Az RkpM fehérje funkciójának elemzése

DIPLOMAMUNKA

Készítette: PÁLVÖLGYI ADRIENN Biológus hallgató

Témavezető: DR. PUTNOKY PÉTER Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar

Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

PÉCS, 2004

PA_DIP04.doc

2

TARTALOMJEGYZÉK

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3 1.1. Bevezetés 3 1.2. Nitrogénkötő szervezetek 3 1.3. A szimbiózis kialakulása 4

1.3.1 A Nod faktor 5 1.3.2 A nitrogénkötésért felelős gének 5

1.4. Sejtfelszíni poliszacharidok 6 1.4.1. Az exopoliszacharidok 6 1.4.2. A lipopoliszacharidok 7 1.4.3. A kapszuláris poliszacharidok 7

2. A MUNKA ELŐZMÉNYEI 12 2.1. Spontán mutáns baktériumtörzsek izolálása 12 3. CÉLKITŰZÉSEK 14 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 15

4.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok 15 4.2. A baktériumok növesztése 16

4.3. Fágok szaporítása 16 4.4. A baktériumok keresztezése 16 4.5. Fágérzékenységi teszt 16 4.6. Összes DNS izolálás 17 4.7. Plazmid DNS izolálás 17 4.8. Polimeráz láncreakció (PCR) 18 4.9. Fragmentizolálás 18 4.10. DNS szekvenálás 19 4.11. Restrikciós emésztés 19 4.12. Gélelekroforézis 19 4.13. Kompetens sejt készítés 20 4.14. Ligálási reakció 20 4.15. Transzformálás 20 4.16. In vitro transzpozíciós mutagenezis 20

4.17. Bioinformatikai módszerek 21 5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 22

5.1 Az rkp-4046 mutáció helyének meghatározása 22 5.2. A 16-3 bakteriofág receptor kialakításában részt vesz az RkpM fehérje 23 5.3. Az rkpM4046 allélban egy missense mutáció található 23 5.4. Újabb mutánsok vizsgálata 26 5.5. Komplementációs kísérlet a receptorfunkció bizonyítására 26 5.6. Az rkpM klónozása egy erős promoter után 29 5.7 Az rkpM expresszió hatása különböző mutáns törzsekben 31 5.8. Az rkpM gén bioinformatikai analízise 32

5.8.1. PLP kötés a DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családnál 33 5.8.2. Az RkpM fehérje DNS-kötő domént tartalmaz? 35 5.8.3 A bioinformatikai elemzések eredményeinek értékelése 37

6. ÖSSZEFOGLALÁS 39 7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK 40 8. RÖVIDÍTÉSEK 45 KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS 46

PA_DIP04.doc

3

1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

1.1. Bevezetés

A biológiai nirtogénkötés igen fontos szerepet tölt be az ökoszisztémában, része a

folyamatos nitrogénkörforgásnak. A folyamatban számos baktérium vesz részt. A lebontó

szervezetek által a szerves nitrogén vegyületek ammóniává alakulnak (ammonifikáció), illetve

a légkörből nitrogénfixálás során a nitrogéngáz szintén ammóniává redukálódik. A redukált

ammónia bizonyos arányát nitrifikáló baktériumok nitráttá oxidálják, mely denitrifikáció

segítségével nitrogéngáz formájában újra a légkörbe juthat. A Föld légkörének 78%-át

nitrogéngáz alkotja, ennek nagy részét a diazotróf szervezetek biológiai úton redukálják

(Burns and Hardy, 1975). A növények egyik alapvető tápanyagforrása a talajból, kötött

formában felvett nitrogén (nitrát, nitrit, ammónia). A növényekkel szimbiózist kialakító

diazotróf baktériumok a légköri nitrogéngázt redukálják ammóniává, így az együttélés

lehetőséget biztosít arra, hogy kimeríthetetlen nitrogén utánpótlásként szolgáljon a

gazdanövények számára.

1.2. Nitrogénkötő szervezetek

Nitrogénkötésre a cianobaktériumok mellett még néhány, szintén prokarióta szervezet

képes. Leghatékonyabban a szimbiózisban élő baktériumok alkalmasak a nitrogénkötésre, de

léteznek szabadonélő szervezetek is, mint a Klebsiella, Rhodospirillum, Azotobacter és

Clostridium fajok. A szimbiotikus baktériumok a növénytől kapják meg a nitrogénkötéshez

szükséges energiát. A cianobaktériumok mindenütt előforduló fotoautotróf prokarióták

(Rippka et al., 1979). Ismerünk mind szabadon (Noctoc spp., Chlorogleosis spp.), mind

szimbiózisban élő fajokat (Nostoc spp., Chalotrix spp.) (West and Adams, 1997). Ezen

szervezeteknél a nitrogénfixálás és fotoszintézis együtt zajlik, de külön differenciálódott

sejtekben. A nitrogén fixálása heterociszta sejtekben, a fotoszintézis vegetatív sejtekben

történik (Wolk et al., 1994). A Nostoc fajok számos élőlénnyel képesek a szimbiózis

kialakítására, úgymint az Azolla moha, a nyitvatermő cikász és a zárvatermő Gunnera

növényekkel (Schenk, 1992). A rhizobiumok, a Rhizobiaceae családba tartozó, Gram-negatív,

diazotróf talajbaktériumok (Rhizobium, Azorhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium,

Mezorhizobium), szimbiózist tudnak kialakítani a pillangósvirágú (Fabaceae) növényekkel

(Dénairé et al., 1992), illetve a nem pillangósvirágú Parasponia fajokkal (Becking, 1992).

A szimbiózis legfejlettebb formája az endoszimbiózis, melyet a rhizobiumok is

alkalmaznak, partnerspecifikus módon jön létre. Ebben az esetben egy kölcsönösen hasznos

együttélésről van szó (Allen and Allen, 1981). A baktérium megfelelő, redukált

PA_DIP04.doc

4

nitrogénforrással látja el a növényt, míg a gazdanövény tápanyagot biztosít a baktérium

számára. A vizsgálatunk tárgyát képező Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium

meliloti), szimbiotikus kapcsolatot képes kialakítani a lucerna (Medicago), lepkeszeg

(Trigonella) és a somkóró (Melilotus) fajokkal. E különleges baktérium-növény kapcsolat

régóta kutatott téma a világon, mind a Sinorhizobium meliloti, mind más rhizobium fajok

esetében (pl. Sinorhizobium fredii).

1.3. A szimbiózis kialakulása

A rhizobium és pillangósvirágúak közötti szimbiózis létrejöttének mechanizmusa

hasonló a patogén baktériumok és az eukarióta sejtek kapcsolódásához (Hentschel et al.,

2000). A szimbiózis kialakulása, igen összetett folyamat, mely komplex molekuláris jelcserén

alapszik. Első lépésként a gazdanövény különféle, flavonoid típusú vegyületeket bocsájt ki a

talajba (Redmond et al., 1986), ami pozitív kemotaxist vált ki (Currier and Strobel, 1974).

Ennek hatására a baktériumok feldúsulnak a növény rhizoszférájában. A flavonoidok, melyek

molekula szerkezete fajspecifikus (Bladergroen and Spaink, 1998), aktiválják a

baktériumsejtekben található un. nodulációs (nod) gének expresszióját, aminek következtében

a baktérium a növény felé kiválaszt egy szignált, a Nod faktort (Schultze et al., 1994), mely

többek között a szimbiótikus gümő kialakulását indukálja. A fertőzés során a baktériumok a

gyökérszőrőkhöz tapadnak (Mills and Bauer, 1985), a tapadást a növény által kiválasztott

lectinek biztosítják (Diaz et al., 1989). Ezután történik a gyökérszőrök meggörbülése. A

fertőzési helyen a sejtfal leépül és egy sejtfalösszetevőkből álló, újonnan lerakódó, belső

csőszerű képlet, az infekciós fonal jön létre, mely folyamatosan növekszik, elágazik

(Robertson and Lyttleton, 1982). Ezáltal jutnak el a baktériumok a gyökérszőrsejtektől a

gümősejtekig, ahol a növényi sejt citoplazmájába endocitózissal lépnek be. A gümősejt

belsejébe került baktériumok peribakteroid membránnal határoltak (Mellor and Werner, 1987).

Mialatt a növény gyökerén kialakul a külön növényi szervként funkcionáló gümő

(Dudley et al., 1987), a baktériumok fiziológiai és morfológiai változásokon mennek

keresztül, egy időleges sejtorganellummá, un. bakteroiddá alakulnak. Miután megtörtént a

baktériumok differenciálódása, megindul a nitrogenáz enzimkomplexet kódoló gének

expressziója, így a szimbiotikus gümő alkalmassá válik a légköri nitrogén redukálására. A

bakteroidok és a növény közötti anyagcseretermékek transzportja a szállítónyalábokon

keresztül történik (Newcomb, 1981).

A gümőfejlődésnek két típusát ismerjük. Az elkülönítés az állandó merisztéma meglétén,

illetve hiányán alapszik (Luyten and Vanderleyden, 2000). Determinált gümő esetében a külső

PA_DIP04.doc

5

kéregsejtekből indul a fejlődés, a merisztematikus aktivitás megszűnik a gümő kifejlődésével.

Determinált gümőt a szója (Glycine max), bab (Phaseolus vulgaris) fajokon kívül más, főleg

trópusi pillangósvirágú (Fabaceae) növény tud létrehozni. Indeterminált gümő esetében pedig

a belső kéregsejtek állandó merisztematikus aktivitása jellemző, folyamatos növekedést

biztosítva ezzel. Az indeterminált gümő, példaként említve a borsó (Pisum sativum), bükköny

(Vicia sp.), lucerna (Medicago sp.) növényeknél fordul elő (Hirsch, 1992). A Sinorhizobium

meliloti indeterminált, a Sinorhizobium fredii determinált gümőképződést indukál.

1.3.1 A Nod faktor

A Nod faktornak fontos szerepe van a szimbiotikus gümő kialakításában, különféle

növényi választ vált ki: a gyökér belső kéregsejtjei között dedifferenciáció és mitózis

inicializálása, mely során egy új osztódószövet alakul ki, a gümőmerisztéma (Dudley et al.,

1987), a növényi gének indukciója, a kálcium oszcilláció (Ehrhardt et al., 1996; Geurts and

Bisseling, 2002), a gyökérszőrök görbülése (Catoira et al., 2000), infekciós fonal növekedése

(Gage and Margolin, 2000). A nod génekben mutáns baktériumok nem képesek a

gümőképződés elindítására (Nod- fenotípus). A nod géneket (pSymA megaplazmidon

találhatóak) két csoportra oszthatjuk, az egyik csoportba (közös nod gének, nodA, nodB,

nodC) azok a gének tartoznak, melyek a Nod faktor alapszerkezetének kialakítását végzik, a

többi gén (nodFEG, nodH, nodPQ) a gazdaspecificitás szempontjából fontos. A növényi

szignált (flavonoidok) a NodD fehérje képes felfogni, ez a fehérje aktiválja a többi nod gént,

kapcsolódik a nod box-ként ismert konzerválódott szekvenciához. Ezzel ellentétes a represszor

hatású, kromoszómán található nolR gén. A két regulátor fehérje (NodD, NolR) biztosítja a

nod gének megfelelő szabályozását. A Nod faktor szerkezete egységesen lipo-kito-

oligoszacharid molekulákból állnak, erre a gazdaspecifitásért felelős gének különböző

oldalláncokat helyeznek (Denarie and Debelle, 1996; Mergaert et al., 1997), így a különböző

szerkezetű molekulák meghatározzák, hogy a baktérium mely növényt képes megfertőzni. A

Nod faktor szekréciójáért a nodIJ gének felelősek.

1.3.2 A nitrogénkötésért felelős gének

A nitrogénkötés megfelelő létrejöttéhez alacsony oxigén tenziójú (mikroaerofil)

környezetre van szükség, ezt a növényi citoszolban lokalizálódó leghemoglobin molekula

biztosítja. A késői bakteriális gének közé tartoznak a nif és bizonyos fix gének. A

nitrogénfixáláshoz szükséges nitrogenáz enzimkomplex egyes részeit a nifHDK gének

kódolják (Fischer, 1994). A nifH gén a homodimer Fe protein (dinitrogenáz reduktáz)

PA_DIP04.doc

6

szintéziséért, a nifD a "2$2 szerkezetű dinitrogenáz " alegység, míg a nifK a $ alegység

kialakításáért felelős (Postgate, 1972). Továbbá a nifE, nifN, nifB gének a FeMo kofaktor

szintézisét végzik (Dean et al., 1993), valamint a nifA génnek, mely egy transzkripciós

aktivátor fehérjét kódol, a nitrogénfixálás szabályozásában van szerepe a fixLJ, fixK génekkel

együtt. Az enzimkomlpex felé történő elektrontranszport biztosítását a fixABCX gének végzik

(Earl et al., 1987). A nagy oxigén affinitású, memránba ágyazott, bakteriod specifikus

citokróm oxidáz komplexet a fixNOQP gének kódolják (Preisig et al., 1993). Alacsony oxigén

koncentráció esetén a szabályozó és szenzor funkciójú fixLJ gének aktiválják a fixK és nifA

regulátor gént, ezáltal megindul a nif operon és több fix gén expressziója (David et al., 1988).

A nif és fix gének regulációját alapvetően a nitrogéngáz és az oxigén koncentrációja határozza

meg.

1.4. Sejtfelszíni poliszacharidok

A rhizobiumok sejtfelszíni poliszacharidjai kulcsszerepet játszanak a szimbiózis

kialakulásának lépéseiben: az infekciós fonal növekedésében, a gümő inváziójában, és a

gazdaspecificitásban (Reuhs et al., 1998), valamint megvédik a baktériumot a környezeti

ártalmakkal szemben. Hasonló szerkezetű sejtfelszíni struktúrákat a patogén baktériumoknál is

találunk, ahol a patogenitást határozzák meg (Reuhs et al., 1993). A S. meliloti sejtfelszíni

poliszacharidjai − sok más Gram-negatív baktériumhoz hasonlóan − az exopoliszacharid

(EPS), lipopoliszacharid (LPS) és a kapszuláris poliszacharid (KPS) (Kannenberg and Brewin,

1994). A poliszacharidok szimbiózisban betöltött szerepére különböző baktérium mutánsok

vizsgálatával derítettek fényt, ilyenek a gümő inváziójára képtelen, infekcióban hibás (Inf-)

baktérium mutánsok, melyek el tudják indítani a gümőfejlődést, de nem képesek bejutni a

belsejébe, “üres” gümők keletkeznek.

