (im Druek).

- - , u. U. Mom~: Die organotrope Wirkung der Nitrosamine. Z. Krebsforseh. 65, 166--167 (1962).

- - - - Experimentelle Untersuchungen zum Problem der Careinomentstehung im l~espira- tionstrakt. I. Die unterschiedliehe Wirkung des Benzpyrens auf die Epi~helien der HauL, der l~undh6hle und der Trachea des Go]dhamsters. Z. Krebsforseh. 65, 56--61 (1962).

- - - - Vergleiehende Untersuehungen an metap]astisehen und malignen Epithe]wueherungen des Respirationstraktes im Tierexperiment. Z. Krebsforsch. 65, 168--169 (1962).

- - - - u. M. ZAGnL: ~ber die untersehiedliehe Lungen-earcinogene Wirkung des Diaethyl- nitrosamin bei Hamster mad Ratte. Z. Krebsforseh. 64, 499--502 (1962).

DRUCKREY, H., R. I~ D. SCttM~ttL u. A. MULLER: Chemisehe Konstitution und earcinogene Wirkung bei Nitrosaminen. l~aturwissenschaften 48, 134:--135 (1961).

- - D. Sem~)Rr~, W. DISe~ER u. A. SCm~DBAC~: Quantitative Analyse der experimen~ellen Krebserzeugung. IqaturwissensehafSen 49, 217--228 (1962).

KOBVRG, E. : Autoradiographische Untersuchungen zum :Nucleins~urestoffweehseI einzeIner Zellarten der Lunge. Verhandl. Dtsch. Ges. Path. 44. Tagg, Mfinehen 1960, S. 160--165.

L~sc~, R., W. SC~IESSLE u. W. OEm~EnT: Autoradiographische Untersuchungen zur DNS- Synthese an menschlichem Exeisionsmaterial aus dem ]~ronchialbaum. Beitr. path. Anat. 129, 296--306 (1963/64).

LvoAS, J. : Untersuchungen zur physiologischen und reparatorischen Regeneration im Tracheo- bronchialepithel der Ratte. I)iss. :Freiburg 1963.

On~L]~lCT, W., J. COT]~ u. F. BitCHiER: Antoradiographische Untersuchungen zur Canceri- sierung der Epidermiszelle der Mausehaut nach Methylcho]anthrenpinselung. Beitr. path. Anat. 125, 280--303 (1961).

SAlqDRITTER, W. : (ira Druck). Prof. Dr. W. DO~TE~WILL,

l~athologisehes Institut der Universiti~t, 8 Mfinchen 15, Thalkirehner Str. 36