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Patrick Hofmann und Florian Hastert
Origami ist den meisten Menschen ein Begriff, doch die wenigsten werden beim Falten eines Blatt Papiers an nanotechnologische oder biomedizinische Anwendungsmöglichkeiten denken. Anders Paul Rothemund, der 2006 in einer Publikation den Begriff des DNA-Origami prägte [1]. Ob er begeisterter Papierfalter ist oder ihm lediglich der Begriff passend erschien, ist nicht bekannt, dafür jedoch, dass er sich mit DNA-Strukturen und deren Eigenschaften beschäftigt. Die Idee, die hinter Rothemunds Publikation und dem Begriff DNA-Origami steckt, ist nicht neu: Bereits in den 80er-Jahren des letzten Jahrhunderts gelang es Forschern, definierte Strukturen, wie beispielsweise eine DNA-Kreuzung aus vier DNA-Strängen, herzustellen [2].
Die Grundbausteine der DNA sind Ribosephosphatbausteine mit den vier Nucleobasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin. Bei der am häufigsten vorkommenden sogenannten Watson-Crick-Basenpaarung, lagern sich bei der Ausbildung eines Doppelstranges Adenin und Thymin sowie Guanin und Cytosin zu Basenpaaren zusammen. Da die Sequenzen für künstliche DNA-Strukturen vor 30 Jahren allerdings noch mit Papier und Stift entworfen werden mussten, konnten nur sehr kurze, wenige hundert Basenpaare lange DNA-Stränge verwendet werden. Hier setzt Rothemunds Idee an. Dank enormer Fortschritte in der Bioinformatik wurde es möglich, Sequenzdesign und Strukturvorhersagen computergestützt zu treffen und darauf basierend vergleichsweise große, zweidimensionale DNA-Strukturen zu erzeugen. Neben Rechnerleistung und bioinformatischen Methoden macht sich das moderne DNA-Origami die gleiche Eigenschaft der DNA zu Nutze, die schon vor dreißig Jahren genutzt wurde – dem selbstständigen Zusammenfinden komplementärer Sequenzen nach thermodynamischen
Gesichtspunkten.
Während Rothemund anfangs als proof of concept einfache zweidimensionale geometrische Figuren wie Rechtecke und Kreise entwarf und herstellte, welche nur aus einer Lage Doppelsträngen bestanden, wurden die auf seinem Konzept basierenden Strukturen schnell komplexer und anwendungsorientierter.
Unlängst stellten Wissenschaftler aus Harvard eine Weiterentwicklung des ursprünglichen Prinzips vor, die single strand tile (SST) Methode [3]. Auch hier macht man sich die Watson-Crick-Basenpaarung zu Nutze, ist jedoch in der Planung noch mehr auf Computerprogramme angewiesen als die Rothemund-Methode. Als proof of concept erstellten Bryan Wei und Kollegen unter anderem das komplette Alphabet aus DNA im Nanomaßstab (Abbildung 1).
Schon heute wird die DNA-Origami-Methode von Wissenschaftlern für unterschiedlichste Zwecke angewendet. Die wahrscheinlich einfachste in der Praxis
Die Aktuelle-Wochenschau© der GDCh – Fachgruppe Biochemie 33/2013
„Wie die DNA schreiben lernte “
Abbildung 1: Zweidimensionale Strukturen, die mit der SST-Methode hergestellt wurden. Jedes Bild zeigt einen150 x 150 nm2 großen Ausschnitt [3]. (Nachdruck mit Genehmigung von Macmillan Publishers Ltd: Nature (doi:10.1038/nature11075), © 2012)
genutzte Struktur ist ein DNA-Lineal, das in hochauflösenden Mikroskopieverfahren zur Messung geringster Abstände eingesetzt wird [4]. Eine weitere Anwendung ist einGerüst aus DNA, auf welchem Moleküle für Einzelmolekülexperimente aufgebracht werden [5].
Und selbst dreidimensionale Strukturen sind inzwischen möglich: Ebbe Andersen und Kollegen aus Göttingen und dem niederländischen Arhus ist es gelungen, mit der DNA-Origami-Methode eine dreidimensionale Struktur in Form eines Würfels mit den Dimensionen 42 x 36 x 36 nm3 mit jeweils nur einer Lage aus DNA-Doppelsträngen als Seitenfläche zu synthetisieren [6]. Durch die Zugabe von kurzen, einzelsträngigen DNA-Molekülen, welche komplementär zu bestimmten Sequenzen an den Kanten waren, lässt sich der Deckel dieser Box öffnen. Der Entwicklung sind kaum Grenzen gesetzt - es werden stetig neue Weiterentwicklungen und Anwendungsmöglichkeiten publiziert.
DNA-Figuren vom Reißbrett
Wie bereits erwähnt, nutzen sowohl DNA-Origami als auch die SST-Methode die Fähigkeit des selfassembly von DNA. Nach der Festlegung auf die herzustellende Form beginnt das Design einer DNA-Origami-Struktur mit der Auswahl eines geeigneten DNA Einzelstranges, des sogenannten scaffold strands, der als Gerüst dient. Als scaffold strand nutzte Rothemund zum Beispiel das 7249 Nukleotide (Nt) lange, zirkuläre Genom des Bakteriophagen M13. Es ist sowohl möglich, einen zirkulären als auch einen linearen Einzelstrang zu verwenden. Dieser DNA-Einzelstrang muss nun theoretisch in eine Form gebracht werden, so dass er jeweils einen Strang eines jeden Doppelstranges bildet,aus welchen die gesamte Struktur besteht (siehe Abbildung 2a & b).Der zweite Schritt ist das Design sogenannter staple strands, kurzer, 25 bis 40 Nukleotide langer einzelsträngiger DNA-Moleküle, deren Sequenz so gewählt ist, dass sie über Watson-Crick-Basenpaarungen komplementär zu bestimmten, diskontinuierlichen Abschnitten des scaffold strand sind. Die staple strands sind in Abbildung 2c in rot, grün, blau und gelb dargestellt. Sie stabilisieren den scaffold strand und halten ihn in seiner
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Abbildung 2: Schematischer Designprozess für DNA Origami (a-d) und SST-Methode(e-i). a: Route des Templatstrangs (schwarz) durch die gewünschte Form. b: Schematische Darstellung von DNA Doppelsträngen mit cross over in gewünschter Form. c: Templatstrang (schwarz) und staple strands(bunt). d: Verbindung zweier Doppelstränge durch cross over. e: Schema der Anordnung der aus 4 Domänen bestehenden SSTs. f: Wie e, jedoch soll deutlich werden, dass sich alle SSTs in ihrer Sequenz unterscheiden. f: Darstellung von e & f als molekulare Leinwand. Jedes Feld kann als eigenständiges Pixel gesehen werden. g: Schema der Basenpaarung dreier SSTs. h, i, k: Von der blanken Leinwand zu einem Molekül mit definiertem Muster.
Abbildung 3: Beispiele für dreidimensionale Strukturen. a: Beispiele für gebeugte Strukturen [7]. b: Box mit den Abmessungen 42 x 36 x 36 nm3 in der Theorie (b1) und als zweidimensionale Projektion eines 3DCryo-Elektronenmikroskopisches Bild (b2) [6]. c: DNA Tetrahedron zur Applikation von siRNA in Zellen. siRNA ist hier schematisch als aus der Struktur herausragender Doppelstarng dargestellt [8]. (Nachdrucke mit Genehmigung von Macmillan Publishers Ltd: a: Nature Methods (DOI:10.1038/NMETH.1570), © 2012); b1 & b2: Nature (DOI:10.1038/nature07971) © 2009); c: Nature Nanotechnology (DOI:10.1038/NNANO.2012.73), © 2012))
zweidimensionalen Struktur, indem sie zwei Doppelstränge miteinander verbinden und regelmäßige crossover zwischen den benachbarten Strängen bilden. In der Regel wird nicht das gesamte virale Genom für die Bildung der Strukturen benötigt. Um noch freie Sequenzen vor unkontrollierter Basenpaarung zu schützen, wurden kurze, ca. 25 Nt große sogenannte remainder strands designt, welche mit ungenutzen Abschnitten des scaffold strand basenpaaren. Die Anzahl der Basen zwischen den einzelnen cross over bestimmen den Abstand zweier nebeneinanderliegender Doppelstränge und somit auch die tatsächliche Größe der Struktur. Liegen die Verbindungen 26 Basenpaare (bp) voneinander entfernt, beträgt der Abstand zwischen den Doppelsträngen circa 1,5 nm, bei Verbindungen alle 16 bp verringert sich der Abstand auf ca.1 nm und bei cross over alle sieben oder acht bp sind zwei Doppelstränge lediglich circa 0,5 nm voneinander entfernt [7].
