Peptid hordozók és alkalmazásuk

Mező Gábor

Budapest

2011. december 9.

Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport

50. éves jubileumi ünnepsége

Elágazó láncú polipeptidek (XAK)

polilizin gerinc

oligo-DL-alanin

AK

XAK

optikailag aktív

aminosav

Szekerke Mária

Z-Xxx-OPcp

Hudecz Ferenc

Hudecz F., Szekerke M.: (1985) Coll. Czech. Chem. Comm. 50, 103-113

Elágazó láncú polipeptidek javított szintézise

polilizin gerinc

oligo-DL-alanin

AK

XAK

optikailag aktív

aminosav

Z-Xxx-OPcp/HOBt

Mező G. és mtsai.: (1988) Coll. Czech. Chem. Comm. 53, 2843-2853

Szekerke Mária

Mező Gábor

Elágazó láncú polipeptidek (AXK)

polilizin gerinc

oligo-DL-alanin

AK

XAK

optikailag aktív

aminosav

XiK

AXK

Mező G. és mtsai.: (1993) Biopolymers 33, 873-885

Tartózkodás a szervezetben (24 óra):

ALK(36%) > EAK > SAK > AK (15%)

NH2 NH2

NH2NH2

NH2 NH2

NH2 NH2

HOOC HOOC

HOOC HOOC

EAK

NH2 NH2

NH2 NH2

HO HO

HO HO

AK

SAK ALK

Polilizin-gerincű elágazó láncú polipeptidek

Szerkezet befolyásoló hatása:

tartózkodás a szervezetben

biodisztribúció

Kiürülés a vérből (24 óra):

EAK (6%) > SAK > ALK > AK (0%)

Akkumuláció szervekben:

ALK: 18% lépben

12% májban

ALK kiválasztott hordozó

Leishmania donovani

kezelésére

NH2 NH2

NH2 NH2

Hudecz F. és mtsai: (1990) Bioconjugate Chemistry 1, 425-430 és (1999) Bioconjugate Chemistry 10, 781-790

Mező G. és mtsai: (1993) Biopolymers 33, 873-885 és (1997) Biopolymers 42, 719-730

Leishmania donovanival fertőzött egér makrofágok

in vitro kezelése: Mtx, ALK-Mtx,

(parazita szám/makrofág 72 órás kezelés)

NH NH2

NH NH2

Metotrexát (Mtx) – ALK konjugátum

25% szubsztitúció

Kontroll 3,8 ± 0,7

Mtx 2,8 ± 0,3

ALK 3,2 ± 0,3

ALK-Mtx 1,8 ± 0,2

ALK + Mtx 2,8 ± 0,2

Leishmania donovanival fertőzött egerek

parazitaszám csökkenése májban

Mtx és ALK-Mtx kezelés hatására

(a paraziták száma/100 sejtben)

Kontroll 115,2 ± 4,5

Mtx 66,2 ± 14,6

ALK 103,7 ± 5,5

ALK-Mtx 6,0 ± 1,9

ALK + Mtx 75,6 ± 4,1

Kóczán Gy. és mtsai: (2002) Bioconjugate Chemistry 13, 518-524

Kóczán György

Gaál D, Hudecz F. : (1998) Eur J Cancer 34, 155-161

Reményi J. és mtsai.: (2003) Biochem Biophys Res Commun. 303, 556-561

Reményi J. és mtsai: (2006) Biochim Biophys Acta 1758, 280-289

Cisz-akonitil daunomicint tartalmazó

elágazó láncú polipeptid konjugátumok

cAD-EAK cAD-SAK

10 mg Dau tartalom/kg

>60 napos túlélés

L1210 leukémiás

egerek esetén

Reményi JuditHudecz Ferenc

MI-1544: Ac-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

GnRH-antagonista (MI-1544) - Ac-EAK konjugátum

Ac-NH Ac-NH

Ac-NH Ac-NH

NHCO HOOC

NHCO HOOCMező Gábor

Mező G. és mtsai: (1996) Bioconjugate Chemistry 7, 642-650

Fokozott tumor növekedést gátló hatás (in vitro és in vivo)

Jelentősen csökkent az ovuláció gátló hatás az antagonista hatású

hormon peptidhez képest (tumor szelektivitás fokozása)

Jelentős túlélést eredményezett emlő tumoros egereken

Mező Imre

Szabó R. és mtsai: (2005) Bioconjugate Chemistry 16, 1442-1450

Anionos elágazó láncú polipeptidek sejtbe jutása

scavanger receptorokon keresztül

Szabó Rita

CH3CO-NH

HOOC HOOC

HOOC HOOC

HOOC HOOC

HOOC HOOC

CH3CO-NH

CH3CO-NH CH3CO-NH HOOC-(CH2)2-CO-NH NH-CO-(CH2)2-COOH

NH-CO-(CH2)2-COOH HOOC-(CH2)2-CO-NH

A típusú scavanger receptorok szerepet játszhatnak anionos karakterű polipeptidek

sejtbe jutásában, így alkalmas célpontok fertőzött makrofágokba történő hatóanyag

célba juttatására.

Ac-EAK Succ-EAK<

Cisztein tartalmú peptidek kapcsolása

elágazó láncú polipeptidekhez diszulfidhíd kialakításával

Mihala Nikolett

NH2 NH2

NH2NH

NH2-Cys(Npys)-CO

9-21-Ahx-Cys-276-284

NH2 NH2

NH2NH

NH2-Cys-CO

9-21-Ahx-Cys-276-284

S

S

9LKMADPNRFRGKDL22

276SALLEDPVG284

Herpes simplex vírus gD1

epitóp peptidek:

Npys: 3-nitro-2-piridinszulfenil

Ahx: 6-amino-hexánsav

Mező G. és mtsai: (2000) Bioconjugate Chemistry 11, 484-491

NH

NH

NH

H2N

NH

OOH

NH

HN

OHS

HN

O

O

O

O

NH2

ClCH2-CO-NH NH2

HO HO

HO HO

ClCH2-CO-NH NH2

S-CH2-CO-NH NH2

HO HO

HO HO

S-CH2-CO-NH

c[RGDfC]

c[RGDfC]

c[RGDfC]

c[RGDfC]

Ciszteint tartalmazó peptidek kapcsolása

elágazó láncú polipeptidekhez

kemoszelektív ligációval

Szabó IldikóLigeti Melinda

Markó K., és mtsai: (2008) Bioconjugate Chemistry 19, 1757-1566

- HCl

SAK bevonat SAK-c[RGDfC] bevonat

fibronektin bevonatbevonat nélküli titán háló

Mezenhimális őssejtek letapadása bevont és bevonatlan titán szövetre

Tuftsin és tuftsin analógok

Thr-Lys-Pro-Arg (humán) Thr-Lys-Pro-Lys (kutya)

g-globulin: a szekvencia 289-292 régiója

Analógok: Thr-Lys-Pro-Arg-Thr-Lys-Pro-Arg (TKPRTKPR, dituftsin)

fokozott hatás a Lys-Pro-Arg antagonista keletkezésének hiányában

Thr-Lys-Pro-Arg-Gly (TKPRG)

fokozott immunstimuláló hatás

Thr-Lys-Pro-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg (TKPKTKPR)

szarkóma vírus által okozott tumor növekedésének gátlása

Fridkin, M., Najjar, V. (1989) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 1

fagocitózis stimulálás

immunmodulátor hatás

kemotaktikus aktivitás monocitákon

tumorellenes hatás

TNF termelés növelése

Hatások:

Oligotuftsin hordozó (OT20)

Oligotuftsin hordozó, Ac-[TKPKG]4-NH2

Ac-TKPKG TKPKG TKPKG TKPKG-NH2

Peptid Inkubációs

idő (óra)Kontroll

OT20 1 98,7±0,58

4 96,5±2,18

98,1±1,18 98,5±1,05 98,3±2,93

91,7±3,56 93,7±2,04 92,2±1,83

0,0015 0,015 0,05

Koncentráció (mg/mL)

Nem toxikus egér lépsejteken

Nagyon jó oldékonyságú, higroszkópos peptid Kalászi AdriánReményi Judit

Mező G. és mtsai: Biopolymers (2004) 73, 645-656

Oligotuftsin hordozó (OT20)

Oligotuftsin hordozó, Ac-[TKPKG]4-NH2

Ac-TKPKG TKPKG TKPKG TKPKG-NH2

0

50

100

150

200

250

300

Tuftsin OT20TKPKG

10 10101.0 1.01.0 0.10.10.1 mg/kgPF

C/1

06

lép

se

jtek

ko

ntr

oll

ho

z

vis

zo

nyít

ott

me

nn

yis

ég

e(%

)

Immunstimuláló hatás

Dózis-hatás összefüggés: immunválasz SRBC

antigén ellen BDF1 egerekben

0

20

40

60

80

100

tite

r

IgM

IgG

1 2

Immunizáció

Nem immunogén

Ciklikus HSV gD-1 epitóp peptid kapcsolása oligotuftsin hordozóhoz

kemoszelektív ligációs technikával

Ac-[TKPKG]4-NH2

ClCH2-CO-OT20(ClAc)4

CH2CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH2

Ac-CGFLG

Ac-[TKPKG]4-NH2

CH2-CO-

-CH2CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH2

Ac-CGFLG-

112 aminosav (46 kapcsolási ciklus + 2 ligációs lépés): 12902 Da

-HCl

Jakab Annamária

Jakab A. és mtsai: (2009) Bioconjugate Chemistry 20, 683-692

Konjugáció követése HPLC-vel és tömegsektrometriával (MS)

28,3

19,5

t = 5 perc

603,74+

804,53+

1206,0

0

1

2

3

4

x107

Intens.