1.4.1. Az exopoliszacharidok

A Rhizobium spp. által termelt exopoliszacharidoknak (EPS) két féle típusát ismerjük.

Az egyik típus EPSII néven ismert, glükózt és galaktózt tartalmazó, diszacharid egységekből

felépülő galaktoglükán. A másik típus a S. meliloti által is termelt EPSI (másnéven savas EPS)

(Fraysse et al., 2003), amely egy szukcinoglükán egységekből álló heteropolimer, mely a sejt

felszínén akkumulálódik, és a sejt környezetébe szekretálódik. A szukcinoglükán hét glükóz és

egy galaktóz molekulát tartalmazó, ismétlődő alegységekből épül fel (Reuber and Walker,

1993). Az alegységeken szukcinil, acetil és piruvil módosításokat tartalmaz. Savas jellegét az

uronsav, szukcinát, piruvát elemek jelenlétének köszönheti. A szukcinoglükán poliszacharid

PA_DIP04.doc

7

szintézise négy lépésből áll, melyért a pSymB megaplazmidon elhelyezkedő exo gének

felelősek. Első lépésként, az UDP-glükóz és UDP-galaktóz szintézise történik (pl. exoB,C,N),

majd egy sejtmembránba ágyazott lipid hordozó felszínén zajlik az ismétlődő oktoszacharid

alegység szintézise nukleotid-cukorból (exoF,J,A,L,M,N,O,U). Következő lépésben az

alegységek módosítása (szukcinil – exoH, acetil – exoZ, piruvil – exoV), majd legvégül az

oktoszacharid alegységek polimerizációja, és a sejtfelszínre való transzfere történik

(exoP,T,Q) (Leigh and Walker, 1994). Az exopoliszacharidnak alapvetően a nitrogénfixáló

gümő létrehozásában, az infekciós fonal kialakulásában van meghatározó szerepe (Cheng and

Walker, 1998; Gonzáles et al., 1998). Sok exopoliszacharid termelésében hibás S. meliloti

törzs nem képes a növény inváziójára (Exo-, Inf- fenotípus), mert az infekciós fonalak

abortálódnak a fejlődő gümő sejtjeinél (Müller et al., 1988).

1.4.2. A lipopoliszacharidok

A lipopoliszacharidok (LPS) a Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos

alkotóelemei, a külső membránhoz kapcsolódva helyezkednek el. A Rhizobium fajok

konzerválodott szerkezetű LPS-el jellemezhetőek (Reuhs et al., 1998). Szerkezetileg három

egységre bonthatók. A külső foszfolipid membránba egy un. horgonyzó molekulával, a lipidA

egység segítségével rögzülnek. A horgonyzó egység különböző szerkezetű lehet a Rhizobium

fajokban (Reuhs et al., 1995). Ehhez kapcsolódik egy úgynevezett “core” oligoszacharid,

melyhez a törzsspecifikus O-antigén kötődik (Kannenberg and Brewin, 1994). A lipidA és a

„core” oligoszacharid egységeket közösen az LPS „rough” (R-LPS) formájának nevezzük, míg

az O-antigén egységet tartalmazó formát „smooth” LPS-nek (S-LPS) hívjuk. A S. meliloti LPS

mutánsok szimbiózisra képesek a gazdanövénnyel, de a szimbiótikus kapcsolat lassabban

alakul ki, mint a vad típusú baktériumok esetében (Lagares et al., 1992). Léteznek olyan

baktérium törzsek is, mint például a S. meliloti 41 törzs, melyeknél az LPS nem játszik fontos

szerepet a fertőzésben, vagy más struktúra veszi át a szerepét, itt az R-LPS forma hiányozhat.

Más rhizobium fajoknál azonban sok esetben előfordul, hogy csak az LPS bizonyul lényeges

tényezőnek, míg a többi (KPS, EPS) nem (Kannenberg and Brewin, 1994).

1.4.3. A kapszuláris poliszacharidok

Léteznek olyan rhizobiumok, melyek nem termelik egyik formájú exopoliszacharidot

sem, mégis szimbiózist tudnak kialakítani bármely gazdanövénnyel. Ennek oka az, hogy ezek

a baktériumok olyan rhizobiális kapszuláris poliszacharidot (KPS vagy K-antigén) termelnek,

mely átveszi az exopoliszacharid szerepét a szimbiózis kialakításában, ilyen baktérium a S.

PA_DIP04.doc

8

meliloti 41 törzs exoB mutánsa (más néven AK631 - Petrovics et al., 1993; Putnoky et al.,

1990). A KPS, mint egy kapszula veszi körül a baktérium sejtet, hidrát mátrixot alkot, amely

rezisztenciát biztosít egyes bakteriofágokkal szemben, és védi a különféle abiotikus

tényezőktől, mint a kiszáradás. Fontos a szimbiótikus felismerés korai szakaszában (Becquart-

de Kozak et al., 1997) A lipopoliszacharid egy konzerválódott szerkezetű poliszacharid, ezzel

ellentétben a KPS törzsspecifikus, sok variánsa fordul elő (Forsberg and Reuhs, 1997; Reuhs,

1997). A KPS nem rendelkezik horgonyzó molekulával, hanem szorosan kapcsolódik a

baktérium felszínéhez. A K-antigén széleskörben elterjedt a talajbaktériumokban,

rhizobiumokban először a Sinorhizobium fredii USDA205 törzsben izolálták (1.ábra) és

kiderült, hogy strukturálisan analóg az E. coli II-es csoportba tartozó K-antigénjével, ahol a

patogenitásban van szerepe (Reuhs et al., 1993; Rosenow et al., 1995).

1. ábra: A S. fredii USDA205 törzs KR1 antigén ismétlődő egységének (Kdops) elsődleges szerkezete (Reuhs et al., 1993).

A rhizobiumok KPS molekulái (1. táblázat) tartalmaznak megegyező és eltérő

egységeket, közös elemek a hexóz és 1-karboxy-2-keto-3-deoxy cukrokból álló ismétlődő

egységek, mint a sziálsav vagy a 3-deoxy-D-manno-2-oktulozonsav (Kdo), különböznek a

glikozil alegységek elrendezésében, a térszerkezetükben, a kapcsolódó oldalláncok

mintázatában, molekula méretben (Forsberg and Reuhs, 1997). A S. meliloti és S. fredii

baktériumok K-antigénjei, Reuhs és munkatársai által igen jól jellemzett poliszacharidok. A S.

meliloti AK631 törzse KR5 antigén néven ismert kapszuláris poliszacharidot termel. A KR5

antigén diszacharid alegységekből épül fel. Az alegység egy glükuronsavból és egy 5,7-

diamino-3,5,7,9-tetradeoxi nonulozonsavból áll, melyen 7-N-acetil és 5-N-β-hidroxibutiril

módosítások is találhatók (Reuhs et al., 1998; Reuhs és Glushka, nem közölt eredmények).

Az elmúlt évek kutatásai során három régiót azonosítottak az S. meliloti 41 törzsben,

melyek a KPS bioszintéziséért felelősek (rkp-1, rkp-2, rkp-3 régiók).

PA_DIP04.doc

9

1. táblázat: A K-antigén szerkezete néhány Rhizobium fajnál (Reuhs et al., 1998). Pse: pseudaminsav, Ac: acetil csoport, $-OH-But: $-OH-Butiril csoport.

K-antigén Törzs Molekuláris szerkezet Hivatkozás

KR1 S. fredii USDA205 [→3-"-D-Galp-(1→5)-$-D-Kdop-(2→]n Reuhs et al., 1993

KR3 S. fredii USDA257 [→3)-$-D-Manp-(1→5)-$-D-Kdop-(2→]n Forsberg and Reush 1997

KR5 S. meliloti AK631 [−$-GlcA→Pse5N($-OH-But)7NAc−]n Reuhs nem közölt eredm.

KR6 S. meliloti NGR247 [−"-Glc→"-NeuNAc−]n Reuhs et al., 1998

KR7 S. meliloti NGR185 [−$-GlcNAc→$-Kdo−]n Reuhs et al., 1998

Az rkp-1 régióban 10 gén található (rkpA-J). A gének nagy része olyan fehérjéket kódol,

melyek hasonlóak a különböző zsírsavszintézisben részt vevő enzimekkel, ezek a fehérjék a

lipofil molekulák módosításában és szállításában játszanak szerepet (Kiss and Kondorosi,

1997; Petrovics et al., 1993). Az említett gének feladata − a feltételezések szerint − , hogy a K-

antigén bioszintéziséhez szükséges lipid hordozót létrehozzák. Az RkpJ fehérjének a

kapszuláris poliszacharid transzportjában lehet szerepe, mert az E. coli KpsS fehérjéjével

homológ. Ha mutáció történik az említett génekben, akkor a KPS nem jelenik meg a

baktérium felszínén. Az rkp-1 régióban nincsenek olyan gének, melyeknek a cukoralegységek

bioszintézisében vagy a KPS polimerizációjában lenne szerepe.

Az rkp-2 régióban két olyan gén található, melyek a vad típusú LPS kialakításához

szükségesek. Az lpsL gén által kódolt fehérje egy UDP-glükuronsav epimeráz, mely a

lipopoliszacharid bioszintézisében fontos. A másik fehérje, az RkpK egy UDP-glükóz

dehidrogenáz, amely az UDP-glükóz UDP-glükuronsavvá oxidálását katalizálja. Az RkpK

fehérje az LPS és a KPS bioszintézisében is fontos (Kereszt et al., 1998).

A pSymB megaplazmidon található rkp-3 régióban 10 gént (rkpL-Z) azonosítottak (Kiss

et al., 2001), melyek pontos funkciója homológiák alapján feltételezett, még kísérletesen nem

bizonyított (2. táblázat). Az rkp-1 és rkp-2 régió általánosan előfordul a Sinorhizobium

genusban, ezzel szemben az rkp-3 régió csak a S. meliloti 41 törzsben található meg. A KPS

bioszintézisért, és a sejtfelszínre való exportálásáért, valamint a növény infekciójáért felelősek.

Az egy policisztronos operont alkotó rkpL-Q gének között vannak olyan gének, melyek

homológiát mutatnak különféle transzferáz enzimet kódoló génekkel (például: rkpM, rkpO,

rkpP). Feltételezett funkciójuk a cukor prekurzorok bioszintézise a KPS polimer számára.

Transzkripciójuk független a fordított orientációval rendelkező rkpR, rkpT, rkpS génektől. E

három gén feladata valószínű az, hogy a KPS polimert transzportálják a citoplazmából a

sejtfelszínre. Az rkpT és rkpS olyan szekvencia motívummal rendelkeznek, mely specifikus az

PA_DIP04.doc

10

ABC transzporter családban. A régió utolsó génje a polymerizáció szabályozását biztosító

rkpZ, melyet korábban lpsZ génként azonosítottak (Brzoska and Signer, 1991). Az RkpZ

fehérje homológ az E. coli KpsC fehérjéjével, melyről tudjuk, hogy befolyása van a termelt

KPS méretére és exportjára (Reuhs et al., 1995).

2. táblázat: Az rkp-3 régióban található gének feltételezett szerepe. A táblázatban feltüntettük a homológ fehérjék bizonyított vagy feltételezett funkcióját, valamint azokat a szervezeteket, melyekben az adott homológ fehérje található.

rkp-3 gén Feltételezett szerep Homológ fehérje Homológ szervezet Homológ fehérje szerepe

rkpL dNTP-hexóz-dehidratáz / epimeráz

Jhp0778 Cap5E FlmA

Helicobacter pylori Staphylococcus aureus

Aeromonas caviea

Cukor-nukleotid szintézis UDP-glükóz epimeráz O-antigén bioszintézis

rkpM DegT/DnrJ/EryC/StrS aminotranszferáz

FlmB SpsC WlbF

Aeromonas caviae Methanococcus janaschii Bordatella bronchiseptica

O-antigén bioszintézis Poliszacharid szintézis Amino-cukor szintézis

rkpN Pse aktiválás NeuA NeuA KpsU

Aeromonas caviae E. coli E. coli

O-antigén bioszintézis CMP-NeuNAC szintáz

CMP-KDO szintáz

rkpO transzferáz FlmD FlaR

SpsG/H

Aeromonas caviae Caulobacter crescentus

Methanococcus janaschii

O-antigén bioszintézis Flagelláris protein

Poliszacharid szintézis

rkpP acetiltranszferázok FlaG SpeG

Caulobacter crescentus E.coli

Flagelláris protein Acil transzferáz

rkpQ Pse szintézis NeuB NeuB NeuB

Aeromonas caviae Helicobacter pylori

E.coli

O-antigén bioszintézis Sziálsav szintáz

NeuNAC kondenzáció

rkpR KPS export a

periplazmatikus téren keresztül

KpsE BexC CtrB

E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

KPS export protein

rkpS ABC transzporter

KPS export a sejtmembránon át

KpsT BexA CtrB

E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

KPS export protein

rkpT ABC-2 típ.transzporter

KPS export a sejtmembránon át

KpsM BexB CtrC

E.coli Haemophilus influenzae Neisseria meningitidis

KPS export protein

rkpZ Lánchosszúság meghatározása

LpsZ KpsC LipA

R. meliloti E. coli

Neisseria meningitidis

LPS modifikáció KPS export protein KPS modifikáció

rkpY Poliszacharid szintézis - Nincs homológja

PA_DIP04.doc

11

Az előzőekben ismertetett poliszacharidok fontos feladatot töltenek be a baktérium-

növény szimbiózis kialakulásában, a baktérium külső környezeti tényezők elleni védelmében.

Az EPS és KPS szerkezete nagymértékben különbözik, mégis azonos szerepet töltenek be a

szimbiózisban, a S. meliloti AK631 törzsnél az EPS feladatát a kapszuláris poliszacharid veszi

át. Ismeretes, hogy a baktérium és a gazdanövény közötti kapcsolat igen specifikus a

poliszacharidok tekintetében is. Az, hogy alapvetően eltérő szerkezetű poliszacharidok

helyettesíteni képesek egymást az invázió folyamatában arra utal, hogy a növény több

független mechanizmussal is felismerheti a baktériumot.

PA_DIP04.doc

12

2. ELŐZMÉNYEK

A szimbiózis kialakulásában különböző növényi, illetve bakteriális gének játszanak

szerepet. Ezen gének egy részet már számos kutatócsoport jellemezte. A növény inváziójához

szükséges bakteriális gének funkciójáról viszonylag még keveset tudunk, ezért az említett

folyamat pontosabb megismerése érdekében, jónéhány infekcióban hibás (Inf-) S. meliloti

mutánst izoláltak, jellemeztek már, melyek nem képesek bejutni a növény belsejébe, így a

szimbiózis kialakulása elakad a gümőfejlődés korai fázisában. Az Inf- fenotípusú mutánsokkal

történő fertőzés során „üres” gümők jönnek létre, segítségükkel sikerült kimutatni, hogy a

szimbiózis kialakulásának ebben a szakaszában a baktérium különböző poliszacharidjainak

fontos szerep jut. Ezen kívül kimutatták, hogy a funkcionális gümő képződéséhez

nélkülözhetetlen az EPS, illetve KPS valamelyikének jelenléte (Walker, 1992). A S. meliloti

AK631 törzs például EPS-t nem termel, mégis képes szimbiózist kialakítani a

gazdanövényeivel, mivel a törzs által termelt KPS helyettesíteni tudja az exopoliszacharidokat

a gümőfejlődés során (Putnoky et al., 1990; Petrovics et al., 1993). Bizonyos vizsgálatok,

melyeket több S. meliloti törzsön végeztek arra utalnak, hogy a KPS-nek akár elsődleges

szerepe is lehet az infekciós folyamatban (B. Reuhs személyes közlés).

Munkánkban szerettük volna jobban megismerni a KPS endoszimbiózisban betöltött

szerepét. Konkrétan arra voltunk kíváncsiak, hogy létezik-e olyan funkcionális

molekularészlet, bioszintézisben bekövetkező utólagos módosítás a KPS-t illetően, melynek

hiányában a szimbiózis az infekciós lépésben elakad. Az EPS esetében már végeztek kísérletet

ennek bizonyítására (Leigh et al., 1985). A kapszuláris poliszacharid szerkezetének

gazdaspecifikus vonatkozásainak megismeréséhez olyan mutáns baktériumtörzsek izolálására

volt szükség, melyek felszínén a KPS kismértékben módosult. Ezen fenotípust okozó genetikai

mutáció(k) helyének pontos behatárolásával a feltételezett gazdaspecifitásért felelős gén(ek)

meghatározhatók.

2.1. Spontán mutáns baktériumtörzsek izolálása

Előzetes információk alapján tudtuk, hogy több Inf- S. meliloti mutáns, mely nem

termelt exopoliszacharidot, rezisztenciát mutatott a 16-3 fággal szemben (Putnoky et al.,

1988). Gyanítani lehetett, hogy az Inf- fenotípusú törzsek (mint az AK631 törzs is), az

invázióra képtelen tulajdonságuk mellett, a fággal szemben mutatott rezisztenciájukat is a KPS

hiányának vagy hibájának köszönhetik. Következésképpen, a poliszacharid bioszintézise és a

PA_DIP04.doc

13

fágreceptor jelenléte, nagy valószínűséggel összefügg. Ezen információkból kiindulva

feltételezték azt, hogy a KPS-molekula egyúttal receptorként szolgálhat a 16-3 fág számára

(Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990).

Munkánkban olyan baktérium-mutánsokra volt szükség, melyek felszínén a KPS

módosult formában van jelen. Ennek érdekében csoportunkban olyan mutánsizolálási eljárást

alkalmaztak (Hoffman Gyula munkája), melynek során a S. meliloti 41 törzsre specifikus 16-3

bakteriofágot alkalmazták szelekciós eszközként. Az RM41 törzsből izolált mutációk

azonosítása az un. host-range jelenség segítségével történt. A fág baktériumfelszínt felismerő

fehérjéjét kódoló gén mutációja révén alakul ki a host-range (gazdaspecifitási) mutáció. Ha

egy fágra rezisztenssé vált baktérium-mutánson lehetséges host-range fágmutánst izolálni,

akkor a baktérium mutáns felszínén a fágreceptor jelen van, de feltehetően módosult

formában. Mivel a jelenség lehetővé teszi host-range fágmutánsok adszorbcióját, ezért

valószínű, hogy „finom” szerkezetbeli változás történhetett.

Ezen kísérlet elvégzésével sikerült olyan baktérium mutánst izolálni (GH4046 törzs),

mely rezisztens volt a 16-3 fággal szemben, tehát feltételezhetően a KPS megváltozott

formában van jelen a sejtfelszínen. Ezzel párhozamosan, sikerült izolálni egy feltehetően

módosult farkirosttal rendelkező host-range fágot (16-3 h5), mely fertőzni képes az izolált

baktériumot.

PA_DIP04.doc

14

3. CÉLKITŰZÉSEK

A munkánk célja az volt, hogy komplementációs kísérletekkel azonosítsuk az izolált

mutáció(k) helyét, valamint megállapítsuk a mutáció(k) jellegét bázissorrend meghatározással,

mely megmutatja milyen változás történt DNS, illetve fehérje szekvencia szinten.

Kíváncsiak voltunk, hogy a KPS valóban fágreceptor szerepet is betölthet, vagy

valamilyen más struktúra látja el a feladatot, mely kapcsolatban van a KPS génjeivel. Ez

utóbbi esetben tudni szerettük volna, hogy a fágreceptor milyen módon épül fel és mely

fehérjék alkotják. A fágreceptor szerkezetét meghatározó gén(ek) azonosítható(k) a mutáció(k)

helyének pontos behatárolásával. Amennyiben a fágreceptor valóban a KPS, úgy ezzel a

módszerrel még ismeretlen bioszintézis-gének azonosítására is lehetőség nyílhat.

Ezen kívül, minél többet szerettünk volna megtudni az érintett gén(ek) funkciójáról,

természetéről bioinformatikai analízis segítségével.

A GH4046 törzsön izolált host-range fág (16-3 h5) oldalán is elindult a jelenség

vizsgálata a csoportunkban (Békási Krisztina, illetve Maász Anita diplomadolgozata, 2004.).

PA_DIP04.doc

15

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

4.1. Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok

Munkánk során használt baktérium és bakteriofág törzsek, valamint plazmidok jellemzőit a

3. táblázat tartalmazza.

3. táblázat: Baktériumok, bakteriofágok, plazmidok.

ELNEVEZÉS JELLEMZŐK REFERENCIA

Sinorhizobium meliloti

RM41 S. meliloti vad típusú (Exo+, Nod+, Fix+) Szende K.

AK631 RM41 exoB631 (Nod+ Fix+) Kondorosi Á.

GH4046 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy.

GH4178 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffmann Gy.

GH4180 RM41 16-3 fágra rezisztens, spontán mutáns Hoffman Gy

AT212 AK631 rkpM::Tn5 (212) KmR SmR Kiss et al., 2001

Escherichia coli

JF1754 met leu his hsr- hsm+ Friesen, J

PP219 JF1754 (pRK2013) Putnoky P.

AV4189

AV4190 XL1 Blue pBS::rkpM Kpn-Sal AmpR Ez a munka

AV4191

AV4223 XL1 Blue pSem91::rkpM EcoRV KmR Ez a munka

AV4258 XL1 Blue (pAV4223 Km::Cm(F-778)) KmS CmR Ez a munka

XL1 Blue RecA1,endA1,gyrA96,thi-1, hsdR17,supE44,relA1 Bullock et al., 1987

lacZ∆M15 TcR

JM109 F’ traD36 proA+B+ lacIq ∆(lacZ)M15 / e14- Yanisch-P et al., 1985 (McrA-)∆(lac-proAB) endA1 gyrA96 (Nalr) thi-1 hsdR17(rk

-mk+) glnV44 relA1 recA1

Bakteriofágok 16-3 S.meliloti 41 törzs fágja Orosz and Sik, 1970

16-3 h5 S.meliloti GH4046 törzsre specifikus host-range mutáns Hoffmann Gy.

Plazmidok pBluescript SK II (+/−) AmpR Stratagen, USA

pBBR1 MCS-3 Széles gazdaspecifitású konjugatív plazmid TcR Kovach et al., 1994

pSem91 Expressziós vektor KmR Semsey et al., 1999

pRK2013 Helper plazmid keresztezéshez KmR Ditta et al., 1980

___________________________________________________________________________

PA_DIP04.doc

16

4.2. A baktériumok növesztése

A S. meliloti törzseket TA (Orosz et al., 1973) vagy GTS (minimál) (Kiss et al., 1979)

táptalajokon 32 oC -on, az E. coli törzseket pedig LB (Sambrook et al., 1989) tápközegben 37 oC-on növesztettük. A táptalajok a megfelelő antibiotikumot a 4. táblázatban feltüntetett

végkoncentrációban tartalmazták.

4. táblázat: Az antibiotikumok végkoncentrációja (:g/ml)

Antibiotikum E. coli S. meliloti

Tetraciklin 15 15

Kanamicin 30 200

Kloramfenikol 5 5

Ampicillin 200 --

4.3. Fágok szaporítása

A felszaporítani kívánt fág egy tarfoltját 10 ml TA folyadékba tettük, és 0,2 ml éjszakán

át felnövesztett baktériumtörzs hozzáadása után a lombikot 32 °C-on, 12-24 órán át rázattuk.

A fáglizátumhoz néhány csepp kloroformot adtunk, majd meghatároztuk a fágszámot úgy,

hogy 0,1 ml megfelelően hígított fágot, 0,2 ml éjszakán át felnövesztett baktériumot és 4ml

TA fedőagart összekeverve TA lemez tetejére rétegeztünk. A lemezeket 12-24 órán át 32 °C-

on történő inkubálás után értékeltük ki. A fáglizátumok általában 109 részecskét tartalmaztak

milliliterenként.

4.4. A baktériumok keresztezése

A keresztezni kívánt baktériumokat és a “helper” (PP211) törzset felnövesztettük a

megfelelő antibiotikumokat tartalmazó komplett táptalajon. A keresztezést 0.9%-os NaCl-

oldatban felszuszpendált baktériumokkal végeztük, TA lemezen összecseppentve őket. 16-24

órás 32 oC -on történő inkubálás után a felnőtt baktériumokat felszuszpendáltuk, és a

megfelelő antibiotikumot tartalmazó szelektív lemezre kentük különböző hígításban.

4.5. Fágérzékenységi teszt

A baktériumok fágérzékenységét 16-3 vad típusú, 16-3h5 host-range mutáns

bakteriofágokkal szemben vizsgáltuk. A vizsgálni kívánt baktériumot tartalmazó TA fedőagar

felszínére 1 µl, körülbelül 106 darab fágot tartalmazó lizátumot cseppentettünk, és 24 órás

inkubációs idő után vizsgáltuk, hogy bekövetkezett-e a lízis vagy sem.

PA_DIP04.doc

17

4.6. Összes DNS izolálás

1.5 ml, éjszakán át növesztett, baktériumkultúrából a sejteket centrifugálással ülepítettük

és 300 µl TE oldatban (50 mM TrisHCL, 20 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáltuk. 100 µl 5%

SDS-t tartalmazó TE oldatot és 100 µl pronáz oldatot (2,5 mg/ml pronáz TE oldatban) adtunk

hozzá. 1-3 órás 37oC-os inkubálás után 500 µl fenollal ráztuk össze, majd centrifugálás után a

felülúszót újabb Eppendorf-csőbe pipettáztuk át. 500 µl fenol:kloroform oldattal (25 térfogat

fenol:24 térfogat kloroform:1 térfogat izoamil-alkohol) ráztuk össze. Centrifugálás után a

felülúszóhoz 500 µl kloroform oldatot (24 térfogat kloroform:1 térfogat izoamil-alkohol)

adtunk, összeráztuk és centrifugáltuk. A vizes fázist 1000 µl etanollal kicsaptuk. A kocsonyás

csapadékot új, 500 µl 70%-os etanol tartalmú, eppendorf csőbe tettük át pipettahegy

segítségével. Centrifugálás után a felülúszót leöntve, szárítást követően, a DNS csapadékot

100 µl steril desztillált vízben oldottuk fel (Meade et al., 1982 ).

A pSEM91 plazmid vektorba történő rkpM inszert beépülésének tesztelésére gyors DNS

izolálási technikát használtunk. A vizsgálni kívánt baktériumot felszuszpendáltuk 100µl steril

desztillált vízben, 5 percig 100°C-on forraltuk, majd 5 percig 0°C-on inkubáltuk. Ezután a

mintát 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót új csőbe pipettáztuk és higítottuk (10x).

4.7. Plazmid DNS izolálás

A plazmid vagy kozmid DNS-t E. coli esetén 3-3 ml LB tápfolyadékban, S. meliloti

esetén pedig TA tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett

sejtekből Ish-Horowicz és Burke (Ish-Horovicz and Burke, 1981) szerint alkalikus lízissel

preparáltuk. 1.5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe tettünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük.

A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCL, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz pH 8.0)

szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0.2N NaOH, 1% SDS)

hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd erős rázással 160 µl

jéghideg Na-acetát oldatot (3M, pH 4.8) adtunk hozzájuk. 5 perces 0°C-os inkubáció után 5

percig centrifugáltuk, és a felülúszóból 400 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 10

perc -20°C-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk és szárítottuk. A csapadékot 100

µl Tris-pufferben (50 mM TrisHCL, 100 mM Na-acetát, pH 8.0) oldottuk fel, majd 200 µl

etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0°C-os inkubáció után a csapadékot centrifugáltuk,

szárítottuk, majd 30 µl RNáz-os trideszt vízben (100 µl/ml RNázA) oldottuk fel.

PA_DIP04.doc

18

A szekvenáláshoz és a transzpozíciós in vitro reakcióhoz készített preparátumoknál

további tisztítási lépést iktattunk be. A plazmid DNS izolálálás végén 50 µl RNáz-os desztillált

vízben vettük fel a csapadékot, majd 0.1 térfogat 10% SDS és 1 térfogat 7,5 M NH4-acetát

után 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután centrifugáltuk 5 percig és a felülúszót új csőbe

pipettáztuk, ehhez 0,6 térfogat izopropanolt adtunk és -20°C -ra tettük 20 percig. Az inkubálás

után etanolos mosás, és szárítás következett. A csapadékot 40 µl steril desztillált vízbe vettük

fel.

4.8. Polimeráz láncreakció (PCR)

Az rkpM gént magába foglaló, illetve ennek egy részét tartalmazó DNS-szakaszt

sokszoroztuk meg polimeráz láncreakció segítségével. A felhasznált oligonukleotidokat az 5.

táblázat tartalmazza. DNS szekvencia meghatározáshoz az rkpM4046, illetve rkpM4178 allélt

magába foglaló DNS szakaszt az RM-15 és RM-13 primerekkel, valamint az alábbiakban

részletezett RKP-M program alkalmazásával amplifikáltuk (1625 bp). A klónozáshoz használt

rkpM allél felsokszorozásához ugyanezen primereket, és a valószínűsíthetően jobb hatásfokkal

tompa végeket létrehozó Pfu DNS-polimerázt alkalmaztuk (RKP-M1 program). A pSEM91

plazmid vektorba történő rkpM inszert beépülésének tesztelésére két belső primert (RM-23,

RM-25) használtunk fel, melyekkel 1% agaróz gélen is könnyen detektálható (558 bp)

fragmentet kaptunk (RKP-M2 program).

Az alábbi PCR-programokat alkalmaztuk:

RKP-M RKP-M1 RKP-M2

1. 1 min. 94°C 1. 1 min 95°C 1. 1 min. 94°C 2. 30 sec. 94oC 2. 1 min 95°C 2. 30 sec. 94oC 3. 30 sec. 62oC 3. 30 sec. 62oC 3. 30 sec. 59oC 4. 1 min. 72oC 4. 3 min 72oC 4. 1 min. 72oC 5.34× a második lépésre 5. 34× a második lépésre 5.34× a második lépésre 6. 30 sec. 20oC 6. 5 min 72oC 6. 30 sec. 20oC 7. End 7. 1 min 20oC 7. End

8. End

4.9. Fragmentizolálás

A PCR terméket agaróz gélelektroforézis segítségével tisztítottuk. Az izolálni kívánt

fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk és 20 perces 60V feszültség melletti

elektroforézis után az izolálandó fragment a papírra került. A papírt eppendorf csőbe tettük, és

a DNS-t 100 µl 1M NaCl oldattal mostuk le, kétszer egymás után. A DNS kicsapása 20 µl 3M

Na-acetát oldattal (pH 7,0) és 120 µl izo-propanollal történt. 20 perces -20oC-os inkubálás

után lecentrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot.

PA_DIP04.doc

19

4.10. DNS-szekvenálás

Az izolált PCR fragmenteket, DNS szekvencia meghatározás céljából a MTA Szegedi

Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumába küldtük el. A szekvenálási reakcióhoz

felhasznált oligonukleotidok fő jellemzőit az 5. táblázat foglalja össze.

5. táblázat: A szekvenálási reakcióhoz felhasznált oligonukleotidok ___________________________________________________________________________

Oligonukletid neve Nukleotidszekvencia Számított Tm (oC) ___________________________________________________________________________

RM-15 primer 5’- GCATTAGGCCCGGGGAGAAGC -3’ 62,4

RM-13 primer 5’- CAGGCCGAAGGAACGGAACCTC -3’ 62,0

RM-25 primer 5’- CGAGCCAAGGTGGACTTCGTT -3’ 59,4

RM-23 primer 5’- CAGGCCGGAATAGCTGTCAGG -3’ 59,5

RM-35 primer 5’- CTGGCTCGGCGATATGATAAG -3’ 54,9

RM-33 primer 5’- AGCGAAATGCACGAGCACAAC -3’ 59,0

4.11. Restrikciós emésztés, kettős emésztés

A DNS minták restrikciós emésztését Sambrook és mtsai szerint végeztük. (Sambrook et

al., 1989). A kettős emésztés esetén, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát

kicsaptuk 0,1 térfogat 3M Na-acetát (pH=7) és 2 térfogat et-OH (96%) hozzáadásával, és min.

20 percig inkubáltuk -20°C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70% et-OH mosás, szárítás után

30µl steril desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót.

4.12. Gélelekroforézis

A fragmentek elválasztására 1%-os agaróz gélt használtunk. Az elválasztásra szánt DNS

mintához, az alábbiakban leírt összetételű STOP-oldatot adtunk (5xSTOP-ból a végtérfogat

1/5-ét). A gélelektroforézist minigél esetében 60V-on, fragmentizolálásnál 40V-on végeztük.

Kontrollként, PstI enzimmel emésztett, λ DNS-t alkalmaztunk.

1%-os agaróz gél: 1 g agaróz, 100 ml 1xTBE puffer, 100 µl etidium-bromid (100 µg/ml).

5xSTOP 20 ml-hez: 2 g ficoll, 10 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0), 40 mg brómfenolkék (BFB).

5xTBE törzsoldat: 54 g TRIS, 27,5g bórsav, 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) / 1000 ml.

PA_DIP04.doc

20

4.13. Kompetens sejt készítés

Kompetens sejtek készítéséhez XL1-Blue, valamint JM109 E. coli törzset használtunk.

200 ml SOB táptalajban (2% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,

pH 7.0) éjszakán át 22°C-on növesztett baktériumkultúrát 10 percre jégre tettünk. A 10 perces

centrifugálással (4000 rpm) összegyűjtött sejteket 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES,

15 mM CaCl2, 250 mM KCl, pH 6.7) szuszpendáltuk. 10 percig jégen inkubáltuk, majd

centrifugálással összegyűjtöttük a sejteket, és 20 ml jéghideg TB pufferben szuszpendáltuk. A

szuszpenzióhoz 1.5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorf-csövekbe szétosztva -80°C-os

hűtőben fagyasztottuk és tároltuk transzformációig (Inoue et al., 1990).

4.14. Ligálás

A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, ligáz puffer (5×koncentráció:

200 mM TrisHCL, 50 mM MgCl2, 50 mM dithiotreitol (DTT) 2,5 mM ATP, pH 7.8) és steril

desztillált víz felhasználásával készítettük. A fragment mennyisége tízszeres volt a vektor

mennyiségéhez képest. A reakcióhoz T4 DNS ligázt használtunk, és az elegyet legalább 2

óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk.

4.15. Transzformálás

Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -20°C-ról

jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig

jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37°C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 µl SOC

oldatot (2% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM glükóz, pH

7.0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra tettük.

pBluescript használata esetén a táptalajba 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl Xgal oldatot

(2%,dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsokat kék-fehér screen segítségével

detektáltuk. (Inoue et al., 1990). A transzpozíciós mutagenezisnél antibiotikumot használtunk

szelekciós eszközként (Km, Cam).

4.16. In vitro transzpozíciós mutagenezis

A pSEM91 plazmid vektor transzpozonos mutagenezisét a TGS II Kit (Template

Generation SystemTM II, TGSTM II, F-702; Haapa et al., 1999) alapján végeztük el. A cél a

vektoron lévő rezisztencia marker megváltoztatása volt. Kloramfenikol rezisztencia gént

juttattunk be a kanamicin génbe. Plazmid DNS tisztítás után megmértük a minta DNS-

koncentrációját. A reakcióhoz szükséges DNS mennyiséget a target DNS hossza (8,4 kb)

PA_DIP04.doc

21

alapján (40 ng DNS/ kb) határoztuk meg. A meghatározott térfogatú DNS mintához, 4 µl 5x

puffert, 1 µl (20 ng/µl) kloramfenikol rezisztenciagént hordozó entranszpozont, 1 µl (0,22

µg/µl) MuA transzpozáz enzimet adtunk, majd az elegyet 20 µl-re egészítettük ki steril

desztillált vízzel. A mintát 1 órán át 30°C -on inkubáltuk, ezután 10 percig 75°C -on

inaktiváltuk, majd transzformáltuk.

4.17. Bioinformatikai módszerek

Az RkpM fehérje homológok keresésére az NCBI honlapon elérhető BLASTP programot

használtuk (Altschul et al., 1990; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). A homológ funkcionális

doménekről a PROSITE (Falquet et al., 2002; www.expasy.org/prosite) és Pfam

(www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) adatbázisokból gyűjtöttünk információkat. Motívum

elemzést a UNIX rendszer alatt működő EMBOSS programcsomag PATMATDB programjával

végeztünk. A fehérje további elemzésére, HTH motívum prediktálásra, többszörös illesztések

elvégzésére az ExPASy Molecular Biology Server honlapon (Gasteiger et al., 2003,

www.expasy.org), és a Lion Bioscience AG, SRS programjában (srs.ebi.ac.uk/Tools) elérhető

eszközöket alkalmaztuk. A feltételezett transzmembrán domének elemzését a TopPred

programmal végeztük (Claros and Heijne, 1994; www.sbc.su.se/~erikw/toppred2).

PA_DIP04.doc

22

5. EREDMÉNYEK

5.1. Az rkp-4046 mutáció helyének meghatározása

Munkánk megkezdésekor rendelkezésünkre állt a GH4046 spontán mutáns S.meliloti

törzs, mely rezisztens a vad típusú 16-3 bakteriofággal szemben, viszont a 16-3 h5 host range

fág fertőzni képes. Az volt a célunk, hogy megtaláljuk a mutációt szenvedett gén pontos

helyét, majd a mutáció jellegét. Mivel sejtettük, hogy a változás valamelyik KPS

bioszintézisért felelős génben van, ezért először azt kellett megállapítanunk, hogy az rkp-4046

mutáció egy már azonosított vagy egy ismeretlen rkp génben történt. Ennek kiderítésére

genetikai komplementációs kísérleteket végeztünk.

2. ábra: Az rkp-3 régió szerkezete (Kiss et al., 2001). fent: Feltüntettük a pAT399 és a pAT401 kozmid klónokban található inszertek által lefedett

részeket. A régión belül néhány restrikciós enzim hasítóhelyét is jelöltük (E: EcoRI; B: BamHI; H: HinDIII).

lent: Nyilakkal az azonosított gének helyét és irányultságát jelöltük.

Az első komplementációs kísérletben azt vizsgáltuk, hogy melyik rkp régióban található

a mutáció. Az rkp-3 régiót két átfedő kozmid klón tartalmazta (pAT399, pAT401; 2.ábra),

ezért ezeket külön kellett vizsgálni. A kísérlet eredményeként megállapítottuk, hogy az rkp-

4046 mutáció az rkp-3 régió bal oldali szakaszán (pAT399) található.

A következő komplementációs kísérlettel a mutáció rkp-3 régióban található helyét

kerestük. A régióban található gének elhelyezkedése és teljes nukleotidszekvenciája már

ismert volt (Kiss et al., 2001). Az eredmények alapján, a régiót számos – a kapszuláris

poliszacharid-bioszintézisben részt vevő – rkp gén alkotja (2. ábra).

PA_DIP04.doc

23

Az előző kísérletből tudtuk, hogy a mutáció a pAT399 kozmid klón szakaszára esik.

Eredményeink szerint az rkp-4046 mutáció az rkpM génben van, tehát a GH4046

baktériumtörzs az rkpM egy mutáns allélját hordozza. Ezt rkpM4046 allélnak neveztük el. (A

komplementációs kísérletek részletes leírása, Deák Veronika diplomadolgozatában található).

5.2. A 16-3 bakteriofág receptor kialakításában részt vesz az RkpM fehérje.

A csoportunkban végzett egyéb kísérletek alapján megállapították, hogy az általunk

vizsgált GH4046 mutáns törzs egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot ugyanúgy,

mint az AT212 (rkpM::Tn5) mutáns törzs sem, melyen nem lehet host-range fágot izolálni és

az rkpM génben egy Tn5 transzpozont tartalmaz, így elrontva a gén működését. Ez arra utalt,

hogy a 16-3 fág receptora valószínűleg nem a KPS, mint azt előzőleg feltételeztük. Ezen

információkból kiindulva valószínű, hogy a host-range fágmutánsok esetében az „elsődleges”

receptorként szolgáló KPS hiányában egy másik sejtfelszíni poliszacharid veheti át annak

szerepét. Ha ez így van, akkor minden rkp mutánson, de legalább az rkpM::Tn5(212) mutációt

hordozó baktériumon lehetséges volna a host-range fágmutánsok izolálása. Ezt több független

kísérletben is megpróbáltuk, de minden alkalommal csak a kontrollként alkalmazott GH4046

törzsön kaptunk plakkokat.

Tehát közvetett bizonyíték mutatott arra, hogy a fágreceptor nem a KPS és, hogy az

rkpM4046 allél egy különleges mutációt hordoz, mely egy megváltozott szerkezetű fágreceptort

eredményez. Kézenfekvő volt ezek után a feltételezés, hogy maga az RkpM fehérje szolgál

fágreceptorként, és az rkpM4046 allél valószínűleg csak egyetlen aminosavcserét eredményező

(un. missense) mutációt tartalmaz.

5.3. Az rkpM4046 allélban egy missense mutáció található

A továbbiakban arra kerestünk választ, hogy az rkpM4046 allélban DNS szekvencia

szinten milyen változás történt. A vadtípusú szekvencia (AK631) pontos bázissorrendje már

ismeretes volt (AC: AJ245666; Kiss et al., 2001), ezért megtervezhettük a mutáns gén

megsokszorozásához, illetve szekvencia meghatározásához szükséges oligonukleotidokat.

A GH4046 baktériumtörzs össz-DNS preparátumából polimeráz láncreakció (PCR)

segítségével a kívánt DNS-szakaszt megsokszoroztuk, majd izoláltuk ezt a fragmentet, agaróz

gélelektroforézis alkalmazásával.

Mivel a PCR-fragment 1625 bázispár hosszúságú, míg a benne foglalt rkpM gén 1161

bázispárnyi, ezért a mutáns allél DNS-szekvenciájának meghatározásához – a PCR-

primereken kívül – szükség volt még négy oligonukleotid tervezésére, hogy mindkét szálon

PA_DIP04.doc

24

lehetővé tegyék az egymással átfedő leolvasások a nukleotidsorrend biztonságos

meghatározását (3.ábra).

3. ábra: A PCR és a szekvenálási reakciókhoz felhasznált oligonukletidok elhelyezkedése. A PCR reakcióhoz az Rm-15 és az Rm-13 primereket alkalmaztuk. A DNS-szekvencia meghatározásához – az előbbieken kívül – szükség volt még négy oligonukleotidra (Rm-25; Rm-35; Rm-23; Rm-33; pontos szekvenciájukat az 5. táblázat tartalmazza).

Az izolált PCR-fragment nukleotid szekvenciáját a tervezett oligonukleotidok

segítségével, szubklónozás nélkül, direkt úton határoztuk meg. A részszekvenciák

összeillesztése után megállapítottuk, hogy az rkpM4046 allél, meglepő módon, két missense

mutációt hordoz a gén 3' végének közelében. Ezek alapján nem tudtuk eldönteni, hogy

mindkettő mutáció vagy csak az egyik felelős a megváltozott szerkezetű fágreceptor

kialakulásáért. A probléma oka az, hogy a vadtípusú szekvencia megállapítása az AK631 törzs

alapján történt, míg a GH4046 mutáns az RM41 törzsből lett izolálva. Feltételeztük, hogy csak

az egyik mutáció okozza az RkpM fehérje funkcióvesztését. Ennek kiderítésére az rkpM41

nukleotid sorrendjét is meghatároztuk, így kiderült, hogy az AK631 és RM41 között is létezett

egy eltérés, mely semlegesnek bizonyult a fágreceptor kialakulása és a KPS bioszintézis

szempontjából, mivel mindkettő termel KPS-t és szenzitív a 16-3 fággal szemben. Az rkpM41

vadtípusú és rkpM4046 mutáns allél közötti eltérés egy aminosav cseréjét jelenti az általa kódolt

fehérje C-terminális részén. (Az rkpM41 allél szekvenálása lsd. Deák Veronika

diplomadolgozata, 2004). A vad típusú allél leucint (Leu252) meghatározó kodonjának (TTG)

egyik bázisa megváltozott (TTC), mely fenilalanin (Phe252) beépülését okozza az

aminosavlánc adott pozíciójába (4. ábra).

PA_DIP04.doc

25

4. ábra: A vad típusú rkpM gén nukleotidsorrendjét illetve az általa meghatározott aminosavszekvenciát tartalmazza az ábra. Feltüntettük a GH4046, GH4178 és GH4180 baktériumtörzsek mutáns alléljának felsokszorozásához és DNS-szekvencia meghatározásához alkalmazott oligonukleotidok (Rm-13, Rm-15, Rm-23, Rm-25, Rm-33, Rm-35) elhelyezkedését. A sárgával kiemelt TTG kodon a GH4046 és GH4178 törzsekben azonosított mutáció helyét jelöli, ahol ez TTC kodonra változott. A mutáció eredményeként leucin (L252) helyett fenilalanin (P252) épül be a fehérje adott pozíciójába.

PA_DIP04.doc

26

5.4. Újabb mutánsok vizsgálata

Kíváncsiak voltunk arra, hogy csak az RkpM fehérje alkotja-e a fágreceptort, illetve annak

mely részei vesznek részt a felismerésben. Hogy közelebb kerüljünk a válaszhoz,

tanszékünkön újabb mutánsokat izoláltak, hasonló módszerekkel a már leírtakhoz (2. fejezet).

Ezek az rkp-4178 és az rkp-4180 mutációkat hordozó törzsek.

Mindkét törzsből DNS-t izolálva, megsokszoroztuk az rkpM gént hordozó DNS szakaszt

PCR reakció segítségével, és kimutattuk, hogy az rkp-4178 mutáció teljesen megegyezik az

előzőekben vizsgált rkpM4046 mutációval (4. ábra). Tehát, egy teljesen független

mutánsizolálás és szekvencia meghatározás megerősítette előző eredményeinket.

Az rkp-4180 mutáció vizsgálata azonban más eredményt hozott. Ebben az esetben az rkpM

génben nem találtunk semmilyen mutációt. Az előzetes komplementációs eredmények szerint

(Szabó Csilla munkája), a mutáció ez esetben az rkp-3 régió más génjének területére esik, ami

arra enged következtetni, hogy az RkpM fehérjén kívül más alkotója is van a fágreceptornak.

Végeredményben, az a következtetés vonható le, hogy az RkpM fehérje a fágreceptor

alkotóeleme, C-terminális része a fággal való kapcsolat kialakításában közvetlen szerepet

játszik.

Mindezt alátámasztja a host-range fágok vizsgálata is (Békási Krisztina, illetve Maász

Anita diplomadolgozata 2004.), ahol a h génben történt missense mutáció lehetővé teszi, hogy

az RkpM4046 fehérjét tartalmazó baktériumokon a host-range mutáns fág szaporodhasson.

Tehát, egy baktériumfehérje egyetlen aminosavának megváltozása következtében megszűnt

felismerési folyamatot a fág egy fehérjéjének egyetlen aminosavában bekövetkezett

megváltozása helyre tudta állítani. Ez, a két fehérje közvetlen kölcsönhatására utal.

Hasonló jelenséget már más rendszerekben is kimutattak. Például az Escherichia coli K-12

törzse és a λ fág esetében a fág receptora a maltóz és maltodextrinek transzportjáért felelős

külső membránfehérje, a MalB. Ezzel közvetlen kölcsönhatásban a fág farkirost J fehérjéje áll.

A malB génben történő pontmutációkra, melyek fágrezisztenciát eredményeznek, a host-range

fágok szintén egy-egy missense mutációval „reagálnak”, melyek mind a j génnek a farkirost C

terminálisát kódoló részére estek (Wang et al., 1998; Werts et al., 1994).

5.5. Komplementációs kísérlet a receptorfunkció bizonyítására

A következő kísérletekben tovább szerettük volna erősíteni a feltevésünket, miszerint az

RkpM fehérje a fágreceptor alkotórésze. Ennek bebizonyítására újabb komplementációs

kísérletet terveztünk. A vadtípusú (rkpM), illetve a mutáns gént (rkpM4046), olyan S. meliloti

törzsbe kívántuk bejuttatni konjugáció segítségével, mely egyáltalán nem termel kapszuláris

PA_DIP04.doc

27

poliszacharidot (az rkpM4046 klónozása és az ehhez kapcsolódó komplementációs kísérlet

Deák Veronika diplomadolgozatában, 2004., szerepel). Ilyen törzs a már említett

rkpM::Tn5(212) (AT212) mutáns. Azt reméltük, így helyreáll a fággal való fertőzhetőség a

vadtípus bejuttatása esetén a 16-3, a mutáns allél bejuttatása esetén a 16-3 h5 host-range

bakteriofággal. A vadtípusú génnel történő komplementáció kontrollként is szolgál az

rkpM4046 allél vizsgálatához.

Az első komplementációs kísérletnél (lsd. 5.1 bekezdés), ahol a GH4046 törzsben

történő mutáció pontos helyét határoztuk meg, az rkpL-Q génekben külön-külön Tn5

transzpozont tartalamzó plazmidokat juttattunk be a mutáns baktériumba. Mivel valószínű,

hogy az rkpL-Q gének egy policisztronos egységbe tartoznak, feltételezhető, hogy egy

promóterről íródnak át, ezért a konjugáció során azt reméltük, hogy érvényesül a transzpozon

beépülésének poláris hatása, azaz a tőle „down-stream” elhelyezkedő összes gén átíródásának

blokkolása. A kísérletben kiderült, hogy a poláris hatás nem érvényesül. Ebből arra

következtettünk, hogy a beépült Tn5 transzpozonon van olyan promóter-szerű szekvencia,

mely elegendő az inszerció után elhelyezkedő gének expressziójához, vagy eleve az rkp-3

régió tartalmaz ilyen szekvenciákat. Ezen információkat figyelembe véve, a konjugációs

kísérlet elvégzéséhez olyan plazmidot konstruáltunk, mely az rkp-3 régióból csak az rkpM

gént tartalmazza.

Először a vadtípusú S. meliloti (RM41) törzsből össz-DNS preparátumot készítettünk,

majd az Rm-13 és Rm-15 primerek segítségével, polimeráz láncreakcióval megsokszoroztuk

az rkpM gén megfelelő hosszúságú szakaszát (1161 bp). A DNS-fragment izolálása után

következett a fragment ligálása a pBluescript vektoron lévő KpnI-SalI helyre. Mivel a pBBR1

MCS-3 vektoron lévő KpnI-PstI helyre szerettük volna ligálni az rkpM fragmentet, de az nem

tartalmazott PstI restrikciós hasítóhelyet, ezért alkalmaztuk először a pBluescript vektort (5.

ábra). A pBBR1 MCS-3 vektor KpnI-PstI helyére történő inszert beépülést restrikciós

emésztéssel ellenőriztünk. Az rkpM gént hordozó plazmidszármazékot konjugációval

bejuttattuk az S. meliloti rkpM::Tn5(212) mutánsba, majd a komplementáció sikerét fágteszttel

vizsgáltuk.

A kísérletben nem sikerült komplementálni az rkpM::Tn5(212) mutánst, nem állt vissza

a vad típusú 16-3 bakteriofággal történő fertőzhetőség. A mutáns rkpM4046 alléllal történő

hasonló vizsgálat sem volt eredményes (Deák Veronika diplomadolgozata, 2004).

A klónozásos kísérlet eredményeiből kiindulva valószínű, hogy a vektorba épített rkpM

inszert eleje nem tartalmaz ilyen promoter jellegű szekvenciát, tehát a következőkben olyan

plazmidot kell terveznünk, ahol az inszertet közvetlenül a promóter után építjük be.

PA_DIP04.doc

28

5. ábra: Az rkpM gén klónozása pBBR1 MCS-3 vektorba. Az ábrán a munka egyes lépései láthatók. A gént PCR segítségével amplifikáltuk, majd a fragment izolálása után ligáltuk a pBluescript II SK(+) vektor KpnI-SalI helyére, majd a pBBR1 MCS-3 vektor KpnI-PstI helyre.

PA_DIP04.doc

29

5.6. Az rkpM klónozása egy erős promóter után

Az előző kísérlet nem hozta meg a várt eredményt, ezért, hogy biztosítsuk az rkpM gén

expresszióját, egy újabb klónozási kísérletet végeztünk. A vadtípusú rkpM gént a pSEM91

expressziós vektorba juttattuk be, közvetlenül a Ptac promóter után. Az rkpM4046 mutáns génnel

is elvégeztük a kísérletet (Deák Veronika diplomadolgozata, 2004). Kezdetként, hasonlóan az

előbbi klónozási kísérlethez, polimeráz láncreakciót alkalmaztunk a megfelelő DNS szakasz

megsokszorozására, de ebben nem az általánosan használt Taq polimeráz enzimet használtuk,

hanem a fragment végén nagyobb hatékonysággal tompa véget létrehozó Pfu polimerázt. A

fragment izolálása után szintén pBluescript vektorba ligáltuk az inszertet, de ebben az esetben

a vektoron lévő EcoRV helyre. Mivel itt nem irányított inszertbevitel volt, mint az első

klónozásnál (5.5 pont), meg kellett állapítani, hogy az inszert megfelelő orientációban épült-e

be. Ennek kiderítésére restrikciós emésztést végeztünk.

A megfelelő orientációjú konstrukciót (6. ábra) SmaI enzimmel emésztettük, és

fragmentizolálás után, a pSEM91 vektor EcoRV helyére ligáltuk. Az inszertet tartalmazó

plazmidot XL1Blue sejtbe transzformáltuk, ezután meg kellett állapítanunk az inszert

beépülését és annak orientációját. A transzformánsokból öszes DNS-t izoláltunk „gyors” DNS

preparálással, majd az rkpM inszertet amplifikáltuk PCR segítségével (RM-23, RM-25

primerek). Azokon az izolált plazmidokon, melyeknél a PCR reakció kimutatta az inszert

jelenlétét, restrikciós emésztést végeztünk SalI enzim segítségével. A inszertet megfelelő

orientációban tartalmazó származékot a fragmentek mérete alapján tudtuk kiválasztani

(pAV4223).

A kísérlet során felmerült egy probléma, miszerint a komplementációban recipiensként

használt AT212 (rkpM::Tn5) törzs szintén Km rezisztencia génnel rendelkezik, mint a

pSEM91 vektor. Így nem tudjuk kiszelektálni azokat a S.meliloti, rkpM::Tn5(212) sejteket,

melyekbe a konjugáció során bejutott az rkpM gént tartalmazó pSEM91 plazmid. Ennek

megoldására, in vitro transzpozíciós mutagenezissel a vektor Km rezisztenciagénjébe egy

kloramfenikol (Cam) rezisztenciagént juttattunk be, ezzel elrontva a Km rezisztenciáért felelős

gént. Transzformálás után azokat a sejteket kerestük (pAV4223 Km::Cm(F-778)), melyek Km

szenzitív és Cam rezisztensek voltak. Az entranszpozon beépülését restrikciós emésztéssel is

ellenőriztük (7. ábra). A klónozásos és transzpozíciós kísérletek végére egy olyan

plazmidszármazékkal (pAV4258) rendelkeztünk, mely tartalmazta a pSEM91 expressziós

vektoron a Ptac promoter után építve az rkpM vadtípusú gént, és a kanamicin rezisztencia gént

inaktiváló kloramfenikol rezisztenciát hordozó entranszpozont.

PA_DIP04.doc

30

6. ábra: Az rkpM gén klónozása pSEM91 expressziós vektorba A klónozási folyamat egyes lépéseit szemlélteti az ábra. PCR segítségével megsokszoroztuk a vizsgált gént, a fragment izolálását követően a pBluescript II SK(+) vektor EcoRV helyére ligáltuk, majd a pSEM91 vektor szintén EcoRV helyére. Végül in vitro transzpozíciós mutagenezissel Cam rezisztenciagént juttattunk a plazmid Km génjébe.

PA_DIP04.doc

31

7. ábra: Az in vitro mutagenezis ellenőrzése restrikciós emésztéssel. (A) A bal oldali fotón látható a SalI enzimmel emésztett pAV4223 plazmid, három fragment keletkezik (5,2kb; 1,7kb; 1,2kb). (B) A jobb oldali fotón az 1,3kb-os entranszpozon beépülését követő restrikciós emésztés (SalI) eredménye látható. Az 1,2kb-os fragmentből a beépülés hatására 2,5kb-os fragment keletkezett. λ: PstI enzimmel emésztett lambda DNS

5.7. Az rkpM expresszió hatása különböző mutáns törzsekben

A kísérletben továbbra is azt szerettük volna megtudni, hogy az RkpM fehérje részt

vesz-e a fágreceptor kialakításában. A klónozás során létrehozott pAV4258 plazmidot juttatuk

be konjugáció segítségével az AT212 (rkpM::Tn5), a receptor mutáns GH4046 (rkpM4046),

illetve kontrollként a vad típusú AK631 törzsekbe.

A komplementáció sikerét, vagyis a transzkonjugáns baktériumok fenotípusát fágteszttel

ellenőriztük. Az AK631 törzset mind a 16-3, mind a 16-3 h5, ezzel ellentétben a GH4046

törzset csak a 16-3 h5 bakteriofág képes fertőzni, viszont az AT212 törzset egyik sem. A

kísérletben azt figyeltük, hogy az említett fenotípusok hogyan változnak meg a Ptac::rkpM

konstrukció jelenlétében. Eredményként azt vártuk, hogy az AT212 (rkpM::Tn5) törzsbe,

plazmidon bejuttatott vadtípusú rkpM gén képes helyreállítani mindkét fággal történő

fertőzhetőséget. Ez nem sikerült, a mutáns rkpM4046 génnel történő konjugáció sem hozott

eredményt, ebben az esetben azt reméltük, hogy az AT212 törzs 16-3 h5 fággal szembeni

fertőzhetősége áll helyre (Deák Veronika diplomadolgozat, 2004). A kísérlet pozitív

eredménye, hogy a bejutatott vadtípusú rkpM az AK631 esetén nem csökkentette a fágokkal

való fertőzhetőséget, a GH4046 törzset pedig fertőzhetővé tette a vadtípusú 16-3 fággal

szemben (6. táblázat).

PA_DIP04.doc

32

6. táblázat: A komplementációs kísérlet eredménye. Donor törzs: AV4258. Feltüntettük a recipiensek fágfertőzhetőségét konjugáció előtt és után.

Fenotípus (Fágfertőzés)

Transzkonjugáns fenotípus (Fágfertőzés) Recipiens törzsek

16-3 h5 16-3 h5

AK631 (vad típus) + + + +

4046 − + + +

AT212 (rkpM::Tn5) − − − −

Az AT212 (rkpM::Tn5) törzsel történő konjugáció során valószínű, hogy a Tn5

transzpozon poláris hatása valahogyan mégis megnyílvánul, vagy a kialakításban résztvevő

gének nem tudják létre hozni a fágreceptort. A mutáns rkpM4046 gén bevitelével csökken az

AK631 törzs mindkét fággal történő fertőzhetősége (Deák Veronika diplomadolgozat, 2004).

Ezek alapján azt is feltételezhetjük, hogy az RkpM fehérje önmagában represszor hatású lehet,

ha nem tudja kialakítani a fágreceptort és a KPS bioszintézisben sem vesz részt. A jelenség

következetesebb körüljárásához további kísérletek szükségesek, mivel bonyolultabb

folyamatról lehet szó, mint azt gondoltuk. Azt is meg kell állapítani, hogy a külön bejuttatott

RkpM fehérje mennyire befolyásolja a KPS termelést.

5.8. Az rkpM gén bioinformatikai analízise

Ahhoz, hogy minél többet megtudjunk egy ismeretlen génről, illetve az általa kódolt

fehérjéről, további információkat bioinformatikai eszközök segítségével nyerhetünk. Ezen

ismeretek felhasználásával olyan biológiai kísérleteket tervezhetünk, melyekkel

megállapítható a fehérje természete, funkciója.

Az S. meliloti baktérium KPS bioszintézisben szerepet játszó rkpM génjének nukleotid

és fehérjeszkvenciája már rendelkezésre állt (AC: AJ245666). Ismert volt, hogy a BLASTP

homológia keresés alapján az RkpM szekvenciája nagyban hasonlít a DegT/EryC/DnrJ/StrS

piridoxál-foszfát (PLP) függő aminotranszferáz családba tartozó fehérjékkel (Kiss et al.,

2001). Az említett családba tartozó fehérjék főként poliszacharid és antibiotikum

bioszintézisért felelősek. Már a bevezetőben említettük, hogy az rkp-3 régió a KR5 antigén

szintézisének törzsspecifikus génjeit tartalmazza és csak a S. meliloti 41 törzs rendelkezik ezen

génekkel. A GC-tartalom és a kodonhasználat elemzésével kiderült, hogy az rkp-3 régió génjei

valószínűleg horizontális transzfer segítségével, újonnan szerzett gének. Az egyes kódoló

szekvenciák különböző kodonhasználattal rendelkeznek, valamint a régió génjeinek GC-

PA_DIP04.doc

33

tartalma alacsonyabb, mint az alap „háztartási” géneké (Kiss et al., 2001). Hasonlót már más,

főleg patogén baktériumok K-antigén specifikus génjeinél is feltételeztek. Ezen

információkból kiindulva részletesebb elemzéseket végeztünk a fehérjén. Konzerválódott

domén homológia (Marchler-Bauer et al., 2003) alapján az RkpM fehérje legnagyobb

hasonlóságot a WecE fehérjével mutatott, mely prediktált PLP kötő, sejtfal bioszintézis

regulációjában résztvevő fehérje (COG0399.1) A szekvencia szintű homológia vizsgálatnál

feltűnt, hogy az RkpM fehérje magasfokú hasonlóságot mutat a Pseudomonas aeruginosa

egyik O9 szerotípusba tartozó fehérjéjével (ORF_7, AC: AAM27873.1). A K-antigéneket

alkotó pszeudaminsavat (Pse) először a Pseudomonas törzsekben fedezték fel. Az RkpL-Q

fehérjék BLASTP elemzéséből kitűnt, hogy mindegyik fehérje homológ valamelyik O-antigén

biosztinézisben résztvevő P. aeruginosa fehérjével, melyek pontosan abban a sorrendben

helyezkednek el (O9 szerotípus, AC: AF498420), mint az rkp-3 régióban lévő homológ

fehérjék. Ezekből az adatokból gondolhattunk volna arra is, hogy a S. meliloti ettől a O9

szerotípusba tartozó P.aeruginosa törzstől kapta az rkpL-Q géneket, de Raymond és

munkatársai kimutatták, hogy ezen O-antigén bioszintézisben résztvevő gének GC-tartalma

alacsonyabb a Pseudomonas alap „háztartási” génjeinek GC-tartalmától (Raymond et al.,

2002; www.genome.washington.edu/uwgc/O-Antigen). Ebben az esetben is horizontális

transzferrel magyarázzák a jelenséget ugyanúgy, mint a szintén RkpM homológ P.aeruginosa

WbpE fehérje, alapgénektől eltérő GC-tartalmát. (AC: AAG06543.1, [Pseudomonas

aeruginosa PAO1]; Burrows et al., 1996).

A kísérleti eredményeinkből következtetve az RkpM fehérje a fágreceptor alkotóeleme,

tehát valószínű, hogy a sejtmembránban helyezkedik el, és transzmembrán doménekkel

rendelkezik. Számítógépes elemzés szerint az RkpM fehérje három transzmembrán domént

tartalmaz (50-70, 73-93, 123-143 aminosavak), tehát a belső membránba ágyazódva található.

A domének lehetséges elhelyezkedését a 10. ábra (5.8.3. bekezdés) szemlélteti. A 243

aminosavból álló C terminális rész a periplazmatikus tér felé néz, az általunk meghatározott

rkpM4046 mutáció ezen a szakaszon található.

5.8.1 PLP kötés a DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családnál

A következőben a DegT/EryC/DnrJ/StrS piridoxál-foszfát függő amintranszferáz

családról (a továbbiakban DegT család) gyűjtöttünk információkat. Léteznek más PLP függő

aminotranszferáz fehérjék, melyeket már részletesebben elemeztek (aminotranszferáz I.-V.

osztály). Ezekről tudjuk, hogy meghatározott PLP kötőhellyel rendelkeznek, melyek

konzerválódott fehérje szekvencia motívumai ismertek (Pfam adatbázis, I. és II. osztály:

PA_DIP04.doc

34

PF00155, III. osztály: PF00202, IV. osztály: PF01063, V. osztály: PF00266). A PLP kötőhely

szerkezetileg 2 " hélixből és a közöttük lévő $ lemezből áll. A kötőhelyet kialakító molekulák

két rétegből álló struktúrát alkotnak. Az első réteg kapcsolódik a foszfát-csoport 3 oxigén

atomjához. A fehérje és a kofaktor közötti kötésben kiemelt szerepe van a lizin aminosavnak,

mely Schiff bázist képez a PLP molekulával (Denesyuk et al., 2002; Denesyuk et al., 2003). A

DegT család, egy újonnan leírt osztályba tartozik, tagjai főleg pyridoxál/pyridoxamin-foszfát

függő aminotranszferázok, melyek szintén rendelkeznek erősen konzerválódott

fehérjeszekvencia motívummal, de ez eltér az öt aminotranszferáz osztálynál leírt

motívumoktól. A motívum képlete a következő:

G-(D,V,T)-(E,V,Q)-x 76-84-(E,Q,R)-D-x10-12-(G,D,Q)-x3-5-G-x8-10-S-x4-K-x4-5-(G,A,L,F)-(E,D,Q)-G-G.

Itt feltételezhetően szintén a lizin (K) képez Schiff bázist a kofaktorral, emellett az

aszparaginsav (D) hidrogénkötést alakít ki a PLP N1 atomjával (Ahlert et al., 1997; Pascarella

and Bossa, 1994).

8. ábra: A DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családba tartozó fehérjék PLP-kötő motívumjainak többszörös illesztése (www.expasy.org). DegT (P15263), WbpE (AAG06543.1), DnrJ (P25048), MosB (AAA91313.1), ORF_7 (AAM27873), RkpM (AJ245666). Az RkpM és az ORF_7 fehérjék motívumtól való eltérését nyíllal jelöltük. A megengedett glutaminsav (E), valin (V) vagy glutamin (Q) helyett triptofán (W) áll.

Miután megvizsgáltuk az RkpM fehérjeszekvenciáját motívum kereső programmal,

kiderült, hogy nem rendelkezik az említett motívummal, ugyanúgy ahogy a P.aeruginosa

ORF_7 fehérje sem, ezzel ellentétben a P. aeruginosa WbpE fehérjéje igen. Ezután, hogy

PA_DIP04.doc

35

kiderítsük pontosan milyen eltérés lehet az RkpM fehérje szekvenciája és a motívum között,

többszörös illesztéseket végeztünk. Az RkpM fehérje és az előbb említett P.aeruginosa

ORF_7 (AAM27873.1) fehérje szekvenciája egyetlen egy aminosavban különbözött a PLP

kötő motívum képletében megadott konzerválódott aminosavakhoz képest, és mindkét

fehérjénél ugyanaz az eltérő aminosav állt, ugyanabban a pozícióban (8. ábra). Más DegT

családdal homológ fehérjénél is találkoztunk ugyanezzel a jelenséggel, de ott más eltérő

aminosav állt az adott pozícióban. Az utóbbi fehérjék PLP kötését még nem bizonyították. Az

eredmények alapján valószínűsíthető, hogy az RkpM fehérje a DegT aminotranszferáz

családba tartozik és piridoxál-foszfát kötésre képes, hogy tényleges bizonyságot nyerjünk

erről, biológiai kísérletekkel kell bizonyítanunk a funkciót.

5.8.2. Az RkpM fehérje DNS-kötő domént tartalmaz?

Léteznek olyan DegT/EryC/DnrJ/StrS aminotranszferáz családba tartozó fehérjék,

melyeknél bizonyították, hogy regulátor szereppel rendelkeznek. Többek között ilyenek a

DegT (Takagi et al., 1990), a DnrJ (Stutzman-Engwall et al., 1992) és a MosB (Murphy et al.,

1993) fehérjék. Az eddigi eredmények alapján elképzelhető, hogy az RkpM fehérje is

rendelkezhet regulátor szereppel (lsd. 5.7 bekezdés). Az aminotranszferáz családba tartozó

fehérjéknél feltételeznek egy hélix-turn-hélix DNS kötő motívumot (Lacalle et al., 1992). Az

előbb leírt, bizonyítottan regulátor funkcióval rendelkező feherjéknél ez a motívum

megtalálható. Többszörös illesztéseket végeztek és az adott helyen fehérje szekvencia

hasonlóság alapján feltételezik a kötőhelyet. Ezzel a módszerrel már más fehérjéknél is

állapítottak meg valószínűsíthető hélix-turn-hélix (HTH) motívumot (Brennan and Matthews,

1989). Mivel a létező hélix-turn-hélix motívumot prediktáló számítógépes programokkal nem

sikerült DNS-kötő helyet találnunk az RkpM fehérjén (a DegT, DnrJ, MosB fehérjéknél sem),

ezért mi is ezt a homológián alapuló módszert használtuk fel a motívum keresésére.

A DegT család fehérjéi meghatározott helyen rendelkeznek a kötőhellyel. A DNS kötő

motívum 20 aminosavból álló fehérje részlet. A regulátor szereppel bíró fehérjék és más, nem

ebbe a családból származó, hasonló kötőhellyel rendelkező fehérjék szekvenciáinak illesztése

alapján megállapítható, hogy a motívum tartalmaz erősen és kevésbé erősen konzerválódott

aminosavakat (Brennan and Matthews, 1989; Murphy et al., 1993). Ezek alapján készítettünk

egy olyan szabályos kifejezésekből álló képletet, amelyet felhasználhattunk számítógépes

motívum keresésre. Mivel a kötőhely igen rövid hosszúságú és csak néhány konzerválódott

aminosavat tartalmaz, ezért egy fehérje szekvencián belül is több helyen előfordulhat.

Szerencsénkre a DNS kötőhelyet pont a PLP kötő motívum által lefedett szekvencia részre

PA_DIP04.doc

36

valószínűsítik, ezért a PLP kötő motívum bizonyos elemeit is felhasználva, olyan DNS kötő

motívumot prediktáló képletet készítettünk, melyet adott helyre pozícionálhattunk ([GA]-x(4)-

G-x(5)-[LI]-x(6)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G). Az általunk létrehozott képletet

felhasználva végeztünk számítógépes keresést az RkpM fehérjén. A képlet túl szigorúnak

bizonyult, mert nem illeszthető a fehérjére. Mivel a motívum tartalmazott kevésbé

konzerválódott aminosavat is, ezért bizonyos változtatásokkal sikerült olyan motívumot

szerkeszteni, mely már illett az RkpM és annak homológ fehérjéire is (9. ábra).

