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Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com
cacaueiro
Alinne Batista Ambrósio
Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira
Co-orientadora: Dra. Odalys García
SUMÁRIO
Introdução
- Doença vassoura-de-bruxa
- Hormônios vegetais
- Por que a giberelina?
• Objetivos
• Metodologia
•Resultados preliminares
• Riscos
INTRODUÇÃO
• Vassoura-de-bruxa
AIME AND PHILLIPS-MORA, 2005.
• Sintomas
- Hipertrofia
- Hiperplasia
- Superbrotamento
- Frutos partenocárpicos
Introdução
.
Introdução
auxina
giberelina
citocininas
etileno
ácido abscísico
• Hormônios vegetais
DHPatógeno
Hospedeiro
Doença
Introdução• Desbalanço hormonal
Introdução• Desbalanço hormonal
- O patógeno pode alterar diretamente o metabolismo dos fitohormôniosproduzidos pela planta
• Desbalanço hormonal
- Patógenos de plantas são capazes de eles mesmos produzirem fitohormônios
Introdução
• Desbalanço hormonalIntrodução
Introdução
Produção Alteração
• Na vassoura-de-bruxa
POR QUE GIBERELINA?
• Giberelina ativa a divisão celular
Introdução
GAs CDKs G1 >>> S
G2 >>> M
Divisão de células meristemáticas
Introdução
POR QUE GIBERELINA?
• A giberelina induz a elongação de tecidos intactos da planta mediados por proteínas, como expansinas e xiloglucano endotransglicosilase (XET)
GAs Expansinas e XETAfrouxamento
da parede celular
Aumento do tamanho da célula
POR QUE GIBERELINA?Introdução
XET
Expansinas
IntroduçãoPOR QUE GIBERELINA?
• A giberelina induz a expressão de invertases e amilases
Planta sadia
Me = medulaMu = canal de mucilagem
Me
Mu
Planta infectada
Introdução• Sintomas
Tratamento de sementes de arroz
com extrato de esporos de M. perniciosa em
comparação com tratamento com
giberelina.
Introdução
Tratamento de plântulas de cacau com extrato de esporos de M. perniciosa
• Giberelina
- GAs são diterpenóides
- Gibberella fujikuroi
- Hormônio vegetal que está envolvido na regulação do crescimento e desenvolvimento da planta, incluindo germinação de sementes, crescimento do caule, indução de floração e maturação de frutos
- 136 GAs vêm sendo identificadas em plantas, fungos e bactérias
Introdução
IntroduçãoGiberelinas ativas
Gibberellin A12 aldehyde
P450-1P450-1
Gibberellin A7
Geranylgeranyl diphosphateent-Kaurene
Gibberellin A4 Gibberellin A14 aldehyde
ent-7alpha-Hydroxy-
kauroic acid ent-Kaurenoic acid
P450-4P450-4
P450-1P450-1P450-1P450-1
P450-1 e 2P450-1 e 2
ggs2ggs2 CPS / KSCPS / KS
GA4 GA4 desaturasedesaturase
Introdução
Gene Clusterização/singlets banco M. perniciosa
BLAST NR bp total E value
GA4 desatura
se
CP02-S3-038-509-B10-E.F Gibberella fujikuroi des gene for GA4 desaturase
--- 0.0
P450-4 CP02-S2-040-354-G04-M.FCP02-S3-038-547-G02-S.FCP02-PF-096-002-E07-C.G
cytochrome P450-4 (ent-kaurene oxidase)
898770942
2e-124e-164e-13
P450-1 CP02-S2-038-269-G11-M.FCP02-S3-038-547-G02-S.F
cytochrome P450-1 (GA14-synthase 914770
2e-154e-16
ggds CP02-S2-032-338-A12-E.FCP02-S3-033-416-E10-C.G
geranylgeranyl diphosphate synthase
538909
1e-212e-17
P450-2 CP02-S3-040-626-G08-C.F P450II GA20 oxidase 1041 2e-16
GfCPS/KS CP02-S3-000-110-H11-C.F GfCPS/KS [Gibberella fujikuroi] 1019 1e-09
P450 -3 CP02-S2-000-144-G06-L.H cytochrome P450 -3 C13 oxidase) 569 3e-20
DELLA BINT-RT-001-014-B09-E.FBIEM-NT-001-006-F10-E.F
GIA/RGA-like gibberellin response modulator
657894
2e-424e-43
Cdc2 BINT-SP-001-017-A07-E.FBINT-SP-001-050-B02-E.F
putative receptor-like serine-threonine protein kinase
624527
4e-681e-53
GID1 receptor BINT-SP-001-023-C09-E.F Gibberellin receptor GID1 (Gibberellin-insensitive dwarf protein 1)
8e-14
Introdução
27642 505
952 aa
Contig8670 Contig15446
182
CPS-KS
Introdução
1
4
392 aa
333
GGPP
Contig14680
Contig7333
22
1 342 aa
278
G4 des
Contig13951 Contig2062
Introdução
Manejo de nitrogênio na lavoura de cacau - Edvaldo
Lavoura de EdvaldoLavoura do vizinho
• Regulação da síntese de giberelina.