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z

2+MWcalc.: 2410,48

MWexp.: 2410,60

MWcalc.: 2659,22

MWexp.: 2658,60

665,74+

887,13+

0

1

2

3

4x106

Intens.

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z

10 20 30 40 50

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Ab

s 220 n

m

Idő (perc)

735,314+

791,813+

857,612+ 935,5

11+

1028,910+

1143,19+

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

x107

Intens.

400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z

25,6

26,9

27,5

27,8

28,4

29,4

630,28+

720,17+

839,96+

1007,75+

0

2

4

6

8

x106

Intens.

400 600 800 1000 1200 1400 m/z

639,112+

697,111+

766,610+

851,79+

958,08+

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

x107

Intens.

400 600 800 1000 1200 1400 m/z

t = 3 óra

„2 epitóp kópiát“- tartalmazó

konjugátum

MWcalc.: 7657,00

MWexp.: 7656,30

MWcalc.: 5034,24

MWexp.: 5033,50

MWcalc.:10279,76

MWexp.:10279,50

16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Ab

s 220 n

m

Idő (perc)

27,8

29,4

28,4

591,69+

665,58+

760,47+

887,06+

1064,15+

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

x107

Intens.

400 600 800 1000 1200 1400 m/z

861,215+

922,614+

993,513+

1076,212+

1173,911+

1291,110+

1434,59+

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

x107

Intens.

600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

MWcalc.: 5316,42

MWexp.: 5315,80

MWcalc.: 12902,52

MWexp.: 12902,20

t = 24 óra

10 20 30 40 50

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Ab

s 220 n

m

Idő (perc)

861,215+

922,714+

993,613+

1076,212+

1173,911+

1291,210+

0.0

0.5

1.0

1.5

x107

Intens.

400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

27,8

MWcalc.: 12902,52

MWexp.: 12902,70

A tisztított OT20-HSV epitóp konjugátum jellemzése

CH2CO

Ac-[TKPKG]4-NH2

CH2CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH2

Ac-CGFLG H-LKMADPNRFRGKDL-NH2

Ellenanyag felismerés (A16 mAb; kompetíciós ELISA)

7,2 pmol 4,2 pmol

10 20 30 40 50

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Ab

s 220 n

m

Idő (perc)

Hordozó

Ciklikus

B-sejt

epitóp

127 aminosav: 14762 Da

Promiscuous T-sejt epitóp Tetanus toxoidból: 593-599 szekvencia (YSYFPSV)

Herpes simplex vírus elleni szintetikus vakcina

K

Ciklikus

B-sejt

epitóp

Ciklikus

B-sejt

epitóp

Ciklikus

B-sejt

epitóp

HordozóK

Irányító

molekulaIrányító

molekula

Irányító

molekulaIrányító

molekuladrog

drog

„Chemotactic Drug Targeting”

Kőhidai LászlóBai Katalin Boglárka

Kemoattraktáns hatású irányító peptidek:

For-Met-Leu-Phe

For-Nle-Leu-Phe

For-Thr-Lys-Pro-Arg

Ac-Thr-Lys-Pro-Lys-Gly

Thr-Lys-Pro-Arg

Thr-Lys-Pro-Lys-Gly

Mező G. és mtsai: (2006) J. Pept. Sci. 12, 328-336

Bai K.B. és mtsai: (2008) Bioconjugate Chemistry 19, 2260-2269

CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(H-TKPKG)G]4-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(Ac-TKPKG)G]4-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(H-TKPR)G]4-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(For-TKPR)G]4-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

Mtx-GFLGC-NH2

Metotrexátot tartalmazó oligotuftsin alapú biokonjugátumok

Metotrexát tartalmú oligotuftsin konjugátumok

kemotaktikus aktivitása THP-1 monocitákon

(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(TKPKG)4

0

50

100

150

200

250

-11 -10 -9 -8 -7 -6

lg c [M]

ctx

.in

d.%

(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(Ac-TKPKG)4

0

50

100

150

200

250

-11 -10 -9 -8 -7 -6

lg c [M]

ctx

.in

d.%

x

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

xx

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

ctx

.in

d.%

log c [M]

(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(TKPR)4

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

0

50

100

150

200

250

- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6

ctx

.in

d.%

log c [M]

(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(For-TKPR)4

Korreláció a kemotaktikus aktivitás, a sejtfelvétel és a citosztatikus hatás között.

Köszönjük!

SOTE

KOKI

ELTE

OOI

Creative CellSoft Flow

Universities:

(Konstanz, Barcelona, Oxford, Ioannina, Palermo,

Groningen, Nottingham)Bose Institute, Calcutta

PKCS

MetriMed

Bay Zoltán Intézet

MikroVákuum

TKI