HHHHHHHHtttHHHHHHHHH EryC1 QAVGARHRGHRVGAGSNAAA DegT QAIGAKYNGKCVGELGTAAT MosB QAHGALYKGQHVGLLSDIGC DNRJ QAHGARRHGRLVGTQGHAAA G-x(4)-G-x(5)-[LI] STRS QATGTEIGGRPIGGFGDLAC PRG1 HAHGSRYKGKPVGTFGDAAV ΛCro QTKTAKDLGVYQSAINKAIH 434REP QAELAQKVGTTQQSIEQLEN

ORF_7 HAIGGRYLGEYIGNCRYSDITIFSFHPVKIITTAEGG RkpM HAVGGRYRGEPIGNCRYSDVTVFSFHPVKIVTTAEGG

1. [GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G

2. [HQ]-x(2)-[GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G

9. ábra: Feltételezett DNS kötő motívumok a DegT családba tartozó és egyéb, már bizonyítottan DNS kötő, valamint az RkpM és ORF_7 (P. aeruginosa) fehérjéknél. Pirossal a konzerválódott, kékkel a PLP motívum konzerválódott aminosavait jelöltük. Az 1. számmal jelölt képlet illik az RkpM és ORF_7 fehérjékre. Az adatbázis keresés (7. táblázat) során újabb aminosavval bővítettük a képletet (2. motívum képlet), zölddel jelölve.

A következőkben arra voltunk kíváncsiak, hogy az általunk készített képlet mennyire

jellemző a DegT aminotranszferáz családra. Ennek megállapítására, a képlet segítségével

keresést végeztünk fehérje szekvencia adatbázisokban. A vizsgálatok alapján a motívumot

olyan fehérjék is tartalmazzák, melyek nem az aminotranszferáz, hanem főleg B típusú

karboxilészteráz/lipáz családba tartozó fehérjék. A képlet újabb módosításával (9. ábra, 2.

motívum) sikerült csak azokat a fehérjéket megtalálnuk, melyek mind a DegT családba

tartoznak. A keresés eredménye tartalmazta mind az RkpM, WbpE, ORF_7 mind a DegT,

EryC, StsC, DnrJ fehérjéket is (7. táblázat). Az első képlet alkalmazásával 66, DegT családdal

homológ fehérjét találtunk a trembl adatbázisban, míg a bővített képlettel csak 52-t, ezen

fehérjék többségénél még nem írtak le DNS kötő domént. A számokból következik, hogy 14

PA_DIP04.doc

37

fehérje adott szekvencia részlete nem hisztidin (H) vagy glutamin (Q) aminosavval kezdődik.

Az utóbbi fehérjék nagy része perozamin szintáz enzim (RfbE, WbhD).

Természetesen nem mondhatjuk, hogy ez a képlet konkrétan HTH motívumot prediktál,

mivel nagyobb szekvenciarészletet fed le, mint maga a DNS kötő hely. Inkább lehetőséget ad

arra, hogy egy DegT családdal homológiát mutató fehérjében megtaláljuk azokat a

konzerválódott aminosavakat, melyek jellemzőek a már bizonyítottan regulátor szereppel

rendelkező fehérjék DNS kötő motívumjaira.

7. táblázat: Fehérje szekvenciák keresése a kétféle képlet alapján (db).

Motívum: [GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G

Adatbázis DegT/EryC/DnrJ/StrS családba tartozó fehérje

Nem DegT/EryC/DnrJ/StrS családba tartozó fehérje

Swissprot 5 1

trembl 66 18

Motívum: [HQ]-x(2)-[GA]-x(4)-G-x(12,14)-S-x(4)-K-x(4,5)-[GALF]-[DQE]-G-G

Swissprot 5 --

trembl 52 --

5.8.3 A bioinformatikai elemzések eredményeinek értékelése

A számítógépes elemzések alapján az RkpM a DegT/EryC/DnrJ/StrS fehérje családba

tartozik, és valószínű, mint piridoxál-foszfát függő aminotranszferáz funkcionál. A fehérje kis

eltéréssel, tartalmazza a fehérje családra jellemző PLP kötő motívumot, és ami fontos,

rendelkezik a PLP molekulával kötést kialakító aszparagin és lizin aminosavakkal a megfelelő

pozíciókban. Az RkpM fehérje homológ számos poliszacharid és sejtfal bioszintézisében

szereplő regulátor fehérjével. Vizsgálataink alapján feltételezhető, hogy van egy DNS kötő

HTH motívum a fehérjén, viszont érdekes, hogy mind az RkpM, mind a DegT család regulátor

fehérjéinél a PLP kötésben fontos szerepet betöltő lizin és a DNS kötő hely igen közel

találhatók egymáshoz. Ebből arra következtethetünk, hogy a két funkció nem működhet

egyszerre. Mivel a KPS kialakításáért felelős az RkpM, tehát ez esetben az aminotranszferáz

funkció érvényesül, de bizonyos esetekben előfordulhat, hogy szabályozó DNS-régió(k)hoz

kötődhet, és a hasonló HTH motívummal rendelkező fehérjék (λcro, 434Rep, λRep)

PA_DIP04.doc

38

természetéből kiindulva valószínű, hogy represszáló hatású. Az elemzések alapján a fehérje a

belső membránban helyezkedik el, három transzmembrán doménnel rendelkezik (10. ábra). A

mutáció a periplazmatikus tér felé néz, a PLP kötésért felelős aszparginsav (D157) és lizin

(K188) aminosavak, valamint a prediktált DNS kötő motívum is a periplazmatikus tér felé néző

szekvenciarészre esik. Hasonló tulajdonságokkal rendelkezik a Xanthomonas campestris pv.

campestris LPS bioszintézisben résztvevő WxcK fehérjéje, mely szintén a DegT családdal

homológ és tartalmaz egy transzmembrán domént (Vorhölter et al., 2001).

10. ábra: Az RkpM fehérje feltételezett transzmembrán doménjeinek elhelyezkedése Az ábrán kékkel jelöltük a PLP motívum által lefedett szekvenciarészt, valamint nyillal az rkpM4046 mutációt.

A következőkben a különböző funkciók bizonyítására, biológiai kísérletek elvégzésére

van szükség, legfőképpen azt kell tisztázni, hogy az említett lehetséges funkciók milyen

feltételek esetén érvényesülnek.

PA_DIP04.doc

39

6. ÖSSZEFOGLALÁS

Munkánk kezdetekor rendelkezésünkre állt egy olyan Sinorhizobium meliloti baktérium

mutáns (GH4046), melyet a host-range jelenség segítségével izoláltak, rezisztens a vadtípusú

16-3 bakteriofággal szemben, emellett gyanítottuk, hogy módosult szerkezetű KPS-el

rendelkezik. Feltételeztük, hogy a KPS receptorként szolgál a 16-3 bakteriofág számára, mivel

a KPS hiánya befolyásolja a fágrezisztenciát. Bizonyítani szerettük volna, hogy a KPS valóban

fágreceptor szerepet is tölthet be, vagy más struktúra felelős ezért, valamint a poliszacharid

bioszintézisben résztvevő gének természetének megismerését tűztük ki célul.

Komplementációs kísérlettel megállapítottuk, hogy a GH4046 törzs mutációja az rkpM

génben található és a gén bázissorrendjének meghatározásával kiderült, a változást egy

missens mutáció okozta a fehérje C-terminális részén. A vad típusú allél leucint (Leu252)

meghatározó kodonjának (TTG) egyik bázisa megváltozott (TTC), mely fenilalanin (Phe252)

beépülését okozza az aminosavlánc adott pozíciójába. Ugyanezt az eredményt találtuk a

függetlenül izolált GH4178 törzs vizsgálatánál is. Megtudtuk, hogy a GH4046 baktérium törzs

egyáltalán nem termel KPS-t. Ezek alapján arra következtettünk, hogy a feltételezéseinkkel

ellentétben a fágreceptor nem ez, hanem egy olyan sejtfelszíni struktúra, melynek

kialakításában az RkpM fehérje, ezen kívül a GH4180 tözs előzetes vizsgálata szerint más

fehérje is részt vesz. A továbbiakban klónozási és újabb komplementációs kísérleteket

végeztünk a fágreceptor felépülésének pontosabb megismerése érdekében. A kísérletekben

nem sikerült igazán tisztázni a folyamatot, de rávilágítottak arra, hogy az RkpM több

funkcióval rendelkező fehérje, a receptor kialakulásában több tényező is szerepet játszhat,

mint azt gondoltuk.

A számítógépes elemzések szerint, az RkpM fehérje feltételezhetően a

DegT/EryC/DnrJ/StrS piridoxál-foszfát kötő aminotranszferázok családjába tartozik, hasonló

több poliszacharid és sejtfal bioszintézisében résztvevő regulátor fehérjével. Valószínűleg a

belső sejtmembránban helyezkedik el és három transzmembrán doménnel rendelkezik.

Homológia alapján DNS kötő helix-turn-helix (HTH) motívum prediktálható a fehérjén, illetve

tartalmazza azokat a konzerválódott aminosavakat, melyek jellemzőek a bizonyítottan

regulátor funkcióval rendelkező fehérjék DNS kötő motívumjaira.

A biológia kísérletekből és a bioinformatikai analízisből kitűnik, hogy az RkpM fehérje

több funkcióval is rendelkezhet, melyek különböző feltételek mellett érvényesülhetnek. A

különböző fehérje funkciók bizonyítására és azok összefüggéseinek tisztázására további, főleg

biológiai kísérleteket kell elvégezni a jövőben.

PA_DIP04.doc

40

7. IRODALMI HIVATKOZÁSOK

Ahlert, J., J. Distler, K. Mansouri, and W. Piepersberg. 1997. Identification of stsC, the gene encoding the L- glutamine:scyllo-inosose Streptomycetes. Arch Microbiol. 168:102-113.

Allen, O.N., and E.K. Allen. 1981. The Leguminosae: A source book of characteristics, uses, and nodulation The University of Wisconsin Press, Madison.

Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and D.J. Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/.

Becking, T.H. 1992. The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia. Chapman & Hall, New York.

Becquart-de Kozak, I., B.L. Reuhs, D. Buffard, C. Breda, J.S. Kim, R. Esnault, and A. Kondorosi. 1997. Role of the K-antigen subgrup of capsular polysaccharides in the early recognition process between Rhizobium meliloti and alfalfa leaves. Mol. Plant-Microbe Interact. 10:114-123.

Bladergroen, M.R., and H.P. Spaink. 1998. Genes and signal molecules involved in the rhizobia-Leguminosae symbiosis. Current Opinion Plant Bio. 1:353-359.

Brennan, R.G., and B.W. Matthews. 1989. The Helix-Turn-Helix DNA Binding Motif. J Biological Chemistry. 264:1903-1906.

Brzoska, P.M., and E.R. Signer. 1991. lpsZ, a lipopolysaccharide gene involved in symbiosis of Rhizobium meliloti. J. Bacteriol. 173:3235-3237.

Bullock, W.O., J.M. Fernandez, and J.M. Short. 1987. Xl1-blue: A High Efficiency Plasmid Transforming RecA Es. Biotechniques. 5:376-379.

Burns, R.C., and R.W.F. Hardy. 1975. Nitrogen fixation in bacteria and higher plants. Springer Verlag, New York.

Burrows, L.L., D.F. Charter, and L.J. S. 1996. Molecular characterization of the Pseudomonas aeruginosa serotype O5 (PA01) B-band lipopolysaccharide gene cluster. Mol Biol. 22:481-495.

Catoira, R., C. Galera, F. de Billy, R. Penmetsa, E. Journet, F. Maillet, C. Rosenberg, D. Cook, C. Gough, and J. Denarie. 2000. Four genes of Medicago truncatula controlling components of a nod factor transduction pathway. Plant Cell. 12:1647-1666.

Cheng, H.P., and G.C. Walker. 1998. Succinoglycan is required for initiation and elongation of infection threads during nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. J Bacteriol. 180:5183-5191.

Claros, M.G., and G.v. Heijne. 1994. TopPred II: an improved software for membrane protein structure predictions. Comput. Applic. Biosci. 10:685-686.

Currier, W.M., and G.A. Strobel. 1974. Chemotaxis of a Rhizobium spp to a glucoprotein produced by birdsfoot trefoil roots. Science. 196: 434-436.

David, M., M.-L. Daveran, J. Batut, A. Dedien, O. Domergue, J. Ghai, C. Hertig, P. Boistard, and D. Kahn. 1988. Cascade regulation of nif gene expression in Rhizobium meliloti. Cell. 54:671-683.

Dean, D.R., J.T. Bolin, and L. Zheng. 1993. Nitrogenase metalloclusters : structures, organisation and synthesis. J. Bacteriol. 175:6737-6744.

Dénairé, J., F. Dabellé, and C. Rosenberg. 1992. Signaling and host range variation in nodulation. Annu Rev Microbiol. 46:497-531.

Denarie, J., and F. Debelle. 1996. Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: Signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu. Rev. Biochem. 65:503-535.

PA_DIP04.doc

41

Denesyuk, A.I., K.A. Denessiouk, T. Korpela, and M.S. Johnson. 2002. Functional Attributes of the Phosphate Group Binding Cup of Pyridoxal Phosphate-dependent Enzymes. J Mol Biol. 316:155-172.

Denesyuk, A.I., K.A. Denessiouk, T. Korpela, and M.S. Johnson. 2003. Phosphate group binding "cup" of PLP-dependent and non-PLP-dependent enzymes: leitmotif and variations. Biochimica et Biophysica Acta. 1647:234-238.

Diaz, C.L., L.S. Melchers, P.J.J. Hooykaas, B.J.J. Lugtenberg, and J.W. Kijne. 1989. Root lectin as a determinant of host-plant specificity in the Rhizobium legume symbiosis. Nature. 338:579-581.

Ditta, G., S. Stanfield, D. Corbin, and D.R. Helinski. 1980. Broad host- range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 7347-7351.

Dudley, M.E., T.W. Jacobs, and S.R. Long. 1987. Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta. 171:289-301.

Earl, C.D., C.W. Ronson, and F.M. Ausubel. 1987. Genetic and structural analysis of the Rhizobium meliloti fixA fixB fixC and fixX genes. J. Bacteriol. 169:1127-1136.

Ehrhardt, D.W., R. Wais, and S.R. Long. 1996. Calcium spiking in plant root hairs responding to Rhizobium nodulaton signals. Cell. 85:673-681.

Falquet, L., M. Pagni, P. Bucher, N. Hulo, C.J.A. Sigrist, K. Hofmann, and A. Bairoch. 2002. The PROSITE database, its status in 2002. Nucleic Acids Research. 30:235-238.

Fischer, H.-M. 1994. Genetic regulation of nitrogen fixation in rhizobia. Microbiol Rev. 58:352-386.

Forsberg, L.S., and B.L. Reuhs. 1997. Structural characterization of the K antigens from Rhizobium fredii USDA257: evidence for a common srtuctural motif, with strain-specific variation, in the capsular polysaccharides of Rhizobium spp. J. Bacteriol. 179:5366-5371.

Fraysse, N., F. Couderc, and V. Poinsot. 2003. Surface polysaccharide involvement in establishing the rhizobium-legume symbiosis. Eur. J. Biochem. 270:1365-1380.

Gage, D.J., and W. Margolin. 2000. Hanging by thread: invasion of legume plants by rhizobia. Current Opinion Microbio. 3:613-617.

Gasteiger, E., A. Gattiker, C. Hoogland, I. Ivanyi, R.D. Appel, and A. Bairoch. 2003. ExPASy: the proteomics server for indepht protein knowledge and analysis. Nucleic Acid Research. 31:3784-3788.

Geurts, R., and T. Bisseling. 2002. Rhizobium Nod factor perception and signalling. Plant Cell:s239-s249.

Gonzáles, J.E., C.E. Semino, L.X. Wang, L.E. Castellano-Torres, and G.C. Walker. 1998. Biosynthetic control of molecular weigth in the polymerization of the octasaccharide subunits of succinoglycan, a symbiotically important exopolysaccharide of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci USA. 95:13377-13482.

Haapa, S., S. Suomalainen, S. Eerikäinen, M. Airaksinen, L. Paulin, and H. Savilahti. 1999. An efficient DNA sequencing strategy based on the bacteriophage Mu in vitro DNA transposition reaction. Genome Res. 9:308-315.

Hentschel, U., M. Steinert, and J. Hacker. 2000. Common molecular mechanism of symbiosis and pathogenesis. Trends Microbiol. 8:226-231.

Hirsch, A.M. 1992. Developmental biology of legume nodulation. New Phytol. 122:211-237. Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia

coli with plasmids. Gene. 96:23-28. Ish-Horovicz, D., and J.F. Burke. 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res.

9:2989-2998. Kannenberg, E.L., and N.J. Brewin. 1994. Host-plant invasion by Rhizobium : the role of cell-

surface components. Trends Microbiol. 2:277-283.

PA_DIP04.doc

42

Kereszt, A., E. Kiss, B. Reuhs, R.W. Carlson, A. Kondorosi, and P. Putnoky. 1998. Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and the invasion of the symbiotic nodule: rkpK gene encodes for a UDP-glucose dehydrogenase. J. Bacteriol. 180:5426-5431.

Kiss, E., A. Kereszt, F. Barta, S. Stephens, B. Reuhs, L., A. Kondorosi, and P. Putnoky. 2001. The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strain-specific genes that determine K antigen structure. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14:1395-1403.

Kiss, E., and A. Kondorosi. 1997. Complete sequence of a Rhizobium plasmid carrying genes necessary for symbiotic association with the plant host. BioEssays. 19:843-846.

Kiss, G.B., E. Vincze, Z. Kalman, T. Forrai, and A. Kondorosi. 1979. Genetic and biochemical analysis of mutants affected in nitrate reduction in Rhizobium meliloti. J. Gen. Microbiol. 113:105-118.

Kovach, M.E., R.W. Phillips, P.H. Elzer, R.M. Roop, and K.M. Peterson. 1994. pBBR1MCS: A broad-host-range cloning vector. BioTechniques. 16:800-802.

Lacalle, R.A., J.A. Tercero, and A. Jiménez. 1992. Cloning of the complete biosynthetic gene cluster for an aminonucleoside antibiotic, puromycin, and its regulated expression in heterologous hosts. EMBO J. 11:785-792.

Lagares, A., G. Caetano-Anolles, K. Niehaus, J. Lorenzen, H.D. Ljunggren, A. Puhler, and G. Favelukes. 1992. A Rhizobium meliloti lipopolysaccharide mutant altered in competitiveness for nodulation in alfalfa. J Bacteriol. 174:5941-5952.

Leigh, J.A., E.R. Signer, and G.C. Walker. 1985. Exopolysaccharide deficient mutants of Rhizobium meliloti that form inefficient nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:6231-6235.

Leigh, J.A., and G.C. Walker. 1994. Exopolysaccharides of Rhizobium: Synthesis, regulation and symbiotic function. Trends Genet. 10:63-67.

Luyten, E., and J. Vanderleyden. 2000. Survey of identified in Shinorhizobium meliloti spp., necessary for the development of an efficient symbiosis. Eur. J Soil Biol. 36:1-26.

Marchler-Bauer, A., J.B. Anderson, C. DeWeese-Scott, N.D. Federova, L.Y. Geer, S. He, D.I. Hurwitz, J.D. Jackson, A.R. Jacobs, C.H. Lanczycki, C.A. Leibert, C. Liu, T. Madej, G.H. Marchler, R. Mazumder, A.N. Nikolskaya, A.R. Panchenko, B.S. Rao, B.A. Shoemaker, V. Simonyan, J.S. Song, P.A. Thiessen, S. Vasudevan, Y. Wang, R.A. Yamashita, J.J. Yin, and S.H. Bryant. 2003. CDD: a curated Entrez database of conserved domain alignments. Nucleic Acids Research. 31:383-387.

Meade, H.M., S.K. Long, G.B. Ruvkun, S.E. Brown, and F.M. Ausubel. 1982 Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenesis. J. Bacteriol. 149:114-122

Mellor, R., and D. Werner. 1987 Peribacteroid membrane biogenesis in mature legume root nodules. Symbiosis. 3:75-100

Mergaert, P., M. Van Montagu, and M. Holsters. 1997. Molecular mechanism of Nod factor diversity. Mol Microbiol. 25:811-817.

Mills, K.K., and W.D. Bauer. 1985. Rhizobium attachment to clover roots. J Cell Sci Suppl. 2:333-345.

Murphy, P.J., S.P. Trenz, W. Grzemski, F.J. De Bruijn, and J. Schell. 1993. The Rhizobium meliloti Rhizopine mos Locus Is a Mosaic Structure Facilitating Its Symbiotic Regulation. J Bacteriol. 175:5193-5204.

Müller, P., M. Hynes, D. Kapp, K. Niehaus, and A. Puhler. 1988. Two classes of Rhizobium meliloti inf ection mutants differ in exopolysaccharide production and in coinoculation properties with nodulation mutants. Mol. Gen. Genet. 211:17-26.

PA_DIP04.doc

43

Newcomb, W. 1981 Nodule morphogenesis and differentiation. In Biology of the Rhizobiaceae. Vol. 13. K.L. Giles and A.G. Atherly, editors. Academic Press, New York. 247-298.

Orosz, L., and T. Sik. 1970. Genetic mapping of rhizobiophage 16-3. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 17:185-194.

Orosz, L., Z. Svab, A. Kondorosi, and T. Sik. 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125:341- 350.

Pascarella, S., and F. Bossa. 1994. Similarity between pyridoxal/pyridoxamine phosphate-dependent enzymes involved in dideoxy and deoxyaminosugar biosynthesis ang other pyridoxal enzymes. Prot Science. 3:701-705.

Petrovics, G., P. Putnoky, B. Reuhs, J. Kim, T.A. Thorp, K.D. Noel, R.W. Carlson, and A. Kondorosi. 1993. The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol. Microbiol. 8:1083-1094.

Postgate, J.R. 1972. The Chemistry and Biochemistry of Nitrogen Fixation. Plenum Press, London.

Preisig, O., D. Anthamatten, and H. Hennecke. 1993. Genes for a microaerobically induced oxidase complex in Bradyrhizobium japonicum are essential for a nitrogen-fixing endosymbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:3309-3313.

Putnoky, P., E. Grosskopf, D.T.C. Ha, G.B. Kiss, and A. Kondorosi. 1988. Rhizobium fix genes mediate at least two communication steps in symbiotic nodule development. J. Cell Biol. 106:597-607.

Putnoky, P., G. Petrovics, A. Kereszt, E. Grosskopf, D.T.C. Ha, Z. Banfalvi, and A. Kondorosi. 1990. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J. Bacteriol. 172:5450-5458.

Raymond, C.K., E.H. Sims, A. Kas, D.H. Spencer, T.V. Kutyavin, R.G. Ivey, Y. Zhou, R. Kaul, J.B. Clendenning, and M.V. Olson. 2002. Genetic variation at the O-antigen biosynthetic locus in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 184:3614-3622.

Redmond, J.W., M. Batley, M.A. Djordjevic, R.W. Innes, P.L. Kuempell, and B.G. Rolfe. 1986. Flavons induce expression of nodulation genes in Rhizobium. Nature. 323:632-635.

Reuber, T.L., and G.C. Walker. 1993. The acetyl substituent of succinoglycan is not necessary for alfalfa nodule invasion by Rhizobium meliloti Rm1021. J. Bacteriol. 175:3653-3655.

Reuhs, B.L. 1997. Acidic capsular polysaccharides (K antigens) of Rhizobium. In Biology of Plant-Microbe Interactions. G. Stacey, B. Mullin, and P.M. Gresshoff, editors. International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, St. Paul. 331-336.

Reuhs, B.L., R.W. Carlson, and J.S. Kim. 1993. Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:3570-3580.

Reuhs, B.L., D.P. Geller, J.S. Kim, J.E. Fox, and S.G. Pueppke. 1998. Sinorhizobium fredii, and Sinorhizobium meliloti produce structurally conserved lipopolysaccharides and strain-specific K antigens. Appl. Environ. Microbiol. 64:4930-4938.

Reuhs, B.L., M.N. Williams, J.S. Kim, R.W. Carlson, and F. Cote. 1995. Suppression of the Fix- phenotype of Rhizobium meliloti exoB mutants by lpsZ is correlated to a modified expression of the K polysaccharide. J. Bacteriol. 177:4289-4296.

Rippka, R., J. Deruelles, J.B. Watersbury, M. Herdman, and R.Y. Starnier. 1979. Generic assingments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J Gen Microbiol. 111:1-61.

PA_DIP04.doc

44

Robertson, J.G., and P. Lyttleton. 1982. Coated and smooth vesicles in the biogenesis of cell walls, plasma membranes, infection threads and peribacteroid membrane in root hairs and nodules of white clover. J Cell Sci. 58:63-78.

Rosenow, C., F. Esumch, I.S. Roberts, and K. Jann. 1995. Characterization and Localization of the KpsE Protein of Escherichia coli K5, Which Is Involved in Polysaccharide Export. J Bacteriol. 177:1137-1143.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Schenk, H.E.A. 1992. Cyanobacterial symbioses. Springer-Verlog, New York. Schultze, M., E. Kondorosi, P. Ratet, M. Buire, and A. Kondorosi. 1994. Cell and molecular

biology of Rhizobium-plant interactions. Int. Rev. of Cytol. 156:1-75. Semsey, S., I. Papp, Z. Buzas, A. Patthy, L. Orosz, and P. Papp. 1999. Identification of site-

specific recombination genes int and xis of the Rhizobium temperate phage 16-3. J Bacteriol. 181:4185-4192.

Stutzman-Engwall, K.J., S.L. Otten, and C.R. Hutchinson. 1992. Regulation of secondary metabolism in Streptomyces spp. and overproduction of daunorubicin in Streptomyces peucetius. J.Bacteriol. 174:144-154.

Takagi, M., H. Takada, and T. Imanaka. 1990. Nucleotide sequence and cloning in Bacillus subtilis of the Bacillus stearothermophilus pleiotropic regulatory gene degT. J Bacteriol. 172:411-418.

Vorhölter, F.-J., K. Niehaus, and A. Pühler. 2001. Lipopolisaccharide biosynthesis in Xanthomonas campestris pv. campestris: a cluster of 15 genes is involved in the biosynthesis of the LPS O-antogene and the LPS core. Mol Genet Genomics. 266:79-95.

Walker, G.C. 1992. Role of exopolysaccharides in nodulation. In Nodulation and Nitrogen Fixation in Rice. G.S. Khush and J. E-Bennett, editors. Int Rice Research Inst, Manila. 55-60.

Wang, J., V. Michel, M. Hofnung, and A. Charbit. 1998. Cloning of the J gene of bacteriophage lambda, expression and solubilization of the J protein: first in vitro studies on the interactions between J and LamB, its cell surface receptor. Res Microbiol. 149:611-624.

Werts, C., V. Michel, M. Hofnung, and A. Charbit. 1994. Adsorption of bacteriophage lambda on the LamB protein of Escherichia coli K-12: point mutations in gene J of lambda responsible for extended host range. J. Bacteriol. 176:941-947.

West, N.J., and D.G. Adams. 1997. Phenotypic and Genotypic Comparison of Symbiotic and Free-Living Cyanobacteria from a Single Field Site. Applied Environ Microbiol. 63:4479-4484.

Wolk, C.P., A. Erust, and J. Elhai. 1994. Heterocyst and metabolism and development. Kluwer Academic Publisher, Boston.

Yanisch-Perron, C., J. Viera, and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains : nucleotid sequence of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene. 33:103-119.

PA_DIP04.doc

45

8. RÖVIDÍTÉSEK

KPS kapszuláris poliszacharid EPS exopoliszacharid LPS lipopoliszacharid Amp ampicillin Tc tetraciklin Km kanamicin Cam kloramfenikol EDTA etilén-diamino-tetra-acetát SDS nátrium-lauril-szulfát Tris tris-(hidroxi-metil)-amino-metán DTT dithiotreitol DNS dezoxi-ribonukleinsav PCR polimeráz láncreakció kb kilobázis PLP piridoxál-foszfát HTH hélix-turn-hélix

PA_DIP04.doc

46

KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS

Munkámat a PTE Természettudományi Kar, Genetikai és Molekuláris Biológiai

Tanszékén végeztem. Hálás vagyok a tanszék összes dolgozójának, hogy megfelelő hátteret

biztosítottak terveim megvalósításához.

Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért

önzetlen segítségéért, tanácsaiért.

Köszönöm Deák Veronikának, − akivel a közös témánk kísérleteit együtt végeztem −

kitartását és ötleteit, Hoffman Gyulának, hogy rendelkezésünkre bocsájtotta az izolált

baktérium mutánsokat, valamint Nagy Tibornak a bioinformatikai elemzésekben adott hasznos

segítségét.

PA_DIP04.doc