Introdução
AREA (NIT2) GAs
Nitrogênio
Introdução
Hipótese de trabalho
M. perniciosa na fase é capaz de sintetizar giberelina que deve produzir um desbalanço hormonal no cacaueiro criando as condições favoráveis para o estabelecimento do fungo e o desenvolvimento da doença.
Testar a hipótese formulada é algo fundamental para a compreensão da doença Vassoura-de-bruxa. Se ela for verdadeira, teremos conseguido a chave para o controle do problema através
do manejo do nitrogênio na planta.
OBJETIVOS
1. Mapeamento físico
2. Quantificação da produção de giberelina durante a interação e a partir de sobrenadante do fungo (biotrofico e necrotrofico)
3. Analise de expressão dos genes em diferentes fases do ciclo de vida (esporos, micelio biotrofico e micelio necrotrofico)
4. Estudos de complementação de mutantes funcionais
METODOLOGIAS
• Pulse field e Southern blot
• Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS)
• Real -Time PCR
METODOLOGIAS
• Complementação de mutantes (Transformação dos mutantes de G. funjikuroi )
- Race – PCR
- Screening dos genes da síntese de GA em biblioteca de M. perniciosa em fago lambda EMBL3/BamH I
RACE - PRC
RACE - PRC PCR
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 81. Hind III
2. 5’ / CPS-KS (1)
3. 5’ / CPS-KS (2)
4. CPS-KS (3) / 3’
5. 5’ / G4 (1)
6. G4 (2) / 3’
7. 5’ / GGPP (1)
8. GGPP (2) / 3’
1. Hind III
2. cDNA necrotrófico
3. cDNA biotrófico
4. DNA genômico
5. Controle negativo
6. cDNA necrotrófico
7. cDNA biotrófico
8. DNA genômico
9. Controle negativo
G4-des
GGPP
1
2 3 4 65 97 8
RESULTADOS PRELIMINARES
Teste expressão
1
2 3 4 65 97 8 1. Hind III
2. cDNA necrotrófico
3. cDNA biotrófico
4. DNA genômico
5. Controle negativo
6. cDNA necrotrófico
7. cDNA biotrófico
8. DNA genômico
9. Controle negativo
G4-des
CPS-KS
RESULTADOS PRELIMINARES
Teste expressão
RESULTADOS PRELIMINARES
Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS
• Identificação e quantificação de giberelinas durante interação
- Extratos de plantas diferentes (resistente e susceptível)
- Diferentes partes da planta
- Diferentes estádios
• Identificação e quantificação de giberelinas do sobrenadante - colaboração com grupos de pesquisa da Argentina
RESULTADOS PRELIMINARES
RISCOS
• A expressão gênica não é evidencia de que o fungo produza o composto ativo
• Complexidade da caracterização de hormônios vegetais (em especial de giberelinas) devido à diversidade de precursores e de rotas biossíntéticas
• No Brasil não existem grupos estabelecidos com experiência na quantificação e identificação de giberelinas e existem poucos grupos com essa especialidade no mundo