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4. Konstruktion einer chromosomalen B. subtilis-Knockout Mutante
Erlernen einer Methode zur Inaktivierung eines Gens bei Bacillus subtilis
Versuchsziel:
Experimentelle Möglichkeiten, eine Knockout-Mutante zu konstruieren:
1. Gen mit den flankierende Regionen in ein Vektor-Plasmid einbauen; Markergen in die singuläre Schnittstelle am Beginn des zu inaktivierenden Gens
2. Gen mit flankierender Region in ein Vektor- Plasmid klonieren; Markergen in singuläre Schnittstelle innerhalb des Gen einbauen
A B B C
B Marker B
A
B
B
C
3. Etwa 300 bp vom Beginn des Gens mittels PCR amplifizieren und in einen Integrationsvektor einbauen
Charakteristika der pMUTIN- Vektoren
1. Erlauben die Konstruktion von Knockouts2. Fusionieren das Promotor-lose lacZ-Gen an
den Promotor des inaktivierten Gens3. Fusionieren den regulierbaren Pspac
Promotor an Gene des Operons, die downstream von dem inaktivierten liegen
Experimentelle Durchführung: Teil 1
1. Präparation des rekombinanten Plasmids pMUTIN-yrdB aus E. coli-Zellen
2. Kontrollverdau des Plasmids; Kontrolle leerer Vektor
3. Transformation B. subtilis; Selektion auf LB + 1 µg/ml Erythromycin (Em)
4. Screening von ca. 100 Transformanten auf LB + 100 µg/ml Em
Unterscheidung
zwischen Pseudo-
resistenten und
resistenten
Kolonien
1 µg/ml Em
100 µg/ml Em 1 µg/ml Em
resistente pseudo-resistente Kolonien
Experimentelle Durchführung: Teil 2
5. Präparation chromosomaler DNA aus zwei Kandidaten
6. Hydrolyse der chromosomalen DNA mit EcoRV
7. Auftrennung der DNA-Fragmente in einem 0,8% Agarosegel
8. Southern-Blot (Vakuum-Blot)9. Detektion der gesuchten DNA-Fragmente mit
einer DIG-markierten RNA-Sonde
Experimentelle Durchführung: Teil 3
• Hydrolyse der chromosomalen DNA mit EcoRV
• Auftrennung der DNA-Fragmente in einem 0,8% Agarosegel
• Southern-Blot (Vakuum-Blot)• Detektion der gesuchten DNA-Fragmente mit
einer DIG-markierten RNA-Sonde
ECL (Enhanced ChemoLuminescence):
Zweitantikörper mit konjugierter Meerrettich Peroxidase
1. Meerretich-Peroxidase reduziert H2 O2 zu Wasser und Sauerstoffradikalen
2. Sauerstoffradikale reagieren mit Luminol zu 3- Aminophtalat und Lichtquanten
Zwei konsekutive Reaktionen: