B SEJT DIFFERENCIÁCIÓ A CSONTVELŐBEN

V D JTCGACGTTATATAGCTGCAATATA

Junctional Diversity

TTTTTTTTTTTTTTT

Germline-encoded nucleotides

Palindromic (P) nucleotides - not in the germline

Non-template (N) encoded nucleotides - not in the germline

Creates an essentially random sequence between the V region, D region and J region in heavy chains and the V region and J region in light chains

How does somatic gene rearrangement(recombination) work?

1. How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of

DNA?

Combinatorial diversity

2. How do V region find J regions and why don’t they join to C regions?

12-23 rule

3. How does the DNA break and rejoin?

Imprecisely, with the random removal and addition of nucleotides to

generate sequence diversity

Junctional diversity (P- and N- nucleotides, see above)

Gene rearrangement and the synthesis of cell-surface IgM in B cells

SUMMARY

Coexpression of IgD and IgM is regulated by RNA processing.

Hogyan fejeznek ki az érett B-sejtek sejt felszíni IgM és IgD receptorokat is?

Hogyan működik

Sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómánALLÉL KIZÁRÁS

Csak egyféle H- és L-lánc szintetizálódikA sejtfelszínre 2 H- és 2 L-láncból álló dimerek kerülnek ki

?

Minden B-sejt azonos specificitású immonglobulint termel

A nehéz és a könnyű lánc is 2 példányban van a csíravonalban (anyai és apai kromoszómán)

Mégis csak egy B-sejt receptor (BCR) képződik

The B-sejt monospecifikus antitestet termel

Ez alapvető fontosságú a specifikus ellenanyag válasz szempontjából.

A mechanizmus ami ezt biztosítja:

Allélkizárás…Allelic exclusion

ÜGYES GENETIKAI BIZONYÍTÉK AZ ALLÉL KIZÁRÁSRA

Az Ig allotípusok a B-sejtek felszínén fluoreszcens festékkel kimutathatók

a/a b/b a/b

YBb YBa YBb

Y

YB ab

YBa ÉS

ALLOTÍPUS- a H-lánc C-régió polimorfizmusa (marker)

H-lánc átrendeződés gátlása megakadályozza, hogy egy B-limfocitában

kétféle specificitás alakuljon ki

AZ ALLÉL KIZÁRÁS SZÜKSÉGES A HATÉKONY KLONÁLIS SZELEKCIÓHOZ

Minden utódsejtnek ugyanazzal a specificitással kell rendelkeznie, máskülönben az immunválasz hatásfoka romlik

A H-lánc átrendeződés gátlása az osztódó utódsejtekbenmegakadályozza az új specifitások létrejöttét

S. typhi

Antibody

S. typhi

YY

Y Y

A H-lánc átrendeződés gátlása biztosítja, hogy egy sejtben csak egyféle ellenanyag képződjön

Az allél kizárás megakadályozza a nem kívánatos specifitású ellenanyagok képződését

BSaját antigenpl. májsejt

S. aureusY Y

YYYB

S. aureus

YY

Y

YY

Y

Y

AntiS. aureus

Ab

Y

Y Y

Y Y

YAnti-májsejt

Ab

Egyféle Ag receptor/sejt HA egy sejtben kétféle Ag receptor lenne

Y

Y Y

Y

YY Y

AntiS. aureus

Ab

Ezáltal megakadályozza a nem kívánatos auto-reaktív választ

Az allél kizárás szükséges a repertoire teljességének kialakulásához („lyuk” a készletben)

Anti-agyi fehérje B-sejt kizárása – sajáttal szembeni tolerancia

YYBB

Sejtenként egy Ag specificitás

S. aureus

Anti-agyi fehérje IgAND

anti-S. Aureus IgYYYBB

IF ha sejtenként két specificitás lenne

Anti-agyi fehérje Ig

BB

Deléció Anergia

OR

Anti-S.Aureus B sejtek kizáróknak és hiányoznak a készletből

BUTBUT

YYYBB

1. Az Ig génszegmensek szomatikus átrendeződése ellenőrzött sorrendben, meghatározott program szerint megy végbe

2. Egy egyed különböző B-limfocitáiban a gén szegmensek kombinációja nagy számú, egymástól eltérő nehéz és könnyű lánc variábilis régiót eredményez

3. Egy adott egyed teljes B-sejt készlete eltérő módon átrendezett, eltérő variábilis régióval rendelkező B-limfocitából áll

A B-SEJT KÉSZLET SOKFÉLE ANTIGÉN FELISMERÉSÉRE KÉPES

4. Egy B-sejt az allél kizárás eredményeként csak egyféle nehéz és egyféle könnyű láncot szintetizál

ELKÖTELEZETTÉ VÁLIK EGY ADOTT ANTIGÉN KÖTŐ HELY KIALAKÍTÁSÁÉRT

A CSONTVELŐBEN ZAJLÓ SZOMATIKUS GÉNÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE

AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK

A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE

Az allél kizárás lehetőséget ad a limfómák Az allél kizárás lehetőséget ad a limfómák diagnózisáradiagnózisára

Egyetlen egyedi átrendeződéssel rendelkező sejt klonális osztódása alapján a vérben keringő vagy csontvelői tumor sejtek

aránya meghatározható

Felhasználható a kezelést követő reziduális tumor sejtek követésére

Diagnosis and monitoring of the treatment of childhood acute lymphocytic leukemia (C-ALL)

The sequence of the framework regions are well conserved. Step 1: design primers that amplify these regions together with the hypervariable regions

Step 2: sequence the PCR fragments to obtain spec. Sequence info on the actual tumor (monoclonal, majority of amplification product is tumor-derived

Step 3: based on the sequence info, design tumor-specific PCR primers

Step 4: quantitate gene expression by Q-PCR. Follow success of therapy and detect minimal residual disease much earlier then by flow cytometry

Minimális reziduális betegség (MRD)

A gyermekkori akut limfoblasztos A gyermekkori akut limfoblasztos leukémia (ALL) heterogén leukémia (ALL) heterogén

betegségbetegség

Eltérő prognózisú alcsoportokEltérő prognózisú alcsoportok

Személyre szabott kemoterápia kiválasztásaSzemélyre szabott kemoterápia kiválasztása

Terápiára adott válasz

Relapszus korai felismerése

Csontvelőátültetés

Áramlási citometria:Áramlási citometria:- a leukémiás sejtek abberáns protein a leukémiás sejtek abberáns protein

expresszióját detektáljaexpresszióját detektálja- kvantitatív módszer, de mintaigényeskvantitatív módszer, de mintaigényes

Real-time kvantitatív PCRReal-time kvantitatív PCR- a PCR specifikussága és érzékenysége + a PCR specifikussága és érzékenysége +

abszolút kvantitálásabszolút kvantitálás- minimális mennyiségű minta szükségesminimális mennyiségű minta szükséges

Minimális reziduális betegség Minimális reziduális betegség (MRD)(MRD)

- nyomonkövetésére használt módszerek- nyomonkövetésére használt módszerek

1. gDNS izolálás D1 és follow-up csontvelő mintákból

2. Multiplex PCR: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK

(BIOMED2 primer-párok)

3. Szekvenálás: Páciens-specifikus szekvencia

4. Primertervezés, real-time kvantitatív PCR assay (QPCR)

optimalizálása és karakterizálása

6. Follow-up csontvelő minták analízise, MRD kvantitálása

(D8, D15, D33,M2,M3,M5,M7,M10,M12, évenként)(D8, D15, D33,M2,M3,M5,M7,M10,M12, évenként)

MRD analízis real-time kvantitatív PCR-ral: Munkafázisok

II. Szekvencia meghatározásaABI Prism - 3100 Avant Genetic Analyzer,

ABI Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit

Result of IMGT junction analysis (http//imgt.cines.fr): IGH rearrangement of patient Q015

IG/TCR génátrendeződések monitorozásareal-time kvantitatív PCR-rel

V N1 D N2 J

Konszenzus próba ésreverz primer

Általunk tervezett,páciens-specifikus

forward primer

BIOMED2 Concerted Action: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK

Relapszuskockázat megállapítása MRD alapján

Perifériás

A B sejt fejlődés szakaszai

Őssejt - HSC Korai pro-B sejt Késői pro-B sejt

Kis pre-B sejt Éretlen B sejt érett B sejt

Az egyes érési fázisokat sejtfelszíni markerek megjelenése (vagy eltűnése) jellemzi

Csíravonal DH to JH VH to DHJH VHDHJH

Nagy pre-B sejt

Pre-receptor

Y

ReceptorH+L

CD19, CD10,RAG

B-cell development is dependent on bone marrow stromal cells

Termelt faktorok – CITOKINEKKolónia stimuláló faktorokNövekedési faktorokDifferenciációs faktorok

2. A sztróma sejtek citokineket termelnek

B

A CSONTVELŐI SZTRÓMA SEJTEK TÁPLÁLJÁK/SEGÍTIK A FEJLŐDŐ B- LIMFOCITÁKAT

A citokinek és a közvetlen sejt-sejt kölcsönhatások a differenciáció során változnak

Sztróma sejt

1. Specifikus sejt-sejt kölcsönhatás a sztróma sejtek és a B-sejtek között

Sejt-sejt kölcsönhatás

Koraipro-B

c-KitReceptor Tyrosine

kináz

Stem cell factor (SCF)Sejthez kötött növekedési

faktor

VLA-4(Integrin)

CLP

A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak

Sztróma sejt

Sejt adhéziósmolekulák

VCAM-1(Ig superfamily)

EBF, E2APax5

Interleukin-7receptor

Sztróma sejt

Késői pro-B Pre-B

Interleukin-7Növekedési faktor

Korai pro-B

VLA-4(Integrin)

VCAM-1(Ig superfamily)

A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak

CD19, CD10,RAG és proliferációDJ… VDJ átrendeződés

B sejt receptor

Átmenetileg jelenik meg a membránban produktív VHDHJH CH átrendeződés után

VpreB/5 – pót L-lánc, a membrán kifejeződéshez szükséges

Ig & Ig jelátvivő molekulák

CH

H-láncVHDHJH

V-preB

5

A pre-B sejt receptor liganduma nem ismert

Pre-

The pre B-cell receptor monitors the quality of heavy chain rearrangement

Mutation in λ5– arrest atPro-B cell stage

SÚLYOS IMMUNDEFICIENCIA

Productive µ-lánc átrendeződés---pre-BCR

RAG gének lekapcsolása

µ-lánc átrendeződés leállALLELIC EXCLUSIONEgyféle µ-lánc és specificitás

A pre-B sejt receptor stimulálásának következményei

1. Biztosítja az egyedi specificitást

Nagy Pre-B

Sztróma sejt

Ismeretlen ligand

2. Kiváltja a belépést a sejtciklusba

ALLÉL KIZÁRÁS

1. Gátolja a további H-lánc átrendeződést

2. A keretben leolvasható átrendeződést hordozó pre-B sejtek osztódását eredményezi

LargePre-B

LargePre-B

LargePre-B

LargePre-B Large

Pre-BLargePre-B Large

Pre-BLargePre-B Large

Pre-BLargePre-B

Proliferáció

Y ÉretlenB sejt

L-lánc kifejeződésIgM a membránban

IgM

A pre-B sejt receptor stimulálása sejtosztódást vált ki

Largepre-B

Sok nagy pre-B sejt azonos pre-B receptorokkal

Large pre-B

Intracellular VDJCH chainVL-JL átrendeződés

Osztódás leáll

Pre-B receptor eltűnik

Kis pre-B

A GÉNÁTRENDEZŐDÉS LEHETŐSÉGEI

V-D-J1.allél

V-D-J2.allél

mRNSFehérjereceptor

Átrendeződés gátlása

V-J1.allél

V-J2.allél

V-J1.allél

V-J2.allél

Nem sikeres

Sikeres

mRNS fehérje

Átrendeződés gátlása

mRNS fehérje

Átrendeződés gátlása

Nem-produktív L-lánc átrendeződés megoldható további átrendetődéssel

A multi-specificitással rendelkező éretlen B-sejtek a csontvelőben rekednek

Receptor editing

A monovalens saját antigéneket felismerő éretlen B sejtek anergiás állapotba A monovalens saját antigéneket felismerő éretlen B sejtek anergiás állapotba kerülnekkerülnek

Rövid élettartam a Rövid élettartam a perifériánperiférián

1. Az immunoglobulin gén szegmensek szigorúan ellenőrzöttszigorúan ellenőrzött átrendeződése

2. Egy adott B-sejt elkötelezetté válik egy egyedi H- és L-láncegy egyedi H- és L-lánc variábilis domén szintézisére, ami meghatározza a specificitást

3. Egy adott egyedben nagy B-sejt készlet (repertoire) alakul ki, ahol az egyes B-sejt klónok különböző H- és L-lánc variábilis doménekkel rendelkeznek

4. Ez a potenciális B-sejt készlet sokféle különböző antigén felismerésére képes

5. A naív éretlen B-sejtek azonos H- és L-lánc variábilis régiókkal rendelkező IgM és IgD felszíni immunoglobulint is kifejeznek

A SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS ÉS ALLÉL KIZÁRÁS EREDMÉNYE