Die SST-Methode bedient sich nicht mehr Hybridmolekülen aus viraler und synthetischer DNA, sondern setzt auf die de novo-Synthese aller DNA-Moleküle. Objekte nach der SST Methode bestehen ausschließlich aus 21, beziehungsweise 42 nt langen staple strands, hier single strand tiles genannt. Jeder 42 NtSST bindet an vier andere SSTs, so dass, wie in den Abbildungen 2e - i dargestellt, eine durchgehende Fläche aus DNA entsteht. Halbe SSTs werden, wie die remainder strands bei der Origami-Methode, benötigt, um überhängende Sequenzen an den Rändern der Fläche vor dem unkontrollierten Hybridisieren mit anderen freien Sequenzen zu schützen. Jeder SST in der rechteckigen Struktur kann nun als Pixel gesehen werden. Über die gezielte Auswahl derjenigen Pixel, welche innerhalb des Rechtecks die gewünschte Form bilden, sowie der Berechnung von Sequenzen und der Synthese der korrelierenden DNA-Moleküle kann im Prinzip jede erdenkliche Struktur verwirklicht werden.
Bei beiden Methoden ist der Designprozess ohne die Hilfe von Computern undenkbar. Das als open source Software verfügbare Programm caDNAno (http://cadnano.org) ist zum Beispiel in der Lage,komplexe zweidimensionale DNA-Origami-Strukturen zu berechnen. Das von Carlos Castro und Kollegen aus München und den USA entwickelte Programm CanDo kann auf der Basis von caDNAno Dateien dreidimensionale Strukturen berechnen. Das von Wei und Kollegen entwickelte Programm zu ihrer SST-Methode ist sogar in der Lage, einem angeschlossenen Roboter Befehle zu erteilen, so dass dieser automatisch die geforderten SSTs aus einer Bibliothek auswählt und mischt.
>Dreidimensionale Strukturen stellen die Anwender beider Methoden vor noch größere Herausforderungen. Beim 3D-DNA-Origami müssen cross over in alle Richtungen geplant werden, die Route des scaffold strand muss deutlich geschickter gewählt werden. Es muss entschieden werden, wie Strukturen, in welchen mehrere Lagen Doppelstränge übereinander liegen, gebildet werden. Prinzipiell möglich sind eine quadratische Anordnung, bei der jeder Doppelstrang mit vier anderen Doppelsträngen wechselwirkt, oder eine hexagonale Anordnung der Doppelstränge, bei welcher jeder Strang mit drei anderen Doppelsträngen wechselwirkt. Eine andere Herausforderung besteht beispielsweise im Verlassen rechteckiger Geometrien durch Beugung, wie sie unter anderem Castro und Kollegen zeigen konnten.
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Ausblick
Aus den verschiedenen Methoden und den nahezu grenzenlosen Möglichkeiten für Formen und Strukturen aus DNA ergeben sich zahlreiche potentielle Anwendungsmöglichkeiten in Medizin, Biochemie, Physik und Materialwissenschaften. Aktuelle Forschungen beschäftigen sich mit der Möglichkeit, DNA-Strukturen als Nanopartikel zu nutzen, um Wirkstoffe spezifisch in Zellen zu bringen, da sich die Partikeleigenschaften durch DNA-Origami sehr homogen einstellen lassen [8]. Dreidimensionale Strukturen wurden von Hyukjin Lee und Kollegen genutzt, um siRNAs in Tumorzellen zu bringen. Strukturen wie der von Andersen et al. entwickelte Würfel könnten in Zukunft genutzt werden, um in einem Organismus Moleküle bis hin zu ganzen Viren einzufangen und unter Verschluss zu halten. Ebenso wäre der entgegengesetzte Weg vorstellbar: DNA-Boxen könnten Medikamente in den Körper bringen und erst in Anwesenheit bestimmter DNA-Sequenzen oder anderer Signalmoleküle ihre Fracht freigeben, was Shawn Douglas und Kollegen kürzlich in vitro gelang [9]. Mit der Origamimethode wurde ein hexagonales Fass synthetisiert und mit zwei verschiedenen Molekülen beladen. DNA-Aptamere fungierten als Schlösser, die das Fass zusammenhielten, es in Gegenwart von bestimmten Proteinen öffneten und so die Fracht freigaben. Ein solcher Nanoroboter aus DNA ist prädestiniert für medizinische Anwendungen.
Des Weiteren könnten Origami-Strukturen als Gerüst für leitende Materialien auf Mikrochips oder Halbleitern dienen und diese so noch kleiner machen. Ebenso sind Anwendungen als Gerüst für Carbonfasern vorstellbar, die damit mit extremer Genauigkeit in bestimmte Formen gebracht werden könnten. Honglu Zhang und Kollegen gelang es kürzlich, eine 238 x 108 nm2 große zweidimensionale Struktur zu erstellen, mit circa 800 staple strands eine der bisher größten Strukturen überhaupt [10]. Neben noch komplexeren zwei- und dreidimensionalen Strukturen ist es also auch möglich, Strukturen noch größer zu planen. Seit Rothemunds Publikation verlief die Entwicklung rasant, so dass man auf zukünftige Errungenschaften gespannt sein darf.
Take home messages:
• DNA-Origami bezeichnet Methoden, mit welchen man zwei- und dreidimensionale Strukturen aus DNA im Nanomaßstab herstellen kann.
• Seit der ersten Publikation 2006 folgten zahlreiche Berichte über potenzielle Anwendungsmöglichkeiten.
• Bereits heute ist es möglich, mit DNA-Origami eine Vielzahl verschiedener Strukturen zu synthetisieren, darunter beispielsweise Moleküle, welche in Gegenwart von bestimmten Signalmolekülen ihre Struktur verändern.
• Mit diesen Methoden werden Wissenschaftlern völlig neue Werkzeuge für biochemische, biomedizinische und technische Anwendungen in die Hand gegeben.
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Kontakt: Schlauer Fuchs
Der Artikel wurde im Rahmen des Studienprojektes HighChem des Fachbereichs Chemie der Technischen Universität Darmstadt verfasst (s. Woche 2).
Die Autoren, Patrick Hofmann und Florian Hastert, sind Studierende im Masterstudiengang Technische Biologie an der TU Darmstadt.
(E-Mail: [email protected] und [email protected].)
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Katja Schmitz (E-Mail: [email protected]).
Unsere Schlaue-Fuchs-Frage zu diesem Beitrag lautete:
Welche Anwendungsmöglichkeiten sind für Formen und Strukturen aus DNA denkbar?Nennen Sie zwei Beispiele.
Literatur:
[1] P. W. Rothemund, Nature 2006, 440, 297-302.
[2] N. C. Seeman, N. R. Kallenbach, Biophysical journal 1983, 44, 201-209.
[3] B. Wei, M. Dai, P. Yin, Nature 2012, 485, 623-626.
[4] C. Steinhauer, R. Jungmann, T. L. Sobey, F. C. Simmel, P. Tinnefeld, Angew Chem Int Ed Engl 2009, 48, 8870-8873.
[5] A. Gietl, P. Holzmeister, D. Grohmann, P. Tinnefeld, Nucleic acids research 2012.
[6] E. S. Andersen, M. Dong, M. M. Nielsen, K. Jahn, R. Subramani, W. Mamdouh, M. M. Golas, B. Sander, H. Stark, C. L. Oliveira, J. S. Pedersen, V. Birkedal, F. Besenbacher, K. V. Gothelf, J. Kjems, Nature 2009, 459, 73-76.
[7] C. E. Castro, F. Kilchherr, D. N. Kim, E. L. Shiao, T. Wauer, P. Wortmann, M. Bathe, H. Dietz, Nature methods 2011, 8, 221-229.
[8] H. Lee, A. K. Lytton-Jean, Y. Chen, K. T. Love, A. I. Park, E. D. Karagiannis, A. Sehgal, W. Querbes, C. S. Zurenko, M. Jayaraman, C. G. Peng, K. Charisse, A. Borodovsky, M. Manoharan, J. S. Donahoe, J. Truelove, M. Nahrendorf, R. Langer, D. G. Anderson, Nature nanotechnology 2012, 7, 389-393.
[9] S. M. Douglas, I. Bachelet, G. M. Church, Science 2012, 335, 831-834.
[10] H. Zhang, J. Chao, D. Pan, H. Liu, Q. Huang, C. Fan, Chem Commun (Camb) 2012.
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